專利名稱：用于精度管理的疑似組織和使用該組織的精度管理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于精度管理的疑似組織(或稱為“用于精度管理的模擬組織”，下面也單獨稱為“疑似組織”)和使用該組織的精度管理方法。
背景技術(shù)：
近年來，在臨床診斷領(lǐng)域中基因檢查迅速普及?；驒z查是分析核酸或染色體等，以檢查是否存在與遺傳性疾病相關(guān)的突變或核型等為臨床目的的檢查。從生物體切除的組織內(nèi)檢查是否存在來自腫瘤細胞的核酸是基因檢查的一個例子。該檢查工序主要由預(yù)處理、核酸擴增和檢測三個工序所組成。
預(yù)處理有多種方法。例如首先向從檢查目標的從生物體中切除的組織中加入用于預(yù)處理的試劑。然后勻漿添加了試劑的切除組織，從得到的勻漿物中抽提純化RNA，回收。
在核酸擴增時，將上述用于測定的試劑裝到樣品容器中，向其中加入酶或引物等試劑，通過核酸擴增反應(yīng)擴增目的核酸。
在檢測中，通過測定熒光染色的目的核酸的熒光或通過測定按照擴增比例產(chǎn)生的副產(chǎn)物的渾濁度等，判斷切除組織中目的核酸的有無或計算其濃度。
在上述的基因檢查中，各工序(預(yù)處理、核酸擴增和檢測)中的各種因素會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。所以，在基因檢查領(lǐng)域，為了確保各工序的精度和可信度，充實精度管理是很重要的。
關(guān)于核酸擴增和檢測，用含有已知濃度目的核酸的對照溶液作為陽性對照，用含不應(yīng)該擴增核酸的對照溶液作為陰性對照，進行精度管理。陽性對照可以確認目的核酸的擴增和所擴增的目的核酸的檢測是否正常進行，陰性對照可確認未擴增不該擴增的核酸。
關(guān)于預(yù)處理，由于進行預(yù)處理的人的技術(shù)水平不同，存在切除組織的勻漿程度的不同等問題，所以預(yù)處理的精度管理也很重要。不過，關(guān)于預(yù)處理，現(xiàn)狀是尚未進行精度管理。手動進行勻漿時，因為進行預(yù)處理的人的技術(shù)水平的不同，造成切除組織在勻漿程度上存在差異。此外，用自動破碎裝置等進行自動勻漿時，由于攪拌機的轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)定等勻漿條件或由于繼續(xù)使用造成攪拌機磨損消耗等，引起切除組織的勻漿程度的不同。所以無論用手動，還是用自動破碎裝置等進行勻漿時，都需要對勻漿條件等預(yù)處理進行精度管理。所以，期望開發(fā)用于管理預(yù)處理精度的可用于精度管理的物質(zhì)和使用該用于精度管理的物質(zhì)的精度管理方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供可用于基因檢查等精度管理的精度管理物質(zhì)和使用該物質(zhì)的精度管理方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了由核酸或細胞、和能保持上述核酸或細胞的凝膠組成的用于精度管理的疑似組織。
通過上述的本發(fā)明，提供了在基因檢查中能用于預(yù)處理的精度管理的精度管理物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了包括下述工序的精度管理方法對由核酸或者細胞、和能保持上述核酸或者細胞的保持體組成的、具有所定表示值(或稱為標示值)的用于精度管理的疑似組織實施包括勻漿在內(nèi)的核酸抽提處理，測定所得到的試樣的核酸濃度的工序；和將上述核酸濃度的測定值和上述表示值比較，判斷上述核酸抽提處理是否適當?shù)墓ば颉?br> 此外，本發(fā)明還提供了包括下述工序的精度管理方法對由目的核酸或者含有目的核酸的細胞、和能保持上述目的核酸或者含有目的核酸的細胞的保持體組成的、具有所定表示值的用于精度管理的疑似組織進行勻漿，擴增所得到的試樣中含有的目的核酸的濃度的擴增工序；測定擴增的目的核酸，測定來自上述疑似組織的目的核酸濃度的測定工序；和比較上述疑似組織的目的核酸濃度的測定值和上述表示值，判斷上述勻漿、上述擴增工序和上述測定工序是否適當?shù)墓ば颉?br> 通過本發(fā)明，提供了使用用于精度管理的物質(zhì)在基因檢查中進行預(yù)處理精度管理的方法。


圖1是表示由電腦13和分光光度計14組成的吸光光度計測定裝置15的圖。
圖2是表示精度管理操作流程的流程圖。
圖3為核酸擴增檢測裝置的示意圖。
圖4為表示圖3所示的核酸擴增檢測裝置測定部的的整體構(gòu)成的示意圖。
圖5為表示圖3的核酸擴增檢測裝置中的精度管理操作流程的流程圖。
圖6為在實驗例1中制備用于測定的試樣的概況。
圖7為示范性表示疑似組織和裝有該疑似組織的微管的示意圖。
圖8為表示用于測定的試樣i和ii的RNA濃度的圖。
圖9為表示在實驗例2中制備用于測定的試樣iii和iv的概況。
圖10為表示用于測定的試樣iii和iv的RNA濃度的圖。
圖11為在實驗例3中制備用于測定的試樣v、vi和vii的概況。
圖12為表示用于測定的試樣v、vi和vii的擴增上揚的時間。
具體實施例方式
“疑似組織”指的是疑似的生物體組織。作為疑似組織，例如可假定為從生物體中切除的淋巴節(jié)等。疑似組織是由核酸或細胞、和能保持核酸或細胞的保持體組成的，可用于基因檢查預(yù)處理的精度管理。
本實施方案中的“核酸”不僅指DNA或RNA，還包括PNA、BNA、其類似物等的人工核酸。此外，例如也可以使用如Armored RNA(USPatent No.5677124)等的將核酸包入到蛋白質(zhì)等中的核酸作為本發(fā)明的核酸。對核酸的來源沒有特別的限制，可以是從細胞中抽提的，也可以是人工合成的。
作為細胞只要是含有核酸的細胞即可，沒有特別的限制，優(yōu)選腫瘤細胞(oncocyte)。此外，在基因檢查中，優(yōu)選含有編碼部分或全部被檢物質(zhì)的基因、該基因?qū)?yīng)的mRNA和從上述序列的部分序列中選擇出的至少一種核酸的細胞。
在基因檢查中，例如用腫瘤標記物(或稱為“腫瘤標識物”)作為被檢查物質(zhì)。作為腫瘤標記物，可列舉細胞角蛋白(CK)、癌胚抗原、α胎蛋白、組織多肽抗原、免疫抑制酸性蛋白、甲胎蛋白、堿性胚胎蛋白、PIVKA、DUPAN、彈性酶、SCC抗原、Pro GRP、神經(jīng)特異烯醇化酶、尿中NMP-22、前列腺酸性磷酸酶、γ精漿蛋白等。
本發(fā)明中的保持體是凝膠，作為保持體，優(yōu)選在室溫(25℃)下呈現(xiàn)固體形態(tài)，通過加熱到一定溫度可以呈現(xiàn)流動化的物質(zhì)。此外，優(yōu)選具有在固體形態(tài)中能夠和生物體組織具有同等程度的堅固程度的物質(zhì)。
用作保持體的凝膠含有溶劑和凝膠化劑。凝膠化劑是具有添加到溶劑中能使溶液凝膠化性質(zhì)的物質(zhì)。作為凝膠化劑，可列舉瓊脂、瓊脂糖、角叉菜膠、藻酸、藻酸鹽、果膠、膠原、明膠、谷蛋白等天然高分子，或聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)等合成高分子等。可以在本發(fā)明實施方案的疑似組織中使用1種或2種以上的上述合成高分子和天然高分子。作為溶劑沒有特殊的限定，例如可以使用水、TE(TrisEDTA)、TAE(Tris-Acetate EDTA)、TBE(Tris-Borate EDTA)等。
瓊脂是由紅藻類細胞壁中含有的半乳糖和半乳糖衍生物構(gòu)成的多糖。只要能用作凝膠化劑，對瓊脂的來源沒有特殊的限制，可列舉從石花菜屬、龍須菜屬、海膜藻屬、長枝棘糊藻屬、杉藻科屬、刀形石花菜屬、日本石花菜等中純化的瓊脂。
瓊脂糖是以D-半乳糖和3，6-脫水-L半乳糖相互交聯(lián)為主要結(jié)構(gòu)的多糖，在D-半乳糖的1位和3，6-脫水-L-半乳糖的4位上以β糖苷鍵結(jié)合，或在3，6-脫水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖的3位上以α糖苷鍵結(jié)合。只要能用作凝膠化劑即可，對瓊脂糖的來源沒有特殊的限定。在瓊脂中通常含有比例大約為70％的瓊脂糖，經(jīng)純化能得到高純度的瓊脂糖?？梢允褂铆傊羌兌葟牡偷礁叩母鞣N瓊脂糖含量的瓊脂糖。
角叉菜膠是紅藻類中含有的多糖。只要能用作凝膠化劑即可，對其來源沒有特殊的限制。例如可以使用從屬于杉藻科、紅翎菜科、沙菜科的生物等中純化得到的物質(zhì)。在實施方案中可以使用例如κ-角叉菜膠、λ-角叉菜膠等。
κ-角叉菜膠具有在D-半乳糖-4-硫酸的1位和3，6-脫水-D-半乳糖的4位上以β糖苷鍵、在3，6-脫水-D-半乳糖的1位和D-半乳糖-4-硫酸的3位上以α-糖苷鍵相互交聯(lián)的基本結(jié)構(gòu)。
λ-角叉菜膠具有在D-半乳糖的1位和D-半乳糖-2，6-二硫酸的4位上以β糖苷鍵、在D-半乳糖-2，6-二硫酸的1位和D-半乳糖的3位上以α糖苷鍵相互交聯(lián)的基本結(jié)構(gòu)。
藻酸是褐藻類細胞壁中含有的多糖，具有由β-1，4鍵的D-甘露糖酸和α-1，4鍵的L-古羅糖酸(guluronic acid)連接成的鏈狀結(jié)構(gòu)。只要能用作凝膠化劑即可，對藻酸的來源沒有特殊的限定，在本實施方案中，可以使用如藻酸或其鹽(鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽等)等。
果膠是植物的細胞壁中含有的多糖，其主要成分是酸性多糖，該多糖具有在α-1，4鍵的D-半乳糖醛酸的一部分上混有α-1，2鍵的L-鼠李糖的主鏈，還具有阿拉伯糖、半乳糖等中性糖豐富的側(cè)鏈，即，鼠李半乳糖醛多糖I。只要能用作凝膠化劑，對于果膠的來源沒有特殊的限定。
膠原是動物的細胞外基質(zhì)的主成分蛋白質(zhì)，具有由3條多肽鏈組成的3股螺旋結(jié)構(gòu)。此外，明膠為用熱水處理膠原得到的衍生蛋白質(zhì)。只要能用作凝膠化劑即可，對膠原和明膠的來源沒有特殊的限定，在本實施方案中可以使用從動物的組織中純化的、人工合成的明膠和膠原等。
谷蛋白是谷類中含有的粘附性蛋白質(zhì)，是通過谷蛋白類的蛋白質(zhì)和植物蛋白類的蛋白質(zhì)的結(jié)合所形成的。只要能用作凝膠化劑即可，對谷蛋白的來源沒有特殊的限定，在本實施方案中，例如可以使用從小麥或大麥中抽提的、人工合成等的谷蛋白。
PVA是由聚醋酸乙烯水解得到的，是以乙烯醇單位作為主體的合成高分子。
PEG是由環(huán)氧乙烷經(jīng)堿處理，通過以陰離子聚合或以質(zhì)子為起始的陽離子聚合得到的、以乙二醇單位為主體的合成高分子。
PAA是通過丙烯酰胺的乙烯基聚合或酰胺基的氫轉(zhuǎn)移聚合得到的、以丙烯酰胺單位為主體的合成高分子。
本實施方案中使用的PVA、PEG和PAA只要能用作凝膠化劑即可，對其聚合度等沒有所定的限制。
使用上述的疑似組織，通過吸光度測定、或核酸擴增和核酸檢測等進行基因檢查的預(yù)處理的精度管理。
下面，對通過使用吸光度測定進行預(yù)處理精度管理(實施例1)和使用核酸擴增以及核酸檢測進行的預(yù)處理精度管理(實施例2和實施例3)進行說明。
(實施例1)使用吸光度測定進行預(yù)處理精度管理，包括下述工序?qū)τ珊怂峄蚣毎?、和能保持核酸或細胞的保持體所組成的、具有所定的表示值的用于精度管理的疑似組織實施包括勻漿在內(nèi)的核酸抽提處理，測定由此得到的試樣的核酸濃度工序；和比較核酸濃度的測定值和上述表示值，判斷上述核酸抽提處理是否適當?shù)墓ば颉?br> <表示值α的計算>
首先，計算表示值。
表示值是對由確定的操作流程制備的疑似組織實施所定的預(yù)處理，測定其吸光度計算出的核酸濃度測定值。通過比較該表示值和核酸濃度測定值，進行針對測定對象的預(yù)處理精度管理。
下面，對用于計算表示值的疑似組織α的制備進行說明。
在測定疑似組織α的吸光度之前，混合含有核酸的核酸溶液或含有細胞的細胞懸濁液和含有緩沖劑的試劑(下面，稱為勻漿試劑)，將該混合物作為基準試樣α。使用核酸溶液時，測定該基準試樣α的吸光度，計算出基準試樣α中的核酸濃度，將其作為基準值α。使用細胞懸濁液時，將細胞懸濁液和勻漿試劑的混合物充分勻漿，將其作為基準試樣α。測定基準試樣α的吸光度，計算出核酸濃度，將其作為基準值α。并且，預(yù)先用細胞計數(shù)板(例如細胞計數(shù)板8100105；ASONE公司)或細胞計數(shù)裝置(例如粒子計數(shù)分析裝置CDA-500；SYSMEX公司)等計數(shù)細胞懸濁液中的細胞數(shù)。
然后，使用與在基準試樣α制備中所用的核酸溶液或細胞懸濁液等量的相同物質(zhì)制備疑似組織α。
制備疑似組織α?xí)r，首先，將溶劑裝到微管等容器中。
向容器中的溶媒中添加凝膠化劑，用恒溫槽或微波爐等加熱凝膠化劑和溶劑的混合物和裝有該混合物的容器，使凝膠化劑在溶劑中完全溶解，制備凝膠劑化溶液。
將裝有凝膠劑化溶液的容器置于室溫下或冷藏庫等低溫下，使凝膠化劑溶液冷卻。
凝膠化劑溶液在到達一定溫度以下時，凝固形成凝膠狀的固體形態(tài)，在成為固體形態(tài)之前，用移液器等向凝膠化溶劑中加入與制備基準試樣α?xí)r所使用的核酸溶液或細胞懸濁液等量的相同物質(zhì)。然后，為了不使凝膠化劑溶液與核酸溶液或與細胞懸濁液的混合液中的核酸或細胞局部過濃，進行混合液的混合。
然后，將液體溫度降低到可使凝膠化劑溶液成為凝膠狀固體形態(tài)的溫度，使含有核酸或細胞的凝膠化劑溶液凝膠化，得到由核酸或細胞、和保持核酸或細胞的保持體所組成的疑似組織α。
對上述制備的疑似組織α實施與在基因檢查預(yù)處理中相同的處理，測定吸光度。
在預(yù)處理中，首先，向疑似組織α中添加勻漿試劑。調(diào)整勻漿試劑的添加量，使疑似組織α與勻漿試劑的混合物的體積與基準試樣α的體積相等。
然后，勻漿疑似組織α與勻漿試劑的混合物，制備勻漿物。
離心分離由疑似組織α得到的勻漿物，將上清移到其他的容器中。在260nm測定該上清的吸光度，測定核酸濃度。
從疑似組織α中得到的上清中的核酸濃度與基準值α相等或近似時(例如該核酸濃度表現(xiàn)為在基準值α的70％以上，優(yōu)選80％以上的值時)，表示通過勻漿有效地抽提出疑似組織α勻漿物上清中含有的核酸，可將該核酸濃度測定值作為表示值α。
<通過吸光度測定進行預(yù)處理的精度管理>
下面，用圖1說明吸光度測定裝置15的結(jié)構(gòu)。
圖1是表示電腦13和分光光度計14構(gòu)成的吸光度測定裝置15的圖。電腦13和分光光度計14連接，可以數(shù)據(jù)通訊。
電腦13配備有顯示部16、具有用于輸入信息或操作的輸入部17和CPU、ROM、RAM等的控制部。此外，為了遙控操作分光光度計，進行精度管理，在電腦13的硬盤上安裝了計算機程序。并且控制部的CPU通過實行上述計算計程序，進行后述的精度管理操作。
分光光度計14配備有LED、激光發(fā)光部等發(fā)光元件和光電二級管、光電倍增管等光接收元件，發(fā)光元件和光接收元件之間可安置被檢測物。這種分光光度計14可用光接收元件檢測從發(fā)光元件照射被檢測物后透過的光，測定被檢測物的吸光度。此外，可以從電腦遠程操作分光光度計14，從電腦13指示測定操作的開始。
下面，用圖2說明通過吸光度測定裝置15進行的精度管理操作。
圖2是表示精度管理操作流程的流程圖。
精度管理中使用疑似組織α和同塊(lot)的疑似組織β。
對疑似組織β實施與對疑似組織α的預(yù)處理相同的勻漿、離心、上清回收等預(yù)處理。
用吸光度測定裝置15對疑似組織β實施預(yù)處理得到的上清，進行下述的以表示值α為基準的精度管理操作。
首先，操作者將疑似組織β的上清安置到分光光度計14中。
然后，操作者用輸入部17輸入疑似組織β的的屬性信息(表示值等)，例如通過點擊畫面中所示的測定開始按鈕的所定操作，輸入開始測定的指示。電腦13的控制部將輸入的屬性信息歸類到RAM中，一旦接收測定開始指示輸入，指示在分光光度計14上開始在260nm處測定上清的吸光度(S1)。通過該指示，分光光度計14測定上清的吸光度。
電腦13的控制部接收到由分光光度計14測定的吸光度測定值(S2)信息，以接收到的吸光度測定值為基準計算核酸濃度(S3)。
然后，電腦13的控制部通過比較計算出的核酸濃度和表示值α，進行精度管理處理(S4)。具體而言，當核酸濃度在所定的范圍內(nèi)(例如為表示值α的70％以上，優(yōu)選80％以上)時，電腦13的控制部判定對疑似組織β實施的處理是適當?shù)?，當核酸濃度在所定的范圍?例如不足表示值α的70％，優(yōu)選不足80％)時，判定對疑似組織β實施的處理是不適當?shù)摹?br> 并且，電腦13的控制部將S4中的精度管理處理結(jié)果顯示到顯示部16上。
在本實施方案中，可以是分光光度計14自動地將吸光度的測定結(jié)果發(fā)送到電腦13上，也可以將測定結(jié)果顯示在分光光度計14上，將所顯示的測定結(jié)果手動輸入到電腦13上。
此外，本實施方案中的分光光度計14將測定結(jié)果自動地發(fā)送到電腦13上，也可以將測定結(jié)果表示在分光光度計14上，不用電腦來比較所顯示的測定結(jié)果和表示值α也可以。
(實施例2)用核酸擴增和核酸檢測進行的預(yù)處理精度管理，包括下述工序勻漿由目的核酸或含有目的核酸的細胞、和能保持目的核酸或含有目的核酸的細胞的保持體所組成的、具有所定表示值的用于精度管理的疑似組織，擴增所得到的試樣中含有的目的核酸的擴增工序；檢測擴增的目的核酸，測定來自目的疑似組織的目的核酸濃度的測定工序；和比較疑似組織的目的核酸濃度的測定值和表示值，判斷勻漿、擴增工序和測定工序是否適當?shù)墓ば颉?br> <表示值γ的計算>
下面對用于計算表示值的疑似組織γ的制備進行說明。
在疑似組織γ的核酸擴增和核酸檢測之前，首先混合含有目的核酸或含有目的核酸的細胞的細胞懸濁液與勻漿試劑，制備基準試樣γ。溶液中含有細胞時，將細胞懸濁液與勻漿試劑的混合物充分勻漿后的物質(zhì)作為基準試樣γ。另外，預(yù)先計數(shù)細胞懸濁液中的細胞數(shù)。
然后，使用與用于制備基準試樣γ的含目的核酸或細胞溶液等量的相同物質(zhì)制備疑似組織γ。
按照和上述疑似組織α的制備相同的方法制備疑似組織γ。
向疑似組織γ中添加勻漿試劑。調(diào)整勻漿試劑的添加量，使疑似組織γ和勻漿試劑的混合物的體積與基準試樣γ的體積相等。
勻漿疑似組織γ和勻漿試劑的混合物，制備勻漿物。
離心分離從疑似組織γ得到的勻漿物，將上清移到其他的容器中。以下，將該上清作為用于測定的試樣γ。
針對上述的基準試樣γ和用于測定的試樣γ進行核酸擴增和核酸檢測。
作為核酸擴增，向基準試樣γ和用于測定的試樣γ的上清中添加酶試劑，用公知的核酸擴增方法擴增目的核酸(目的核酸含有RNA時，擴增與該RNA的堿基序列相對應(yīng)的cDNA)。
作為檢測，可以使用任何公知的核酸檢測方法。
純化伴隨核酸擴增同時產(chǎn)生的焦磷酸酸鎂等不溶性物質(zhì)時，通過目測確認反應(yīng)液上清的渾濁度，或測定反應(yīng)液的吸光度或散射光強度進行渾濁度測定，或用有色的濾膜過濾反應(yīng)液，通過確定濾膜上的殘渣，檢測目的核酸(國際公開WO 01/83817號小冊子)。
此外，如果在如溴化乙錠、SYBR GREEN I或Pico Green的雙鏈嵌入性熒光素存在的情況下，實施核酸擴增，可以通過測定反應(yīng)液的熒光，檢測目的核酸。
在渾濁度測定或熒光測定中，觀察到伴隨著核酸擴增生成物的增加，渾濁度或熒光增大。如果用實時監(jiān)測該增大的話，可以同時追蹤閉鏈類核酸的擴增與渾濁度或熒光的增加。
目測檢測核酸時，比較基準試樣γ的渾濁度和用于測定的試樣γ的渾濁度，以此確認是否正確地用于測定的試樣γ進行了預(yù)處理。
使用測定渾濁度檢測核酸時，比較用于測定的試樣γ的目的核酸濃度和基準試樣γ的目的核酸濃度(以下，定為基準值γ)。當上述值相等或顯示出近似值時(例如用于測定的試樣γ的目的核酸濃度為基準值γ的70％以上，優(yōu)選顯示80％以上的值的時候)，表示通過勻漿可以有效地抽提出來自疑似組織γ的用于測定的試樣γ中含有的目的核酸，可以將該目的核酸濃度測定值定為表示值γ。此外，用實時檢測渾濁度或熒光的增大時，比較用于測定的試樣γ中所含核酸直至擴增加大開始的時間(擴增上揚時間detection time)和基準試樣γ的擴增上揚時間(以下，定為基準值γt)。上述值相等或顯示出近似值時，表示通過勻漿有效地抽提出用于測定的試樣γ中所含的目的核酸，可以將其上揚時間作為表示值γt。
<通過核酸擴增和核酸檢測進行的預(yù)處理的精度管理>
下面，對基于表示值γ或γt的精度管理方法進行說明。
制備用于精度管理的疑似組織δ。疑似組織δ是和上述疑似組織γ相同塊的疑似組織。
對疑似組織δ進行與對疑似組織γ實施的預(yù)處理相同的勻漿、離心、回收上清等預(yù)處理，制備用于測定的試樣δ。
對用于測定的試樣δ實施與對上述用于測定的試樣γ進行的核酸擴增和核酸檢測相同的操作，測定用于測定的試樣δ的目的核酸濃度和/或擴增上揚時間。
用于測定的試樣δ的目的核酸濃度測定值或擴增上揚時間表示出和上述表示值γ或γt近似的值時，認為疑似組織δ實施的處理是適當?shù)摹?br> 另外，在上述的預(yù)處理、核酸擴增和核酸檢測中的至少一個工序中可以通過裝置自動地進行。
例如作為自動地進行核酸擴增和核酸檢測的裝置，可列舉核酸擴增檢測裝置。
作為核酸擴增檢測裝置，例如支持診斷在癌癥手術(shù)里切除的組織中的癌轉(zhuǎn)移的GD-100(SYSMEX制造)。通過該裝置，以切除組織內(nèi)的mRNA為模板，通過RT-LAMP(Reverse Transcription Loop MediatedIsothermal Amplification，榮研化學(xué))法，從mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增該cDNA，通過測定伴隨擴增而增大的溶液渾濁度，計算切除組織內(nèi)mRNA的擴增上揚時間和拷貝數(shù)。
該核酸檢測裝置可以對從生物體中切除的組織中含有多少癌癥標記物(例如細胞角蛋白19)的核酸進行定量。
圖3是表示核酸擴增檢測裝置的圖。
圖4是表示圖3所示的核酸擴增檢測裝置的測定部的整體構(gòu)成的圖。
首先，參照圖3，對核酸擴增檢測裝置進行說明。核酸擴增檢測裝置是由測定部101和用通信線路連接到測定部101的用于數(shù)據(jù)處理的電腦102所構(gòu)成的。
電腦102的構(gòu)成和實施例1中說明的電腦13的構(gòu)成是相同的。電腦102配備有顯示部103、具有用于輸入信息或進行操作的輸入部104和CPU、ROM、RAM等的控制部。
測定部101如圖5所示，包括分注機構(gòu)部10、樣品容器安置部20、試劑容器安置部30、吸液管頭安置部40、吸液管頭廢棄部50、和5個反應(yīng)檢測塊60a構(gòu)成的反應(yīng)檢測部60。
測定部101中，如圖5所示，與用微機控制的裝置一起，還配置有控制裝置外部的輸入、輸出的控制部70、和內(nèi)藏有能夠供給包括控制部70在內(nèi)的整體裝置電力的電源部80。此外，在測定部101的正面的所定位置上配置了緊急停止開關(guān)90。
沿著X軸方向配置了樣品容器安置部20、試劑容器安置部30和吸液管頭安置部40。此外，樣品容器安置部20配置在裝置正面靠外側(cè)，試劑容器安置部30配置在裝置正面靠內(nèi)側(cè)。此外，相對于樣品容器安置部20、試劑容器安置部30和吸液管頭安置部40，在Y軸的方向上隔著所定間隔的位置上，沿著X軸方向配置了5個反應(yīng)檢測塊60a和吸液管頭廢棄部50。即，樣品容器安置部20、試劑容器安置部30、吸液管頭安置部40、吸液管頭廢棄部50和5個反應(yīng)檢測塊60a配置成方形形狀(長方形形狀)。
此外，分注機構(gòu)部10包括相對于X軸和Y軸方向(平面方向)可以移動的手臂部11、和與手臂部11相對的分別獨立在Z軸方向(垂直方向)可以移動的2列(2根)注射器部12a。2根注射器12分別在前端配備了可以安裝移液器移液頭的噴嘴部12a。
此外，如圖5所示，在樣品容器安置部20的凹陷部，包圍著可以取出的具有5個樣品容器安置孔21a和把持部21b的容器安置臺21。沿著X軸方向在一列中隔著所定的間隔設(shè)置了樣品容器安置臺21的5個樣品容器安置孔21a。該樣品容器安置臺21的5個樣品容器安置孔21a上安裝了可以裝入經(jīng)過預(yù)處理的切除組織和/或疑似組織制備的用于測定的試樣的樣品容器22。
在試劑容器安置部30的凹陷部位中包圍著可以取出的、具有2個引物試劑容器安置孔31a、2個酶試劑容器安置孔31b和把持部31c的試劑容器安置臺31。在沿著Y軸方向，隔著所定的間隔分別設(shè)置了2個孔試劑容器安置臺31的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑安置孔31b。在該試劑容器安置臺31的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑安置孔31b上，分別安裝了2個容器裝2種引物試劑的引物試劑容器32a和與2種引物試劑對應(yīng)的裝酶試劑的酶試劑容器32b。并且，正面左側(cè)的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑容器阻抗31b上配置了裝對應(yīng)于細胞角蛋白19(CK19)的mRNA裝引物試劑的引物試劑容器32a、裝CK19mRNA酶試劑的酶試劑容器32b。此外，在正面右側(cè)的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑容器安置孔31b上配置了裝作為內(nèi)部標準物質(zhì)的β激動蛋白的mRNA的引物的引物試劑容器32a和裝β激動蛋白的mRNA的酶試劑的酶試劑容器32b。
并且，不局限于用β激動蛋白的mRNA作為內(nèi)部標準物質(zhì)，也可以用其他的看家基因的mRNA等作為內(nèi)部標準物質(zhì)(國際公開WO03/070935號小冊子)。
在吸液管頭安置部40的2個凹陷部位，分別包圍著具有可容納36支吸液管頭41的容納孔42a的2個可以脫離的鎖42。此外，在吸液管頭安置部40處設(shè)置了2個取出按鈕43。通過按壓該取出按鈕43，使鎖42成為可以取出的狀態(tài)。
如圖5所示，反應(yīng)檢測部60的各反應(yīng)檢測塊60a由反應(yīng)部61、2個渾濁度檢測部62和閉蓋機構(gòu)部63所構(gòu)成。各反應(yīng)部61配有檢測池65。閉蓋機構(gòu)部63具有向檢測池65中裝入池部67a的功能。
(實施例3)在實施例3中，對用GD-100(SYSMEX制造)進行核酸檢測時的操作順序和裝置操作進行具體說明。這里，對使用由細胞和保持細胞的保持體組成的疑似組織時的情況進行描述。
<表示值εt的計算>
在疑似組織的核酸擴增和核酸檢測之前，首先，將含有認為含有CK19mRNA的細胞的細胞懸濁液和勻漿試劑混合，制備試樣，充分勻漿，將其作為基準試樣ε。另外，預(yù)先計數(shù)細胞懸濁液中的細胞數(shù)。
然后，使用與用于制備基準試樣ε的細胞懸濁液等量的相同物質(zhì)，按照與上述制備疑似組織α同樣的方法制備疑似組織ε。
向疑似組織ε中添加勻漿試劑。調(diào)整勻漿試劑的添加量，使疑似組織ε和勻漿試劑的混合物的體積和基準試樣ε的體積相等。
勻漿疑似組織ε和勻漿試劑的混合物，制備勻漿物。
離心分離從疑似組織ε得到的勻漿物，將上清移到其他的容器中。下面，用該上清作為用于測定的試樣ε。
將裝基準試樣ε和用于測定的試樣ε的容器分別安裝到樣品容器安置臺21的樣品容器安置孔21a上。
然后，在正面左側(cè)的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑容器安置孔31b上安裝裝有CK19mRNA的引物試劑的引物試劑容器32a和裝有CK19mRNA的酶試劑的酶試劑容器32b。
然后，在正面右側(cè)的引物試劑容器安置孔31a和酶試劑容器安置孔31b上安裝裝有β激動蛋白mRNA的引物試劑的引物試劑容器32a和裝有β激動蛋白mRNA的酶試劑的酶試劑容器32b。
然后，在吸液管頭安置部40的凹陷部位嵌入分別裝有36支一次性吸液管頭41的2個塊42。然后，在各反應(yīng)檢測塊60a的反應(yīng)部61的2個檢測池安置孔61a上安裝檢測池65的2個池部67a。
然后，開始測定部101的操作。開始測定部101的操作后，分注機構(gòu)部10的手臂部11移動到吸液管頭安置部40，通過使2個注射器部12向下移動，使噴嘴部12a的前端自動安裝上吸液管頭41。并且，將2個注射器部12向上移動后，使分注機構(gòu)部10的手臂11朝著試劑容器安置臺31上安裝的裝有CK19mRNA和β激動蛋白mRNA的引物試劑的2個引物試劑容器32a的上方方向，沿著X軸方向移動。并且，通過使2個注射器部12向下移動，使各吸液管頭41的前端插入到2個引物試劑容器32a內(nèi)的CK19mRNA和β激動蛋白的引物試劑的液面，使吸液管頭41內(nèi)吸入各引物試劑。
吸入引物試劑后，使2個注射器部12向上移動后，分注機構(gòu)部10的手臂部11向反應(yīng)檢測塊60a的上方移動。然后，通過將2個注射器部12向下移動，將裝在2個注射器部12的噴嘴部12a上的2個吸液管頭41分別插入到檢測池65的池部67a內(nèi)，將CK19mRNA和β激動蛋白mRNA的引物試劑分別吐出到2個池部67a中。
在吐出引物試劑后，使2個注射器部12向上移動，分注機構(gòu)部10的手臂部11朝著吸液管頭廢棄部50的上方，沿著X軸移動。在吸液管頭廢棄部50，廢棄吸液管頭41。
然后，分注機構(gòu)部10的手臂部11再次移動到吸液管頭部40，在吸液管頭部40處按照和上面相同的操作，向2個注射器部12的噴嘴部12a的前端自動安裝2個新的吸液管頭41。然后，分注機構(gòu)部10的手臂部11朝向試劑容器安置臺31上安裝的分別裝有CK19mRNA和β激動蛋白mRNA的2個酶制劑的2個酶制劑容器32b的上方，沿著X軸方向移動。然后，通過將2個注射器部12向下方移動，吸引2個酶試劑容器32b內(nèi)的CK19mRNA和β激動蛋白mRNA的2個酶制劑，使2個注射器部12向上移動。然后，是CK19mRNA和β激動蛋白mRNA的2個酶制劑分別吐出到檢測池65的2個池部67a中。在吐出酶試劑后，使分注機構(gòu)部10的手臂部11移動到吸液管頭廢棄部50的上方后，廢棄吸液管頭41。
然后，分注機構(gòu)部10的手臂部11再次移動到吸液管頭部40處后，向2個注射器部12的噴嘴部12a的前端自動安裝2個新的吸液管頭41。然后，分注機構(gòu)部10的手臂部11朝著樣品容器安置臺21上安裝的、分別裝有基準試樣ε和用于測定的試樣ε的2個樣品容器22的上方，沿著X軸方向移動后，將基準試樣ε和用于測定的試樣ε分別吸引到吸液管頭41內(nèi)。
向檢測池65的2個池部67a分別吐出基準試樣ε和用于測定的試樣ε時，通過2個注射器部12自動的進行吹吸，使2個池部67a內(nèi)的混合液混合。之后，分注機構(gòu)部10的手臂11移動到吸液管頭廢棄部50的上方后，廢棄吸液管頭41。
向上述池部67a中分別裝入基準試樣ε和用于測定的試樣ε各試劑，通過閉蓋機構(gòu)部63，使檢測池65的池部67a的蓋子閉合后，啟動測定部101的加熱器，將檢測池65內(nèi)的液體溫度加熱到約65℃，通過上述的RT-LAMP，以CK19的mRNA為模板擴增cDNA。然后，實時監(jiān)測伴隨擴增生成的焦磷酸鎂的白色渾濁進行渾濁度測定。具體而言，來自LED光源(圖中未出示)的光照射擴增反應(yīng)時的檢測池65的池部67a。用感光元件感光照射的光，用實時監(jiān)測擴增反應(yīng)時檢測池65的池部67a內(nèi)溶液的渾濁度，分別計算出基準試樣ε和用于測定試樣ε中含有的CK19mRNA的擴增上揚時間。此處，將渾濁度達到0.1的時間作為擴增上揚時間。
將通過渾濁度測定計算的基準試樣ε的擴增上揚時間作為基準值εt。當用于測定的試樣ε的CK19mRNA的擴增上揚時間表示出和基準值εt相等或近似的值時，表明通過勻漿有效地抽提出用于測定的試樣ε中含有的CK19mRNA，可將該CK19mRNA擴增上揚的時間作為表示值εt。
<使用核酸擴增和核酸檢測進行預(yù)處理的精度管理>
下面，用圖5對精度管理操作進行說明。圖5是表示在圖3中的核酸擴增檢測裝置上進行精度管理操作的流程的示意圖。
在精度管理中使用與疑似組織ε相同塊的疑似組織η。
用與對疑似組織ε實施的預(yù)處理相同的方法對疑似組織η進行勻漿、離心、回收上清等預(yù)處理。
用疑似組織η的上清，進行下述以表示值εt為基準的核酸擴增檢測裝置上的精度管理操作。
首先，操作者將疑似組織η的上清裝入到測定部101中。
然后，操作者用輸入部104輸入疑似組織η的屬性信息(表示值等)，例如通過點擊如畫面中所示的測定開始按鈕的所定操作，輸入測定開始的指示。
電腦102的控制部將輸入的屬性信息歸類到RAM中，一旦接收操作者輸入的測定開始的指示，就指示測定部101開始測定(S6)。測定部101接收到來自電腦102的開始測定的指示后，首先向上述上清中添加引物或酶等。添加結(jié)束后，測定部101開始測定上清的渾濁度，啟動加熱器加熱上清。
測定部101測定加熱器的溫度，加熱到所定的溫度(例如65℃)時，發(fā)送到達設(shè)定溫度通知到電腦102上，電腦102的控制部接收到該信息(S7)。
測定部101發(fā)送到達設(shè)定溫度通知后，每隔一定時間(例如每隔5秒)測定上清的渾濁度，將渾濁度測定值發(fā)送到電腦102上。電腦102的控制部開始接收濁度測定值信息(S8)，接收直至每隔一段時間的渾濁度測定結(jié)束為止(S9)。
然后，電腦102的控制部判斷渾濁度測定值是否到達0.1以上(S10)。當渾濁度測定值不足0.1時，電腦102的控制部實行后述S14的處理。當渾濁度測定值達到0.1以上時，電腦102的控制部計算從接收到到達設(shè)定溫度通知以后直至渾濁度到0.1以上的時間，將其作為疑似組織η的上清的擴增上揚時間(S11)。
然后，電腦102用計算出的擴增上揚時間，以表示值εt為基準進行精度管理處理(S12)。具體而言，將擴增上揚時間和表示值εt比較，如果擴增上揚時間在所定的范圍內(nèi)(例如表示值εt+0分以上不足5分)，判定對疑似組織η實施的勻漿、核酸擴增和核酸檢測是適當?shù)摹Ｈ绻麛U增上揚時間在所定的范圍外(例如表示值εt+5分以上)時，判定對疑似組織η實施的勻漿、核酸擴增和核酸檢測是不適當?shù)摹?br> 電腦102的控制部將S11中精度管理處理的結(jié)果表示到顯示部103上(S13)。
然后，電腦102的控制部，判斷是否從測定開始經(jīng)過了所定的時間(例如60分鐘)(S14)。
未經(jīng)過所定時間時，電腦102的控制部判斷是否能計算出擴增上揚時間(S15)。能計算出時，進行S14處理，不能計算出時，實行S10處理。
另一方面，在S14中經(jīng)過所定時間時，電腦102的控制部向測定部101指示渾濁度測定結(jié)束(S16)。測定部101一旦接收到該渾濁度測定結(jié)束的信息，就終止渾濁度測定操作，停止加熱。
渾濁度測定結(jié)束后，電腦102的控制部使在顯示部103的測定結(jié)果的實時顯示結(jié)束(S17)。
另外，在本實施方案中，測定部101可以將測定結(jié)果自動的發(fā)送到電腦102上，也可以將測定結(jié)果顯示到測定部101上，將顯示的測定結(jié)果手動輸入到電腦102上。
在本實施方案中，測定部101將測定結(jié)果自動地發(fā)送到個人用計算機102上，將測定結(jié)果顯示到測定部101上，也可以將顯示的測定結(jié)果不用電腦102來和表示值εt比較。
在實施例1～3中，也可以通過手動研杵等對基準試樣或疑似組織進行勻漿。此外，也可以使用特公平6-36732記載的細胞破碎裝置或特開2004-209322記載的自動破碎裝置。手動進行勻漿時，管理用研杵等對實施例的疑似組織進行細胞破碎操作的精度。用裝置進行勻漿時，管理裝置的勻漿條件的設(shè)定或攪拌機的損耗狀態(tài)。
在實施例1～3中，也可以在離心分離前，通過公知的核酸抽提法從勻漿物中抽提純化核酸。作為核酸抽提法的具體例子，用酶、表面活性劑、變性劑等分解基因包含體，之后，使用酚法、堿法或酚·氯仿法等歷來使用的基因包含體的分解物中抽提核酸的方法。最近，在核酸提取的過程中，使用離子交換樹脂、玻璃濾膜、玻璃珠或具有蛋白質(zhì)凝集作用的試劑等。此外，作為在核酸的抽提中可以用作結(jié)合核酸的載體的系統(tǒng)，已知使用玻璃粒子和碘化鈉的方法、使用羥基磷灰石的方法等。
(實驗例1)在實驗例1中，制備由核酸和保持核酸的保持體所組成的疑似組織，實施勻漿等的所定處理，通過在260nm波長處吸光度的測定確認是否能從疑似組織中抽提出核酸。假定該疑似組織是從生物體中切除的淋巴節(jié)，進行制備。
制備含有下述組成的勻漿試劑200mM(pH3.0)Glycin-HCl(和光純藥工業(yè))5％Brij35(Sigma)0.05％KS-538(信越化學(xué)工業(yè))上述濃度表示的是在試劑中的濃度。
如下所示，用勻漿試劑和/或瓊脂糖溶液，制備用于測定的試樣i和ii。
在實驗例1中進行的制備用于測定的試劑的概況如圖6所示。
<用于測定的試樣i的制備>
首先，在微管中，使用安裝有移液器吸頭的移液器，取出10μL含有4.6μg從小鼠細胞中抽提的RNA的溶液(下面稱為RNA溶液)，將其作為對照A。然后，向?qū)φ誂中添加650μL勻漿試劑，通過吹吸混合該混合液。從該混合液中取出100μL，作為用于測定的試樣i，裝到小池a中。
<用于測定的試樣ii的制備>
首先，向微管中裝入純化水。然后，向微管內(nèi)加入6μg瓊脂糖(商品名NuSieve GTC Agarose；CAMBERX公司)作為凝膠化劑，然后，添加純化水，使其總體積達到150μL。將該微管在設(shè)定溫度大約為70℃的恒溫槽內(nèi)，加熱直至純化水中的瓊脂糖完全溶解。瓊脂糖一旦完全溶解在純化水中，就從恒溫槽中取出，在常溫下使瓊脂糖的溶液的液體溫度降低。該瓊脂糖溶液的瓊脂糖濃度為4w/v％。瓊脂糖溶液凝膠化之前(當瓊脂糖溶液的液體溫度到40℃時)，向瓊脂糖溶液中加入10μL RNA溶液。為了使RNA不在瓊脂糖溶液中局部過濃，用移液器吹吸混合添加了RNA溶液的瓊脂糖溶液。在添加RNA溶液后，再將瓊脂糖溶液放置在常溫下，使瓊脂糖凝膠化，成為內(nèi)部保持RNA的保持體(瓊脂糖凝膠)。將微管內(nèi)裝有的瓊脂糖凝膠作為對照B。對照B相當于本發(fā)明的用于精度管理的疑似組織。
圖7是示范性地展示上述制備的疑似組織和裝有該疑似組織的微管的圖。微管2配備了裝有疑似組織的收容部5和封住收容部的蓋6，在收容部5中裝有作為保持體的瓊脂糖凝膠3和在該瓊脂糖凝膠3中保持的RNA4。
向160μL對照B中加入500μL勻漿試劑，用研杵進行10次往復(fù)破碎操作，然后在大約2000g下離心大約1分鐘，取100μL上清，將其作為用于測定的試樣ii，裝入到小池b中。
用于測定的試樣ii可以假定為在預(yù)處理中充分勻漿疑似組織所得到的均一的勻漿物。
希望此處所用的勻漿試劑、微管、移液器、純化水、瓊脂糖、小池a和b均為無RNA酶的。
<吸光度的測定>
在測定時，用分光光度計(UV-2500PC島津制造所)，測定裝在小池a和b中的各用于測定的試樣的吸光度(O.D.260nm)，計算出各用于測定的試樣中含有的RNA的濃度。
測定結(jié)果如下面的表1所示。此外，將表1的RNA濃度進行圖示，其結(jié)果如圖8所示。
在表1中的“吸光度測定值”欄目中表示的是進行了3次上述實驗例后，其測定值的平均值。
在“RNA濃度(μg/mL)”欄目中表示由吸光度測定值計算出的各用于測定的試樣中含有的RNA的濃度。
在“相對于用于測定的試樣i的回收率”欄目中表示的是，當用于測定的試樣i的RNA濃度(或吸光度測定值)為100％時，以百分率表示的用于測定的試樣ii的相對值。
表1

由表1和圖8可知，用于測定的試樣i的RNA濃度測定值為7.1μg/mL。該值對應(yīng)于制備對照A時微管內(nèi)裝有的RNA溶液中的RNA濃度。
用于測定的試樣ii的RNA濃度測定值為5.8μg/mL，相對于用于測定的試樣的回收率為81.8％。
由測定結(jié)果可知，與用于測定的試樣i相比，通過對保持了核酸的保持體實施預(yù)處理能夠檢測出80％以上的核酸。這表示通過進行10次往復(fù)的勻漿能有效地從保持體中回收核酸。
所以，用于測定的試樣ii的RNA濃度測定值能夠在后述的實驗例2中作為表示值。
(實驗例2)在實驗例2中，制備由核酸和保持核酸的保持體所組成的疑似組織，分別計算出當實施勻漿等所定的處理進行核酸濃度測定時和不進行勻漿進行核酸濃度測定時的核酸濃度，和在實驗例1中計算出的表示值相比較。
如下所示，制備用于測定的試樣iii和iv。
在本實驗例中進行的用于測定的試樣的制備的概況如圖9所示。
<用于測定的試樣iii和iv的制備>
在制備用于測定的試樣iii時，首先，向?qū)嶒灷?中的對照B和同塊的對照C中加入500μL勻漿試劑。然后實施和制備用于測定的試樣iii同樣的處理，取出100μL上清，裝入到小池c中。
在制備用于測定的試樣iii時，首先，向?qū)嶒灷?中的對照B和同塊的對照D中加入500μL勻漿試劑。從該對照D和勻漿試劑的混合物中取出100μL上清，裝入到小池d中。用于測定的試樣iv是不進行勻漿而制備的物質(zhì)。
<吸光度的測定>
在測定時，用分光光度計(UV-2500PC島津制造所制)，測定裝在小池c和d中的各用于測定的試樣的吸光度(O.D.260nm)，計算出各用于測定的試樣中含有的RNA濃度。
測定結(jié)果如下面的表2所示。此外，如圖10所示，用圖示出表2的RNA濃度。
在表2中的“吸光度測定值”欄目中表示的是進行3次上述實驗例，其測定值的平均值。
在“RNA濃度(μg/mL)”欄目中表示的是由吸光度測定值計算出的各用于測定的試樣中含有的RNA濃度。
在“相對于表示值的回收率”欄目中表示的是，當實驗例1中計算出的表示值為100％時，以百分率表示的用于測定的試樣iii和iv的相對值。
表2

由表2和圖10可知，用于測定的試樣iii的RNA濃度測定值為5.8μg/mL。該值和表示值相比，回收率為100％。
此外，不進行勻漿就進行測定的用于測定的試樣iii的RNA濃度測定值為1.2μg/mL。該值和表示值相比，回收率為20.4％。
由上述測定結(jié)果可知，不進行勻漿，就不能從疑似組織中有效地提取出核酸。
所以，通過比較表示值和疑似組織的核酸濃度測定值，能確認是否正確地進行了勻漿。
通過實驗例1和2可確定，在各實驗例中制備的疑似組織(對照B～D)適于在基因檢測中的勻漿的精度管理。
(實驗例3)在實驗例3中，使用由含有目的核酸的細胞和保持含有目的核酸的細胞的保持體組成的疑似組織，通過測定細胞中含有的CK19mRNA的擴增上揚時間，從疑似組織中抽提核酸，確認是否能夠擴增。該疑似組織假定為從生物體上切除的淋巴節(jié)制備得到的物質(zhì)。此處將渾濁度到達0.1時的時間作為擴增上揚時間進行計算。
如下所示，用勻漿試劑和/或瓊脂糖溶液，制備用于測定的試樣v、vi和vii。將用于測定的試樣v的擴增上揚時間作為本實驗例的陽性對照，將用于測定的試樣vii作為陰性對照。
在本實驗例中進行的用于測定的實驗例制備的概況如圖11所示。
<用于測定的試樣v的制備>
首先，用細胞計數(shù)板(ASONE公司)顯微鏡計數(shù)來自人乳癌的細胞(MDA-MB-231；大日本制藥)，使溶液中含有2×106個細胞，制備細胞懸濁液。將該細胞懸濁液裝入到微管中，將其作為對照E。向?qū)φ誆中加入實驗例1中使用的勻漿試劑直至1ml。對該對照E和勻漿試劑的混合物用研杵進行10次往復(fù)破碎操作。將得到的勻漿物在大約2000g下離心大約1分鐘，取20μl作為用于測定的試樣v，裝入到微管e中。
<用于測定的試樣vi的制備>
首先，向微管中裝入純化水。向其中添加8μg瓊脂糖(CAMBREX公司)作為凝膠化劑。將該微管在設(shè)定溫度大約為70℃的恒溫槽內(nèi)，加熱直至純化水中的瓊脂糖完全溶解。瓊脂糖一旦完全溶解在純化水中，就從恒溫槽中取出，向瓊脂糖溶液中加入在制備用于測定試樣v時相同的細胞懸濁液。為了使細胞不在瓊脂糖溶液中局部過濃，通過吹吸混合瓊脂糖溶液和細胞懸濁液的混合液。在-20℃的冷藏庫中，使該混合液的液體溫度降低，使混合液凝膠化，將其作為對照F。另外，將瓊脂糖溶液和細胞懸濁液的總體積調(diào)整到200μl。瓊脂糖溶液的瓊脂濃度為4w/v％。對照F相當于本發(fā)明的用于精度管理的疑似組織。
解凍對照F后，加入800μl勻漿試劑，用移液器進行10次往復(fù)破碎操作。將得到的勻漿物在大約2000g下，離心大約1分鐘，取20μl上清，將其作為用于測定的試樣vi，裝入到微管f中。
<用于測定的試樣vii的制備>
首先，制備對照G。對照G除了不用細胞懸濁液之外，按照和對照F相同的方法進行制備。
向?qū)φ誈中添加800μl勻漿試劑，用研杵進行10次往復(fù)破碎操作。將得到的勻漿物在大約2000g下離心大約1分鐘，取20μl作為用于測定的試樣vii，裝入到微管g中。
<擴增上揚時間的測定>
向微管e、f和g中分別加入180μl勻漿試劑，10倍稀釋用于測定的試樣v、vi和vii。
用基因擴增檢測裝置GD-100(Sysmex公司)，擴增對應(yīng)于稀釋的各用于測定試樣的CK19mRNA的cDNA，實時監(jiān)測伴隨著擴增增大的渾濁度變化。
測定結(jié)果如圖12所示。
圖12(1)、(2)和(3)分別為表示用于測定的試樣v、vi和vii的擴增上揚時間的圖表。
作為陽性對照的用于測定試樣v的擴增上揚時間為12.7分鐘，用于測定的試樣vi的擴增上揚時間為12.9分鐘。此外，沒有發(fā)現(xiàn)作為陰性對照的用于測定的試樣vii的擴增上揚。
通過以上的測定結(jié)果可知，如果正確進行了疑似組織的勻漿，由疑似組織得到的用于測定的試樣的擴增上揚時間顯示出和作為陽性對照的用于測定的試樣v的擴增上揚時間非常近似的值，可判定可將該疑似組織作為精度管理物質(zhì)。
本說明書中，僅記述了對從生物體切除的組織實施預(yù)處理，通過檢測切除組織中含有的核酸推測有無疾病的情況，還可以通過測定切除的組織中含有的所定的蛋白質(zhì)的表達量或活性推測有無疾病。因為在這種情況下需要進行切除組織的預(yù)處理，可以通過使用由細胞和保持細胞的保持體組成的疑似組織檢測蛋白質(zhì)，進行預(yù)處理的精度管理。通過測定吸光度或檢測蛋白質(zhì)的表達、活性分析檢測預(yù)處理的疑似組織中含有的蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.由核酸或細胞、和能保持上述核酸或細胞的凝膠組成的用于精度管理的疑似組織。
2.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述核酸是RNA。
3.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述核酸是mRNA。
4.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述細胞是癌細胞。
5.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述凝膠含有溶劑和凝膠化劑。
6.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述凝膠通過加熱而流動化。
7.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述凝膠含有選自天然高分子和合成高分子中的至少一種。
8.在權(quán)利要求1的用于精度管理的疑似組織中，上述凝膠含有瓊脂、瓊脂糖、角叉菜膠、藻酸、藻酸鹽、果膠、膠原、明膠、谷蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇、和聚丙烯酰胺中的至少一種。
9.包括下述步驟的精度管理方法對由核酸或細胞、和能保持上述核酸或細胞的保持體組成的、具有所定表示值的用于精度管理的疑似組織實施包括勻漿在內(nèi)的核酸抽提處理，測定由此得到的試樣的核酸濃度；將上述核酸濃度的測定值和上述表示值比較，判斷上述核酸抽提處理是否適當。
10.包括下述步驟的精度管理方法對由目的核酸或含有目的核酸的細胞、和能保持上述目的核酸或含有上述目的核酸的細胞的保持體組成的、具有所定表示值的用于精度管理的疑似組織實施勻漿，擴增由此得到的試樣中含有的目的核酸的擴增工序；檢測擴增的目的核酸，測定來自上述疑似組織目的核酸濃度的測定工序；和將上述疑似組織的目的核酸濃度的測定值和上述表示值比較，判斷上述擴增工序和上述測定工序是否適當?shù)墓ば颉?br> 11.在權(quán)利要求10的方法中，上述目的核酸選自編碼腫瘤標記物的一部分的基因、編碼腫瘤標記物全部的基因、對應(yīng)于這些基因的mRNA以及上述核酸的部分序列中的至少一種。
12.在權(quán)利要求11的方法中，上述腫瘤標記物是細胞角蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠在基因檢查中可用于預(yù)處理精度管理的用于精度管理的疑似組織。該用于精度管理的疑似組織由核酸或者細胞、和能保持上述核酸或者細胞的凝膠所組成。
文檔編號G01N33/50GK1763230SQ20051011366
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者山崎正稔, 藤本敬二 申請人:希森美康株式會社