專利名稱：用于篩查食管癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于癌癥篩查和/或早期診斷的蛋白質(zhì)芯片，以及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的篩查試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了用于篩查食管癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片和由此蛋白質(zhì)芯片衍生的篩查試劑盒及其在健康人群或高危人群中進(jìn)行食管癌癌前病變的篩查和/或早期診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食管癌是人類常見腫瘤之一，發(fā)病率高、死亡率高，目前食管癌的五年死亡率仍然在90％以上，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。食管癌死亡率高的最重要的原因是食管癌的診斷率低，早期食管癌病人無明顯體征，因而到醫(yī)院就診的病人絕大多數(shù)是中晚期病人。食管癌的發(fā)生、發(fā)展具有明顯的階段性，通常經(jīng)歷食管炎、食管鱗狀上皮不典型增生(包括輕中重三級不典型增生)、原位癌，最終發(fā)展為浸潤癌。食管鱗狀上皮不典型增生是食管癌的癌前病變，這一階段稱之為食管癌發(fā)生的癌前階段。將食管癌癌前病變患者從人群中篩查出來，進(jìn)行干預(yù)性治療可以將食管癌的發(fā)生阻斷在癌前階段，這對于提高食管癌的治愈率及降低死亡率具有重大意義。
目前常用的食管癌癌前病變的診斷技術(shù)包括中國食管氣囊拉網(wǎng)脫落細(xì)胞檢查、日本海綿球拖拉脫落細(xì)胞檢查、胃液隱血檢測技術(shù)、食管鏡檢查及食管粘膜碘染色。
二十世紀(jì)五十年代末，河南醫(yī)科大學(xué)首先開展了應(yīng)用“雙腔管帶網(wǎng)氣囊”進(jìn)行食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞學(xué)檢查。1993年的一組204個(gè)病例的報(bào)告顯示，依據(jù)食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)和診斷的早期癌手術(shù)切除后5、10和25年的生存率分別為92.6％、71.6％和48.0％，效果令人滿意。但在普查過程中發(fā)現(xiàn)該技術(shù)也存在諸多問題。1972到1996年間，在我國食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行的多次共71890人的普查中，食管拉網(wǎng)脫落細(xì)胞學(xué)檢查對食管癌重度不典型增生的檢出率在1％-10％之間，差別較大。造成這一問題的原因可能是由于該技術(shù)受到拉網(wǎng)操作醫(yī)生、細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生的水平，診斷標(biāo)準(zhǔn)等多因素的影響。1980年后，隨著食管內(nèi)鏡技術(shù)的普及，發(fā)現(xiàn)拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性低，漏診率高。1995年和2002年兩次對437人和742人的食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查與食管鏡及食管粘膜碘染色檢查的雙盲對比研究發(fā)現(xiàn)，食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查對不典型增生的敏感性分別為33.6％和30.3％，即有接近70％的患者被漏診。而且由于食管拉網(wǎng)過程太痛苦，患者的接受率越來越低。
日本海綿球拖拉脫落細(xì)胞檢查與食管拉網(wǎng)相比，具有操作簡單，受檢者痛苦少，接受率效率高的優(yōu)點(diǎn)。但是，但食管上皮脫落細(xì)胞收集率低，效果差，敏感性低。一組460例45-65歲高發(fā)區(qū)的自然人群，每人連續(xù)3項(xiàng)三盲檢查，先海綿球，然后食管拉網(wǎng)，最后內(nèi)鏡檢查(術(shù)中加碘染色)，三者最后確診為食管者分別為0，11，23例，可見日本海綿球拖拉脫落細(xì)胞檢查普查應(yīng)用價(jià)值不大。
由于吞咽食物和食管蠕動的摩擦，使食管粘膜表面脆弱的病灶易受到損傷并導(dǎo)致病變細(xì)胞的脫落和出血。這些細(xì)胞和血液可隨食物或唾液流入胃內(nèi)，存入胃液。按此設(shè)想，秦德興設(shè)計(jì)了胃隱血檢測篩查法。在一個(gè)速溶膠囊內(nèi)裝棉球，膠囊在胃液中溶化釋放棉球，棉球吸附1ml的胃液，拿出體外進(jìn)行潛血試驗(yàn)。魏德興報(bào)告一組4970例胃液隱血檢測，(++)和(+++)陽性者共372例，其中284例接受內(nèi)鏡檢查，21例診斷為食管癌。對食管癌的敏感度52.5％，特異度74.9％，漏診率47.5％，不能檢測出食管癌癌前病變。形若齊設(shè)計(jì)的一組隱血試驗(yàn)和內(nèi)鏡檢查的雙盲試驗(yàn)(495例)，證明胃隱血檢測篩查法對食管癌的敏感度21.3％，特異度90.2％，癌漏診率達(dá)78.7％，對癌前病變的檢出率為0。陸建邦1994年對476人的檢查結(jié)果認(rèn)為該方法對食管癌及其癌前病變的漏診率為100％。由于胃隱血檢測篩查法的靈敏度低漏診率高，對食管癌及其癌前病變沒有篩查的價(jià)值。
食管內(nèi)鏡檢查時(shí)應(yīng)用碘染色的檢查方法是為了提高食管癌及其癌前病變的發(fā)現(xiàn)率和診斷率。1993-1994年日本yokoyama首先將此方法應(yīng)用于食管癌的篩查。對629例40歲以上的無任何食管癌有關(guān)癥狀的男性進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)了21例食管癌，其中包括8例原位癌，檢出率為3.3％。1995年王國清等在河南林縣用此方法篩查食管癌高危人群460例，檢出食管癌16例，檢出率3.47％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)重度不典型增生26例，檢出率5.65％。2002年王國清等報(bào)道了一組3022例40-69歲的高危地區(qū)人群的篩查結(jié)果。用該方法檢出食管鱗癌131例，檢出率4.33％；輕度不典型增生676例，檢出率22.4％；中度不典型增生506例，檢出率16.7％；重度不典型增生153例，檢出率5.1％；原位癌100例，檢出率3.3％。實(shí)踐說明食管內(nèi)鏡加碘染色的方法重復(fù)性高可靠性好，發(fā)現(xiàn)食管癌和癌前病變的準(zhǔn)確性在99％以上，漏診率很低。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，曾考慮用該方法作為篩查的手段。但是，由于該方法成本高，檢查效率低，不適合作大規(guī)模的人群篩查。另外，由于此方法為侵入性檢查，受檢者過于痛苦，受檢者順從率低。因此，在我國現(xiàn)有國情下不可能成為大規(guī)模食管癌高危人群的普查方法。
隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，在研究食管癌病因的同時(shí)，也在分子水平上對食管癌發(fā)生發(fā)展有了更多的了解。已有的研究表明在食管癌發(fā)生發(fā)展的多階段過程中，細(xì)胞形態(tài)的惡性生物學(xué)改變伴隨著其分子水平的多種基因參與和改變，它們包括癌基因的擴(kuò)增、過度表達(dá)、突變和抑癌基因的缺失、突變、易位、重排等等多種基因的改變。到目前為止，已報(bào)道的與食管癌發(fā)生相關(guān)的基因異常改變約有十余種。最常見的癌基因改變有細(xì)胞周期蛋白cyclinD、cyclinE等，表皮生長因子EGF及其受體EGFR和c-erbB-2基因，mdm-2、HER2、myc基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)等等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)P53、Rb、p16、Bcl-2、int-2、E-Cadherin等抑癌基因的突變、缺失、轉(zhuǎn)導(dǎo)、易位及甲基化等改變。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的分析還發(fā)現(xiàn)，多個(gè)染色體上某些區(qū)段的擴(kuò)增或缺失與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如1q、3q2、5p、8q和20q染色體DNA拷貝數(shù)增加和3p、9p、13q、18q和Xp拷貝數(shù)減少等。為檢測這些基因的改變，相繼建立和發(fā)展起來多種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如各種PCR技術(shù)(RT-PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLPs)，各種核酸雜交技術(shù)(Southern、Northern、比較基因組雜交技術(shù)等)，以及近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和微衛(wèi)星多態(tài)性分析技術(shù)等。但這些技術(shù)對病患的判斷均需依賴于病灶組織或病變細(xì)胞的獲得。然而陽性樣本的獲取難度較大，而且很難在食管癌的癌前階段采集到所需的標(biāo)本，使這些技術(shù)在食管癌癌前病變的篩查中難以發(fā)揮相應(yīng)的作用。加之這些技操作復(fù)雜，技術(shù)難度高，重復(fù)性差，需要特殊試劑和儀器，其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性尚難以定論，目前國內(nèi)外均未將這些技術(shù)作為人群普查篩檢食管癌癌前的手段和方法。
目前大約已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50余種人食管鱗癌生物標(biāo)志物，它們或與人食管鱗癌的易感性相關(guān)，或與食管鱗癌發(fā)生直接相關(guān)，或與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)，或與食管鱗癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，或與食管鱗癌臨床分期相關(guān)，或與食管鱗癌耐藥相關(guān)等等。這些標(biāo)志物包括P53、p63、MDM2、RB、cdk4、cdk6、cyclin D1、cdk2、cyclin E、P16INK4A、p21Cip1/WAF1 EGFR、c-erbB-2、int-2、hst-1、TGF-beta、Smad 1、Smad 5、TGF-beta R-I、TGF-betaR-II、Fas、Fas ligand、bcl-2、Bcl-xl、E-cadherin、CD44、Integrin、laminin、fibronectin、MMPs-1、MMPs-2、MMPs-4、MMPs-7、MMPs-9、MMPs-12、MT1-MMP、myc、COX-2、annexin I，annexin II，small proline-rich proteins(SPRRs)、calcium-binding S100 proteins(S100A2，S100A8，S100A9)、cytochrome P-450s(CYP2E1，CYP2A6，and CYP2D6)、CYP2E1、CYP2A6、CYP1A1 GSTM1、GSTs(GSTT1，GSTP1)、N-acetyltransferase2(NAT-2)、MGMT、hMLH1、XRCC1等等。(Xing D，Tan W，Lin D.中國人群食管癌的遺傳多肽和易感性.腫瘤學(xué)報(bào)道.2003Sep-Oct；10(5)1615-23.Ferec C，Giroux MA，Audrezet MP，RobaszkiewiczM.腫瘤蛋白P53和食管癌.病理生理(巴黎).1997 Dec；45(10)871-5.Shimada Y，Imamura M.食管癌的預(yù)警標(biāo)志一從分子生物學(xué)的觀點(diǎn).日本Gan To Kagaku Ryoho.1996 Jul；23(8)972-81.Streit M，Schmidt R，Hilgenfeld RU，Thiel E，Kreuser ED.胃腸道腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中的黏附分子.分子醫(yī)學(xué)雜志.1996 May；74(5)253-68.Riddell RH.食管和食管胃連接處的惡性增生的早期發(fā)現(xiàn).美國消化道雜志.1996 May；91(5)853-63.Sasaki H，Watanabe H，Terada M.食管鱗狀細(xì)胞癌的遺傳學(xué)改變?nèi)毡綨ippon Rinsho.1996 Apr；54(4)1060-5.Montesano R，Hollstein M，HainautP.食管癌發(fā)生的分子機(jī)理.法國Ann Ist Super Sanita.1996；32(1)73-84.Tahara E.胃腸道腫瘤的遺傳學(xué)改變，分子診斷的應(yīng)用.癌癥.1995 Mar15；75(6 Suppl)1410-7.Roth JA.食管癌的細(xì)胞及分子生物學(xué).北美胸部外科臨床.1994 May；4(2)205-16.Tahara E.人胃腸道腫瘤的生長因子和抑癌基因.臨床腫瘤學(xué)癌癥研究雜志.1990；116(2)121-31.Rhonda F，Souza，MD.上消化道腫瘤的分子和生物學(xué)基礎(chǔ)-食管癌.北美外科腫瘤臨床.2002 11257-272.Alfred King，Y.Lam.食管鱗狀細(xì)胞癌的分子生物學(xué).腫瘤學(xué)及血液學(xué).2000 3371-90.)。這些食管癌相關(guān)生物標(biāo)志物中，多數(shù)屬于位于胞漿和胞核的類型，另外的EGFR、c-erbB-2、TGF-beta R-I、TGF-beta R-II、Fas、Fas ligand、E-cadherin、CD44、Integrin、laminin、fibronectin等標(biāo)志物位于食管癌癌細(xì)胞表面，大致分為三大類，受體類、細(xì)胞表面粘附分子和細(xì)胞表面糖蛋白類?？偟膩碚f，這些標(biāo)志物單獨(dú)診斷食管癌的意義不是太高。
以上方法均是直接檢測樣品中發(fā)生改變的抗原、蛋白或基因。與以上檢測方法明顯不同，近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血液中含有針對腫瘤抗原或自身抗原的抗體，某些抗原的相應(yīng)抗體在正常人和腫瘤病人中的分布呈現(xiàn)一定的特異性，可能具有一定的診斷價(jià)值。但目前發(fā)現(xiàn)的這些種類的抗原在腫瘤病人當(dāng)中陽性率低，單獨(dú)應(yīng)用或少數(shù)幾種聯(lián)合應(yīng)用時(shí)診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度都不夠，不能作為一種新的診斷方法。目前根據(jù)研究該類抗原的權(quán)威組織統(tǒng)計(jì)(http//www2.licr.org/CancerImmunomeDB/SerexSearchDB.php)，在食管鱗狀細(xì)胞癌中，這類抗原已發(fā)現(xiàn)多個(gè)，分別是NY-ESO-1、TROP2，SURF1、LOC146223、HOOK2和AGENCOURT_7565913。在其他腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)了可以與食管癌交叉反應(yīng)的這類抗原，如NY-ESO-1等。這些抗原在食管癌和食管癌癌前病變的陽性率低，不具有單獨(dú)的診斷的意義。
綜上所述，上述眾多的食管癌診斷技術(shù)中，目前國內(nèi)外常用的食管癌前病變的篩檢診斷技術(shù)主要為食管鏡檢查及食管粘膜碘染色，但其檢查效率低，病人順從率低。因此，研究開發(fā)易于在人群篩查中廣泛推廣應(yīng)用的簡便、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)無痛的食管癌癌前病變篩查早診技術(shù)是國內(nèi)外攻克食管癌癌前病變篩查的“關(guān)口”的難點(diǎn)和重點(diǎn)。從血液中檢測各種分子標(biāo)志物的技術(shù)方法，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、無創(chuàng)無痛易于接受的特點(diǎn)，優(yōu)于上面所述的各種技術(shù)，但是目前尚缺乏敏感性和特異性均較高的檢查指標(biāo)，食管癌癌前病變涉及的多種基因及分子的改變均難以在血清中檢出。目前尚未見到任何關(guān)于采用多種蛋白質(zhì)抗原檢測血清中相應(yīng)抗體的含量，并以此判斷被檢人是否患有食管癌癌前病變的報(bào)道。目前也尚未見到多蛋白樣品的蛋白質(zhì)芯片用于檢測人血清中相應(yīng)抗體含量的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種新的可用于癌癥篩查和/或早期診斷的蛋白質(zhì)芯片。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片是用于篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片包含但不限于SEQ ID NO1-16所示的多肽或其抗原性片段，通過該蛋白質(zhì)芯片可以檢測來自被檢人的樣品例如血液(血清、血漿或全血成分)中這些特定的多肽或其抗原性片段的相應(yīng)抗體的存在和/或含量，聯(lián)合分析這些多肽或其抗原性片段相應(yīng)抗體檢測的結(jié)果，可以用來判定被檢人是否患有食管鱗癌癌前病變。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一類由上述蛋白質(zhì)芯片衍生制成的癌前病變篩查試劑盒，特別是食管鱗癌癌前病變的篩查試劑盒。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于如上所述的蛋白質(zhì)芯片及由其衍生的診斷試劑盒在篩查和/或診斷癌前病變中的應(yīng)用，優(yōu)選地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片及診斷試劑盒在食管鱗癌癌前病變診斷、健康人群或高危人群食管鱗癌癌前病變篩查中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明同時(shí)提供了一種癌前病變特別是食管鱗癌癌前病變的診斷方法，其包括使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片或診斷試劑盒對來自被檢人的生物學(xué)樣品如血液進(jìn)行檢測并分析。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種新的可用于癌癥篩查和/或早期診斷的蛋白質(zhì)芯片。使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片，通過檢測生物學(xué)樣品中針對特定蛋白質(zhì)抗原的相應(yīng)抗體的存在和/或含量，可實(shí)現(xiàn)對癌癥的篩查和/或早期診斷。
優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片是用于篩查和診斷人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，所述蛋白質(zhì)芯片的特征在于其包含但不限于選自以下一組的多肽或其抗原性片段的斑點(diǎn)(1)具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的H3F3B多肽；(2)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的DNAJA1多肽；(3)具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的TK1多肽；(4)具有SEQID NO4所示氨基酸序列的RBPSUH多肽；(5)具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的PCNA多肽；(6)具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的EIF4G3多肽；(7)具有SEQ ID NO7所示氨基酸序列的RPS3多肽；(8)具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的RPL32多肽；(9)具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的COPB2多肽；(10)具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的TP53多肽；(11)具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的EFHD2多肽；(12)具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的HNRPA1多肽；(13)具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的RPL6多肽；(14)具有SEQ IDNO14所示氨基酸序列的EEF1A1多肽；(15)具有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的TRAF4多肽；(16)具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的MAGE-3多肽。
通過檢測人的樣品如血液樣品中所述的蛋白質(zhì)、多肽或其抗原性片段的相應(yīng)抗體的存在和/或含量，以通過聯(lián)合分析各蛋白質(zhì)相應(yīng)抗體的檢測結(jié)果可以判斷被檢人是否存在食管鱗癌癌前病變。
在本發(fā)明中，術(shù)語“抗原”是指能夠在體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)性蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述抗原為具有選自SEQ ID NO1-16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、多肽或其抗原性片段，也可以是包含上述氨基酸序列的任何多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”具有相同的含義。因?yàn)楸景l(fā)明是采用這些蛋白質(zhì)抗原檢測可以與之結(jié)合的抗體，因此顯而易見的是，只要采用包含上述氨基酸序列的任何多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)，或者是所述多肽或蛋白質(zhì)的抗原性片段，均可以具有幾乎相同的免疫學(xué)特性，從而也可以用于檢測可以與這些蛋白質(zhì)抗原結(jié)合的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的相應(yīng)于SEQ ID NO1至SEQID NO16的16種抗原是經(jīng)采用混合人食管鱗癌癌前病變組織(包括3例中度不典型增生、10例重度不典型增生、1例食管鱗癌)建立表達(dá)cDNA文庫，并通過54例自體和異體食管鱗癌癌前病變病人血清進(jìn)行免疫印跡篩選、削減抑制雜交篩選、去Ig背景篩選后獲得的在食管鱗癌癌前病變病人血清中存在相應(yīng)抗體的抗原，在篩選完1×106pfu的庫之后，共獲得了75個(gè)可與食管鱗癌癌前病變病人血清反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原克隆。
將上述抗原的基因克隆入帶有正確讀碼框的原核表達(dá)載體(例如pET30-b(+))，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，提取包函體并初步純化，獲得了該食管鱗癌癌前病變抗原的重組蛋白。采用上述重組蛋白，以適量濃度點(diǎn)于免疫印跡膜上，采用食管鱗癌癌前病變32例、食管癌和正常人血清各20例，并采用酶聯(lián)免疫印跡法檢測，挑選正常人的陽性率與食管鱗癌癌前病變病人的陽性率有較大差異的克隆。按此方法獲得了22個(gè)與正常人血清反應(yīng)的陽性率與食管鱗癌癌前病變患者有較大差異的抗原克隆。
可采用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片。例如，可將前述獲得的抗原的重組蛋白采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣于醛基化的玻璃基片上，每點(diǎn)的濃度約1-2mg/ml，點(diǎn)樣量約4-10nl。此外，可采用任何合適的方法例如免疫熒光的方法檢測被檢樣品(例如血清)中針對這些抗原的抗體。本發(fā)明人共采用上述方法檢測了323例食管鱗癌癌前病變患者血清，291例食管鱗癌病人血清和462例正常人血清，結(jié)果顯示，其中16種抗原在食管鱗癌癌前病變患者血清和正常人血清中的相應(yīng)抗體存在較大的差異，聯(lián)合分析診斷食管鱗癌癌前病變的靈敏度可達(dá)91.3％，而準(zhǔn)確度也可達(dá)76％。其中對癌前輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌的敏感性和特異性分別為92％和78％、94％和94％、93.8％和80％、95％和90％。這16種抗原分別是(1)H3F3B多肽；(2)DNAJA1多肽；(3)TK1多肽；(4)RBPSUH多肽；(5)PCNA多肽；(6)EIF4G3多肽；(7)RPS3多肽；(8)RPL32多肽；(9)COPB2多肽；(10)TP53多肽；(11)EFHD2多肽；(12)HNRPA1多肽；(13)RPL6多肽；(14)EEF1A1多肽；(15)具TRAF4多肽；(16)MAGE-3多肽。
以上結(jié)果說明，采用含上述16種蛋白質(zhì)抗原的蛋白質(zhì)芯片檢測血液中針對上述16種抗原的相應(yīng)抗體的含量，并且進(jìn)行聯(lián)合分析，有助于判斷被檢人是否患有食管鱗癌癌前病變，這種聯(lián)合分析對于食管鱗癌癌前病變診斷具有較高的靈敏度和特異度，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。在本發(fā)明中，術(shù)語“食管癌癌前病變”指的是各類食管不典型增生，也包括食管原位癌。
因此，本發(fā)明提供了一種新的可用于篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片可用于聯(lián)合檢測分析來自被檢人的樣品中16種特定抗原的相應(yīng)抗體的存在和/或含量，從而判斷被檢人是否為食管鱗癌癌前病變患者。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)芯片采用被檢人的血液樣品為檢測樣品?？刹捎酶鞣N適宜的方法分別檢測16種特定抗原的相應(yīng)特異性抗體在樣品中的相對含量，每種抗原相應(yīng)抗體的相對含量都有一個(gè)相應(yīng)的閾值，被檢血樣高于(或低于)此值的被判斷為陽性，聯(lián)合分析這16種抗原相應(yīng)抗體陽性的總數(shù)，當(dāng)被檢人的16種抗原陽性總數(shù)的值大于一個(gè)相應(yīng)的閾值時(shí)，該被檢人被判為陽性，即被診斷為食管鱗癌癌前病變疑似患者。該蛋白質(zhì)芯片經(jīng)在323人的食管鱗癌癌前病變患者和462人的正常人中驗(yàn)證，其靈敏度為91.3％，準(zhǔn)確度為76％。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)越之處在于1)檢測的指標(biāo)是特定抗原的相應(yīng)抗體在被檢人血清中的含量，即被檢人在體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的針對這些抗原的自身抗體的水平，而不是這些抗原本身在被檢人體內(nèi)的表達(dá)水平。相對于直接檢測抗原本身來說，抗原的相應(yīng)抗體在癌癥發(fā)生的早期就可以產(chǎn)生，此時(shí)抗原也許尚不能在血液中被檢出，因而比直接檢測抗原來說可診斷的癌前病變可能更??；抗原的相應(yīng)抗體更容易進(jìn)入血液循環(huán)而被檢測到，同時(shí)人體可以對微量抗原產(chǎn)生相當(dāng)多的相應(yīng)抗體，具有一定的放大作用；另外，人體對這些抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體的情況也在一定程度反映了人體抗癌前病變(例如食管鱗癌癌前病變癌)免疫反應(yīng)的狀態(tài)，在一定程度上加強(qiáng)了檢測結(jié)果反映被檢人是否患有癌前病變癌的準(zhǔn)確性。
2)結(jié)果判定是在聯(lián)合分析多種抗原相應(yīng)抗體檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上做出的，具有更好的靈敏度和準(zhǔn)確度。例如，現(xiàn)行的食管鱗癌癌前病變診斷技術(shù)方法目前均采用單一指標(biāo)，所以診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度往往達(dá)不到很高。本發(fā)明所采用的16種抗原單獨(dú)檢測食管鱗癌的靈敏度和準(zhǔn)確度都不是很高，但聯(lián)合分析之后該方法診斷食管鱗癌的靈敏度和準(zhǔn)確度都大大提高，達(dá)到了一個(gè)大規(guī)模人群篩查可接受的水平。多標(biāo)志物聯(lián)合分析的觀點(diǎn)與現(xiàn)在公認(rèn)的食管鱗癌發(fā)生是一個(gè)多基因、多過程參與的觀點(diǎn)是相一致。
3)本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片所采用的16種抗原中有7種(H3F3B多肽、TK1多肽、PCNA多肽、RPS3多肽、EFHD2多肽、RPL6多肽、具TRAF4多肽)目前尚未見到食管鱗癌癌前病變病人體內(nèi)存在相應(yīng)抗體的報(bào)道，也尚未見到其用于診斷、檢測食管鱗癌癌前病變的報(bào)道。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了由本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片衍生的篩查癌前病變例如食管鱗癌癌前病變的試劑盒。這類篩查食管鱗癌癌前病變的試劑盒可用于非侵入性地診斷人食管鱗癌癌前病變。本發(fā)明的篩查試劑盒可以采用但不限于采用在此具體使用的蛋白質(zhì)芯片，實(shí)際上，這些試劑盒可以在本領(lǐng)域共知的范圍內(nèi)，加上其它一些對照以便進(jìn)行結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化判斷，或是在上述具體提及的16種蛋白質(zhì)抗原的基礎(chǔ)上，再增加其它的檢測指標(biāo)來聯(lián)合判斷。另外，由本發(fā)明提供的食管鱗癌癌前病變篩查方法衍生的試劑盒也可以采用本領(lǐng)域共知的范圍內(nèi)的多種技術(shù)手段來檢測各抗原相應(yīng)抗體的含量，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，例如免疫熒光、免疫印跡、放射免疫、酶聯(lián)免疫吸附等，檢測抗原相應(yīng)抗體的手段的不同并不會影響對被檢人是否為食管鱗癌癌前病變患者的判斷。
根據(jù)本發(fā)明提供的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，很容易獲得由該蛋白質(zhì)芯片衍生的各種診斷試劑盒。本發(fā)明提供的可用于食管鱗癌癌前病變診斷的蛋白質(zhì)芯片的核心關(guān)鍵在于該芯片包含選自具有SEQ ID NO1-16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)抗原，從而可以通過該蛋白質(zhì)芯片檢測這些特定抗原相應(yīng)抗體在被檢人血液中的含量。從本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)知識很容易推出，采用何種技術(shù)手段檢測抗原相應(yīng)抗體的存在和/或含量，以及采用何種抗原的存在形式(天然抗原、重組蛋白抗原、合成多肽)來檢測均不會影響該方法對被檢人是否患有食管鱗癌癌前病變的判斷；可以預(yù)期的是，在任何食管鱗癌癌前病變診斷試劑盒中只要包含了檢測在此所述的16種抗原的相應(yīng)抗體的檢測指標(biāo)，該試劑盒檢測食管鱗癌癌前病變的靈敏度和特異度就應(yīng)該至少達(dá)到本發(fā)明涉及的方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，額外地增加其它食管鱗癌癌前病變相關(guān)的檢測指標(biāo)一般均能在本發(fā)明涉及的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高診斷靈敏度和準(zhǔn)確度。不過，使用在此具體給出多肽中的一部分多肽或其片段制備的蛋白質(zhì)芯片也能夠在一定程度上有助于判斷被檢人是否患有食管鱗癌癌前病變。
下面舉一些簡單的制備本發(fā)明涉及的篩查食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片衍生的試劑盒的例子?？梢酝ㄟ^以下方法獲得本發(fā)明的試劑盒，但不只限于下列方法。在大腸桿菌中表達(dá)包含有本發(fā)明所述的16種抗原特征氨基酸序列的重組蛋白或重組融合蛋白，純化分離這些目標(biāo)蛋白，使其純度達(dá)到80％以上，在各抗原以及人IgG、人IgM(以上兩種為對照，以便進(jìn)行橫向參比)中加入適量的生物素化的BSA，以適宜的濃度點(diǎn)樣于經(jīng)醛基化處理的玻璃基片上，抗原將共價(jià)交聯(lián)于基片之上，采用牛血清封閉剩余的交聯(lián)位點(diǎn)，干燥后低溫干燥保存，這就是試劑盒中的檢測玻片；將人IgG及人IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，選擇適宜的濃度梯度點(diǎn)樣于經(jīng)醛基化處理的玻璃片基上，抗體標(biāo)準(zhǔn)品將共價(jià)交聯(lián)于基片之上，采用牛血清封閉剩余的交聯(lián)位點(diǎn)，干燥后低溫干燥保存，這就是試劑盒中的檢測校正玻片；將含10％牛血清的PBS(0.01mol/Lm，pH7.4)無菌過濾裝瓶，這就是樣品稀釋液；將含0.02％Tween20的PBS(0.01mol/Lm，pH7.4)無菌過濾裝瓶，這就是洗滌液；將含有適宜稀釋度的鏈霉親和素-Cy5熒光標(biāo)記二抗、鏈霉親和素-Cy3熒光標(biāo)記二抗、羊抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗及羊抗人IgM-Cy3熒光標(biāo)記二抗裝瓶，這就是熒光二抗。以上五種成分即可組裝成一種由本發(fā)明所述方法衍生的食管鱗癌診斷試劑盒，應(yīng)用時(shí)，在檢測玻片的點(diǎn)樣區(qū)加入熒光標(biāo)記的鏈霉親和素37℃下保濕孵育1小時(shí)，采用洗滌液洗滌3次。將被檢人血清取2μl，以樣品稀釋液稀釋至20μl，取10μl加在檢測玻片上覆蓋點(diǎn)樣區(qū)，37℃下保濕孵育1小時(shí)；而取10ul的稀釋液加在檢測校正玻片上覆蓋點(diǎn)樣區(qū)。采用洗滌液洗滌3次，加入與鏈霉親和素標(biāo)記熒光不同的抗人IgG或人IgM熒光二抗(例如，鏈霉親和素為Cy-3標(biāo)記，則加入羊抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗)，37℃下保濕孵育1小時(shí)，采用洗滌液洗滌5次，干燥后在激光共聚焦芯片讀片機(jī)上讀取各點(diǎn)樣點(diǎn)熒光的顏色和強(qiáng)度。各抗原點(diǎn)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度代表了相應(yīng)抗體的相對含量，生物素化的BSA與鏈霉親和素反應(yīng)的熒光強(qiáng)度可作為抗原抗體反應(yīng)的內(nèi)參照，人IgG、IgM的熒光強(qiáng)度可作為各被檢人橫向參比的對照，而由不同稀釋度的人IgG或IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可作為抗體含量的量化標(biāo)準(zhǔn)和批間反應(yīng)的對照。按預(yù)先確定好的各抗原的閾值分析各抗原熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)，可判斷被檢人該抗原相應(yīng)抗體是否為陽性，累加16種抗原的陽性數(shù)，再根據(jù)預(yù)先確定的陽性數(shù)閾值即可判斷該被檢人是否為食管鱗癌患者。在上述衍生試劑盒的基礎(chǔ)上，可再增加檢測指標(biāo)，例如，將NY-ESO-1抗原額外作為1種抗原也點(diǎn)于玻片上，就可以衍生出另外一種試劑盒，并可能增加該試劑盒診斷食管鱗癌癌前病變癌的靈敏度和準(zhǔn)確度。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供了所述的篩查人食管鱗癌癌前病變癌的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒在食管鱗癌癌前病變診斷、健康人群或高危人群食管鱗癌癌前病變篩查中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明還提供了食管鱗癌癌前病變的診斷方法。
針對人群中被懷疑為食管鱗癌癌前病變的被檢者，可抽取其血液樣品，采用本發(fā)明所涉及的篩查食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒，檢測被檢人血液中是否存在與在此所述的抗原相應(yīng)的抗體及其含量，進(jìn)而判斷被檢者是否為食管鱗癌癌前病變患者。由于檢測方法或試劑盒的各種對照的差異，判斷被檢者是否為食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)并不是唯一的，一旦被檢者被采用本發(fā)明判斷涉及的診斷方法或由該方法衍生的試劑盒判斷為患有食管鱗癌癌前病變，則應(yīng)高度懷疑被檢者為食管鱗癌癌前病變患者，并采用各種檢測手段進(jìn)行各種臨床確診，如臨床不能發(fā)現(xiàn)病灶，則應(yīng)密切隨訪監(jiān)測被檢者食管鱗癌癌前病變發(fā)生發(fā)展的情況。
對于普通的健康人群或醫(yī)學(xué)上定義的食管鱗癌癌前病變高危人群，則可以采用本發(fā)明所涉及的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒對他們進(jìn)行普查篩檢，抽取被檢人群的血液樣本，按上述方法判定其是否患有食管鱗癌癌前病變，一旦被檢者被采用本發(fā)明判斷涉及的診斷方法或由該方法衍生的試劑盒判斷為患有食管鱗癌癌前病變，則應(yīng)采用各種檢測手段進(jìn)行各種臨床確診，如臨床不能發(fā)現(xiàn)病灶，則應(yīng)密切隨訪監(jiān)測被檢者食管鱗癌癌前病變發(fā)生發(fā)展的情況。
總的來說，利用本發(fā)明提供的新的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒，可以非常方便、快捷、無創(chuàng)、高效地從食管鱗癌癌前病變高危人群，以及參加檢測的正常健康人群中普查篩檢食管鱗癌癌前病變患者。
下面將結(jié)合實(shí)施例來說明如何實(shí)施本發(fā)明所述的新的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，如何由該蛋白質(zhì)芯片衍生出相應(yīng)的試劑盒，以及如何用上述新的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片及其衍生的診斷試劑盒診斷、普查、篩檢食管鱗癌癌前病變疑似患者、食管鱗癌高危人群以及健康人群。
實(shí)施例通過參考在此給出的一些具體實(shí)施例可獲得對本發(fā)明的進(jìn)一步的理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其無意于對本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，可以對本發(fā)明作出多種改動和變化而不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，因此，這些改動和變化同樣在本申請要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1制備新的篩查人食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片并檢測被檢血清樣本將本方法涉及的16種抗原吸附或共價(jià)交聯(lián)于適宜的固相支持物上。這16種抗原可以是提純的天然蛋白，或是重組表達(dá)的蛋白，或是重組表達(dá)的含有各抗原特征氨基酸序列的重組融合蛋白，或是直接合成的各抗原特征氨基酸序列的多肽。所指的固相支持物可以是玻片、免疫印跡膜、免疫吸附所用的各種微孔板等。可以采用靜電作用的方式將抗原直接吸附于固相支持物上，也可以采用共價(jià)交聯(lián)的方式交聯(lián)于固相支持物上。具體舉例為，取適量生物素化的BSA加入到這12種純化后的抗原重組蛋白中，然后加入終濃度為0.05％的Tween-20，充分混勻后以1mg/ml-2mg/ml的濃度點(diǎn)樣于醛基化的玻璃基片表面，此時(shí)這12種抗原被以共價(jià)交聯(lián)的方式交聯(lián)于玻片表面，即已經(jīng)制備成功可用于診斷人食管鱗癌的蛋白質(zhì)芯片。然后再采用牛血清封閉玻片表面的其它未交聯(lián)的反應(yīng)位點(diǎn)。
封閉后首先將Cy3或者Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素與吸附或共價(jià)交聯(lián)這12種抗原的固相支持物表面混合孵育。經(jīng)通常免疫學(xué)技術(shù)采用的各種洗滌劑洗滌后，加入被檢血樣品與固相支持物表面混合孵育，使得被檢血樣品中的這12種抗原的相應(yīng)抗體與固相支持物表面的抗原結(jié)合，從而間接地吸附于固相支持物表面。再經(jīng)通常免疫學(xué)技術(shù)采用的各種洗滌劑洗去非特異吸附的雜蛋白，在固相支持物表面留下相應(yīng)的人抗體和熒光標(biāo)記的鏈霉親和素。具體舉例，將1∶80稀釋的Cy5標(biāo)記的鏈霉親和素或者1∶800稀釋的Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素與已封閉的玻片37度保濕孵育1小時(shí)后，采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗玻片3次。然后將1∶10稀釋的被檢血清與上述已封閉后的玻片室溫保濕孵育1小時(shí)，棄被檢血清，采用0.01mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗玻片3次。
可以采用多種常用免疫學(xué)方法探測上述存留于固相支持物表面的相應(yīng)人抗體，例如免疫熒光法、免疫酶法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法等。具體舉例，可采用免疫熒光法。在與Cy3-鏈霉親和素反應(yīng)后的玻片內(nèi)加入羊抗人IgG-Cy5二抗，而在與Cy5-鏈霉親和素反應(yīng)后的玻片內(nèi)加入羊抗人IgM-Cy3二抗，保濕孵育1小時(shí)。棄熒光二抗液，采用0.01mol/L的pH7.4的PBS沖洗玻片3次，去離子水沖洗玻片1次?？諝飧稍?，于激光共聚焦芯片掃描儀下讀取635nm和530nm的各點(diǎn)熒光強(qiáng)度和面積。其中635nm下該點(diǎn)的總熒光量(或平均熒光強(qiáng)度)代表被檢血清中該點(diǎn)抗原相應(yīng)的IgG抗體的相對含量，530nm下該點(diǎn)的總熒光量(或平均熒光強(qiáng)度)代表被檢血清中該點(diǎn)抗原相應(yīng)的IgM抗體的相對含量。然后進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理首先，將檢測所得抗原點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與點(diǎn)內(nèi)生物素及鏈霉親和素反應(yīng)的熒光強(qiáng)度相除。其次，如果檢測的抗體類型為IgG，在此步驟將經(jīng)過第一步處理后的數(shù)據(jù)與經(jīng)同樣處理的IgG標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值相除；如果檢測的抗體類型為IgM，在此步驟將經(jīng)過第一步處理后的數(shù)據(jù)與經(jīng)同樣處理的孔內(nèi)IgM標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值相除。第三，將IgG或者IgM標(biāo)準(zhǔn)片的數(shù)據(jù)同樣按照以上兩個(gè)步驟進(jìn)行處理。然后根據(jù)IgG或者IgM抗體的稀釋度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過不同批次標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同，對不同批次的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。然后將第二步的數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算抗原在血清中的相應(yīng)抗體含量。參照設(shè)立的對照并與相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可以判斷該被檢人的該抗原的相應(yīng)抗體是否為陽性。
確定單個(gè)抗原是否為陽性后，聯(lián)合分析16個(gè)抗原的結(jié)果，計(jì)算總的抗原陽性的個(gè)數(shù)，再與相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，凡大于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)值者即可判斷為食管鱗癌癌前病變患者。
實(shí)施例2SEQ ID NO1-16相應(yīng)抗原的制備編碼本發(fā)明所述的(1)H3F3B多肽；(2)DNAJA1多肽；(3)TK1多肽；(4)RBPSUH多肽；(5)PCNA多肽；(6)EIF4G3多肽；(7)RPS3多肽；(8)RPL32多肽；(9)COPB2多肽；(10)TP53多肽；(11)EFHD2多肽；(12)HNRPA1多肽；(13)RPL6多肽；(14)EEF1A1多肽；(15)具TRAF4多肽；(16)MAGE-3多肽的DNA片段已預(yù)先采用EcoR I和Xho I酶克隆在pBluescript SK(+/-)原核克隆載體中。EcoR I和Xho I雙酶切重組表達(dá)載體pET30-b(+)，回收約5.4kb的雙酶切片段備用。EcoR I和Xho I雙酶切含各多肽基因的pBluescript SK(+/-)載體，回收各抗原相應(yīng)的雙酶切片段，分別克隆入回收的pET30-b(+)表達(dá)載體中。再分別采用EcoR I和Xho I雙酶切篩選重組克隆。采用堿裂解法大量提取質(zhì)粒，以0.1μg的DNA轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6，加入終濃度為2mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，4小時(shí)以后離心收獲菌體。超聲波震蕩破碎菌體，離心收集沉淀，沉淀為含有目的抗原蛋白的包函體。8M尿素溶解沉淀，4度放置12小時(shí)以上，離心去除不溶物，與Ni親和層析柱混合結(jié)合1小時(shí)。結(jié)合后裝柱，采用pH6.5的8M尿素洗滌層析柱20倍柱體積，然后采用pH5.9的8M尿素洗脫層析柱10倍柱體積，分部收集，最后采用pH4.5的8M尿素洗脫層析柱10倍柱體積，分部收集。洗脫各組分分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，選擇目的蛋白所在的組分進(jìn)行復(fù)性。將目的蛋白所在的組分合并后調(diào)整蛋白濃度至0.25mg/ml，對含2M尿素的緩沖液透析，4度透析12小時(shí)，再對含0.2M尿素的緩沖液透析，4度透析12小時(shí)，再對含0.02M尿素的緩沖液透析，4度透析12小時(shí)，再對不含尿素的緩沖液透析，4度透析12小時(shí)。采用PEG20000吸水濃縮的方法濃縮各抗原至最終濃度為1mg/ml-2mg/ml。離心去沉淀，Lowrry法測定蛋白含量，獲得各抗原的重組蛋白。
實(shí)施例3篩查食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片的衍生試劑盒的制備(蛋白芯片診斷試劑盒)(一)試劑盒的組成1.預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)片。
3.樣品稀釋液。
4.洗滌液濃縮液。
5.熒光標(biāo)記抗人抗體二抗的濃縮液。
6.熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液。
7.試劑盒說明書。
(二)試劑盒各組成成份的制備1.預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片的制備購買商品化的BSA包被并經(jīng)醛基化處理后的載體玻片，例如美國CEL Associates公司的CSS-100型玻片。采用實(shí)施例2制備的16種抗原的純化重組蛋白，以及人IgG(0.2mg/ml)、人IgM(0.2mg/ml)標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品，加入適量的生物素化的BSA和tween-20，采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)將上述18種樣品點(diǎn)于載體玻片上形成微陣列，每玻片點(diǎn)10個(gè)平行的微陣列，每個(gè)微陣列之間采用貼上適宜大小的塑料膜分割開來，每個(gè)樣品每點(diǎn)點(diǎn)樣約4nl、2個(gè)平行點(diǎn)。點(diǎn)樣結(jié)束后保濕放置4小時(shí)促進(jìn)樣品交聯(lián)于玻片之上，然后在玻片表面加上一層含20％胎牛血清的PBS，室溫保濕放置1小時(shí)后4℃放置過夜，以充分封閉玻片上的非特異蛋白交聯(lián)或結(jié)合位點(diǎn)。棄去液體，空氣干燥，將玻片放置于鋁箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上過程制備成功預(yù)點(diǎn)抗原的蛋白芯片。
2.IgG/IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)片的制備采用0.01mol/L的pH7.4的PBS對IgG和IgM抗體的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，分別配制6個(gè)稀釋度的抗體溶液，包括0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml和160ug/ml。在每份抗體樣品中加入適量的生物素化的BSA，然后加入終濃度為0.05％的Tween-20，充分混勻。采用生物芯片點(diǎn)樣機(jī)將上述抗體標(biāo)準(zhǔn)品樣品點(diǎn)于載體玻片上形成微陣列，每玻片點(diǎn)10個(gè)平行的微陣列，每個(gè)微陣列之間采用貼上適宜大小的塑料膜分割開來，每個(gè)樣品每點(diǎn)點(diǎn)樣約4nl、2個(gè)平行點(diǎn)。點(diǎn)樣結(jié)束后保濕放置4小時(shí)促進(jìn)樣品交聯(lián)于玻片之上，然后在玻片表面加上一層含20％胎牛血清的PBS，室溫保濕放置1小時(shí)后4℃放置過夜，以充分封閉玻片上的非特異蛋白交聯(lián)或結(jié)合位點(diǎn)。棄去液體，空氣干燥，將玻片放置于鋁箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上過程制備成功預(yù)點(diǎn)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白芯片。
3.樣品稀釋液配制含10％胎牛血清的PBS(0.01mol/L，pH7.4)，加入終濃度為0.02％的Tween 20，無菌過濾分裝，每瓶2ml。
4.洗滌液濃縮液配制10倍濃縮的PBS(0.01mol/L，pH7.4)，無菌過濾分裝，每瓶20ml，使用前采用去離子水稀釋至200ml。
5.熒光標(biāo)記抗人抗體二抗的濃縮液使用市售的抗人IgG-Cy5熒光標(biāo)記二抗和抗人IgM-Cy3熒光標(biāo)記二抗在分別滴定適宜的稀釋度后，分裝于棕色小瓶。
6.熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液使用市售的鏈霉親和素-Cy5熒光標(biāo)記二抗和鏈霉親和素-Cy3熒光標(biāo)記二抗在分別滴定適宜的稀釋度后，分裝于棕色小瓶。
7.試劑盒說明書說明書應(yīng)包含以下內(nèi)容，試劑盒的組成、存放條件、使用操作步驟、結(jié)果分析判斷方法、注意事項(xiàng)等。
(三)試劑盒的操作方法與結(jié)果判斷操作方法1.將密封的預(yù)點(diǎn)芯片從4℃下取出，室溫預(yù)溫15分鐘以上。
2.將180ml去離子水加入20ml洗滌液濃縮液，配制好洗滌液。
3.打開預(yù)點(diǎn)抗原和抗體標(biāo)準(zhǔn)品芯片密封袋，取出芯片平放。采用樣品稀釋液按標(biāo)簽上標(biāo)定的稀釋度稀釋熒光標(biāo)記鏈霉親和素的濃縮液，將稀釋好的工作液各取20μl，加入各個(gè)微陣列樣品池，均勻覆蓋樣品池的所有表面，但不要溢出樣品池。
4.37℃下保濕孵育1小時(shí)。
5.快速甩去芯片上的液體，以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片，共洗滌玻片3次。
6.采用樣品稀釋液按照預(yù)定的比例稀釋血清樣品，推薦采用1∶10稀釋。
7.將稀釋好的樣品各取20μl，加入預(yù)點(diǎn)抗原芯片的微陣列樣品池，均勻覆蓋樣品池的所有表面，但不要溢出樣品池。在預(yù)點(diǎn)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的芯片微陣列樣品池內(nèi)加入稀釋液。
8. 37℃下保濕孵育1小時(shí)。
9.快速甩去芯片上的液體，以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片，共洗滌玻片3次。
10.采用樣品稀釋液按標(biāo)簽上標(biāo)定的稀釋度稀釋熒光二抗工作液，將稀釋好的熒光二抗工作液各取20μl，加入各個(gè)微陣列樣品池，均勻覆蓋樣品池的所有表面，但不要溢出樣品池。
11. 37℃下保濕孵育1小時(shí)。
12.快速甩去芯片上的液體，以20ml以上的洗滌液均勻流過玻片表面洗滌玻片，共洗滌玻片3次。
13.以20ml以上的去離子水均勻流過玻片表面洗滌玻片，共洗滌玻片1次。
14.空氣干燥，于適宜的儀器上讀取各點(diǎn)在635nm、530nm的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果判斷1.對于單個(gè)微陣列的單個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)來說，按以下方法判斷其是否陽性分別計(jì)算該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度的比值和人IgG點(diǎn)635nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度的比值，取二者的比值，然后根據(jù)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)點(diǎn)片的抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算該抗原相應(yīng)的抗體含量。采用該數(shù)值與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)比，判斷該點(diǎn)抗原IgG抗體是否陽性，陽性則計(jì)數(shù)為1，陰性計(jì)數(shù)為0；分別計(jì)算該點(diǎn)的532nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度的比值和人IgM點(diǎn)532nm熒光強(qiáng)度與該點(diǎn)的635nm熒光強(qiáng)度的比值，取二者的比值，然后根據(jù)人IgM標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)點(diǎn)片的抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算該抗原相應(yīng)的抗體含量。采用該數(shù)值與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)比，判斷該點(diǎn)抗原IgM抗體是否陽性，陽性則計(jì)數(shù)為1，陰性計(jì)數(shù)為0。
2.對于某個(gè)微陣列對應(yīng)的被檢人來說，其陽性抗原數(shù)按以下方法計(jì)算按1.所述方法判斷單點(diǎn)陽性數(shù)后，陣列中12種抗原單點(diǎn)陽性數(shù)的總和即為被檢人的陽性抗原數(shù)。
3.將被檢人陽性抗原數(shù)與預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)對比，當(dāng)被檢人陽性抗原數(shù)大于或等于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，即被判斷為食管鱗癌陽性。
實(shí)施例4采用新的篩查食管鱗癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片及衍生試劑盒診斷、普查、篩檢食管鱗癌癌前病變疑似患者、食管鱗癌癌前病變高危人群以及健康人群采用實(shí)施例3所述的試劑盒(采用蛋白芯片加免疫熒光法)檢測食管鱗癌癌前病變患者800例食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌癌前病變高危人群3000例、健康人群(普通社區(qū)人群)2000例。采用實(shí)施例4所述的食管鱗癌癌前病變診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。
結(jié)果被檢的800例食管鱗癌癌前病變患者中被判為食管鱗癌癌前病變的730例，被該方法判斷為非食管鱗癌癌前病變的70例。說明該方法可以診斷出90％以上的食管鱗癌癌前病變。
被檢測的食管鱗癌癌前病變高危人群3000例中840例被判斷為食管鱗癌癌前病變，采用食管鏡檢查及食管粘膜碘染色檢測已經(jīng)診斷這840例被檢人中338例屬于食管鱗癌癌前病變。這說明該方法可以以較高的靈敏度將食管鱗癌癌前病變患者從被檢人群中篩檢出來，從而可以用于初步篩查食管鱗癌癌前病變危人群，在將這些高度疑似食管鱗癌癌前病變的人群進(jìn)行臨床確診和隨訪。
被檢測的健康人群(普通社區(qū)人群)2000例中480例被判斷為食管鱗癌癌前病變，其中臨床確診1例食管鱗癌癌前病變。說明采用該方法可以將食管鱗癌患者從健康人群中篩檢出來。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<120>用于篩查食管癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片<130>I200501569MB<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>136<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>H3F3B抗原片段<400>1Met Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala1 5 10 15Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ser20 25 30Thr Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala35 40 45Leu Arq Glu Ile Arq Arq Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg50 55 60Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys65 70 75 80Thr Asp Leu Arq Phe Gln Ser Ala Ala Ile Gly Ala Leu Gln Glu Ala85 90 95Ser Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala100 105 110Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala115 120 125Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala130 135<210>2<211>339<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>DNAJA1抗原片段
<400>2Met Val Lys Glu Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn1 5 10 15Ala Thr Gln Glu Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys20 25 30Tyr His Pro Asp Lys Asn Pro Asn Glu Gly Glu Lys Lys Gln Ile Ser35 40 45Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Glu Leu Tyr Asp50 55 60Lys Gly Gly Glu Gln Ala Ile Lys Glu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Phe65 70 75 80Gly Ser Pro Met Asp Ile Phe Asp Met Phe Phe Gly Gly Gly Gly Arg85 90 95Met Gln Arg Glu Arg Phe Arg Gly Lys Asn Val Val His Gln Leu Ser100 105 110Val Thr Leu Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Lys Leu Ala Leu115 120 125Gln Lys Asn Val Ile Cys Asp Lys Cys Glu Gly Arg Gly Gly Lys Lys130 135 140Gly Ala Val Glu Cys Cys Pro Asn Cys Arg Gly Thr Gly Met Gln Ile145 150 155 160Arg Ile His Gln Ile Gly Pro Gly Met Val Gln Gln Ile Gln Ser Val165 170 175Cys Met Glu Cys Gln Gly His Gly Glu Arg Ile Ser Pro Lys Asp Arg180 185 190Cys Lys Ser Cys Asn Gly Arg Lys Ile Val Arg Glu Lys Lys Ile Leu195 200 205Glu Val His Ile Asp Lys Gly Met Lys Asp Gly Gln Lys Ile Thr Phe210 215 220His Gly Glu Gly Asp Gln Glu Pro Gly Leu Glu Pro Gly Asp Ile Ile225 230 235 240Ile Val Leu Asp Gln Lys Asp His Ala Val Phe Thr Arg Arg Gly Glu245 250 255
Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala Leu Cys Gly260 265 270Phe Gln Lys Pro Ser Pro Asp Lys Leu Ser Leu Leu Glu Lys Leu Leu275 280 285Pro Glu Arg Lys Glu Val Glu Glu Thr Asp Glu Met Asp Gln Val Glu290 295 300Leu Val Asp Phe Asp Pro Asn Gln Glu Arg Arg Arg His Tyr Asn Gly305 310 315 320Glu Ala Tyr Glu Asp Asp Glu His His Pro Arg Gly Gly Val Gln Cys325 330 335Gln Thr Ser<210>3<211>234<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TK1抗原片段<400>3Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys1 5 10 15Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys20 25 30Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr35 40 45Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser50 55 60Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu65 70 75 80Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile85 90 95Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Met Glu Phe Cys Glu Ala Met100 105 110Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe115 120 125
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<223>RBPSUH抗原片段<400>4Met Ala Trp Ile Lys Arg Lys Phe Gly Glu Arg Pro Pro Pro Lys Arg1 5 10 15Leu Thr Arg Glu Ala Met Arg Asn Tyr Leu Lys Glu Arg Gly Asp Gln20 25 30Thr Val Leu Ile Leu His Ala Lys Val Ala Gln Lys Ser Tyr Gly Asn35 40 45Glu Lys Arg Phe Phe Cys Pro Pro Pro Cys Val Tyr Leu Met Gly Ser50 55 60Gly Trp Lys Lys Lys Lys Glu Gln Met Glu Arg Asp Gly Cys Ser Glu65 70 75 80Gln Glu Ser Gln Pro Cys Ala Phe Ile Gly Ile Gly Asn Ser Asp Gln85 90 95Glu Met Gln Gln Leu Asn Leu Glu Gly Lys Asn Tyr Cys Thr Ala Lys100 105 110
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<223>PCNA抗原片段<400>5Met Phe Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu1 5 10 15Glu Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser20 25 30Ser Gly Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val35 40 45Gln Leu Thr Leu Arg Ser Glu Gly Phe Asp Thr Tyr Arg Cys Asp Arg50 55 60Asn Leu Ala Met Gly Val Asn Leu Thr Ser Met Ser Lys Ile Leu Lys65 70 75 80Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala85 90 95Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser100 105 110
Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile115 120 125Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe130 135 140Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile145 150 155 160Ser Cys Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly165 170 175Asn Gly Asn Ile Lys Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu180 185 190Glu Ala Val Thr Ile Glu Met Asn Glu Pro Val Gln Leu Thr Phe Ala195 200 205Leu Arg Tyr Leu Asn Phe Phe Thr Lys Ala Thr Pro Leu Ser Ser Thr210 215 220Val Thr Leu Ser Met Ser Ala Asp Val Pro Leu Val Val Glu Tyr Lys225 230 235 240Ile Ala Asp Met Gly His Leu Lys Tyr Tyr Leu Ala Pro Lys Ile Glu245 250255Asp Glu Glu Gly Ser260<210>6<211>1585<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EIF4G3抗原片段<400>6Met Asn Ser Gln Pro Gln Thr Arg Ser Pro Phe Phe Gln Arg Pro Gln1 5 10 15Ile Gln Pro Pro Arg Ala Thr Ile Pro Asn Ser Ser Pro Ser Ile Arg20 25 30Pro Gly Ala Gln Thr Pro Thr Ala Val Tyr Gln Ala Asn Gln His Ile35 40 45Met Met Val Asn His Leu Pro Met Pro Tyr Pro Val Pro Gln Gly Pro50 55 60
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Glu Thr Ser Asp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Asn Asp Asp Asp Ile Cys325 330 335Lys Lys Pro Cys Ser Val Ala Pro Asn Asp Ile Pro Leu Val Ser Ser340 345 350Thr Asn Leu Ile Asn Glu Ile Asn Gly Val Ser Glu Lys Leu Ser Ala355 360 365Thr Glu Ser Ile Val Glu Ile Val Lys Gln Glu Val Leu Pro Leu Thr370 375 380Leu Glu Leu Glu Ile Leu Glu Asn Pro Pro Glu Glu Met Lys Leu Glu385 390 395 400Cys Ile Pro Ala Pro Ile Thr Pro Ser Thr Val Pro Ser Phe Pro Pro405 410 415Thr Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro His Thr Pro Val Ile Val420 425 430Pro Ala Ala Ala Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ile Thr Val435 440 445Gln Arg Val Leu Glu Glu Asp Glu Ser Ile Arg Thr Cys Leu Ser Glu450 455 460Asp Ala Lys Glu Ile Gln Asn Lys Ile Glu Val Glu Ala Asp Gly Gln465 470 475 480Thr Glu Glu Ile Leu Asp Ser Gln Asn Leu Asn Ser Arg Arg Ser Pro485 490 495Val Pro Ala Gln Ile Ala Ile Thr Val Pro Lys Thr Trp Lys Lys Pro500 505 510Lys Asp Arg Thr Arg Thr Thr Glu Glu Met Leu Glu Ala Glu Leu Glu515 520 525Leu Lys Ala Glu Glu Glu Leu Ser Ile Asp Lys Val Leu Glu Ser Glu530 535 540Gln Asp Lys Met Ser Gln Gly Phe His Pro Glu Arg Asp Pro Ser Asp545 550 555 560Leu Lys Lys Val Lys Ala Val Glu Glu Asn Gly Glu Glu Ala Glu Pro565 570 575Val Arg Asn Gly Ala Glu Ser Val Ser Glu Gly Glu Gly Ile Asp Ala580 585 590
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<223>HNRPA1抗原片段<400>12Met Ser Lys Ser Glu Ser Pro Lys Glu Pro Glu Gln Leu Arg Lys Leu1 5 10 15Phe Ile Gly Gly Leu Ser Phe Glu Thr Thr Asp Glu Ser Leu Arg Ser20 25 30His Phe Glu Gln Trp Gly Thr Leu Thr Asp Cys Val Val Met Arg Asp35 40 45Pro Asn Thr Lys Arg Ser Arg Gly Phe Gly Phe Val Thr Tyr Ala Thr50 55 60Val Glu Glu Val Asp Ala Ala Met Asn Ala Arg Pro His Lys Val Asp65 70 75 80Gly Arg Val Val Glu Pro Lys Arg Ala Val Ser Arg Glu Asp Ser Gln85 90 95Arg Pro Gly Ala His Leu Thr Val Lys Lys Ile Phe Val Gly Gly Ile100 105 110Lys Glu Asp Thr Glu Glu His His Leu Arg Asp Tyr Phe Glu Gln Tyr115 120 125Gly Lys Ile Glu Val Ile Glu Ile Met Thr Asp Arg Gly Ser Gly Lys130 135 140Lys Arg Gly Phe Ala Phe Val Thr Phe Asp Asp His Asp Ser Val Asp145 150 155 160Lys Ile Val Ile Gln Lys Tyr His Thr Val Asn Gly His Asn Cys Glu165 170 175Val Arg Lys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Met Ala Ser Ala Ser Ser Ser180 185 190
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Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile245 250 255Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Val Leu260 265 270Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val Asn Val Thr Thr Glu275 280 285Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Pro290 295 300Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys Asp Val305 310 315 320Arg Arg Gly Asn Val Ala Gly Asp Ser Lys Asn Asp Pro Pro Met Glu325 330 335Ala Ala Gly Phe Thr Ala Gln Val Ile Ile Leu Asn His Pro Gly Gln340 345 350Ile Ser Ala Gly Tyr Ala Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile355 360 365Ala Cys Lys Phe Ala Glu Leu Lys Glu Lys Ile Asp Arg Arg Ser Gly370 375 380Lys Lys Leu Glu Asp Gly Pro Lys Phe Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ala385 390 395 400Ile Val Asp Met Val Pro Gly Lys Pro Met Cys Val Glu Ser Phe Ser405 410 415Asp Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr420 425 430Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ala Val Asp Lys Lys Ala Ala Gly Ala435 440 445Gly Lys Val Thr Lys Ser Ala Gln Lys Ala Gln Lys Ala Lys450 455 460<210>15<211>470<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TRAF4抗原片段
<400>15Met Pro Gly Phe Asp Tyr Lys Phe Leu Glu Lys Pro Lys Arg Arg Leu1 5 10 15Leu Cys Pro Leu Cys Gly Lys Pro Met Arg Glu Pro Val Gln Val Ser20 25 30Thr Cys Gly His Arg Phe Cys Asp Thr Cys Leu Gln Glu Phe Leu Ser35 40 45Glu Gly Val Phe Lys Cys Pro Glu Asp Gln Leu Pro Leu Asp Tyr Ala50 55 60Lys Ile Tyr Pro Asp Pro Glu Leu Glu Val Gln Val Leu Gly Leu Pro65 70 75 80Ile Arg Cys Ile His Ser Glu Glu Gly Cys Arg Trp Ser Gly Pro Leu85 90 95Arg His Leu Gln Gly His Leu Asn Thr Cys Ser Phe Asn Val Ile Pro100 105 110Cys Pro Asn Arg Cys Pro Met Lys Leu Ser Arg Arg Asp Leu Pro Ala115 120 125His Leu Gln His Asp Cys Pro Lys Arg Arg Leu Lys Cys Glu Phe Cys130 135 140Gly Cys Asp Phe Ser Gly Glu Ala Tyr Glu Ser His Glu Gly Met Cys145 150 155 160Pro Gln Glu Ser Val Tyr Cys Glu Asn Lys Cys Gly Ala Arg Met Met165 170 175Arg Arg Leu Leu Ala Gln His Ala Thr Ser Glu Cys Pro Lys Arg Thr180 185 190Gln Pro Cys Thr Tyr Cys Thr Lys Glu Phe Val Phe Asp Thr Ile Gln195 200 205Ser His Gln Tyr Gln Cys Pro Arg Leu Pro Val Ala Cys Pro Asn Gln210 215 220Cys Gly Val Gly Thr Val Ala Arg Glu Asp Leu Pro Gly His Leu Lys225 230 235 240Asp Ser Cys Asn Thr Ala Leu Val Leu Cys Pro Phe Lys Asp Ser Gly245 250 255
Cys Lys His Arg Cys Pro Lys Leu Ala Met Ala Arg His Val Glu Glu260 265 270Ser Val Lys Pro His Leu Ala Met Met Cys Ala Leu Val Ser Arg Gln275 280 285Arg Gln Glu Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Glu Leu Ser Val290 295 300Gly Ser Asp Gly Val Leu Ile Trp Lys Ile Gly Ser Tyr Gly Arg Arg305 310 3l5 320Leu Gln Glu Ala Lys Ala Lys Pro Asn Leu Glu Cys Phe Ser Pro Ala325 330 335Phe Tyr Thr His Lys Tyr Gly Tyr Lys Leu Gln Val Ser Ala Phe Leu340 345 350Asn Gly Asn Gly Ser Gly Glu Gly Thr His Leu Ser Leu Tyr Ile Arg355 360 365Val Leu Pro Gly Ala Phe Asp Asn Leu Leu Glu Trp Pro Phe Ala Arg370 375 380Arg Val Thr Phe Ser Leu Leu Asp Gln Ser Asp Pro Gly Leu Ala Lys385 390 395 400Pro Gln His Val Thr Glu Thr Phe His Pro Asp Pro Asn Trp Lys Asn405 410 415Phe Gln Lys Pro Gly Thr Trp Arg Gly Ser Leu Asp Glu Ser Ser Leu420 425 430Gly Phe Gly Tyr Pro Lys Phe Ile Ser His Gln Asp Ile Arg Lys Arg435 440 445Asn Tyr Val Arg Asp Asp Ala Val Phe Ile Arg Ala Ala Val Glu Leu450455 460Pro Arg Lys Ile Leu Ser465 470<210>16<211>314<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MAGE-3抗原片段<400>16
Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu1 5 10 15Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala20 25 30Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val35 40 45Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser50 55 60Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp65 70 75 80Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser85 90 95Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys100 105 110Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu115 120 125Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln130 135 140Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu145 150 155 160Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr165 170 175Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp180 185 190Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile195 200 205Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu210 215 220Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly225 230 235 240Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu245 250 255Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu260 265 270
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His275 280 285His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu290 295 300His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu305 310
權(quán)利要求
1.一種篩查人食管癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，其包含選自以下一組的多肽或其抗原性片段(1)具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的H3F3B多肽；(2)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的DNAJA1多肽；(3)具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的TK1多肽；(4)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的RBPSUH多肽；(5)具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的PCNA多肽；(6)具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的EIF4G3多肽；(7)具有SEQ ID NO7所示氨基酸序列的RPS3多肽；(8)具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的RPL32多肽；(9)具有SEQ ID NO9所示氨基酸序列的COPB2多肽；(10)具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的TP53多肽；(11)具有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的EFHD2多肽；(12)具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的HNRPA1多肽；(13)具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的RPL6多肽；(14)具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的EEF1A1多肽；(15)具有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的TRAF4多肽；和(16)具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的MAGE-3多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片，其中所述的多肽為重組表達(dá)的多肽。
3.一種篩查人食管癌癌前病變的試劑盒，其包括如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的篩查人食管癌癌前病變的蛋白質(zhì)芯片，以及由此蛋白質(zhì)芯片衍生的篩查試劑盒。該蛋白質(zhì)芯片包含了16種特定人蛋白質(zhì)的蛋白斑點(diǎn)，使用該蛋白質(zhì)芯片可以檢測來自被檢人的樣品中這16種蛋白質(zhì)各自相應(yīng)抗體的存在和/或存在，聯(lián)合分析這16種蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體的檢測結(jié)果，可以判斷被檢人是否存在食管癌癌前病變。本發(fā)明進(jìn)一步提供了該蛋白質(zhì)芯片在健康人群或高危人群中篩查食管癌癌前病變的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/53GK1955737SQ20051011673
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者楊治華, 冉宇靚, 李江偉, 胡海 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所