專利名稱：基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS-1、Ag85B抗原決定簇組合而成地新蛋白進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌診斷檢測(cè)的試劑及其在臨床結(jié)核病的診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，由于耐藥和耐多藥結(jié)核病的增多，流動(dòng)人口的增加以及艾滋病和結(jié)核病合并感染，造成結(jié)核病在全球范圍內(nèi)回升。結(jié)核病仍然是當(dāng)今全球最嚴(yán)重的傳染病之一，全球有三分之一的人口約有20億人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年約有1000萬(wàn)新感染者，每年有約300萬(wàn)人死于結(jié)核病。中國(guó)現(xiàn)有結(jié)核病病人500萬(wàn)，占全球的四分之一，且下降趨勢(shì)緩慢，耐藥率高達(dá)46％，被列為“特別引起警示的國(guó)家和地區(qū)”之一。
結(jié)核病的臨床診斷對(duì)于結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)和早治療具有重要意義。目前結(jié)核病診斷的主要手段有病原菌的涂片染色鏡檢和分離培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)以及血清學(xué)檢測(cè)等。涂片染色鏡檢基于結(jié)核桿菌抗酸染色特性達(dá)到檢測(cè)的目的，但該法存在靈敏度低、特異性差的缺點(diǎn)(靈敏度為10-20％)。分離培養(yǎng)法檢查往往需4-8周或更長(zhǎng)的時(shí)間，常延誤臨床的診斷和治療。結(jié)核分枝桿菌侵入人體后，會(huì)引起人體的細(xì)胞免疫和體液免疫，以細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的PPD皮試是臨床上廣泛應(yīng)用的比較簡(jiǎn)便的結(jié)核菌感染的檢測(cè)方法，但特異性較差。以體液免疫為基礎(chǔ)的結(jié)核病特異性抗體的檢測(cè)已經(jīng)成為結(jié)核病診斷的一種重要的輔助手段。早期，人們將PPD作為抗原通過(guò)ELISA法來(lái)檢測(cè)抗體，這種方法具有一定的局限性。一、PPD是一種混合性抗原，很多蛋白不僅結(jié)核分枝桿菌有，其他分枝桿菌也具有。很難鑒別結(jié)核病與環(huán)境分枝桿菌感染者以及卡介苗接種陽(yáng)轉(zhuǎn)者。二、ELISA法需專人操作，不同人操作，不同批試劑，結(jié)果有很大不同，穩(wěn)定性較差，而且時(shí)間也較長(zhǎng)，需2-3小時(shí)。臨床標(biāo)本難做到隨到隨檢測(cè)，限制了其推廣。后來(lái)，金標(biāo)滲濾法應(yīng)用到結(jié)核病人抗體的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間(僅10-20分鐘)，降低了反應(yīng)中人為因素的影響，在一定程度上提高了特異性，現(xiàn)在臨床應(yīng)用的多是由這一方法制備的試劑盒。但僅用單一蛋白作抗原，就降低了檢測(cè)的敏感性，而且金標(biāo)法檢測(cè)臨床標(biāo)本的敏感性本身就低于ELISA法，而且重組蛋白也含有不同的抗原決定簇，有一定的交叉反應(yīng)，敏感性和特異性都需進(jìn)一步提高。
ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85是結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白，能引起人體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。且ESAT6、MPT64在大部分環(huán)境及卡介苗中缺失，PstS-1在卡介苗中的含量也只是結(jié)核分枝桿菌的十分之一。1998年，Morten等報(bào)道了ESAT6的B細(xì)胞抗原決定簇，Thomas等報(bào)道了MPT64的抗原決定簇，PstS-1、Ag85B的抗原決定簇也已被報(bào)道。市售結(jié)核病血清檢測(cè)試劑IC-TB卡中含PstS-1完整蛋白，其敏感性和特異性均有待提高；其他蛋白未見(jiàn)制成血清學(xué)檢測(cè)試劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)診斷試劑，該試劑靈敏度高，特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便、快速，不需要人員培訓(xùn)及昂貴的儀器設(shè)備，可廣泛用于臨床結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷。
本發(fā)明的特點(diǎn)及良好效果
本發(fā)明將結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B的結(jié)核分枝桿菌特異性的B細(xì)胞抗原決定簇的氨基酸進(jìn)行組合。通過(guò)常規(guī)的計(jì)算機(jī)軟件分析組合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，選擇空間結(jié)構(gòu)合理的組合蛋白，再通過(guò)常規(guī)的基因工程手段，將組合蛋白在體外表達(dá)、純化、并制備結(jié)核分枝桿菌的抗體檢測(cè)金標(biāo)試劑。
利用本發(fā)明的組合蛋白作為抗原可檢測(cè)針對(duì)由ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白作抗原所產(chǎn)生的結(jié)核病特異性抗體，比單一完整蛋白檢測(cè)的敏感性和特異性有所提高。結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白B細(xì)胞抗原決定簇組合蛋白與免疫金銀染色聯(lián)合應(yīng)用，理論上可從2個(gè)方面提高檢測(cè)的敏感性和特異性。同時(shí)，還具有金標(biāo)滲濾法快速、易操作的特點(diǎn)，便于臨床推廣應(yīng)用，對(duì)于結(jié)核病檢測(cè)，確診具有重要意義?？蓮V泛用于臨床結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷。
本發(fā)明中的組合蛋白也可為包被抗原，制備結(jié)核分枝桿菌抗體ELISA(間接法)檢測(cè)試劑。本發(fā)明中生產(chǎn)的抗體也可作為包被抗體，制備結(jié)核分枝桿菌抗原ELISA(雙抗體夾心法)檢測(cè)試劑。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出的結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)診斷試劑制備實(shí)施例，包括以下步驟
1)從文獻(xiàn)中找出ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白結(jié)核分枝桿菌特異的B細(xì)胞抗原決定簇的氨基酸，進(jìn)行組合，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)組合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，選擇空間結(jié)構(gòu)合理的組合，合成組合蛋白的編碼基因如下
ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATCCAG GGA GGC TGT GGC TCG AAA CCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGTCCA ACG ACC ACG TAC AAG GCC TTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACCTAT GGT CCC TCG AGT GAC CCG GCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGCTTC CTC GAC CAG GCC AGT CAA CGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AACGCC ATG AAG GGT GAC CTG CAG AGT TCG TTA GGC GCC，該編碼基因兩端含酶切位點(diǎn)BamH I和HindIII；
2)將上述合成的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆T載體上，對(duì)重組子進(jìn)行BamH I和HindIII酶切及測(cè)序鑒定，用合成片段兩端的酶切位點(diǎn)，從T載體上切下目的片段，克隆到表達(dá)載體PET24b上，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1M誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)凝膠電泳及Western Blotting進(jìn)行鑒定分析；
3)、采用凝膠(Pharmacia公司chelating sephrose fast flow生產(chǎn))，經(jīng)過(guò)金屬鏊合層析來(lái)純化表達(dá)蛋白；
4)、將購(gòu)買純化的人IgG(從經(jīng)科宏達(dá)公司)采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序免疫家兔制備抗人IgG抗體(還可包括IgM、IgA)；
5)、通過(guò)檸檬酸還原法制備膠體金；即0.01％氯化金水溶液100ml加熱煮沸，磁力攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液4ml，繼續(xù)加熱煮沸使溶液呈亮紅色為止；冷卻后調(diào)pH至5.8，按每ml膠體金加6ug兔抗人IgG的比例，將二者混合，加入適量聚乙而醇，然后高速離心純化。
6)、經(jīng)方陣滴定，確定檢測(cè)蛋白的濃度2mg/ml，取1ul滴在纖維素濾膜上，并取2mg/ml的人IgG 1ul滴在纖維素濾膜上，制備金標(biāo)滲濾板。并配備封閉緩沖液(0.02mol/LPh7.4的Tris-HCL緩沖液，含1％BSA，0.05％Tween-20)，洗滌緩沖液(0.02mol/L Ph7.4的Tris-HCL緩沖液，0.05％Tween-20)。制備結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾抗體檢測(cè)試劑。
7)、在結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾抗體檢測(cè)試劑的基礎(chǔ)上，配備銀染液(乙酸銀0.11％，對(duì)苯二酚0.35％，阿拉伯樹膠7.14％)等試劑；制備結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾(銀加強(qiáng))抗體檢測(cè)試劑。
上述各制備步驟均為常規(guī)成熟技術(shù)。
本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施例
實(shí)施例1金標(biāo)滲濾抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體
取金標(biāo)滲濾板一塊，加封閉液2-4滴，待封閉液完全滲干后，加入病人血清2-4滴，待血清完全滲干后，加入洗滌緩沖液2-4滴，待洗滌緩沖液完全滲干后，加入金標(biāo)二抗2-4滴，二抗?jié)B干后，加入洗滌緩沖液2-4滴，等5-10分鐘，待左邊質(zhì)控點(diǎn)完全顯色后，觀察右邊點(diǎn)是否顯色，若呈紅色則為陽(yáng)性結(jié)果，若無(wú)點(diǎn)出現(xiàn)則為陰性結(jié)果。
實(shí)施例2金標(biāo)滲濾(銀加強(qiáng))抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體
取金標(biāo)滲濾板一塊，加封閉液2-4滴，待封閉液完全滲干后，加入病人血清2-4滴，待血清完全滲干后，加入洗滌緩沖液2-4滴，待洗滌緩沖液完全滲干后，加入金標(biāo)二抗2-4滴，二抗?jié)B干后，加入洗滌緩沖液2-4滴，等5-10分鐘，待左邊質(zhì)控點(diǎn)完全顯色后，加銀加強(qiáng)試劑2-4滴，5-10分鐘后，觀察右邊點(diǎn)是否顯色，若呈黑色則為陽(yáng)性結(jié)果，若無(wú)點(diǎn)出現(xiàn)則為陰性結(jié)果。
本發(fā)明的效果實(shí)驗(yàn)如表1
表1不同試劑檢測(cè)不同人血清(各200份)的陽(yáng)性率
由上結(jié)果可見(jiàn)本發(fā)明試劑檢測(cè)結(jié)核病人血的敏感性為61％，特異性為98％，高于FD結(jié)核桿菌抗體診斷盒的48％和95％。
權(quán)利要求
1.一種基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)診斷試劑，其特征在于，采用結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS-1、Ag85B的B細(xì)胞抗原決定簇重新組合為一個(gè)蛋白作抗原，作為結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷的特異性地檢測(cè)抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)診斷試劑，其特征在于，所述結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白的B細(xì)胞抗原決定簇組合蛋白的編碼基因?yàn)?br> ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATCCAG GGA GGC TGT GGC TCG AAA CCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGTCCA ACG ACC ACG TAC AAG GCC TTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACCTAT GGT CCC TCG AGT GAC CCG GCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGCTTC CTC GAC CAG GCC AGT CAA CGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AACGCC ATG AAG GGT GAC CTG CAG AGT TCG TTA GGC GCC。
3、一種基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)診斷試劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟
1)從文獻(xiàn)中找出ESAT-6、MPT64、PstS-1、Ag85B蛋白結(jié)核分枝桿菌特異的B細(xì)胞抗原決定簇的氨基酸，進(jìn)行組合，合成編碼基因如下ATG ACA GAG CAG CAG TGG AATTTC GCG GGT ATC GAG GCC GCG GCA AGC GCA ATC CAG GGA GGC TGT GGC TCG AAACCA CCG AGC GGT TCG CCT GAA ACG GGC GCC GGT CCA ACG ACC ACG TAC AAG GCCTTC GAT TGG GAC CAG GCC TAT CGC AAG CCA ATC ACC TAT GGT CCC TCG AGT GAC CCGGCA TGG GAG CGC AAC GAC CCT ACG CAG CAG AGC TTC CTC GAC CAG GCC AGT CAACGG GGA CTC GGC GAG GCC CAA GCT CAG CTC AAC GCC ATG AAG GGT GAC CTG CAGAGT TCG TTA GGC GCC，該編碼基因兩端含酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII；
2)將上述合成的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、誘導(dǎo)表達(dá)；
3)采用凝膠純化表達(dá)蛋白；
4)將購(gòu)買純化的人IgG采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序免疫家兔制備抗人IgG抗體；
5)通過(guò)檸檬酸還原法制備膠體金，將膠體金與抗人IgG抗體者混合，離心純化；
6)經(jīng)方陣滴定，確定檢測(cè)蛋白的濃度，并配備封閉緩沖液，洗滌緩沖液制備成結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾抗體檢測(cè)試劑。
4、如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，還包括
7)在所述制備的結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾抗體檢測(cè)試劑加入銀染液試劑；制備成結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)滲濾(銀加強(qiáng))抗體檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于組合蛋白的結(jié)核分枝桿菌金標(biāo)診斷試劑，采用結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白ESAT6、MPT64、PstS－1、Ag85B的B細(xì)胞抗原決定簇重新組合為一組蛋白作抗原，作為結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷的特異性地檢測(cè)抗體。本發(fā)明將結(jié)核分枝桿菌主要分泌蛋白的B細(xì)胞抗原決定簇基因進(jìn)行組合并通過(guò)基因工程手段表達(dá)、純化得到一個(gè)新蛋白，通過(guò)金標(biāo)滲濾法檢測(cè)結(jié)核病人血清。本發(fā)明靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速、省時(shí)，特異性強(qiáng)，能區(qū)分是因?yàn)榻臃N卡介苗、以及與環(huán)境中多種非結(jié)核分枝桿菌接觸而造成的致敏還是真正的結(jié)核分枝桿菌感染，可廣泛用于臨床結(jié)核病的臨床血清學(xué)診斷。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1844929SQ20051010329
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者張靈霞, 吳雪瓊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三○九醫(yī)院