專利名稱：檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器及其批量生產(chǎn)的制作方法以及檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)是體內(nèi)活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨酶之一，它廣泛分布在人體的各種組織器官內(nèi)，尤以肝臟含量最多，是心臟、肌肉、腎臟的3倍，將近血清的3千倍。在肝臟等臟器受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GPT釋入血液，使血液內(nèi)GPT的活力增高。所以血液中GPT升高幾乎總是由肝病引起的，血液中的GPT通常被用作判斷肝功能是否正常的重要指標(biāo)。目前，血液中的GPT主要在大型血液生化分析儀上進(jìn)行，由于需要使用特殊裝置，測定所需要的血液較多，時(shí)間較長，價(jià)格昂貴，只適合在大型醫(yī)院進(jìn)行。
利用酶的特異性識(shí)別待測物而制作成可供家庭和醫(yī)院中一次性使用的快速生物傳感器，具有批量制作工藝簡單，成本低廉，測試時(shí)間短，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，因此特別適合工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。目前，這種生物傳感器已經(jīng)商品化，其中用于血液中葡萄糖的檢測最為成熟。例如，在絲網(wǎng)印刷電極上固定包括葡萄糖氧化酶在內(nèi)的一些干試劑被血液溶解后產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，通過檢測儀表檢測即可以獲得血液中葡萄糖的濃度，但是絲網(wǎng)印刷技術(shù)生產(chǎn)的生物傳感器，其工藝具有一定的局限性，包括原料的不確定性(如碳、銀漿，網(wǎng)板等)，生產(chǎn)效率偏低，生產(chǎn)過程中容易受到污染等，因此，很可能影響到產(chǎn)品的一致性和準(zhǔn)確性，同時(shí)也制約了生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大。而且，由于葡萄糖在血液中的濃度相對比較高，一般在幾個(gè)毫摩爾到幾十個(gè)毫摩爾，因此，響應(yīng)電流相對比較大，測試也較為容易。
目前，適合于家庭保健、運(yùn)動(dòng)員的測試、血液安全篩查等檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器具有廣闊的應(yīng)用市場。由于血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的濃度相對較低，一般在幾十個(gè)單位，基于上述技術(shù)的生物傳感器存在響應(yīng)電流小(pA-nA)，響應(yīng)時(shí)間較長(10分鐘，甚至更長)，靈敏度較低等缺點(diǎn)。小電流檢測起來比較困難，特別是采用便攜式儀表，很容易受到外界的干擾，從而影響到檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。由于響應(yīng)時(shí)間比較長，血液的凝結(jié)也會(huì)給測試帶來一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速定量測定血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)濃度的生物傳感器。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是提供一種檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，用于快速檢測血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶，該傳感器是用微電子機(jī)械加工工藝制作的；其在一種絕緣基片上形成金屬平面薄膜電極，平面薄膜電極的一端為插入檢測儀器的接入端，在平面薄膜電極的另一端上粘貼帶有圖案的隔離片，隔離片上有微反應(yīng)溝道，微反應(yīng)溝道內(nèi)絕緣基片上的金屬平面薄膜電極構(gòu)成傳感器電極系統(tǒng)；微反應(yīng)溝道里電極系統(tǒng)的工作電極上吸附一層用于反應(yīng)的干試劑；微反應(yīng)溝道上方粘貼另外一層絕緣基片，使微反應(yīng)溝道形成一個(gè)微反應(yīng)腔體，另外一層絕緣基片相對于溝道一面具有親水性物質(zhì)，因此樣品很容易進(jìn)入微反應(yīng)腔體。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述絕緣基片，是從聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯對苯二甲酸鹽的組成中任選一種聚合物制成，這些材料是片材或者是卷材。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述絕緣基片上的金屬平面薄膜電極，是采用濺射、蒸鍍的金屬薄膜工藝制作。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述金屬平面薄膜電極，其材料為金、銀、鉑、鈀中任選一種貴金屬構(gòu)成。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述隔離片，是從聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯對苯二甲酸鹽的組成中任選一種聚合物制成，這些材料是片材或者是卷材，且材料雙面帶膠貼片；隔離片上的圖案是通過沖壓或雕刻的方式獲得。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述全血丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶檢測試條的反應(yīng)試劑，由緩沖液、電子媒介體、生物酶、表面活性劑、親水高分子和用于保持酶活性的穩(wěn)定劑組成。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述電子媒介體是氧化還原聚合物，鐵氰化鉀、對苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、beta-萘酚-4-磺酸鉀、亞甲基藍(lán)、二茂鐵及其衍生物。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述親水高分子是羧甲基纖維素(CMC)，羥基乙基纖維素(HEC)，羥基丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素和乙基纖維素、乙基羥基乙基纖維素、氨基甲基乙基纖維素、聚乙烯基毗咯烷酮、聚乙烯酸、聚賴氨酸和聚氨基酸、聚苯乙烯碘酸、乳膠、丙烯酸或其鹽、甲基丙烯酸或其鹽、淀粉或其衍生物、馬來酐或其鹽類、明膠、瓊脂糖凝膠、樹膠。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述的GPT反應(yīng)試劑，是L-丙氨酸或α-酮戊二酸鹽，為通過轉(zhuǎn)氨酶GPT的酶促反應(yīng)生成谷氨酸或丙酮酸。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述生物酶是谷氨酸氧化酶(GLOD)或丙酮酸氧化酶(PyOD)中的一種。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述生物酶，為每平方厘米0.01～200U活性單位。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述微反應(yīng)溝道上方粘貼另外一層絕緣基片，是在其相對于溝道一面涂附一層親水層。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其可以用于全血、血清、尿液的流體介質(zhì)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的快速測定。
所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其所述用于反應(yīng)的干試劑，被溶液重新溶解后，其各組分的濃度為L-丙氨酸、濃度為0.1～0.5M；α-酮戊二酸鹽、濃度為1.0～20.0mM；谷氨酸酶氧化酶、濃度為0.0～200U；海藻酸鈉、濃度為1.0～10mM；羧甲基纖維素、濃度為1.0～20mg。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器試條的優(yōu)點(diǎn)在于，利用金屬薄膜沉積工藝制作具有精確三維結(jié)構(gòu)的貴金屬電極不僅確保了電極表面的一致性，而且使生產(chǎn)流程進(jìn)一步簡化，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。通過在電極的表面修飾一層，具有氧化還原性質(zhì)的聚合物薄膜，一方面可以降低背景電流，另一方面，也可以作為電子媒介體傳遞電子，降低試條的工作電壓，最大限度地消除了一些電化學(xué)活性物質(zhì)如尿酸、抗壞血酸的干擾。而且這種聚合物具有很高的電子傳遞效率，從而增大了電流響應(yīng)信號(hào)，使得檢測血液中較低GPT的濃度成為可能，同時(shí)也降低了后續(xù)檢測電路的難度，提高檢測儀表的可靠性。


圖1為本發(fā)明檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器的結(jié)構(gòu)分解示意圖；圖2為本發(fā)明檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器的局部剖視圖；圖3為本發(fā)明傳感器對緩沖溶液中的GPT響應(yīng)的校準(zhǔn)曲線；圖4為本發(fā)明傳感器對血清中的GPT響應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的反應(yīng)原理
從上述反應(yīng)式(1)中，血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT) 催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸鹽反應(yīng)生成丙酮酸和L-谷氨酸。反應(yīng)式(2)中L-谷氨酸在谷氨酸氧化酶的催化下產(chǎn)生過氧化氫。反應(yīng)式(3)中丙酮酸在丙酮酸氧化酶的催化下也可以產(chǎn)生過氧化氫。反應(yīng)式(4)中過氧化氫將電極表面固定的過氧化物酶(HRP)氧化，被氧化的HRP又被聚合物膜中的金屬鋨重新還原，被氧化的鋨在電極上獲得電子被還原，隨之產(chǎn)生的電流正比過氧化氫的濃度，因此，可以通過檢測反應(yīng)式(1)中生成的丙酮酸或L-谷氨酸的經(jīng)過氧化生成的過氧化氫的濃度即可以測定GPT的濃度。不過，丙酮酸氧化時(shí)需要額外的試劑如TPP和Mg2+，且丙酮酸氧化酶沒有谷氨酸氧化酶穩(wěn)定。
本發(fā)明采用了微電子機(jī)械(MEMS)加工工藝，批量制作檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器。
參照附圖可以很好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。優(yōu)選實(shí)施例只是為了說明的技術(shù)內(nèi)容，而不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例一如圖1和圖2所示，本發(fā)明的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，包括絕緣基片10，為0.5mm厚的聚碳酸酯片，在該基片10上依靠靜電力粘貼一層保護(hù)性塑料薄膜，利用一臺(tái)高精度刻膜機(jī)雕刻出所需要的薄膜電極的遮蔽掩膜的圖形，通過金屬薄膜沉積工藝，在此基片10上沉積出金薄膜，厚度約為100nm，去掉遮蔽掩膜即可形成金屬平面薄膜電極，薄膜電極的一端作為插入檢測儀器的接入端接入端7、接入端8和接入端9，在另一端的電極表面上粘貼一個(gè)厚度為0.125mm隔離片4，隔離片4上刻有一個(gè)反應(yīng)溝道5(4.0mm×8.0mm)，在反應(yīng)溝道5里的電極系統(tǒng)分別為參比電極1、工作電極2和對電極3，面積均為2.0mm×2.0mm。在工作電極2表面修飾氧化還原聚合物(Redox Polymer，BAS)后，再加入反應(yīng)試劑，干燥后形成一層干試劑層12。
干試劑層12含有谷氨酸酶氧化酶、用于酶活性保持的穩(wěn)定劑和親水高分子等物質(zhì)。具體是在1.0ml的pH值為7.4的0.01M磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉的緩沖液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2單位的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸鈉，10mg羧甲基纖維素(CMC)溶解制成的混合溶液，將這種混合溶液滴在圖1所示的電極系統(tǒng)的反應(yīng)溝道5里，在35℃的恒溫干燥箱中干燥十分鐘。
待反應(yīng)試劑干燥后，再在反應(yīng)溝道5上粘貼一層一面具有親水性層的絕緣基片6形成一個(gè)兩端均敞口的類似毛細(xì)管的微腔體11，反應(yīng)在微腔體11內(nèi)完成。當(dāng)干燥的反應(yīng)試劑被溶液重新溶解后，其各組分的濃度如表1所示表1、試劑組分配方

實(shí)施例二在0.5ml的離心管中加入18μl的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)反應(yīng)試劑。試劑中含有pH值為7.4的0.01M磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉的緩沖液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2U/ml的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸鈉，10mg羧甲基纖維素(CMC)溶解制成的混合溶液。再加入2μl不同濃度的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)溶液。待反應(yīng)2分鐘后，將離心管里的溶液滴加到傳感器的反應(yīng)溝道5里的電極上，在工作電極2和參比電極1兩端加上0.0V電壓，60秒后讀取反應(yīng)的電流。每個(gè)GPT濃度用不同的傳感器測定三次。
傳感器采用上述制作方法，但是沒有加入反應(yīng)試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，在濃度為20～1000U/l的GPT，響應(yīng)信號(hào)與濃度有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99。
實(shí)施例三在0.5ml的離心管中加入20μl的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)反應(yīng)試劑。試劑中含有pH值為7.4的0.01M磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉的緩沖液中含有0.1％的曲拉通(TX-100)，2U/ml的谷氨酸酶氧化酶，10mM海藻酸鈉，10mg羧甲基纖維素(CMC)溶解制成的混合溶液。在35℃的恒溫干燥箱中干燥24小時(shí)。取人血清樣品20μl加入含有干試劑的離心管中，充分?jǐn)嚢?，反?yīng)2分鐘后，將離心管里的溶液滴加到傳感器的反應(yīng)溝道5里的電極上，在工作電極2和參比電極1兩端加上0.0V電壓，60秒后讀取反應(yīng)的電流。響應(yīng)曲線如圖4。3U/l的GPT響應(yīng)電流為39.8nA，而112U/l的GPT響應(yīng)電流為104.9nA，由此得出，傳感器可以用來檢測人血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)濃度。
權(quán)利要求
1.一種檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，用于快速檢測血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶，該傳感器是用微電子機(jī)械加工工藝制作的；其特征在于，在一種絕緣基片上形成金屬平面薄膜電極，平面薄膜電極的一端為插入檢測儀器的接入端，在平面薄膜電極的另一端上粘貼帶有圖案的隔離片，隔離片上有微反應(yīng)溝道，微反應(yīng)溝道內(nèi)絕緣基片上的金屬平面薄膜電極構(gòu)成傳感器電極系統(tǒng)；微反應(yīng)溝道里電極系統(tǒng)的工作電極上吸附一層用于反應(yīng)的干試劑；微反應(yīng)溝道上方粘貼另外一層絕緣基片，使微反應(yīng)溝道形成一個(gè)微反應(yīng)腔體，另外一層絕緣基片相對于溝道一面具有親水性物質(zhì)，因此樣品很容易進(jìn)入微反應(yīng)腔體。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述絕緣基片，是從聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯對苯二甲酸鹽的組成中任選一種聚合物制成，這些材料是片材或者是卷材。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述絕緣基片上的金屬平面薄膜電極，是采用濺射、蒸鍍的金屬薄膜工藝制作。
4.如權(quán)利要求1或3所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述金屬平面薄膜電極，其材料為金、銀、鉑、鈀中任選一種貴金屬構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述隔離片，是從聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯，聚乙烯對苯二甲酸鹽的組成中任選一種聚合物制成，這些材料是片材或者是卷材，且材料雙面帶膠貼片；隔離片上的圖案是通過沖壓或雕刻的方式獲得。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述用于反應(yīng)的干試劑，由緩沖液、電子媒介體、生物酶、GPT反應(yīng)試劑、表面活性劑、親水高分子和用于保持酶活性的穩(wěn)定劑組成。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述電子媒介體是氧化還原聚合物，鐵氰化鉀、對苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、beta-萘酚-4-磺酸鉀、亞甲基藍(lán)、二茂鐵及其衍生物。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述親水高分子是羧甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素、甲基纖維素和乙基纖維素、乙基羥基乙基纖維素、氨基甲基乙基纖維素、聚乙烯基毗咯烷酮、聚乙烯酸、聚賴氨酸和聚氨基酸、聚苯乙烯碘酸、乳膠、丙烯酸或其鹽、甲基丙烯酸或其鹽、淀粉或其衍生物、馬來酐或其鹽類、明膠、瓊脂糖凝膠、樹膠。
9.如權(quán)利要求6所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述的GPT反應(yīng)試劑，是L-丙氨酸或α-酮戊二酸鹽，為通過轉(zhuǎn)氨酶GPT的酶促反應(yīng)生成谷氨酸或丙酮酸。
10.如權(quán)利要求6所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述生物酶是谷氨酸氧化酶或丙酮酸氧化酶中的一種。
11.如權(quán)利要求6或10所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述生物酶，為每平方厘米0.01～200U活性單位。
12.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述微反應(yīng)溝道上方粘貼另外一層絕緣基片，是在其相對于溝道一面涂附一層親水層。
13.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，可以用于全血、血清、尿液的流體介質(zhì)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的快速測定。
14.如權(quán)利要求1所述的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，其特征在于，所述用于反應(yīng)的干試劑，被溶液重新溶解后，其各組分的濃度為L-丙氨酸、濃度為0.1～0.5M；α-酮戊二酸鹽、濃度為1.0～20.0mM；谷氨酸酶氧化酶、濃度為0.0～200U；海藻酸鈉、濃度為1.0～10mM；羧甲基纖維素、濃度為1.0～20mg。
全文摘要
本發(fā)明是一種檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶的生物傳感器，涉及一種用于快速檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT(glutamate－pyruvate transaminase)又稱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT(alanine aminotransferas)的生物傳感器。本發(fā)明的生物傳感器采用微電子機(jī)械(MEMS)加工工藝生產(chǎn)金屬薄膜電極，以及在薄膜電極上通過在電極的表面修飾一層具有氧化還原性質(zhì)的聚合物薄膜作為電子媒介體，在酶與電極表面間傳遞電子。本發(fā)明的生物傳感器響應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，可以用于流體介質(zhì)中如全血、血清、尿液等的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的快速測定。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1900305SQ20051008529
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者李華清, 蔡新霞, 崔大付, 劉春秀, 姜利英, 郭宗慧 申請人:中國科學(xué)院電子學(xué)研究所