專利名稱：殘留農(nóng)藥分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種米等谷物以及蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中殘留農(nóng)藥的分析方法，尤其是涉及一種能高靈敏度檢測新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留農(nóng)藥分析方法。
背景技術(shù)：
以前，本發(fā)明者們提出了可以同時簡便地檢測有機磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留農(nóng)藥檢測方法(參照特許文獻1)。
在上述方法中，在含有羧酸酯酶和膽堿酯酶的混合溶液中使檢測對象試樣反應(yīng)，利用反應(yīng)后的溶液水解羧酸酯酶特異性底物和膽堿酯酶特異性底物，向底物的水解生成物添加顯色試劑使其顯色，或者利用水解生成物自身顯色的底物使其顯色，同時測定多個波長的光譜變化，由此分別的同時檢測出試樣中的有機磷類農(nóng)藥群和氨基甲酸酯類農(nóng)藥群。
通過該構(gòu)成，水解羧酸酯酶特異性底物和膽堿酯酶特異性底物，使用分光光度計同時照射多個波長并進行經(jīng)時變化測定，同時檢測出兩底物分解引起的吸收，經(jīng)演算處理算出各種酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度，由該反應(yīng)速度變化分別檢測試樣中有機磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，因此可以同時簡便地區(qū)分有機磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
然而，雖然上述方法可以區(qū)分檢測出有機磷類農(nóng)藥群和氨基甲酸酯類農(nóng)藥群，但因農(nóng)藥種類不同，有些氨基甲酸酯類農(nóng)藥很難引起酶抑制，而使分析精度不足。
可是，已知氨基甲酸酯類殺蟲劑是通過降低控制害蟲等的神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿酯酶活性而顯示殺蟲效果的。較早注冊的氨基甲酸酯類殺蟲劑存在具有速效性而無持效性的問題。進一步地，1970年代后半時期，在防除害蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)對于前述氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性菌，希望改善該效能降低問題。如此，1980年代以后，為解決上述問題，克百威類似物(惡蟲威)、克百威衍生物(丁硫克百威、呋線威、丙硫克百威)、滅多威衍生物(硫雙威、棉鈴?fù)?アラニカルブ))6種成分作為新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥被注冊。
在前述新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥中，除了惡蟲威之外，所研制的農(nóng)藥，散布后通過在自然界中代謝轉(zhuǎn)化成膽堿酯酶抑制作用較大的克百威或滅多威而緩緩顯示效用。
在前述新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥中，克百威衍生物是在對膽堿酯酶抑制作用較大的克百威上通過硫鍵結(jié)合了其它結(jié)構(gòu)的分子而形成的結(jié)構(gòu)(克百威-S-R)，滅多威衍生物也形成同樣的結(jié)構(gòu)(滅多威-S-R)。將這些結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥散布后經(jīng)過在自然界中的代謝慢慢轉(zhuǎn)化成克百威或滅多威而顯示殺蟲作用。也就是，由于該克百威衍生物和滅多威衍生物的膽堿酯酶抑制作用較小，相對殘留基準值，得不到足夠的檢測靈敏度。
特許文獻1特開2003-298號公報。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述問題，本發(fā)明涉及的技術(shù)問題是提供對被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，可高靈敏度檢出的殘留農(nóng)藥檢測分析方法。
本發(fā)明提供了如下殘留農(nóng)藥分析方法。
1、殘留農(nóng)藥分析方法，其特征在于，對作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的新型體系的克百威衍生物或滅多威衍生物，以還原型谷胱甘肽作為反應(yīng)底物并以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶為其催化劑與之作用，衍生出膽堿酯酶抑制作用較大的物質(zhì)，將該衍生化反應(yīng)生成的物質(zhì)與膽堿酯酶反應(yīng)，由變化的膽堿酯酶活性檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
2.上述1記載的殘留農(nóng)藥分析方法，其中為了緩和阻礙衍生化反應(yīng)的金屬離子的影響，向被檢試樣添加對金屬離子具有較高配合物生成能力的螯合劑，然后檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
3、上述1或2記載的方法，其中克百威衍生物是丁硫克百威、呋線威或丙硫克百威。
4、上述1或2記載的方法，其中滅多威衍生物是硫雙威或棉鈴?fù)?br> 5、上述2記載的方法，其中螯合劑選自多氨基羧酸類以及羥基羧酸類中的至少一種。
6、上述2記載的方法，螯合劑是EDTA或檸檬酸。
7、上述1或2記載的方法，被檢試樣是農(nóng)產(chǎn)品。
8、上述1或2記載的方法，被檢試樣是米，蔬菜或水果。
9、上述1或2記載的方法，被檢試樣是糙米。
本發(fā)明的特征在于，在被檢試樣中含有的作為新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的克百威衍生物或滅多威衍生物，經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的催化作用進行轉(zhuǎn)化后，與膽堿酯酶反應(yīng)，由變化的膽堿酯酶活性檢測該新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，其特征在于，為了緩和經(jīng)前述谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化作用進行轉(zhuǎn)化時的有害物質(zhì)即金屬離子的影響，向被檢試樣添加對金屬離子其有較高配合物生成能力的螯合劑，然后檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
根據(jù)如上的本發(fā)明，使被檢試樣含有的克百威衍生物或滅多威衍生物衍生化，轉(zhuǎn)化成對于膽堿酯酶抑制作用較大的物質(zhì)，通過其與膽堿酯酶反應(yīng)來進行檢測，因此即使是對膽堿酯酶抑制作用較小，相對殘留基準值得不到足夠的檢測靈敏度的該克百威衍生物或滅多威衍生物，也可能以足夠的檢測靈敏度檢測。
另外，添加對金屬離子具有較高配合物生成能力的螯合劑后，進行前述新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)化，使其與膽堿酯酶反應(yīng)來檢測，因此可以順利地進行該新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的衍生化，相對殘留基準值，用足夠的精度來檢測。
具體實施例方式
以下說明了實施本發(fā)明的最佳方式。首先，本發(fā)明的殘留農(nóng)藥分析方法以圖1的示意圖表示。
在圖1中，首先說明虛線圍繞的區(qū)域(區(qū)域I)?？税偻苌?Cf-S-R)(1)經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)(3)催化劑與還原型谷胱甘肽(GSH)(2)反應(yīng)，克百威衍生物(Cf-S-R)(1)轉(zhuǎn)化為克百威(Cf)(4)。該衍生化反應(yīng)中副反應(yīng)生成氧化型谷胱甘肽(GS-S-R)(5)。
上述反應(yīng)于10～40℃在5～60分鐘左右內(nèi)充分進行。反應(yīng)液的pH值通常為5.0～8.5，優(yōu)選為6.0～7.0。
谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的使用量通常為0.003～0.1U/mL，優(yōu)選為0.01～0.05U/mL。
另外，還原型谷胱甘肽(GSH)的使用濃度通常為10-6～10-4M，優(yōu)選為10-5～5×10-5M。
接著，說明點劃線圍繞的區(qū)域(區(qū)域II)。該反應(yīng)目的是，緩和在被檢試樣中含有的金屬離子Mn+(6)對前述衍生化反應(yīng)中使用的還原型谷胱甘肽(GSH)(2)的影響。進行前述衍生化反應(yīng)之前，進行如下反應(yīng)。對于在被檢試樣中含有的金屬離子Mn+(6)，添加對金屬離子具有較高配合物生成能力的螯合劑L(8)，生成不影響衍生化反應(yīng)的Mn+·L(9)。通過該反應(yīng)，抑制了金屬離子Mn+(6)與還原型谷胱甘肽(GSH)(2)的反應(yīng)物GSM(7)生成。因此可以緩和對于前述衍生化反應(yīng)中使用的還原型谷胱甘肽(GSH)(2)的影響。
上述反應(yīng)于10～40℃在5～15分鐘左右內(nèi)充分進行。反應(yīng)液的pH值通常為4.0～12.0，優(yōu)選為6.0～8.0。
上述金屬離子可以列舉的例如鎂離子、銅離子、鐵離子等。
作為本發(fā)明中使用的對金屬具有較高配合物生成能力的螯合劑，例如多氨基羧酸類以及羥基羧酸類。多氨基羧酸類例如EDTA(乙二胺四乙酸)、亞氨基二乙酸、氨三乙酸等，羥基羧酸類例如檸檬酸，酒石酸、羥基安息香酸等。對其使用濃度沒有特別的限制，通常為10-4～10-1M，優(yōu)選為10-3～10-2M。
前述谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)(3)是以還原型谷胱甘肽(GSH)(2)為反應(yīng)底物，分別將克百威衍生物或滅多威衍生物轉(zhuǎn)化為克百威和滅多威而起催化作用。
前述作用為如下反應(yīng)方程式。
化學(xué)方程式1
農(nóng)藥名 R丁硫克百威 -N[(CH2)3CH3]2丙硫克百威 呋線威 化學(xué)方程式2 農(nóng)藥名 R棉鈴?fù)?硫雙威 其效果是可將克百威衍生物轉(zhuǎn)化為對膽堿酯酶抑制作用較大的克百威而可以進行高靈敏度檢測。另外，滅多威衍生物也同樣地可轉(zhuǎn)化為膽堿酯酶抑制作用較大的滅多威而可以進行高靈敏度檢測。
同時，在進行衍生化反應(yīng)之前，將前述螯合劑L(8)添加于被檢試樣中，使妨礙衍生化反應(yīng)的金屬離子Mn+(6)轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥绊懷苌磻?yīng)的Mn+·L(9)，其可以起到抑制還原型谷胱甘肽(GSH)(2)與金屬離子Mn+(6)的反應(yīng)物GSM(7)生成的作用。
前述作用為如下反應(yīng)方程式。
化學(xué)方程式3
Mn++L→ML+GSH→MSM其效果是，緩和了在被檢試樣中含有的金屬離子Mn+(6)對于衍生化反應(yīng)中使用的還原型谷胱甘肽(GSH)(2)的影響，可以促進衍生化反應(yīng)的順利進行。
實施例1在該實施例中，確認丁硫克百威的衍生化作用(參照圖2)。向含各種濃度克百威衍生物丁硫克百威的0.02M Mes緩沖液(pH6.0)的10ml溶液中，添加以在該溶液中的濃度計為5×10-5M的還原型谷胱甘肽(GSH)和以在該溶液中的濃度計為0.025U/mL的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)，放置30分鐘以上后，由丁硫克百威轉(zhuǎn)化為克百威。
接著，在前述放置后的溶液中，加入包含0.1M磷酸緩沖液(pH7.6)以及0.2M氯化鉀組成的溶液10ml，制成20mL溶液，向該溶液中添加以在溶液中的濃度計為0.01U/ml膽堿酯酶和以在該溶液中的濃度計為0.5U/ml膽堿氧化酶，使前述還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化的物質(zhì)進行接觸，放置60分鐘以上。
為了調(diào)節(jié)為接觸而放置后的前述溶液對于膽堿酯酶的抑制作用，添加以在該溶液中的濃度計為2×10-4M的乙酰膽堿，測定生成的過氧化氫。對照比較沒有添加丁硫克百威的溶液，比較添加各種濃度的丁硫克百威的溶液中的過氧化氫產(chǎn)生的信號。丁硫克百威的標準曲線如圖3所示。
圖3以橫軸為農(nóng)藥濃度，以縱軸為抑制信號，●符號是丁硫克百威標樣經(jīng)還原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)轉(zhuǎn)化后的標準曲線，○符號是未進行該轉(zhuǎn)化的丁硫克百威標樣的標準曲線，△符號是克百威標樣的標準曲線。由圖3可知，未進行該轉(zhuǎn)化的丁硫克百威標樣(○符號)具有較小的抑制作用，進行該轉(zhuǎn)化的丁硫克百威標樣(●符號)與克百威標樣的標準曲線(△符號)相同，可以確認由1分子丁硫克百威衍生出1分子克百威。
實施例2在該實施例中，是否對糙米可以進行克百威衍生物丙硫克百威的分析，通過向糙米添加丙硫克百威后回收來確認。首先，粉碎糙米，稱量25g粉碎米，向25g該粉碎米添加20ppb的丙硫克百威。然后，向25g該粉碎米中加入25ml水和50ml乙腈，使用振蕩機進行農(nóng)藥提取(步驟1)。
接著，為了除去前述提取的溶液中的各種雜質(zhì)進行吸濾。取通過該過濾分離得到的過濾液，為了除去該過濾液中水溶性雜質(zhì)和金屬離子進行液液分配。該液液分配是，每次預(yù)先向分液漏斗投入15ml飽和食鹽濃度的1M磷酸緩沖液(pH7.0)，5g食鹽，1ml的50mM EDTA，加入該過濾液振蕩后，放置一會兒直至分成有機層和水層兩層，回收有機層。經(jīng)過該液液分配，水溶性雜質(zhì)轉(zhuǎn)移到由磷酸緩沖液構(gòu)成的水層中，金屬離子和EDTA生成配合物，轉(zhuǎn)移入水層中進而除去(步驟2-1)。
為了除去來自上述有機層液的親油性雜質(zhì)(脫脂)，進行ODS(十八烷基硅膠)柱處理，為了粗精制其他雜質(zhì)，通過加入硫酸鈉和硅膠的柱進行處理。減壓干燥來自該處理的液體，蒸餾掉溶劑(步驟2-2)。
進一步地，用硅膠柱進行精制。對于前述減壓干燥后的殘余物，在該殘余物中加入由乙酸乙酯與己烷以3∶97混合的5ml溶劑溶解之，用硅膠柱展開該溶液，用硅膠吸附該溶液中的雜質(zhì)、農(nóng)藥。此后，以乙酸乙酯與己烷以3∶7混合的20ml溶劑展開，洗提硅膠吸附的農(nóng)藥。收集并減壓干燥該展開的2種混合溶劑，蒸餾掉溶劑。該減壓干燥后的殘余物再溶解至12.5mL包含0.02MMes緩沖液(pH6.0)的溶液中。(步驟2-3)。
從上述轉(zhuǎn)溶后的12.5mL溶液取2mL，與包含0.02M Mes緩沖液(pH6.0)(2-嗎啉代乙磺酸)組成的溶液8mL組合，成為10mL作為被檢試樣。在該被檢試樣中添加各種濃度的丙硫克百威(即克百威衍生物)(步驟3-1)。
在前述被檢試樣中經(jīng)還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶對丙硫克百威向克百威進行轉(zhuǎn)化之前，添加對金屬離子具有較高配合物生成能力的螯合劑EDTA，其在該被檢試樣中的濃度為0.5mM，緩和了進行該轉(zhuǎn)化時在該被檢試樣中含有的有害物質(zhì)即金屬離子的影響。此后，添加以在該被檢試樣中的濃度計為5×10-5M的還原型谷胱甘肽和以在該被檢試樣中的濃度計為0.025U/ml的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，放置30分鐘以上，由丙硫克百威向克百威進行轉(zhuǎn)化(步驟3-2)。
接著，在前述放置后的被檢試樣中添加與實施例1的情形相同的溶液、膽堿酯酶、膽堿氧化酶，以放置60分鐘以上的方式進行接觸(步驟3-3)。
此后，向為了接觸而放置后的前述被檢試樣中添加與實施例1相同的乙酰膽堿，測定生成的過氧化氫。對照比較沒有添加實施例1的農(nóng)藥的溶液，對添加各種濃度丙硫克百威的被檢試樣中的過氧化氫產(chǎn)生的信號進行比較。在被檢試樣(糙米)中丙硫克百威的標準曲線如圖5所示。
圖5以橫軸為農(nóng)藥濃度，以縱軸為抑制信號，○符號是與前述實施例1相同的方法制作的丙硫克百威標樣經(jīng)還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化后的標準曲線，●符號是對在糙米中添加濃度為20ppb的丙硫克百威回收后的被檢試樣進一步添加各種濃度的丙硫克百威，經(jīng)還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化后的標準曲線。通過圖5可知，由于●的斜率和○的斜率相同，可以在被檢試樣(糙米)中進行衍生化。另外，由于●的標準曲線與橫軸的交點大致為-20ppb，可以確定粉碎后立刻添加的丙硫克百威后得到回收。因此可知，被檢試樣(糙米)中丙硫克百威的分析，即使相對于0.2ppm殘留農(nóng)藥基準值，也可以足夠的檢測靈敏度檢測。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以應(yīng)用于殘留于米等谷物的殘留農(nóng)藥檢測，或殘留于蔬菜或水果等農(nóng)產(chǎn)品的殘留農(nóng)藥檢測。


圖1表示克百威衍生物向克百威衍生化，以及緩和作為衍生妨害物的金屬離子的影響的反應(yīng)的示意圖。
圖2丁硫克百威衍生化的步驟圖。
圖3經(jīng)還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化的丁硫克百威的標準曲線。
圖4對糙米進行丙硫克百威分析的步驟圖。
圖5被檢試樣(糙米)中丙硫克百威的標準曲線。
1克百威衍生物(Cf-S-R)2還原型谷胱甘肽(GSH)3谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)4克百威(Cf)5氧化型谷胱甘肽(GS-S-R)6金屬離子(Mn+)7還原型谷胱甘肽與金屬離子的反應(yīng)物(GSM)8螯合劑(L)9金屬離子和螯合劑的配合物(Mn+·L)
權(quán)利要求
1.一種殘留農(nóng)藥分析方法，其特征在于，對作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的新型體系的克百威衍生物或滅多威衍生物，以還原型谷胱甘肽作為反應(yīng)底物并以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶為其催化劑與之作用，衍生出膽堿酯酶抑制作用較大的物質(zhì)，將該衍生化反應(yīng)生成的物質(zhì)與膽堿酯酶反應(yīng)，由變化的膽堿酯酶活性檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
2.上述權(quán)利要求1記載的殘留農(nóng)藥分析方法，其中為了緩和妨礙衍生化反應(yīng)的金屬離子的影響，在被檢試樣中添加對金屬離子具有較高配合物生成能力的螯合劑，然后檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。
3.上述權(quán)利要求1或2記載的方法，其中克百威衍生物是丁硫克百威、呋線威或丙硫克百威。
4.上述權(quán)利要求1或2記載的方法，其中滅多威衍生物是硫雙威或棉鈴?fù)?br> 5.上述權(quán)利要求2記載的方法，其中螯合劑選自多氨基羧酸類以及羥基羧酸類中的至少一種。
6.上述權(quán)利要求2記載的方法，其中螯合劑是EDTA或檸檬酸。
7.上述權(quán)利要求1或2記載的方法，其中被檢試樣是農(nóng)產(chǎn)品。
8.上述權(quán)利要求1或2記載的方法，其中被檢試樣是米，蔬菜或水果。
9.上述權(quán)利要求1或2記載的方法，其中被檢試樣是糙米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殘留農(nóng)藥分析方法，其特征在于，對作為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的新型體系的克百威衍生物或滅多威衍生物，以還原型谷胱甘肽作為反應(yīng)底物并以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶為其催化劑與之作用，衍生出膽堿酯酶抑制作用較大的物質(zhì)，將該衍生化反應(yīng)生成的物質(zhì)與膽堿酯酶反應(yīng)，由變化的膽堿酯酶活性檢測在被檢試樣中含有的新型體系的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。本發(fā)明可以應(yīng)用于殘留于米等谷物的殘留農(nóng)藥檢測，或殘留于蔬菜或水果等農(nóng)產(chǎn)品的殘留農(nóng)藥檢測。
文檔編號G01N33/15GK1680588SQ20051006974
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者江盛貴之, 梶山剛志郎, 加藤純一 申請人:株式會社佐竹, 加藤純一