專利名稱：一種聯(lián)檢epsps和bt蛋白的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物的研制開發(fā)或在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評(píng)價(jià)時(shí)，往往需要對(duì)轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測(cè)定。
1.具有殺蟲性的BT晶體蛋白基因(包括BT-Cry1Ab或BT-Cry1Ac，通常簡(jiǎn)稱為BT基因)，Bt為Bacillus thuringiensis，即蘇蕓金芽孢桿菌的簡(jiǎn)稱；Cry為晶體蛋白(crystalprotein)的簡(jiǎn)稱；Cry1Ab和Cry1Ac為蘇蕓金芽孢桿菌基因編碼的兩種常見的殺蟲晶體蛋白。
2.特異性抗除草劑EPSPS(5-烯醇丙酮莾草酸-3-磷酸合酶)基因。
因此，實(shí)踐中對(duì)一種植物樣本往往都需要進(jìn)行兩種基因的檢測(cè)。
現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)如酶免、放免等方法，受儀器(酶標(biāo)儀、放免閃爍儀、離心機(jī)等)、場(chǎng)地等因素的限制，而且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(酶免檢測(cè)時(shí)間需20hr、放免需30min～1hr)，檢測(cè)成本較高，很難推廣應(yīng)用。
目前出現(xiàn)的用試紙條檢測(cè)的方法雖可部分克服以上不足(如美國(guó)EnviroLogixIncorporated，Strategic Diagnostics，Inc.和重慶金標(biāo)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試紙條)，但每種試紙條只能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中單一的外源基因，實(shí)際操作中容易產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。例如如果檢測(cè)者僅有EPSPS檢測(cè)試紙條，而檢測(cè)對(duì)象中并未轉(zhuǎn)入EPSPS基因，而是轉(zhuǎn)入BT基因，那么很可能會(huì)得出檢測(cè)對(duì)象不存在外源基因的錯(cuò)誤結(jié)果，造成不必要的損失。而且在操作時(shí)，需要將試紙條浸入待檢測(cè)的液體中，操作不是很方便。
因此，實(shí)踐中很需要有一種可同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中Bt晶體蛋白和EPSPS，且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置。
實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是建立一種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速，并能同時(shí)檢測(cè)兩種不同轉(zhuǎn)基因成分(EPSPS和BT蛋白)的免疫檢測(cè)試劑盒。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案是這樣的它包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于底板上放置有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。
底板的上表面可以設(shè)置兩條凹槽，每條凹槽內(nèi)嵌入一條測(cè)試帶，底板的厚度不限。
所述底板或上蓋可具有卡槽，以保證底板與上蓋扣緊。
所述觀測(cè)窗優(yōu)選是長(zhǎng)方形。
試劑盒的形狀不限，如可以是扁平的長(zhǎng)方形或正方形盒。
所述底板內(nèi)的兩條測(cè)試帶，一條用于檢測(cè)EPSPS，另一條用于檢測(cè)BT蛋白。所述測(cè)試帶是一種具有檢測(cè)系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測(cè)材料，由高分子纖維膜、塑料等多層材料制成。兩種蛋白的測(cè)試帶均可分為質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體；EPSPS基因測(cè)試帶的樣品檢測(cè)區(qū)包被特異功能性EPSPS，BT蛋白測(cè)試帶的樣品檢測(cè)區(qū)包被BT-Cry 1Ab/Ac的單克隆抗體或多克隆抗體。
當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)，將產(chǎn)生目的蛋白(EPSPS和BT)，因此通過(guò)檢測(cè)樣品中是否含有上述兩種蛋白來(lái)確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn)入植物，發(fā)生基因沉默，無(wú)目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的(殺蟲或抗除草劑)。
本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，每個(gè)觀測(cè)窗和加樣孔各分別對(duì)應(yīng)一條測(cè)試帶，通過(guò)盒蓋上的加樣孔和觀測(cè)窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)觀測(cè)窗可分別檢查一種基因。
每個(gè)觀測(cè)窗分為測(cè)試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；檢測(cè)時(shí)，將送檢物品的同一種提取液分別滴加在試劑盒的兩個(gè)加樣孔中，3-5分鐘后，通過(guò)肉眼就可以通過(guò)上蓋的觀測(cè)窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。
對(duì)于每個(gè)觀測(cè)窗來(lái)說(shuō)，用以下方式判斷檢測(cè)結(jié)果1、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測(cè)窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。
檢測(cè)結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。
2、陽(yáng)性(+)反應(yīng)狀況觀測(cè)窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)紫紅色條帶。檢測(cè)結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。
3、無(wú)效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，
檢測(cè)結(jié)果表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
本實(shí)用新型所述試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于經(jīng)濟(jì)高效一個(gè)檢測(cè)盒可同時(shí)檢測(cè)2種不同的轉(zhuǎn)基因成份，大大降低了使用成本；簡(jiǎn)便快速2種不同的轉(zhuǎn)基因成份一步法操作，同時(shí)檢測(cè)，不需其它任何附加儀器設(shè)備。直接將待測(cè)樣品液滴加在加樣孔中，3-5分鐘可出結(jié)果；檢測(cè)結(jié)果直觀不借助任何儀器，用肉眼可觀察到結(jié)果；應(yīng)用廣泛可檢測(cè)玉米、棉花、水稻、煙草等各類農(nóng)作物的葉片、種子及加工產(chǎn)品。
由于本實(shí)用新型提供的聯(lián)檢試劑盒同時(shí)可對(duì)植物樣品進(jìn)行EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac分析，檢測(cè)快速、特異、敏感、方便，特別適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開發(fā)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩選，可用于邊防、海關(guān)植物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)及種子經(jīng)營(yíng)銷售部門現(xiàn)場(chǎng)、快速篩查待測(cè)樣品。


圖1和圖2是本實(shí)用新型一種試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是底板的俯視圖，圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖1中有兩條測(cè)試帶，圖2中1是加樣孔，2是觀測(cè)窗。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型試劑盒中的測(cè)試帶的制備用制備檢測(cè)EPSPS的測(cè)試帶來(lái)舉例說(shuō)明實(shí)施例1制備測(cè)試帶1.EPSPS單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml。1周后，將EPSPS單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先處理過(guò)的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1～3×106。10天后收獲腹水，以上過(guò)程皆在無(wú)菌條件下完成。
2.EPSPS單克隆抗體的純化1)以DEAE離子交換層析及Sephacryl S 300分子篩對(duì)單抗進(jìn)行純化；SDS-PAGE平板電泳檢測(cè)純化單抗的純度；ELISA法測(cè)定單抗活性；2)純化過(guò)程取小鼠單抗腹水→3,000rpm離心15分鐘→上清液加50％硫酸銨沉淀，過(guò)夜→3,000rpm離心20分鐘→沉淀溶于0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)→S-300凝膠柱→DEAE Blue層析柱→0-800mM NaCl梯度洗脫→超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測(cè)定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95％以上；4)蛋白濃度測(cè)定紫外分光光度計(jì)測(cè)定279nm處的O.D.值，按以下公式計(jì)算蛋白含量OD279/1.4＝mg/ml(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約1mg/ml；5)單抗活性測(cè)定選用EPSPS抗原包被ELISA板(1μg/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP復(fù)合物，測(cè)定各單抗效價(jià)(大于1∶5000)。
3.羊抗DOAT高效價(jià)免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑→免疫山羊→加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月→第二次加強(qiáng)后10天左右取血→離心取血清→硫酸銨沉淀→DEAE離子交換層析純化；2)效價(jià)測(cè)定ELISA夾心法，抗體效價(jià)稀釋度應(yīng)大于1∶256；3)蛋白濃度測(cè)定紫外分光法測(cè)定OD279，計(jì)算蛋白濃度。
4.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0.01％HauCl4加熱至沸，加入一定量的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由蘭→紫→紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長(zhǎng)期保存，可加入0.02％NaN3。
2)將膠體金液500ml用0.1M NaOH調(diào)pH8.4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2ml，攪拌20分鐘。5,500rpm離心30Min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4℃保存。
5.膜反應(yīng)體系M1的制備1)將EPSPS抗體及純化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約0.2-2mg/ml。
2)純化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2.0mg/ml；3)硝酸纖維素膜大小10cm×27cm，每張膜可噴長(zhǎng)25cm的檢測(cè)及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個(gè)噴頭儲(chǔ)存瓶中；5)設(shè)置噴速為2μl/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗EPSPAD2(2mg/ml)在NC膜上包被反應(yīng)檢測(cè)線，以1.0mg/ml兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對(duì)照線，對(duì)照線與檢測(cè)線的距離為4-4.5mm；6)完成包被后，置37℃干燥箱24小時(shí)，用BB封閉液封閉處理半小時(shí)，用WB洗液抽洗一次；7)37℃干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1.8cm×27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置室溫保存?zhèn)溆谩?br> 6.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，室溫保存。
1)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cm×1.2cm/條。
7.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲(chǔ)存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動(dòng)速度為50mm/s；4)噴制規(guī)格為0.5-1.5cm×25cm/條，每條噴2遍；5)于37℃烘干12小時(shí)，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。
8.反應(yīng)體組裝1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜M1(18mm)，離M6上緣約22mm；3)在M7上貼M5(22mm)，與M6上緣對(duì)齊并與M1上緣交1mm；4)在M7上貼M2a(12mm)，與M1下緣相接；5)在M2上貼M4(10mm)，壓住M1下緣0.5mm；6)在M7上貼M3(12mm)，上緣壓住M4約2/3；7)在M7上貼M2b(18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對(duì)齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住M1約1.5mm；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與M1上緣交1mm，另一端翻過(guò)M6上緣，貼于M6被面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動(dòng)切條機(jī)切成3.5mm規(guī)格。
實(shí)施例2試劑盒裝配將制備好的檢測(cè)EPSPS和檢測(cè)BT蛋白的兩種測(cè)試帶分別嵌入底板的兩個(gè)凹槽中，然后將上蓋與底板扣緊，即成試劑盒。
將試劑盒、滴管和使用說(shuō)明書裝塑料袋封裝后，即可。
實(shí)施例3試劑盒使用過(guò)程1.檢測(cè)樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測(cè)前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為獲得最佳檢測(cè)效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣本混勻，靜置，取上清液作為檢測(cè)樣品。

2.檢測(cè)及結(jié)果將檢測(cè)盒平放，用所配塑料吸管吸取樣品液，滴加4-5滴于檢測(cè)盒的加樣孔1中，吸水材料使待檢樣品緩慢移動(dòng)，膜反應(yīng)體系被啟動(dòng)。無(wú)論待測(cè)基因是否存在于植物樣品中，一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
3.結(jié)果判定每一個(gè)觀測(cè)窗檢測(cè)一種待檢基因是否存在。以下以檢測(cè)EPSPS為例說(shuō)明1)如樣本中不含特定EPSPS蛋白，或其濃度低于檢測(cè)靈敏度，膠體金抗體在層析過(guò)程中不會(huì)被固定在膜上檢測(cè)帶內(nèi)的單抗免疫，因而測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)不會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色檢測(cè)帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。
2)如果待植物樣品中EPSPS蛋白濃度高于其檢測(cè)閾值時(shí)，抗原免疫金與檢測(cè)帶上的另一單抗結(jié)合，在測(cè)試區(qū)內(nèi)(T)將還出現(xiàn)另一紫紅色檢測(cè)帶，顯示陽(yáng)性(+)結(jié)果，即在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測(cè)區(qū)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。注意測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都應(yīng)判定為陽(yáng)性結(jié)果。
3)如質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求1.一種聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒，它包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于底板上放置有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒，其特征在于所述底板的上表面設(shè)置有兩條凹槽，每條凹槽內(nèi)嵌入一條測(cè)試帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒，其特征在于所述底板或上蓋具有卡槽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒，其特征在于所述觀測(cè)窗是長(zhǎng)方形。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種聯(lián)檢EPSPS和BT蛋白的試劑盒。本試劑盒由底板、上蓋組成；底板內(nèi)有兩條測(cè)試帶；上蓋有兩個(gè)觀測(cè)窗和兩個(gè)加樣孔。本試劑盒可一步同時(shí)檢測(cè)2種不同的轉(zhuǎn)基因成份，不需其它任何附加儀器設(shè)備。本試劑盒操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速只要將送檢物品的提取液分別滴加在試劑盒的兩個(gè)加樣孔中，3－5分鐘后，通過(guò)肉眼就可以通過(guò)觀測(cè)窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/558GK2836011SQ200520114588
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日
發(fā)明者林敏 , 張維, 陳明, 平淑珍, 陸偉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所