專利名稱：檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
呋喃唑酮(Furazolidone)是一種人工合成的廣譜抗菌藥，藥效穩(wěn)定，能抑制或殺滅多種革蘭氏陽性和陰性細菌，并對某些原蟲、真菌有一定作用。由于高效廉價，呋喃唑酮在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛的應(yīng)用。
但呋喃唑酮在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入會引起各種疾病。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專家委員會的報告，呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物有致癌性，且易產(chǎn)生抗藥菌株，容易引起畸胎。我國在2002年3月由農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中將呋喃唑酮列為禁用藥，呋喃唑酮進入動物體內(nèi)很快會代謝成為呋喃唑酮代謝物且呋喃唑酮代謝物對人體有著與呋喃唑酮同樣的危害。
因此建立一種有效的呋喃唑酮代謝物(AOZ)的檢測方法成為獸藥殘留分析領(lǐng)域中十分緊要的任務(wù)。目前，水產(chǎn)和畜牧上檢測呋喃唑酮殘留常用的方法有液相色譜(LC)及高效液相色譜法(HPLC)等，這些方法樣品前處理復(fù)雜，儀器成本高，操作煩瑣，只適用于樣本的確證分析，而不適用于大量樣本的篩查。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、適用于大量樣本篩查的檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明的檢測原理當包被原為呋喃唑酮代謝物衍生物偶聯(lián)抗原時是將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物(AOZ-BCG)吸附于固相載體上，加入樣本或呋喃唑酮代謝物衍生物標準品，然后加呋喃唑酮代謝物特異性抗體，待測樣品中殘留的呋喃唑酮代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標板上包被的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原競爭呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體。再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃唑酮代謝物殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物的濃度。
包被原為抗抗體時是將抗抗體吸附于固相載體上，加入呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體，再加入呋喃唑酮代謝物衍生物酶標記抗原和樣本或呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液，待測樣本中殘留的呋喃唑酮代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原競爭呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃唑酮代謝物殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物的濃度，與標準溶液顏色比較則可判斷樣品中呋喃唑酮代謝物的濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有(1)包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標記物；(3)呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體；(4)呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物包被抗原是采用混合酸酐法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與甲狀腺蛋白進行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為含有0.8％～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所用的封閉液是含有3％～10％的馬血清和1％惰性蛋白的溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為(1)用包被緩沖液將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與甲狀腺蛋白(BCG)偶聯(lián)物或抗抗體以0.02～0.08μg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100μl已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37℃溫育2h，并4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次15～30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150～200μl封閉液，37℃溫育1～2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原，所用酶可為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，本發(fā)明優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標記物工作液所用的稀釋液為含有50％甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標記物凍結(jié)，亦可長時間保持酶標記物的生物活性)、1％的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記抗抗體的制備步驟為(1)抗抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
(2)辣根過氧化物酶標記抗抗體的制備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯(lián)，采用的方法是過碘酸鈉法，采用過碘酸鈉法使得抗抗體與辣根過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反應(yīng)體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4∶1，制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，因為辣根過氧化物酶在強氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點。這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分子的橋梁，從而降低酶標記物的酶活性。為了解決這個問題，本發(fā)明將傳統(tǒng)的方法進行了改良，即省去了氨基的封閉過程，因為能產(chǎn)生自身氨基連接的氨基實際很少；同時降低辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比至2∶1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶活性的損失也減少。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記抗原是采用活性酯法將標記酶與呋喃唑酮代謝物半抗原進行偶聯(lián)得到。
本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用混合酸酐法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白進行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3％小牛血清和5‰N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，其制備方法如下(1)呋喃唑酮代謝物衍生物單克隆抗體制備的步驟為a.動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原(呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為80～100μg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞；b.細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5～10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；c.細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成1～5×106個/ml的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存，復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射雜交瘤細胞5×105～106個/只，7～10天后采集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存；e.抗體凍干粉可將腹水在37℃環(huán)境下烘干，放入-20℃保存；f.抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體以0.02～0.08μg/ml濃度進行稀釋。
(2)呋喃唑酮代謝物衍生物多克隆抗體制備的步驟為采用新西蘭大白兔作為免疫動物，免疫原(呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為1mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中當標記酶為辣根過氧化物酶時底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉；濃縮洗滌液為含有0.8％～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有50％甲醇和1％小牛血清的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液為六個濃度梯度的呋喃唑酮代謝物衍生物溶液，呋喃唑酮代謝物衍生物稀釋液為含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為a.呋喃唑酮代謝物衍生物標準溶液呋喃唑酮代謝物衍生物系列標準溶液6瓶，濃度為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L，1～3ml/瓶。
b.包被緩沖液pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
c.封閉液含有3％～10％馬血清和1％惰性蛋白的溶液。
d.濃縮洗滌液含有0.8％～1.2％吐溫20，1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M、pH7.4)，為正常使用濃度的15～25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.酶標記物酶標記抗抗體工作液或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原工作液，7～12ml/瓶，1瓶。
f.底物顯色液A液過氧化氫或過氧化脲；g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；h.底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液pH 8.1、含有MgCl20.01％100mmolTris-HCl；i.終止液1～2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，5～8ml/瓶，1瓶。
j.抗體稀釋液pH8.2的0.05mol/L、含有3％小牛血清和5‰N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
k.濃縮復(fù)溶液含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的5～10倍，30～50ml/瓶，1瓶。
本發(fā)明所述檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明中樣品前處理方法為(1)魚蝦、肌肉(豬、牛)取1g的均質(zhì)物(魚蝦/肉樣)，依次加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M的HCL和100ul 10mM的2-硝基苯甲醛，充分振蕩。超聲振蕩1小時后于37℃孵育3小時，分別加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，劇烈振蕩30秒鐘后室溫下(20-25℃)、3000rpm離心，取出2.5ml的乙酸乙酯層蒸干。用1ml的正己烷或正庚烷溶解干燥物，用1ml的復(fù)溶液適當?shù)幕旌?。室?20-25℃)、3000rpm離心，取50ul的下層液體進行分析。
本方法的優(yōu)點為采用超聲振蕩并孵育可使加入的試劑與樣本充分的接觸，向樣本加入1M的HCL加快呋喃唑酮代謝物與蛋白的分解，大大減少了樣本處理的時間。
(2)牛奶取2ml牛奶，將其5000rpm離心10min，除去上層脂肪，取下層進行分析。
本發(fā)明所述檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物殘留的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)檢測方法a.向包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶標板微孔中加標準品溶液或樣品溶液并加入呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后加入酶標記抗抗體，溫育洗板后顯色，終止，用酶標儀測定吸光度值；b.向包被抗抗體的酶標板微孔中加入呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后加入酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原并加入呋喃唑酮代謝物衍生物系列標準品或樣品溶液，溫育洗板后顯色，終止，用酶標儀測定吸光度值。
(3)分析檢測結(jié)果。
(三)有益效果本發(fā)明提供的檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法，樣品前處理過程簡單，費用低廉，且能同時檢測大批樣品。


圖1呋喃唑酮代謝物的檢測標準曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.包被原的合成將呋喃唑酮代謝物采用衍生物法合成呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和甲狀腺蛋白載體蛋白用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到。
b.免疫原的合成將呋喃唑酮代謝物采用衍生物法合成呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和卵清蛋白載體蛋白用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到。
2.呋喃唑酮代謝物衍生物鼠單克隆抗體的制備a.動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。
b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
c.細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成5×106個/ml的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5×106個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
3.呋喃唑酮代謝物衍生物兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7d后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
4.酶標板的制備用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃環(huán)境過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實施例2檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板；(2)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；
(3)呋喃唑酮代謝物衍生物鼠單克隆抗體；(4)呋喃唑酮代謝物標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；(5)底物顯色液A液為過氧化氫，底物顯色液B液為鄰苯二胺；(6)終止液為2mol/L的硫酸緩沖液；(7)濃縮洗滌液為pH 7.4，含有0.8％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(8)抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3％小牛血清和5‰N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液；(9)濃縮復(fù)溶液為含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。
實施例3檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建組建檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶聯(lián)板；(2)用堿性磷酸酯酶標記的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；(3)呋喃唑酮代謝物衍生物兔多克隆抗體；(4)呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；(5)底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液；(6)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；(7)濃縮洗滌液為PH 7.4，含有0.8％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。
實施例4樣品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測1.樣品前處理取1g魚蝦的均質(zhì)物，依次加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M的HCL和100μl10mM的2-硝基苯甲醛，充分振蕩。超聲振蕩1小時后于37℃孵育3小時，分別加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，劇烈振蕩30秒鐘在室溫下(20-25℃)離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm。取出2.5ml的乙酸乙酯層蒸干，用1ml的正己烷溶解干燥物，用1ml的復(fù)溶液適當?shù)幕旌?。在室?20-25℃)、3000rpm離心。用50ul的下層液體進行分析。
2.用試劑盒檢測向呋喃唑酮代謝物衍生物偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標板微孔中加系列標準品或樣本溶液(各2孔)50μl，再加入呋喃唑酮代謝物衍生物抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，20～25℃恒溫箱中反應(yīng)60min。倒出孔中液體，每孔加入250μl濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體100μl，用蓋板膜封板，20～25℃恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌工作。加入底物顯色液A液過氧化氫50μl，再加B液鄰苯二胺50μl，輕輕振蕩混勻，20～25℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液2mol/L硫酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以呋喃唑酮代謝物濃度的半對數(shù)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液中呋喃唑酮代謝物所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃唑酮代謝物的實際濃度。
實施例5樣品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測1.樣品前處理取2ml牛奶，將其置5000rpm離心10min，除去上層脂肪，取下層50μl，試劑盒所提供的復(fù)溶液按1∶40倍稀釋。
2.用試劑盒檢測向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標板微孔中加入呋喃唑酮代謝物衍生物兔多克隆抗體工作液100μl，用蓋板膜封板，20～25℃恒溫箱中反應(yīng)60min，倒出孔中液體，每孔加入250μl濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入細菌提取堿性磷酸酯酶標記的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原50μl，再加入系列標準品或樣本溶液50μl，用蓋板膜封板，20～25℃恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌過程。加入對硝基磷酸鹽緩沖液100μl，輕輕振蕩混勻，20～25℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液2mol/L氫氧化鈉50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以呋喃唑酮代謝物衍生物濃度(μg/L)的半對數(shù)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃唑酮代謝物實際濃度。
實驗例1標準品精密度試驗從每批按照實施例1(4)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出10個微孔，測定0.45μg/L標準溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計算變異系數(shù)CV％，結(jié)果見表1。
表1標準可重復(fù)性試驗(CV％)


結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在3.5％～9.4％之間，符合了變異系數(shù)小于20％的規(guī)定，說明本試劑盒標準品精密度達到了標準。
實驗例2樣本可重復(fù)性試驗以0.5μg/L濃度的呋喃唑酮代謝物對魚蝦、肌肉和牛奶，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表2～3。
表2魚蝦、肌肉樣品可重復(fù)性試驗

表3牛奶樣品可重復(fù)性試驗


結(jié)果表明魚蝦、肌肉樣本變異系數(shù)均低于20％，牛奶樣本的變異系數(shù)均低于20％，符合了變異系數(shù)小于25％的規(guī)定，說明本試劑盒測定樣本的精密度達到了標準。
實驗例3試劑盒的準確度試驗取兩個濃度的呋喃唑酮代謝標準品溶液，分別為0.5μg/kg(L)和1μg/kg(L)，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。
表4試劑盒的準確度


結(jié)果表明魚蝦、肌肉添加的回收率在73.4％～92.8％之間，牛奶添加回收率在73.5％～86.1％之間。
實驗例4試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、呋喃唑酮代謝物添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在2-8℃可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標記物；(3)呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體；(4)呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于呋喃唑酮代謝物衍生物包被抗原是采用混合酸酐法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與甲狀腺蛋白進行偶聯(lián)得到的；包被抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原，所用標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶。
4.如權(quán)利要求1-3之任一所述的試劑盒，其特征在于當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉；濃縮洗滌液為含有0.8％～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有50％甲醇和1％小牛血清的磷酸鹽緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液為六個濃度梯度的呋喃唑酮代謝物衍生物溶液，呋喃唑酮代謝物衍生物稀釋液為含有50％甲醇和1％小牛血清的磷酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求1或5所述的試劑盒，其特征在于呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用混合酸酐法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與卵清蛋白進行偶聯(lián)得到的。
7.一種檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-6之任一所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板，酶標記物，呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體，呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用這種酶聯(lián)免疫試劑盒檢測呋喃唑酮代謝物的方法，它包括以下步驟首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法，樣品前處理過程簡單，費用低廉，且能同時檢測大批樣品。
文檔編號G01N33/543GK1766624SQ200510086768
公開日2006年5月3日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 馮才偉, 萬宇平, 吳小平, 馮才茂, 汪善良, 李軍, 趙正苗, 張照亮, 史為民, 張素霞, 丁雙陽 申請人:北京望爾生物技術(shù)有限公司