專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的診斷試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科，是1989年發(fā)現(xiàn)的與輸血有關(guān)的非甲、非乙型肝炎病毒。丙型肝炎呈全球性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3％，估計(jì)約1.7億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬(wàn)例。全國(guó)血清流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國(guó)一般人群抗-HCV陽(yáng)性率為3.2％。HCV主要經(jīng)血液傳播，主要有(1)經(jīng)輸血和血制品傳播。(2)經(jīng)破損的皮膚和粘膜傳播。(3)母嬰傳播。HCV是肝硬化、肝功衰竭和肝細(xì)胞癌的常見(jiàn)病因。目前尚無(wú)有效方案治療丙型肝炎，預(yù)防丙型肝炎最有效的方法是切斷傳染源，特別是杜絕攜帶HCV的人員獻(xiàn)血，因此必須采用有效的檢測(cè)試劑。
現(xiàn)有檢測(cè)HCV的方法目前有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和HCV抗體檢測(cè)。其中HCV抗體檢測(cè)是獻(xiàn)血員篩查的主要方法。機(jī)體感染HCV后，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)HCV的抗體，最早出現(xiàn)的抗體類(lèi)型為IgM，約在7～30天內(nèi)出現(xiàn)，之后IgM消失IgG出現(xiàn)，約在30～60天出現(xiàn)。HCV感染機(jī)體后至出現(xiàn)可檢測(cè)出抗體時(shí)的一段時(shí)間被稱(chēng)作窗口期。HCV抗體檢測(cè)試劑當(dāng)前已發(fā)展到第三代，窗口期約4～10周，但只能檢測(cè)血中的IgG抗體，檢測(cè)的靈敏度和特異性有待于進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法，解決現(xiàn)有技術(shù)只能檢測(cè)IgG抗體的技術(shù)問(wèn)題；還解決可同時(shí)檢測(cè)血中的所有抗HCV抗體，進(jìn)一步縮短窗口期、進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和特異性的問(wèn)題。
本發(fā)明的技術(shù)方案這種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有硫酸溶液的終止液；
(7)、含有磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對(duì)照正常人血清；(9)、陽(yáng)性對(duì)照含有HCV抗體的人血清。
這種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法，其特征在于I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過(guò)夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；II、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過(guò)氧化物酶用改良過(guò)碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備；III、其它組分的制備洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對(duì)照為正常人血清，陽(yáng)性對(duì)照為含有HCV抗體的人血清。
這種用檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的方法，其特征在于檢測(cè)步驟如下a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔、陰性血清對(duì)照孔、陽(yáng)性血清對(duì)照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50μl，再依次加入陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照和樣品各50μl，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿(mǎn)各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物100祃，空白對(duì)照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；d、洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測(cè)定用酶標(biāo)儀對(duì)空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測(cè)定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中不含有HCV抗體。
有益效果本發(fā)明的試劑盒中采用雙抗原夾心法，具有更高的檢測(cè)活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)只能檢測(cè)IgG抗體的缺點(diǎn)，一次檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)血中的所有抗HCV抗體如IgG、IgM等，從而可進(jìn)一步縮短窗口期最早至2周以?xún)?nèi)。顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率，可進(jìn)一步減小輸血后HCV感染的機(jī)率。
感染者血清中HCV標(biāo)志物出現(xiàn)順序參見(jiàn)圖1，本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM類(lèi)型抗體，較只能檢測(cè)IgG類(lèi)型抗體的現(xiàn)有HCV抗體檢測(cè)試劑的窗口期約縮短20天。
本發(fā)明經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品檢定結(jié)果顯示外觀檢查、陰性標(biāo)準(zhǔn)品符合率、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品符合率、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明臨床考核結(jié)果分別委托中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院、河南省性病艾滋病防治研究所、北京市紅十字血液中心進(jìn)行了臨床考核試驗(yàn)，結(jié)果如下表
為了進(jìn)一步考核本發(fā)明較現(xiàn)用技術(shù)的優(yōu)越性，委托中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)化研究中心進(jìn)行臨床考核試驗(yàn)，結(jié)果在5份早期感染HCV血清中，本發(fā)明檢出陽(yáng)性1份，而現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有1份能夠檢出。結(jié)果如下
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)HCV抗體檢測(cè)法相比較，本發(fā)明臨床應(yīng)用敏感度和特異度較高，能夠完全符合臨床使用要求。本發(fā)明適用于檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒抗體是否存在?？奢^現(xiàn)用技術(shù)大大縮短窗口期。


圖1是證明本發(fā)明有益效果的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)曲線(xiàn)圖。
用本發(fā)明一次檢測(cè)可同時(shí)檢測(cè)血中的IgG、IgM抗HCV抗體，并可進(jìn)一步縮短窗口期最早至2周以?xún)?nèi)。
具體實(shí)施方式
[1]、本發(fā)明檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒組份實(shí)施例(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有2M硫酸溶液的終止液；(7)、含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對(duì)照正常人血清；(9)、陽(yáng)性對(duì)照含有HCV抗體的人血清。、本發(fā)明檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法實(shí)施例I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備先制備用于包被酶聯(lián)板的HCV基因重組結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原；將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過(guò)夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板。此即將HCV抗原包被于酶聯(lián)板上。
II、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合物的制備先制備用于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HCV基因重組結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原，此即區(qū)別于其它檢測(cè)HCV抗體診斷試劑的酶標(biāo)記物特征所在；將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過(guò)氧化物酶用改良過(guò)碘酸鈉法結(jié)合在一起，即為酶標(biāo)HCV抗原結(jié)合物。
改良過(guò)碘酸鈉法，具體步驟如下氧化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)用純化水將HRP配成4mg/ml溶液，加入0.2ml含有6mg過(guò)碘酸鈉的溶液，室溫避光反應(yīng)20分鐘；透析將氧化后HRP溶液用pH4.5 1mmol/l乙酸鹽溶液透析，30分鐘1次，共8次；調(diào)節(jié)pH用0.1mol/1，pH9.5的碳酸鹽緩沖液將上述HRP溶液的pH調(diào)至9.0以上；準(zhǔn)備HCV抗原用0.01mol/l，pH9.5的碳酸鹽緩沖液將HCV抗原調(diào)配成8mg/ml濃度；與HCV抗原交聯(lián)將上述HRP溶液與HCV抗原溶液以等體積比例，將抗原溶液緩慢加入HRP溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)；
還原將新鮮配制的2mg/ml硼氫化鈉溶液，按0.2ml/4mgHRP的濃度加入上述HRP-HCV抗原溶液，4℃反應(yīng)2小時(shí)；透析將HRP-HCV抗原結(jié)合物溶液，用100倍以上體積的0.01mol/l，pH7.2磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜，至少換3次透析液；分裝保存加入等量甘油，分裝后低溫保存。
III、試劑盒其它組分包括洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對(duì)照血清為正常人血清，陽(yáng)性對(duì)照血清為含有HCV抗體的人血清。、用檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的檢測(cè)步驟實(shí)施例a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔、陰性血清對(duì)照孔、陽(yáng)性血清對(duì)照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50祃，再依次加入陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照和樣品各50祃，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿(mǎn)各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HcV抗原結(jié)合物100μl，空白對(duì)照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；d、洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測(cè)定用酶標(biāo)儀對(duì)空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測(cè)定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中不含有HCV抗體。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒的組分包括(1)、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板；(2)、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物；(3)、含有吐溫的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；(4)、含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液A；(5)、含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液的顯色液B；(6)、含有硫酸溶液的終止液；(7)、含有磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液；(8)、陰性對(duì)照正常人血清；(9)、陽(yáng)性對(duì)照含有HCV抗體的人血清。
2.一種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒的制備方法，其特征在于I、用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備將包被用HCV重組抗原加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，每孔100微升，孵育過(guò)夜，用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入含有酪蛋白的Tris緩沖液，37℃孵育2小時(shí)后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；II、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過(guò)氧化物酶用改良過(guò)碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備；III、其它組分的制備洗滌液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液，顯色液A為含有過(guò)氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液，顯色液B為含有四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液，終止液為2M硫酸，樣品稀釋液為含有酪蛋白的磷酸鹽緩沖液，陰性對(duì)照為正常人血清，陽(yáng)性對(duì)照為含有HCV抗體的人血清。
3.一種用檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒檢測(cè)樣品中丙型肝炎病毒抗體存在的方法，其特征在于檢測(cè)步驟如下a、加樣取用HCV抗原包被的預(yù)包被酶聯(lián)板，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔、陰性血清對(duì)照孔、陽(yáng)性血清對(duì)照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液50μl，再依次加入陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照和樣品各50μl，混勻，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；b、洗板棄去各孔內(nèi)液體，將洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后，注滿(mǎn)各孔，靜置10-20秒，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板，最后拍干；c、加酶在各孔加酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物100μl，空白對(duì)照孔不加，貼上不干膠條，置37℃溫育30分鐘；洗板方法同b；e、顯色依次在各孔加顯色劑A液、B液各50μl，混勻，置37℃避光溫育10分鐘；f、終止依次在各孔加終止液50μl，混勻；g、測(cè)定用酶標(biāo)儀對(duì)空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)；h、結(jié)果判定根據(jù)測(cè)定OD值與臨界值的比值。若比值大于1，則為陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中含有HCV抗體；若比值小于1，則為陰性反應(yīng)，說(shuō)明樣品中不含有HCV抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)丙肝病毒抗體診斷試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法，將包被用HCV重組抗原加至緩沖液中混勻，加至酶聯(lián)板內(nèi)，孵育過(guò)夜，用緩沖液洗滌酶聯(lián)板后，再加入緩沖液，孵育后，棄去孔內(nèi)液體，徹底干燥酶聯(lián)板，完成預(yù)包被酶聯(lián)板的制備；將標(biāo)記用HCV重組抗原和辣根過(guò)氧化物酶用改良過(guò)碘酸鈉法結(jié)合在一起，完成酶標(biāo)記HCV抗原結(jié)合物的制備；試劑盒中還含有顯色液A、顯色液B、終止液、樣品稀釋液、陰性對(duì)照為正常人血清、陽(yáng)性對(duì)照為含有HCV抗體的人血清。本發(fā)明的試劑盒具有更高的檢測(cè)活性，一次檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)血中的所有抗HCV抗體如IgG、IgM等，進(jìn)一步縮短了窗口期，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1670532SQ200510200158
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日
發(fā)明者王保君, 馮長(zhǎng)訪(fǎng), 馬曉暉 申請(qǐng)人:北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司