專利名稱：一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的精確鑒定以及基于此技術(shù)方法對(duì)麥谷蛋白亞基的進(jìn)一步表征。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟显耘嗝娣e最大、產(chǎn)量最高、地理分布最廣的重要農(nóng)作物，其種植面積和產(chǎn)量約占谷物作物的30％，被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)與家畜飼養(yǎng)業(yè)。小麥種子中含有其他糧食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面條、餅干、糕點(diǎn)和饅頭等多種專用食品。因此，種子蛋白的組成和含量在很大程度上決定小麥加工品質(zhì)的優(yōu)劣。
Osborne(1907)根據(jù)溶解特點(diǎn)的不同將小麥種子蛋白分為以下四類清蛋白和球蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白。研究表明，小麥谷蛋白多聚體是自然界最大的蛋白分子(Wrigley，1996；Stevenson和Preston，1996)。通常所說(shuō)的小麥貯藏蛋白是指醇溶蛋白和麥谷蛋白，其中麥谷蛋白約占貯藏蛋白的40％左右。根據(jù)還原條件下在SDS-PAGE中的遷移率不同，又可將麥谷蛋白分為兩類高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)。HMW-GS的組成和含量直接影響小麥面粉的烘烤質(zhì)量，而LMW-GS則與面團(tuán)彈性密切相關(guān)。
大量研究表明，LMW-GS位點(diǎn)的等位變異與小麥的品質(zhì)差異具有高度相關(guān)性。1984年P(guān)ayne等首先發(fā)現(xiàn)LMW-GS組成與四倍體小麥品質(zhì)有直接關(guān)系，例如具有LMW-1型電泳圖譜的品種往往擁有較差的加工品質(zhì)，而具有LMW-2型電泳圖譜的品種則恰恰相反，往往具有優(yōu)良的品質(zhì)特性。1997年Nieto-Taladriz等發(fā)現(xiàn)構(gòu)成LMW-1、LMW-2型的亞基由Glu-3、Glu-2位點(diǎn)上的等位基因控制。Luo等(2001)在比較普通小麥HMW-GS和LMW-GS等位變異對(duì)面粉品質(zhì)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Glu-3位點(diǎn)的等位變異對(duì)小麥品質(zhì)相關(guān)的技術(shù)參數(shù)具有顯著的影響，如面粉蛋白含量、SDS沉淀值、子粒硬度等。迄今為止，研究單個(gè)LMW-GS對(duì)小麥品質(zhì)的影響還比較少。1998年Sissons等用RP-HPLC分離了一些LMW-GS進(jìn)行品質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)N-端為METSHIPGL-的LMW-GS可以改善面粉的混合特性。1999年Lee等對(duì)細(xì)菌表達(dá)的3個(gè)LMW-GS進(jìn)行了品質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)自一粒小麥A基因組的LMW-E2和LMW-E4比來(lái)自一粒小麥D基因組的LMW-16/10能夠更有效地提高面粉合面特性，增加面團(tuán)的延展性。
基于在SDS-PAGE中遷移率的不同，可將LMW-GS分為B、C和D型亞基。B型亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為40000-50000Da，C型亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為30000-40000Da，D型亞基是很微小的一部分，僅在少數(shù)小麥品種中出現(xiàn)。編碼B型亞基的基因位點(diǎn)在第一部分同源群染色體短臂的Glu-3位點(diǎn)。編碼C型亞基的基因位點(diǎn)可能在第一部分同源群染色體短臂的Gli-1位點(diǎn)或在第6部分同源群染色體短臂上的Gli-2位點(diǎn)。D型亞基也許在Gli-1位點(diǎn)。研究表明低分子量谷蛋白亞基基因位點(diǎn)與醇溶蛋白的基因位點(diǎn)緊密相連，如Gli-1位點(diǎn)，含有3種蛋白質(zhì)基因ω醇溶蛋白基因、γ醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白亞基基因。
B型亞基和C型亞基有相似的結(jié)構(gòu)。中央重復(fù)區(qū)都全部由脯氨酸和谷氨酞胺的重復(fù)序列組成，這些重復(fù)序列主要形成β轉(zhuǎn)角。N端是一個(gè)非常短的非重復(fù)序列，C端也由非重復(fù)序列組成，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，且包含其所有的半胱氨酸殘基。C端的8個(gè)半胱氨酸殘基的位置是高度保守的。B型亞基中有1～8號(hào)中的6個(gè)半胱氨酸殘基(1-5和7號(hào))，另外還有一個(gè)6’在C端。對(duì)B型低分子量谷蛋白亞基的測(cè)序發(fā)現(xiàn)一些B型低分子量谷蛋白亞基還含有另外一個(gè)半胱氨酸殘基。對(duì)編碼B型低分子量谷蛋白亞基的基因序列分析表明，其N端應(yīng)有一個(gè)半胱氨酸殘基，但是在大多數(shù)小麥品種的B型低分子量谷蛋白亞基中卻沒有發(fā)現(xiàn)，而在中央重復(fù)區(qū)的N端發(fā)現(xiàn)有一個(gè)半胱氨酸殘基。
C型低分子量谷蛋白亞基和α或γ醇溶蛋白結(jié)構(gòu)相似?？赡苁怯捎诖既艿鞍谆虬l(fā)生了突變，使其可以形成分子間二硫鍵，所以屬于谷蛋白類。醇溶蛋白是單體蛋白，不能形成聚集體。Cα型和Cγ型分別含有6個(gè)和8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，然而Cα型亞基的基因序列顯示在N端應(yīng)有一個(gè)半胱氨酸殘基。在Cγ型中央重復(fù)區(qū)的N端有一個(gè)半胱氨酸殘基。另外，在Cγ型亞基中央重復(fù)區(qū)，一些小麥品種中另外出現(xiàn)了一個(gè)半胱氨酸殘基。
D型低分子量麥谷蛋白亞基和C型亞基一樣與醇溶蛋白有相似的生化特性，甚至氨基酸序列也是如此。D型亞基和ω型醇溶蛋白一樣屬于貧硫蛋白，由很小的N端、C端和中央重復(fù)區(qū)組成。中央重復(fù)區(qū)富含谷氨酰胺，脯氨酸和苯丙氨酸，由交搭β轉(zhuǎn)角組成。一般認(rèn)為D型低分子量谷蛋白亞基可能是由ω型醇溶蛋白編碼基因突變而造成一個(gè)半胱氨酸殘基能夠形成分子間二硫鍵，形成聚合體而導(dǎo)致的。
與HMW-GS相比，低分子量麥谷蛋白亞基的組成更為復(fù)雜，一個(gè)品種一般具有20-50個(gè)基因。因此，長(zhǎng)期以來(lái)由于缺乏有效的分離方法，與HMW-GS相比，國(guó)內(nèi)外對(duì)LMW-GS的研究相對(duì)滯后，由于常規(guī)分離方法SDS-PAGE分辨度不高，操作復(fù)雜，所得到的分子量往往與實(shí)際的分子量相差較大，因此急需建立新的、更加有效的分離鑒定技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確立一種穩(wěn)定、快速的質(zhì)譜方法，從而可以對(duì)小麥低分子量谷蛋白亞基進(jìn)行精確的分子量測(cè)定。通過(guò)這一蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可快速準(zhǔn)確的鑒定出小麥低分子量谷蛋白亞基的分子量，分析小麥谷蛋白的低分子量亞基組成，從而鑒定并表征不同品種的小麥。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，包括如下步驟1.在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜樣品時(shí)，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；2.在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的配比為以溶解液體積為計(jì)量基準(zhǔn)，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15-25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜樣品時(shí)，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，目的在于先去除蛋白提取液中的高分子量谷蛋白亞基。
目前小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的測(cè)定主要采用SDS-PAGE凝膠電泳方法。但SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量是根據(jù)蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系對(duì)其進(jìn)行分子量的測(cè)定，但有一部分蛋白質(zhì)在SDS體系中的相對(duì)遷移率與其分子量不呈線性關(guān)系，如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，組蛋白F1本身帶有大量的正電荷，結(jié)合的SDS不足以消除原來(lái)正電荷的影響，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(如某些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白(例如膠原蛋白)和一些含二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，電泳的相對(duì)遷移率與分子量的對(duì)數(shù)不呈線性關(guān)系。所以傳統(tǒng)的SDS-PAGE對(duì)蛋白分子量的測(cè)定存在很大誤差。質(zhì)譜是通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)荷比來(lái)進(jìn)行分子量測(cè)定的方法，其精確度極高。本發(fā)明以質(zhì)譜技術(shù)為核心，建立了一套精確測(cè)定小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的方法。
質(zhì)譜是通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)荷比來(lái)進(jìn)行成份和結(jié)構(gòu)分析的方法，其發(fā)展得益于兩種軟電離技術(shù)的發(fā)展(張國(guó)安等，2003)電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。電噴霧電離方法是利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電在N氣流的作用下，液滴爆裂并最終成噴霧狀，分析物離子化以帶電荷方式進(jìn)入質(zhì)量分析器。MALDI離子源產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分中的質(zhì)量數(shù)有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，且MALDI對(duì)鹽和表面活性劑有較強(qiáng)耐受力，適合高通量分析。因此MALDI-MS最適合分析多肽以及蛋白質(zhì)混合物，這種儀器是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀，能夠?qū)O微量樣品進(jìn)行分析。
質(zhì)譜主要用于解決兩個(gè)分析問題精確測(cè)定生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸、糖類等的分子量，并提供分子結(jié)構(gòu)信息；對(duì)存在于生命復(fù)雜體系中的微量或痕量小分子生物活性物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析(吳世榮等，2004)。蛋白質(zhì)類生物大分子分子量的測(cè)定有著十分重要的意義，如對(duì)均一蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，既要測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，又要測(cè)定亞基和寡聚體的分子量，以及水解、酶解片段的分子量。常規(guī)的分子量測(cè)定主要有滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠層析及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。這些方法存在樣品消耗量大，精確度低、易受蛋白質(zhì)的形狀影響等缺點(diǎn)(趙善楷等，1996)。
本發(fā)明是利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，快速表征小麥LMW-GS，并確定其精確分子量的一種新方法，該方法具有以下特征(1)樣品用量少，一般半粒種子(約20mg)即可滿足需要。
(2)提取方法簡(jiǎn)單，無(wú)有毒試劑，而SDS-PAGE提取液中常常含有有毒試劑，樣品制備時(shí)間長(zhǎng)。
(3)所用時(shí)間短，分離迅速，適合高通量分析。SDS-PAGE分離LMW-GS一般需要1-2個(gè)小時(shí)(小槽薄層膠)或10多個(gè)小時(shí)(大槽)，經(jīng)過(guò)染色、脫色，得到最后電泳圖譜往往需要1-2天，而MALDI-TOF-MS分析一個(gè)樣品只需要幾分鐘。
(4)分辨率高。在SDS-PAGE圖譜中很難區(qū)分的亞基在質(zhì)譜中很容易區(qū)分。
(5)檢測(cè)靈敏敏度。一般只需10-100pmol蛋白樣品即可檢測(cè)，而SDS-PAGE的上樣量至少需要微升級(jí)。
(6)可檢測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍廣(上限可達(dá)幾十萬(wàn))。
(7)分辨率(可達(dá)600m/Δm)和精確度高(內(nèi)標(biāo)法可達(dá)0.01％)。
(8)結(jié)果保存分析容易。直接以圖片方式存貯，只需做簡(jiǎn)單處理即可用于分析比較。
(9)可獲得精確分子量信息，精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SDS-PAGE方法。
獲得精確的分子量信息對(duì)進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能非常重要，特別是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Protein translational modifications，PTMs)的研究。因此，質(zhì)譜技術(shù)很有可能成為一種高靈敏度鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的微量技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1六倍體面包小麥品種“京411”(Triticum aestivum L.)低分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE(A)和質(zhì)譜鑒定(B)，圖1A中，1為全部的麥谷蛋白，2為低分子量麥谷蛋白，3為高分子量麥谷蛋白(含部分低分子量谷蛋白)；圖2四倍體野生二粒小麥(Triticum dicoccoides)YS-5和YS-13低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜鑒定；圖3二倍體粗山羊草(Aegilops tauschii)低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜鑒定；圖4栽培一粒小麥(Triticum monococcum)TM-1和TM-3低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜鑒定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1小麥低分子量谷蛋白亞基的SDS-PAGE鑒定(1)植物材料小麥品種“京411”。
(2)LMW-GS的提取20mg種子砸成粉末狀放入1.5ml離心管，加入70％乙醇150μl，渦旋30-60min，10000g離心10min，去上清。加入異丙醇250μl，65℃水浴30min，10000g離心10min，去上清并用濾紙吸干，重復(fù)3次。加入0.1ml 50％異丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1％DTT)渦旋混勻，65℃水浴30min。再加入0.1ml50％異丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1.4％的4-乙烯吡啶)渦旋混勻，65℃水浴30min，12000g離心15min。取上清用40％丙酮室溫沉淀3小時(shí)，12000g離心15min，收集上清；將上清用80％丙酮在-20℃沉淀過(guò)夜，13000g離心15min，收集沉淀，沉淀即為小麥低分子量谷蛋白亞基。
(3)LMW-GS的SDS-PAGE分離與鑒定①SDS-PAGE電泳樣品的制備在沉淀中加入100μl的樣品緩沖液(2％SDS，0.02％溴酚藍(lán)，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振蕩30分鐘，12000g離心10分鐘，作SDS-PAGE上樣用。
②SDS-PAGE電泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3電泳槽、5％濃縮膠、12％分離膠，Tris-甘氨酸緩沖液系統(tǒng)，15mA電泳2小時(shí)，0.1％考馬斯亮藍(lán)R-250染色，10％乙醇和10％乙酸脫色，電泳圖譜如圖1A所示。
實(shí)施例2LMW-GS的MALDI-TOF-MS鑒定(1)植物材料六倍體面包小麥(Triticum aestivum L.，AABBDD)品種“京411”。
四倍體野生二粒小麥(Triticum dicoccoides，AABB)YS-5、YS-13二倍體粗山羊草(Aegilops tauschii，DD)TD121、TD128、TD132二倍體栽培一粒小麥(Triticum monococcum L.，AmAm)TM1、TM3(2)質(zhì)譜分析樣品的制備20mg種子砸成粉末狀放入1.5ml離心管，加入0.5M NaCl溶液100μl，渦旋30-60min，5000g離心10min，去上清。加入ddH2O 200μl，渦旋30min，5000g離心10min，去上清，重復(fù)3次。加入0.4ml 50％正丙醇渦旋混勻，室溫放置30min，12000g離心5min，去上清，并用濾紙吸干凈，此步驟重復(fù)3次。加入0.2ml 50％正丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.5]+1％DTT)，振蕩混勻，65℃水浴30min。取上清用40％丙酮室溫沉淀3小時(shí)，13000g離心15min，收集上清。將上清用80％丙酮在-20℃沉淀過(guò)夜，13000g離心15min，收集沉淀，沉淀即為小麥低分子量谷蛋白亞基。然后用真空干燥儀干燥沉淀，加入50μl 20％乙腈溶液(含0.1％TFA)溶解。
(3)MALDI-TOF-MS使用島津AX1MA-CFRTMPlus型基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜儀(配有軟件用于系統(tǒng)操作和數(shù)據(jù)處理)，全自動(dòng)樣品處理，軟件控制精確定位，具有延遲提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。
①靶板的清洗(384型)用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的樣品，1％甲酸超聲10-15min，ddH2O沖洗，加丙酮超聲10-15min，加甲醇超聲10-15min，加水超聲10-15min，取出靶板，用甲醇沖洗，通風(fēng)櫥中干燥。
②基質(zhì)的選擇與制備基質(zhì)選用芥子酸SA(3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基質(zhì)溶于1ml50％乙腈+0.05％TFA中，避光保存。
③標(biāo)樣的制備與選擇LMW-GS分子量的測(cè)定Albumin-Aldrase(66431.08、33216.0、39212.88)，0.1％TFA溶解。
④上樣前處理1％TFA平衡ZIPtip，過(guò)濾樣品，反復(fù)抽吸5-10次，1％TFA過(guò)濾，0.4μl Elution Buffer洗脫樣品。
⑤參數(shù)的設(shè)置分子量的測(cè)定采用線性模式，分子量范圍10000-100000Da。
⑥點(diǎn)樣(三明治法)基質(zhì)0.5μl，樣品0.5μl，基質(zhì)0.5μl。
⑦質(zhì)譜測(cè)定待樣品干燥后將靶板放入質(zhì)譜的樣品艙，依以下程序進(jìn)行靶板位置的校正→標(biāo)樣的測(cè)定、校正(選用Average、Threshold-Apex)→樣品的校正、測(cè)定(選擇與標(biāo)樣一致的儀器參數(shù))→數(shù)據(jù)保存。
⑧圖像處理利用KratosAnalytical ltd.lanchpad V2.4.0軟件進(jìn)行圖像處理。根據(jù)處理結(jié)果，可獲得不同品種LMW-GS組成圖譜和各亞基的精確分子量，如圖1B所示。
實(shí)施例3低分子量谷蛋白亞基質(zhì)譜鑒定方法的應(yīng)用(1)LMW-GS表征與小麥品種鑒定普通小麥為異源六倍體種(2n＝6x＝42)，有許多豐富的近緣種質(zhì)資源，包括二倍體粗山羊草(DD)、二倍體栽培一粒(AA)、四倍體野生二粒和栽培二粒小麥(AABB)等，在這些近緣種中，LMW-GS變異非常豐富，蘊(yùn)藏著大量的優(yōu)質(zhì)候選基因，是面包小麥品質(zhì)改良的重要基因資源。因此有效的鑒定手段是充分利用這些資源的關(guān)鍵。同時(shí)，LMW-GS圖譜可作為品種鑒定的可靠標(biāo)記，對(duì)育種中的標(biāo)記輔助選擇和品種權(quán)益保護(hù)具有重要意義。利用所建立的LMW-GS質(zhì)譜鑒定方法，對(duì)不同倍性的小麥進(jìn)行低分子量谷蛋白亞基的鑒定，獲得了高分辨度的LMW-GS圖譜(結(jié)果如圖1-圖4所示)。根據(jù)這些低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜圖譜，可以對(duì)不同的小麥品種或種質(zhì)進(jìn)行表征與鑒定。鑒于質(zhì)譜技術(shù)的高靈敏度和高精確度，對(duì)LMW-GS的分離鑒定效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的SDS-PAGE方法。
(2)LMW-GS的精確分子量確定MALDI-TOF-MS方法可準(zhǔn)確測(cè)定小麥低分子量谷蛋白亞基的分子量，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。小麥不同近緣種低分子量谷蛋白亞基分子量的測(cè)定結(jié)果見圖2-4圖。質(zhì)譜方法檢測(cè)的LMW-GS的數(shù)量比SDS-PAGE多，測(cè)得的分子量精度也要高得多，因此該技術(shù)是精確測(cè)定小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的有效方法。
(3)LMW-GS翻譯后修飾(PTMs)鑒定小麥的面粉品質(zhì)與麥谷蛋白亞基的組成密切相關(guān)，不同類型的麥谷蛋白亞基對(duì)于面筋品質(zhì)的貢獻(xiàn)不同。然而，也有研究表明，即使同一亞基，在不同的小麥品種中對(duì)面粉品質(zhì)的貢獻(xiàn)也不完全相同。針對(duì)這一現(xiàn)象，推測(cè)小麥麥谷蛋白亞基可能存在翻譯后修飾現(xiàn)象，不同程度的修飾，如糖基化和磷酸化等有可能導(dǎo)致不同品種中同一亞基對(duì)面粉品質(zhì)的貢獻(xiàn)不同。然而，近年來(lái)在對(duì)小麥麥谷蛋白亞基的翻譯后修飾的研究中，獲得了不同的研究結(jié)果。有人認(rèn)為小麥麥谷蛋白亞基存在糖基化和磷酸化修飾的現(xiàn)象，且發(fā)生修飾的程度較高，而有人則認(rèn)為麥谷蛋白亞基不存在翻譯后修飾。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因在很大程度上是由于研究方法的不同造成的。MALDI-TOF-MS精確分子量測(cè)定方法的建立將進(jìn)一步促進(jìn)低分子量谷蛋白亞基翻譯后修飾的深入研究。
通過(guò)比較用質(zhì)譜方法測(cè)出的谷蛋白亞基的分子量大小和用基因序列推導(dǎo)得到的谷蛋白亞基分子量大小的差異，可以初步判斷小麥谷蛋白亞基翻譯后的修飾狀況。當(dāng)分子量差異超過(guò)基因序列推導(dǎo)的0.1％(質(zhì)譜儀允許誤差)時(shí)，可初步推斷谷蛋白亞基可能發(fā)生了某種形式的翻譯后修飾。
根據(jù)以上設(shè)想，我們采用一對(duì)等位基因特異PCR引物對(duì)栽培一粒小麥(Triticum monococcum L.，AmAm，2n＝2x＝14)TM-1和TM-3的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到2個(gè)不同的全基因編碼序列，包括上游啟動(dòng)子、開放閱讀框和下游序列，無(wú)內(nèi)含子。根據(jù)推導(dǎo)出的氨基酸序列，2個(gè)基因LMW-M1和LMW-M3均為典型的LMW-i型亞基，分子量分別為38708.7Da和38720.8Da。然后提取TM-1和TM-3的LMW谷蛋白亞基，利用MALDI-TOF-MS分析獲得了上述2個(gè)亞基的精確分子量，分別為38789.6Da和39026.9Da(結(jié)果見圖4)。經(jīng)過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)LMW-M1亞基的分子量與基因推導(dǎo)的十分接近(小于0.1％)，而LMW-M3亞基的分子量差異大于允許誤差，由此推測(cè)LMW-M1亞基沒有發(fā)生翻譯后修飾，而LMW-M3亞基則存在某種形式的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化修飾等。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步進(jìn)行LMW-GS翻譯后修飾類型、修飾位點(diǎn)及其功能研究。
權(quán)利要求
1.一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，包括如下步驟(1)在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜樣品時(shí)，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；(2)在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的配比為以溶解液體積為計(jì)量基準(zhǔn)，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15-25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
2.如權(quán)利要起1所述的鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，其特征在于在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜樣品時(shí)，先用40％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，然后用80％的丙酮沉淀清液中的低分子量谷蛋白亞基。
3.如權(quán)利要起1所述的鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，其特征在于用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的優(yōu)選配比為以溶解液體積為計(jì)量基準(zhǔn)，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的20％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，屬于生命科學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的精確鑒定以及基于此技術(shù)方法對(duì)麥谷蛋白亞基的進(jìn)一步表征。本發(fā)明一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜方法，包括如下步驟(1)制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質(zhì)譜樣品時(shí)，先用35－45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75－85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；(2)在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，以溶解液體積為計(jì)量基準(zhǔn)，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15－25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
文檔編號(hào)G01N23/00GK1800812SQ20051013531
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者晏月明, 張倩, 李巧云, 安學(xué)麗, 張艷貞, 王愛麗 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)