專利名稱：一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(cla)組成和含量的方法
技術領域：
本發(fā)明是一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，以氣相色譜技術為核心，主要針對乳脂肪的分離、CLA異構體和十八碳單烯酸異構體的分離和區(qū)分，通過物理方法從牛奶中分離脂肪后進一步利用100米長毛細管柱分離CLA和十八碳單烯酸異構體，屬于分析方法學領域。
背景技術：
CLAs是一組十八碳二烯酸結構和位置異構體的總稱，理論上應該包括14種位置異構體，同時每個位置又有兩種不同幾何異構體(即順式和反式)，因此總共有56種異構體。但CLA的最初來源僅限于具有抗癌作用的反芻動物源性異構體(c9t11CLA)。該物質最初在瘤胃內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)，所以又稱瘤胃酸。
由于CLA具有獨特的生物學功能，因此關于CLA的相關研究已成為近幾年國際研究熱點之一。研究表明，反芻動物產(chǎn)品是人類獲取天然CLA的主要生物來源，但乳脂肪中有400多種不同的脂肪酸，而CLA只是其中的一種具有共軛雙鍵的微量多不飽和脂肪酸。目前乳脂肪經(jīng)典的分析方法是用有機溶劑提取乳脂肪，然后通過酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，隨后進行層析分離(如利用氣相色譜，GC)。但是目前對于牛奶CLA和C18:1(t-C18:1和c-C18:1)異構體的分析還沒有國際一致的標準。
在乳脂肪的提取過程中，使用大量的(至少比樣品多15倍以上)氯仿甲醇和水(8∶4∶3)混合物具有很好的提取效果，但由于氯仿具有毒性，同時脂肪層容易結合到界面處的蛋白層上，因此從安全、實驗室污染和分離效果的角度考慮，不宜利用氯仿批量處理樣品。Forch(1957)和Bligh(1959)的方法是從組織提取脂肪的經(jīng)典方法，而Hara和Radin(1978)建立的利用有正己烷和異丙醇混合物提取乳脂肪的方法目前應用十分廣泛，但該方法步驟繁瑣，每天最多處理40個樣品，當樣品量少時，應用該方法比較適合。如果大批量處理樣品時，該方法的應用受到限制。
利用GC確定揮發(fā)性衍生物是GC分析的一個必要步驟，而FAME具有較高的揮發(fā)性，因此脂肪酸的測定通常將其甲酯化后測定。常用的甲酯化試劑有鹽酸(HCL)、硫酸(H2SO4)、三氟化硼(BF3)和甲醇鈉(NaCH3)。HCL容易準備，適合于所有普通的脂類結構，例如游離脂肪酸、酯、酰胺、甘油脂等。鹽酸催化甲酯化的過程通常在80度能夠反映完全。在該條件下，共軛系統(tǒng)異構化而增加t，t異構體的含量，同時使CLA產(chǎn)生含甲氧基的副產(chǎn)物。降低溫度，如60度或者室溫后雖然降低了異構化的發(fā)生，但甲酯化不完全。硫酸對共軛雙鍵的異構化作用于鹽酸相似，一般在催化異丙脂的過程中應用較廣。利用BF3除了不穩(wěn)定外(即使在冷藏保存時)，其它和HCL具有類似的優(yōu)缺點。因此不利于CLA的分析。利用NaCH3在50度加熱10到15分時能夠很快的形成FAME，當室溫過夜時也能完全的轉化，隨后FAME可以利用正己烷提取。利用堿作催化劑的好處可以避免CLA的異構化，但和一些游離脂肪酸和酰胺類脂不發(fā)生反應。
CLA可經(jīng)酸、堿催化后形成FAME，利用氣相色譜(GC)分析，但由于酸催化可改變共軛稀中雙鍵的構型而容易形成產(chǎn)生人造CLA，故酸催化法一般不常用。堿催化法分析效果較好，當采用甲醇鈉或四甲基胍(TMG)作為酯化劑時，雖不產(chǎn)生異構體和人造CLA，但不能甲基化游離脂肪酸和N一結合脂肪酸(如鞘酯)。目前通過化工堿法催化亞油酸或催化富含亞油酸的油脂而合成的CLA，主要含有兩種異構體，即c9t11C18:2和t10c12C18:2，但同時也形成兩種副產(chǎn)物，即t8，c10-C18:2和c11，t13-C18:2。因此，上述兩種方法均不適宜于分析游離脂肪酸高的樣品。CLA中共軛雙鍵的穩(wěn)定性較亞油酸(LA)低，與花生四稀酸(C20:4，n-6；)和二十二碳六稀酸(C22:6，n-3，DHA)相似，因此，在分析此類脂肪酸前應防止其發(fā)生異構化和氧化。
隨著分析技術的發(fā)展，現(xiàn)已能利用氣相色譜、銀離子交換液相色譜、紅外光譜及電離質譜等進行CLA異構體的定量分析，但這些研究結果并不能完全適用于牛奶脂肪酸樣品的分析上。例如當利用甲醇鈉時，無法分析乳脂肪中的鞘磷脂和游離脂肪酸。但這些方法耗時、工作量大、成本高，而且不利于大批量的處理樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法。該方法可以提高乳脂肪的分離效率和質量和定量分析牛奶中優(yōu)勢CLA和C18:1異構體。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，是從牛奶中通過兩步超速離心分離出乳脂肪，第一步離心力為17000g-18500g，離心溫度控制在4～8℃，離心時間20～40分鐘，第二步離心力為18500g-25000g，離心溫度控制在18～25℃之間，離心時間20～40分鐘；然后通過脂肪酸酯化過程，使分離出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通過氣相色譜檢測牛奶的脂肪酸組成和含量。
其中，第一步離心力應不低于17000g，但要比第二步離心力低，第一步離心力為17000g-18500g；第二步離心力應不低于18500g，但從目前使用的離心機來看，離心機的離心力都不超過25000g，因此，第二步離心力為18500g-25000g。
離心力RCF(g)與離心機轉子的轉速(rpm)的換算關系為RCF(g)＝1.11×10-6(rpm)2r，其中，RCF(g)為離心力；rpm為離心機轉子的轉速；r(mm)為旋轉半徑。因此，離心力RCF(g)可以通過所使用的離心機的旋轉半徑、控制離心機轉子的轉速得到。
乳脂肪中有400多種不同的脂肪酸，而CLA僅其中的一種具有共軛雙鍵的微量多不飽和脂肪酸。目前乳脂肪經(jīng)典的分析方法是用有機溶劑提取乳脂肪，然后通過酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，隨后進行層析分離(如利用氣相色譜，GC)。因此，如果直接將乳脂肪酸的分析方法應用于牛奶CLA的分析過程中會有很多局限性。經(jīng)典方法在乳脂肪的提取過程中，常使用大量的毒性有機溶劑[如氯仿甲醇和水混合物(毒性強)或者正己烷和異丙醇混合物(毒性低)]。而本發(fā)明的方法是采用兩步超速離心分離乳脂肪，對于牛奶CLA和C18:1異構體具有很好的分離效果，本發(fā)明的方法可以提高乳脂肪的分離效率和質量和定量分析牛奶中優(yōu)勢CLA和C18:1異構體。
在本發(fā)明的快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法中，所述的脂肪酸酯化過程是利用酸堿混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，在其甲脂化的過程中，先加2wt％的氫氧化鈉甲醇溶液于分離的乳脂肪中，振蕩后在48-55℃水浴10-20分鐘，然后加入5vt％的鹽酸/甲醇溶液在78-82℃水浴40分鐘-1小時20分鐘后冷卻到室溫。
在本發(fā)明的快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法中，在其甲脂化的過程中，其優(yōu)選的工藝參數(shù)是先加2wt％的氫氧化鈉甲醇溶液于分離的乳脂肪中，振蕩后在50℃水浴15分鐘，然后加入5vt％的鹽酸/甲醇溶液在80℃水浴1小時后冷卻到室溫。
所使用的氫氧化鈉甲醇溶液為2wt％(質量百分比)的氫氧化鈉甲醇溶液；鹽酸/甲醇溶液為5vt％(體積百分比)的鹽酸/甲醇溶液。
脂肪酸的測定通常將其酯化后測定，經(jīng)典方法在脂肪酸酯化的過程中，常單純的使用酸或者堿作為催化劑，容易造成CLA異構體的異構體化(單獨使用酸，如鹽酸、硫酸或三氟化硼)或者不能完全酯化脂肪酸(當單獨使用堿時，如利用甲醇鈉不能酯化游離脂肪酸)。而本發(fā)明的方法是采用利用酸堿混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，可以提高定量分析牛奶中優(yōu)勢CLA和C18:1異構體的準確性。
在本發(fā)明的快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法中，所述的通過氣相色譜檢測牛奶的脂肪酸組成和含量過程，是利用100米長毛細管柱結合二階升溫程序通過氣相色譜儀火焰檢測牛奶的脂肪酸組成和含量，該二階升溫程序是，在68-72℃維持3-5分鐘，然后以12-14℃/分升到175-180℃維持25-30分鐘后，再以3.8-4.2℃/分升溫到210-220℃維持25-35分，程序總共運行75-85分鐘。
在本發(fā)明的二階升溫程序的優(yōu)選工藝參數(shù)是在70℃維持4分鐘，然后以13℃/分升到175℃維持27分鐘后，再以4℃/分升溫到215℃維持25分，程序總共運行75分鐘。
本發(fā)明的優(yōu)點與有益效果在于，一般牛奶在分析脂肪酸組成前應盡可能的抑制脂肪酶和磷酸酶等分解酶的作用，因此常需要在-70度冰柜貯存，這樣限制了樣品的貯存量和處理效率。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過超速離心的方法，每天可以大批的處理牛奶樣品(至少每天可處理300個樣)，分離出乳脂肪后，體積小便于貯存和后續(xù)的分析，也避免了大量使用毒性有機溶劑。同時在甲酯化的過程中，可以選擇出理想內(nèi)標，采用酸堿混合甲酯化的方法，完全有效的催化脂肪酸形成甲基酯，彌補了單獨利用酸或堿催化酯化的不足之處。氣相色譜條件的優(yōu)化，主要包括分離系統(tǒng)和溫度的有機結合，最后借助氣相配置100米極性毛細管柱和二階升溫程序，提高了分析的精度和可靠性。
本發(fā)明的方法可以確定牛奶的脂肪酸組成和含量，尤其對于牛奶CLA和C18:1異構體具有很好的分離效果。本方法與經(jīng)典的參考方法相比，對于乳脂肪酸組成沒有顯著的影響，但彌補了經(jīng)典方法存在耗時、工作量大、環(huán)境污染、成本高和處理效率低缺陷，每天可以處理300個樣品，能極大地提高分析效率。


圖1是四種CLA和C18:1異構體的標準圖譜。
圖2是25種脂肪酸標準物的分離圖譜。
具體實施例方式
針對擬解決的技術問題和制定的技術方案，本發(fā)明具體實施方式
通過實例說明如下。
實施例1標準物的配置在最初CLA上市時，大多數(shù)商品源CLA混合物含有四種主要的異構體，即t8，c10，c9t11，c11，t13和t10，c12CLA，同時在每種異構體中相應的含有少量的c，c和t，t異構體。目前市售的CLA主要含兩種異構體(c9，t11和t10，c12)，同時相應伴隨著兩種微量的c，c和t，t異構體。本申請中主要選用了牛奶含量最高的兩種CLA異構體(即c9t11和t10c12)，同時選用了c9c11和t9t11異構體判斷處理過程對CLA異構化的影響。所有脂肪酸標準物見表1。將每種脂肪酸標準物質利用色譜純正己烷溶解后定容，最終的濃度如表1示。
表1用于牛奶脂肪酸分析的標準物質


實施例2乳脂肪的分離本申請中，利用日立牌高速離心機，首先將牛奶樣品(如果牛奶樣品事先經(jīng)冷凍保存，需在室溫水浴中化凍)在17800×g以上，4～8℃離心30分鐘后，收集上層粗脂肪層約1g于2ml Eppendorf離心管中，在20000×g以上，20～25℃離心20分鐘(注意此時離心后會分成3層，上層為脂肪層；中間為蛋白質、微量脂肪和其它的水溶性物質；下層為水相)，收集上層黃色清亮脂肪層冷凍保存或者直接用于后續(xù)分析。
實施例3脂肪酸的甲酯化定量稱取實例2中分離的乳脂肪(不超過40mg)，加150ul濃度為5mg/ml的C17:0、2mlNaOCH3/Methanol(2質量％)于帶螺蓋的試管中，振蕩后在50℃水浴15分鐘，然后加入2ml鹽酸/甲醇溶液(5體積％)在80℃水浴1小時后冷卻到室溫，加入2ml蒸餾水和6ml正己烷，震蕩，靜止分層或離心分層。吸取上層，在GC下分析檢測。
實施例4毛細管柱選擇目前主要有兩種100米長極性毛細管柱(CP Sil88和SP2560)，本申請采用SP2560(Supelco Inc.，Bellefonte，PA，USA)能夠很好的分離大部分CLA和C18:1異構體，而50米和60米的毛細管柱不宜于分離CLA和C18:1異構體。
實施例5升溫程序本申請采用了二階升溫程序。即在70℃維持4分鐘，然后以13℃/分升到175℃維持27分鐘后，再以4℃/分升溫到215℃維持30分鐘，程序總共運行80分鐘。
實施例6內(nèi)標物質的選擇內(nèi)標選擇的理想條件是待測樣品中不含，與待檢測樣品具有相似的火焰檢測靈明度。牛奶中一些支鏈脂肪酸由于其含量低，如C13:0、C15:0、C17:0、C19:0、C21:0和C23:0?？捎米鲀?nèi)標。但在分析牛奶樣時，由于C19:0的峰和C18:1、C18:2的峰十分接近，而C21:0的峰在CLA異構體之間出現(xiàn)，因此C19:0和C21:0不宜用作內(nèi)標。本申請選用了C17:0作內(nèi)標。同時，樣品處理過程中內(nèi)標應該在甲酯化的那一步加入，便于計算回收率。
實施例7CLA和C18:1異構體的區(qū)分CLA異構體主要在C18:3和C20:1和C20:2之間。利用100m長的毛細管柱分離CLA異構體具有理想的效果，異構體的分離的先后順序是c/t，c/c和t/t異構體，其中c9t11CLA是主要的異構體，占總CLA的75-85％。四種CLA的標準圖譜如圖1示CLA異構體分離的先后順序為c9t11 CLA、t10c12 CLA、c9c11 CLA和t9t11 CLA。
牛奶中總的Tc18:1含量范圍在1-7％，C18:1的峰出現(xiàn)在C18:0和C18:2之間。本申請中應用的幾種C18:1的標準圖譜見圖1，其中出峰的先后順序為t11 C18:1、t12C18:1、c9 C18:1和c12 C18:1。
實施例8牛奶中所有常規(guī)脂肪酸標準物質的分離利用100米長的毛細管柱(SP2560)，采用上述二階升溫程序，對本申請應用的25種脂肪酸進行分析，分離圖譜如圖2示。
實施例9利用該方法與其它分析方法結果比較為了驗證本方法在分析牛奶樣品中的可靠性，本方法與其它報道的方法進行了比較。利用中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧所提供的富CLA生鮮牛奶，按照實例2到實例6的過程操作(每種方法10個重復，其中5個樣品為個體奶牛每日早中晚的混合樣，其余5個樣品為143頭牛全天的混合樣)，不同的分析方法之間每種脂肪酸的顯著性差異利用SAS(9.0)軟件包進行統(tǒng)計分析，結果如表2。
表2不同處理方法對牛奶脂肪酸組成的影響


備注方法1本發(fā)明方法方法2Christ等(1982)方法3Kelly等(1998a)方法4Palmquist(1988)從表2的測定結果可以看出，對于牛奶樣品中CLA及C18:1異構體的分析時，除方法4外，本申請所采用的方法和其它幾種文獻報道分析牛奶肪脂肪酸的參考方法之間沒有顯著的差異。由于方法4中僅采用酸法甲酯化，從CLA的異構體可以看出，c9t11CLA比其它三種方法低，而c9c11CLA和t9t11CLA的含量高于其它三種方法?？梢钥闯?，本申請采用的方法(方法1)在分析大批量樣品十分有效，每天可以處理300個樣品，同時節(jié)省時間、勞動量和有機試劑，即能提高分析效率，又能減少毒性有機溶劑造成的污染。
應用范圍本方法適合于牛奶和不同油脂脂樣品中CLA、C18:1異構體及其它脂肪酸組成和含量的測定，但如果要精確測定牛奶中磷酯的含量時，本方法不宜。
權利要求
1.一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，其特征在于是從牛奶中通過兩步超速離心分離出乳脂肪，第一步離心力為17000g-18500g，離心溫度控制在4～8℃，離心時間20～40分鐘，第二步離心力為18500g-25000g，離心溫度控制在18～25℃之間，離心時間20～40分鐘；然后通過脂肪酸酯化過程，使分離出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通過氣相色譜檢測牛奶的脂肪酸組成和含量。
2.按照權利要求1所述一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，其特征在于，所述的脂肪酸酯化過程是利用酸堿混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，在其甲脂化的過程中，先加2wt％的氫氧化鈉甲醇溶液于分離的乳脂肪中，振蕩后在48-55℃水浴10-20分鐘，然后加入5wt％的鹽酸/甲醇溶液在78-82℃水浴40分鐘-1小時20分鐘后冷卻到室溫。
3.按照權利要求1或2所述一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，其特征在于，所述的通過氣相色譜檢測牛奶的脂肪酸組成和含量過程，是利用100米長毛細管柱結合二階升溫程序通過氣相色譜儀火焰檢測牛奶的脂肪酸組成和含量，該二階升溫程序是，在68-72℃維持3-5分鐘，然后以12-14℃/分升到175-180℃維持25-30分鐘后，再以3.8-4.2℃/分升溫到210-220℃維持25-35分，程序總共運行75-85分鐘。
全文摘要
一種快速檢測牛奶共軛亞油酸(CLA)組成和含量的方法，是從牛奶中通過兩步超速離心分離出乳脂肪，第一步離心力為17000g－18500g，離心溫度控制在4～8℃，離心時間20～40分鐘，第二步離心力為18500g－25000g，離心溫度控制在18～25℃之間，離心時間20～40分鐘；通過脂肪酸酯化過程，使分離出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；通過氣相色譜檢測牛奶的脂肪酸組成和含量。本發(fā)明的方法可以確定牛奶的脂肪酸組成和含量，尤其對于牛奶CLA和C18:1異構體具有很好的分離效果。本方法與經(jīng)典的參考方法相比，對于乳脂肪酸組成沒有顯著的影響，但彌補了經(jīng)典方法存在耗時、工作量大、環(huán)境污染、成本高和處理效率低缺陷，每天可以處理300個樣品，能極大地提高分析效率。
文檔編號G01N30/68GK1715909SQ20051009005
公開日2006年1月4日 申請日期2005年8月11日 優(yōu)先權日2005年8月11日
發(fā)明者王加啟, 卜登攀, 周凌云, 劉仕軍, 于建國 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所