專利名稱：抗膽堿能m3型受體抗體測定在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗抗膽堿能M3型受體抗體作為抗原在檢測干燥綜合征及其它疾病中的應(yīng)用。
一、技術(shù)背景干燥綜合征(Sjgren’s Syndrome，SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為特征的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現(xiàn)為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴系統(tǒng)、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區(qū)分布差異，可發(fā)生于任何年齡，以40-60歲，特別是絕經(jīng)后的女性居多，男女之比為1∶9。在我國的患病率為0.77％，在老年人群中的患病率高達4％，全國有近1000萬患者。
近年來，人們對干燥綜合征的病因及發(fā)病機理進行了大量研究，但至今無突破性進展。目前在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)理想的血清學(xué)診斷方法，除臨床癥狀外，主要靠唇腺活檢及腮腺造影等有創(chuàng)檢查明確診斷，由于患者的醫(yī)從性差，常常延誤診斷，并喪失最佳的治療時機。因此，尋找一種敏感性強、特異性高而又簡便易行的檢測方法，對干燥綜合征的診斷及治療具有重要意義。為此，本發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)了可以用于干燥綜合征診斷的血清學(xué)特異性抗原——抗膽堿能M3型受體，該蛋白可以特異性的識別干燥綜合征患者血清中的特異性抗體——抗膽堿能M3型受體抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學(xué)檢測方法(如免疫印跡法)檢測出來，并且具有很高的敏感性和特異性。
二、發(fā)明概述本發(fā)明目的是提供有效檢測干燥綜合征特異性抗原的檢測方法，并應(yīng)用于干燥綜合征的診斷。
膽堿能M3型受體是一種主要分布于外分泌腺及平滑肌的膽堿能受體，也是一種G-蛋白偶聯(lián)受體。它結(jié)合膽堿能神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿，激活磷脂酶C、A2、D通路，電壓依賴性鈣通道開放，使鈣內(nèi)流增加，細胞內(nèi)鈣的濃度升高，cAMP增加，引起腺體分泌和平滑肌收縮。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體可以識別并激活M3型受體，該抗體與M3型受體的長期結(jié)合，不僅降低膽堿能M3型受體對乙酰膽堿的敏感性，還造成M3型受體的進行性破壞，導(dǎo)致受體的降解，進而影響信號傳導(dǎo)通路、干擾水通道蛋白的分布，致使SS患者出現(xiàn)腺體分泌減少、膀胱逼尿肌收縮力減弱等膽堿能神經(jīng)功能異常的臨床表現(xiàn)。
1996年，Bacman等報道[1]了SS患者血清中存在著抗膽堿能M3型受體抗體，并進一步指出該抗體對于SS的診斷具有較高的特異性。但是至今為止，國內(nèi)尚沒有開展抗膽堿能M3型受體抗體與干燥綜合征關(guān)系的研究，國外也沒有這方面大樣本的臨床研究，而且國內(nèi)、外都沒有建立切實可行的該抗體的臨床檢測方法。
以往人們認為膽堿能M3型受體的抗原表位位于其細胞外第二環(huán)，但是，發(fā)現(xiàn)使用M3型受體細胞外第二環(huán)多肽檢測SS患者血清中抗膽堿能M3型受體抗體方法的重復(fù)性不佳[2]。一些研究提出膽堿能M3型受體可能為構(gòu)象型抗原表位[3]，因而提示抗膽堿能M3型受體抗體很可能識別的是M3型受體蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。因而本研究選擇真核表達的重組膽堿能M3型受體蛋白作為抗原基質(zhì)，通過免疫印跡(Western Blot)的方法檢測SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體。該蛋白是一種用于檢測受體與配體結(jié)合能力的蛋白，本研究在國內(nèi)外首次證實該蛋白可以用于檢測抗膽堿能M3型受體抗體。并評價該抗體對SS診斷的敏感性和特異性，了解該抗體與SS臨床表現(xiàn)及其它自身抗體的關(guān)系。
本發(fā)明的抗膽堿能M3型受體抗體可以通過多種方法(例如免疫印跡法、斑點法、酶聯(lián)免疫吸附法、金標(biāo)記法等)對干燥綜合征患者進行檢測，其檢測方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。同時，檢測的抗膽堿能M3型受體抗體類型可為IgG型、IgA型或其他類型的免疫球蛋白。
本發(fā)明所述的膽堿能M3型受體可以用本領(lǐng)域人員所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表達純化法等。


圖1.免疫印記法檢測原理。首先將膽堿能M3型受體進行Tris-HCL SDS-PAGE，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，脫脂牛奶封閉過夜。將其與待測血清一起孵育，如果血清中存在抗膽堿能M3型受體抗體，該抗體就會與硝酸纖維膜上的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。將未結(jié)合的抗體及其它成份沖洗去除后，與生物素標(biāo)記的山羊抗人IgG共同孵育。再洗去未結(jié)合的成份，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素一起溫育。洗去未結(jié)合的成份，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。若血清中含有抗膽堿能M3型受體抗體，在硝酸纖維膜上抗原所在特定位置上顯示出顏色，且抗體滴度越高顏色越深。
圖2.重組膽堿能M3型受體蛋白電泳。蛋白純度為95％。10％ Tris-HCL SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R250染色。顯示分子量為70kD的重組膽堿能M3型受體蛋白。
圖3.免疫印跡法(Western Blot)檢測抗膽堿能M3型受體抗體。檢測結(jié)果顯示已知的抗膽堿能M3型受體的多抗與重組膽堿能M3型受體蛋白發(fā)生了特定的抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)特異性陽性條帶(A)；而陰性對照則無該條帶(B)。
圖4.抗膽堿能M3型受體抗體與SS患者血清及對照組血清反應(yīng)。結(jié)果顯示山羊抗人抗膽堿能M3型受體多抗(膜條1)與抗膽堿能M3型受體反應(yīng)呈陽性；干燥綜合征患者(膜條2-12)血清與重組膽堿能M3型受體蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)陽性條帶；而疾病對照組(條帶13)及正常對照(條帶14)組與該蛋白無反應(yīng)，無條帶。
圖5.抗膽堿能M3型受體抗體在不同風(fēng)濕性疾病的陽性率。應(yīng)用免疫印跡法檢測80例SS患者，其中67例抗膽堿能M3型受體抗體陽性，陽性率為83.8％；在40例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者中無陽性出現(xiàn)；在40例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中僅2例陽性，陽性率為5％；40名正常對照組中，有1例陽性。SS組抗膽堿能M3型受體抗體陽性率與疾病對照組及正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)?？鼓憠A能M3型受體抗體在SS患者的敏感性為83.8％，特異性為97.5％。
圖6.抗膽堿能M3型受體抗體與其他自身抗體敏感性及特異性比較。在80例SS患者中對各種抗體的比較可以看出，抗膽堿能M3型受體抗體的敏感性高于抗SSA、SSB及抗α-胞襯蛋白抗體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)；抗膽堿能M3型受體抗體在診斷SS的特異性方面，優(yōu)于抗SSA和抗SSB，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01；P＜0.05)；抗膽堿能M3型受體抗體的特異性高于抗α-胞襯蛋白抗體，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
圖7.抗膽堿能M3型受體抗體在其他抗體陰性的SS患者的陽性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者中，72％-81％出現(xiàn)抗膽堿能M3型受體抗體陽性。特別是在抗SSA抗體陰性的SS患者中，抗膽堿能M3型受體抗體的陽性率達80.0％，對SS的診斷中更有意義。
圖8.抗膽堿能M3型受體抗體在其他抗體陽性的SS患者的陽性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞襯蛋白抗體陽性的SS患者中，出現(xiàn)抗膽堿能M3型受體抗體陽性率分別為87.5％、88.2％、85.4％。
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但下列實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1膽堿能M3型受體的鑒定膽堿能M3型受體是一種主要分布于外分泌腺及平滑肌的膽堿能受體，也是一種G-蛋白偶聯(lián)受體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體可以識別并激活M3型受體。以往人們認為膽堿能M3型受體的抗原表位位于其細胞外第二環(huán)，但是，發(fā)現(xiàn)使用M3型受體細胞外第二環(huán)多肽檢測SS患者血清中抗膽堿能M3型受體抗體方法的重復(fù)性不佳[8]。一些研究提出膽堿能M3型受體可能為構(gòu)象型抗原表位[28]，因而提示抗膽堿能M3型受體抗體很可能識別的是M3型受體蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。因而本研究選擇真核表達的重組膽堿能M3型受體蛋白作為抗原基質(zhì)，通過免疫印跡(Western Blot)的方法檢測SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體。該蛋白是一種用于檢測受體與配體結(jié)合能力的蛋白，本研究在國內(nèi)外首次證實該蛋白可以用于檢測抗膽堿能M3型受體抗體。
本研究從從sigma公司購進sf9細胞真核表達的人膽堿能M3型受體蛋白，序列為gggcaatggc......agcaaaaaaa aaaaaaa，(引自Gene bank gi54792120)通過SDS-PAGE及免疫印跡法對其進行鑒定。
將購得的蛋白進行SDS-PAGE，并進行凝膠染色，結(jié)果在70KD處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期一致。(見圖2)用抗膽堿能M3型受體多抗與重組膽堿能M3型受體蛋白進行免疫印跡法檢測，結(jié)果出現(xiàn)了陽性條帶，而陰性對照組無條帶。(見圖3)。
由此說明抗膽堿能M3型受體多抗可與重組膽堿能M3型受體結(jié)合，可以嘗試應(yīng)用與檢測SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體。
實施例2干燥綜合征患者和對照組血清中抗膽堿能M3型受體抗體的檢測采用本研究建立的免疫印跡法(即Western Blot)檢測干燥綜合征(SS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者和正常對照血清中的抗膽堿能M3型受體抗體，以評價該抗體在各種疾病中的分布。
首先將抗膽堿能M3型受體進行蛋白SDS-PAGE，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，經(jīng)脫脂牛奶封閉過夜。將其與待測血清一起進行溫育，如果血清中存在抗膽堿能M3型受體抗體，該抗體就會與硝酸纖維膜上的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。將未結(jié)合的抗體及其它成分沖洗干凈后，與加入生物素標(biāo)記的山羊抗人IgG一起孵育，洗去未結(jié)合的成分后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素一起溫育，再次洗去未結(jié)合的成分，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，若血清中含有抗膽堿能M3型受體抗體，則會在硝酸纖維膜的特定位置顯示出顏色，且抗體滴度越高顏色越深。檢測原理示意圖見圖1。
本研究共檢測80例SS、80例其他風(fēng)濕性疾病患者及40例正常人血清中的抗膽堿能M3型受體抗體。檢測結(jié)果在硝酸纖維膜膜的特定位置出現(xiàn)肉眼可見的棕色條帶的為陽性(圖4)。
本實施例主要通過以下幾個方面闡明本發(fā)明抗膽堿能M3型受體抗體在干燥綜合征患者診斷中的意義1.抗膽堿能M3型受體抗體陽性率在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人的比較。
本研究用免疫印跡法檢測了抗膽堿能M3型受體抗體在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人的陽性率(表1，圖5)。結(jié)果顯示，抗膽堿能M3型受體抗體在干燥綜合征的陽性率顯著高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和正常人。
表1.抗膽堿能M3型受體抗體在不同風(fēng)濕性疾病的陽性率

*SS患者的抗膽堿能M3型受體抗體與其他風(fēng)濕性疾病及正常對照組陽性率比較P均＜0.012.抗膽堿能M3型受體抗體與其它干燥綜合征特異性抗體的敏感性和特異性比較。
在80例SS患者中對各種抗體的比較可以看出，抗膽堿能M3型受體抗體的敏感性高于抗SSA、SSB及抗α-胞襯蛋白抗體，具有顯著的差異(p＜0.01)，而對診斷SS特異性，抗膽堿能M3型受體抗體與抗SSA、SSB比較，差異有顯著性(P＜0.01；P＜0.05)；雖然抗膽堿能M3型受體抗體的特異性高于抗α-胞襯蛋白抗體，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表2、圖6)。
表2 SS患者血清抗膽堿能M3型受體抗體與其他自身抗體的敏感性和特異性比較

注*抗膽堿能M3型受體抗體的敏感性和特異性均明顯高于其他抗體，P＜0.01；3.抗膽堿能M3型受體抗體對血清陰性SS患者的意義抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體是目前干燥綜合征較為特異的實驗室指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)在抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者血清中可以檢測到抗膽堿能M3型受體抗體，在抗SSA、抗SSB、α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者血清中抗膽堿能M3型受體抗體陽性率分別為80.0％、82.5％及81.2％，說明抗膽堿能M3型受體抗體的檢測對于抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者的診斷具有重要意義(見表3、圖7)。
表3.抗膽堿能M3型受體抗體在其他抗體陰性的SS患者的陽性率

4.抗膽堿能M3型受體抗體對其他抗體陽性SS患者的意義本研究結(jié)果顯示抗膽堿能M3型受體抗體在抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陽性的SS患者血清中的陽性率分別為87.5％、88.2％及85.4％，說明該抗體與臨床上用于檢測SS的抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體具有很好的一致性，可能是一種新的診斷SS的抗體(表4、圖8)。
表4.抗膽堿能M3型受體抗體在其他抗體陽性的SS患者的陽性率

4、抗膽堿能M3型受體抗體與80例SS住院患者臨床癥狀和實驗室指標(biāo)的關(guān)系本研究結(jié)果顯示，抗膽堿能M3型受體抗體陽性患者的口干、眼干、臟器受累的發(fā)生率低于抗膽堿能M3型受體抗體陰性組，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)?？鼓憠A能M3型受體抗體陽性組ANA、RF的陽性率和IgG、IgA及ESR升高的發(fā)生率高于抗膽堿能M3型受體抗體陰性組，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。此外，抗膽堿能M3型受體抗體陽性組的67例SS患者與該抗體陰性組的13例SS患者在年齡及病程上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
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1.具有膽堿能M3型受體的氨基酸、多肽類似物及蛋白。
2.含權(quán)利要求1的膽堿能M3型受體或其類似物的診斷試劑盒。
3.含權(quán)利要求1的膽堿能M3型受體或其類似物用于免疫印跡法(或使用其它膜條，如硝酸纖維膜或醋酸纖維膜等作為介質(zhì)來包被抗原的印跡法)、斑點法、ELISA法和金標(biāo)法檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種膽堿能M3型受體及其類似物用于干燥綜合征的檢測。這種蛋白可特異性的結(jié)合干燥綜合征患者體內(nèi)的特異性抗體，具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號G01N33/53GK1896101SQ20051008307
公開日2007年1月17日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月14日
發(fā)明者栗占國 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院