專利名稱：固相白色不透明反射式樣品池的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于固相時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的固相白色不透明反射式樣品池。
本實用新型研制的一種新型的固相白色不透明反射式樣品池，可應(yīng)用于熒光免疫分析、親和層析、固相酶技術(shù)和DNA芯片等生物分析領(lǐng)域。
自1979年Soini和Hemmila提出時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)理論，1982年創(chuàng)立第一臺手動測量儀器以來，迄今已發(fā)展為多種TRFIA體系。其中解離增強(DELFIA)體系已經(jīng)實現(xiàn)了商品化，但由于該體系存在著缺陷離子解離后不能產(chǎn)生特異的空間信號，并不適于所有的應(yīng)用，如熒光成像、免疫組化、定位雜交、DNA芯片或在線檢測等。
為了克服DELFIA體系的不足，1988年Ether等人建立了以具有增強熒光作用的新型銪螯合劑4，7-二氯磺基苯-1，10菲啰啉2，9-二羧酸(BCPDA)作為標記物的激光激發(fā)固相時間分辨熒光免疫分析(DSLFIA)的新體系，該檢測系統(tǒng)帶有激光光源和白色不透明反射式樣品池。(用新型銪螯合劑4，7-二氯磺基苯-1，10菲啰啉2，9-二羧酸(BCPDA)作為標記物的激光激發(fā)固相時間分辨熒光免疫分析，分析化學，1988，60，1069-1074。LaserExcitted Time-Resolved SolidPhase Fluoroimmunoassays with the New Europium Chelate4，7--Bis(chlorosulfophenyl)-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxy Acid asLabel.Anal.Chem.1988，60，1069-1074)[1]為深入開展DSLFIA體系開創(chuàng)了檢測系統(tǒng)的先河。但是由于試劑和檢測系統(tǒng)正在完善之中，尚未達到商品化水平。有關(guān)白色不透明反射式樣品池技術(shù)未見報道。
尼龍(聚己內(nèi)酰胺)作為可游離出自由氨基的多氨，很早就引起人們的關(guān)注。但多數(shù)研究都集中于將生物分子偶聯(lián)于尼龍膜上(嗜熱菌蛋白酶固定在多胺膜上，生物技術(shù)和生物工程，2003，82(2)190-199。Immobilization of Thermolysin to polyamide Nonwoven Materials.Biotechnol and Bioeng.2003，82(2)190-199.)[2]可用于斑點免疫分析和免疫印記技術(shù)，不適合做酶聯(lián)免疫分析(ELSIA)固相。關(guān)于將尼龍結(jié)合于聚苯乙烯固相的方法，有人報道預先將生物分子結(jié)合與尼龍膜上之后再覆蓋于PS孔內(nèi)(半抗原結(jié)合的尼龍涂布于聚苯乙烯板作為酶聯(lián)免疫分析固相，免疫方法學雜志.1990，12743-49.Haptenated nyIon--coated polystyreneplates as a solid phase for ELSIA.J.Immunol Methods.1990，12743-49)[3].該法及用該法獲得的PS微孔板已被證明結(jié)合不均勻，不能耐受尼龍水解釋放氨基的強酸處理以及化學偶聯(lián)中的有機溶劑，導致聚苯乙烯表面被侵蝕、破壞。分析其原因是由于使用乙酸/間甲酚/二氯甲烷溶解nylon導致兩個主要問題其一，二氯甲烷快速揮發(fā)，在nylon膜留下微孔，降低了膜的機械強度及對PS的結(jié)合力；其二，鹽酸和有機溶劑通過微孔直接于PS接觸，前者使nylon膜容易斷裂，后者能溶解PS，導致PS與nylon膜混合而掩蓋nylon的活性基團。故該方法只能預先結(jié)合免疫配基，再覆蓋于PS表面，不具備實用價值。
實用新型內(nèi)容為了解決上述存在的技術(shù)問題，本實用新型提供了一種在聚苯乙烯樣品池的表面固定一層白色不透明的尼龍層，經(jīng)化學修飾后得到固相白色不透明反射式樣品池。該固相白色不透明反射式樣品池用于DSLFIA技術(shù)。
本實用新型提供的固相白色不透明反射式樣品池的結(jié)構(gòu)如圖1所示。它是一個有底的圓臺型或圓柱型的杯狀體；是由基體1、中層2、內(nèi)表面層3構(gòu)成；所述的基體1是聚苯乙烯(PS)，中層2是聯(lián)結(jié)于基體1聚苯乙烯(PS)的內(nèi)表面的nylon-6膜層，內(nèi)表面層3是與中層2的nylon-6膜層以共價結(jié)合的多胺基層；所述的基體1聚苯乙烯(PS)和中層2的nylon-6膜層的聯(lián)結(jié)是用吡啶/丙酮預先活化處理基體1的內(nèi)表面，用乙酸/間甲酚/吡啶溶解、活化nylon-6，使兩者之間發(fā)生疏水性相互作用，同時吡啶兼有活化PS和溫和的“侵蝕”作用，可使nylon-6快速牢固地聯(lián)結(jié)于PS內(nèi)表面而形成內(nèi)表面層2；對內(nèi)表面層2的尼龍層進行烷基化處理，可使nylon-6表面生成的烷基-OR很容易地與2，6-二氨基己酸的一個氨基共價結(jié)合，形成另一端游離氨基的手臂，該“手臂”的游離氨基能與蛋白質(zhì)的游離氨基形成較牢固的共價結(jié)合的內(nèi)表面層3是多胺基層，于是得到固相白色不透明反射式樣品池。
下面再詳細介紹本實用新型的制造固相白色不透明反射式樣品池方法的具體步驟和條件，以便對本實用新型作進一步地說明。
本實用新型所用試劑A.基體1活化劑6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。
B.中層2的nylon-6的活化劑(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/間甲酚溶液(V/V)。
C.環(huán)氧氯丙烷的乙醚溶液環(huán)氧氯丙烷與乙醚溶液體積比為1∶9。
D.三乙基氧嗡四硼酸脂(TOTFB)試劑制備40ml 5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持續(xù)攪拌下，加入12.5ml的環(huán)氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分鐘內(nèi)加完，之后加熱回流一小時，室溫再攪拌3小時，濾出TOTFB，再用無水乙醚沖洗3次，得到的TOTFB。其產(chǎn)率為90％--95％以上。
E.TOTFB二氯甲烷溶液含0.01-0.05g/ml TOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。
F.戊二醛液將0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶于0.2M硼酸鹽緩沖溶液(pH＝7.6)。
G.1，6己二胺溶液濃度為0.5M 1，6己二胺的(pH＝9.5)的碳酸鹽緩沖溶液。
本實用新型制備方法的步驟和條件1.nylon-6與PS基體1的聯(lián)結(jié)向由PS基體1池內(nèi)加入基體1活化劑，室溫放置1-3分鐘，棄去溶液后立即加入含12-18％聚酰胺-6粉的中層2nylon-6的活化劑，沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1池的內(nèi)表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2的膜層；2.尼龍膜表面烷基化加入TOTFB二氯甲烷溶液上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷沖洗2次，用二氧六環(huán)沖洗1次；3.修飾尼龍膜表面將戊二醛溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去，加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次，再加入1，6己二胺(pH＝9.5)溶液，室溫放置3小時，倒掉，然后用PBS溶液沖洗3次，即得固相白色不透明反射式樣品池。
本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池的技術(shù)上的特點和有益的效果如下1.利用nylon-6結(jié)合于PS的內(nèi)表面的白色不透明的反射樣品池，采用新的溶解多氨技術(shù)和特定的PS活化劑、多氨凝固劑，使多胺均勻、牢固移植于nylon-6的表面，形成白色反射光的多胺基內(nèi)層。
2.該多胺內(nèi)表面固相在室溫暴露空氣中能長期保存并能耐受強酸、堿、有機溶劑不變形、不脫落。為使nylon-6聚己內(nèi)酰氨結(jié)構(gòu)游離出活性基團，以往用鹽酸部分水解法，由于過度水解會使nylon結(jié)構(gòu)斷裂，控制水解時間又導致游離氨基暴露不充分，故采用TOTFB烷化處理尼龍層。該法不會影響nylon-6結(jié)構(gòu)，且能充分暴露活性基團 利用戊二醛雙功能團作用，一端結(jié)合“手臂”上的游離氨基，另一端游離的醛基結(jié)合蛋白質(zhì)的游離氨基，提高結(jié)合免疫配基的活性。
3.采用吡啶代替二氯甲烷。因為吡啶不但揮發(fā)慢而且能促進溶解狀態(tài)的nylon聚集及與PS的結(jié)合，在PS表面形成均勻、堅韌、不能透過乙機溶劑的薄膜；并在其與PS結(jié)合時，對活性氨基含量、機械強度及對有機溶劑耐受性等方面收到理想的效果。
4.用TOTFB處理nylon表面，文獻中已有報道，但都是用nylon膜反應(yīng)，洗脫需經(jīng)過大量液體浸泡，本實用新型采用池內(nèi)沖洗三次，非特異結(jié)合為3.41％，實驗/非特異＝12.9，顯著高于ELISA 2.1倍診斷標準。
5.將固相白色不透明反射式樣品池用于放射性標記免疫分析，配基結(jié)合率達43.98％，為未處理PS樣品池的2.5-13.1倍。證明本樣品池具有較高活性及靈敏度。
6.本實用新型固相白色不透明反射式樣品池的批內(nèi)誤差統(tǒng)計實驗及對照組平均CV＝5.0％，各組8個平行樣本CV＜10％，顯著高于未處理的PS樣品池。
7.本實用新型固相白色不透明反射式樣品池的破壞性實驗結(jié)果證明蛋白質(zhì)完全變性的溫度為65℃，實驗采用50℃保持加溫48小時，樣品池偶聯(lián)抗體的結(jié)合率仍保持41％，比實驗前降低了4.6％。而未處理PS微孔板結(jié)合率5％，已完全失效。
8.本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池的性能可與與丹麥生產(chǎn)的Nunc Covalink-NH微孔板相比，實用性則比其優(yōu)越(聚苯乙烯微孔板氨基化用于雜交實驗中共價移植DNA探針。分析生物化學1996，23685-94。Amination of polystyrene MicrowellApplication tothe covalent Grafting of DNA probe for Hybridization assays.Anal.Biochem.1996，23685-94)[5]。例如Nunc板的活性基團為-NH，本實用新型為-NH2，該基團聯(lián)結(jié)蛋白質(zhì)的氨基更容易，更穩(wěn)定；Nunc板售價比PS微孔板貴2倍。本實用新型因操作簡便，取材容易，成本只比PS微孔板貴20％左右，在市場上有競爭能力。
本實用新型既可用于免疫分析，還可以用做親和層析固相結(jié)合劑，即將直徑為5-8μm PS微珠按本方法移植活性氨基，可作為高效能親和層析材料，且可以反復使用，其功能及成本均比常用的聚丙烯酰胺凝膠為優(yōu)，具有廣泛的應(yīng)用價值。


圖1是本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池的結(jié)構(gòu)示意圖。此圖也是說明書摘要附圖。
具體實施方式
本實用新型實施例所用的試劑及其制備A.基體1活化劑6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液(V/V)。
B.中層2的nylon-6的活化劑(0.5-0.9％吡啶)的乙酸/間甲酚溶液(V/V)。
C.環(huán)氧氯丙烷的乙醚溶液環(huán)氧氯丙烷與乙醚溶液體積比為1∶9。
D.三乙基氧嗡四硼酸脂(TOTFB)試劑制備40ml 5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持續(xù)攪拌下，加入12.5ml的環(huán)氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分鐘內(nèi)加完，之后加熱回流一小時，室溫再攪拌3小時，濾出TOTFB，再用無水乙醚沖洗3次，得到TOTFB。其產(chǎn)率為90％--95％以上。
E.TOTFB二氯甲烷溶液含0.01-0.05g/ml TOTFB三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)二氯甲烷溶液。
F.戊二醛液將0.5M戊二醛液以5％(v/v)相溶于0.2M硼酸鹽緩沖溶液(pH＝7.6)。
G.1，6己二胺溶液將的0.5M的1，6己二胺溶液(v/v)溶于0.1M(pH＝9.5)的碳酸鹽緩沖溶液。
本實用新型的制備方法的步驟和條件1.nylon-6與PS基體1的聯(lián)結(jié)向由PS基體1池內(nèi)加入基體1活化劑A，室溫放置1-3分鐘，棄去溶液后立即加入含12-18％聚酰胺-6粉的中層2 nylon-6的活化劑B，沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1池的內(nèi)表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2的膜層；2.尼龍膜表面烷基化加入TOTFB二氯甲烷溶液于上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷沖洗2次，用二氧六環(huán)沖洗1次；3.修飾尼龍膜表面將戊二醛溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去，加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次，再加入1，6己二胺(pH＝9.5)溶液，室溫放置3小時，倒掉，然后用PBS溶液沖洗3次，即得固相白色不透明反射式樣品池。
實施例1(1).向由PS構(gòu)成的基體1內(nèi)加入400μl基體1活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液后立即加入200μl由中層2 nylon-6活化劑溶解的12％nylon-6溶液，沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1的內(nèi)表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2 nylon-6膜層；(2).加入400μl 5％三乙基氧翁四氟硼酸酯(TOTFB)的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷沖洗2次，二氧六環(huán)沖洗1次；(3).將200μl 0.5M戊二醛加入上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去。加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次；再加入200μl 0.058g/ml的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉。然后用PBS緩沖溶液沖洗3次，即得本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池。
實施例2(1).向由PS構(gòu)成的基體1內(nèi)加入400μl基體1活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液后立即加入200μl用中層2 nylon-6活化劑溶解的13％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1的內(nèi)表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2 nylon-6膜層；(2).加入400μl 4％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去.用二氯甲烷沖洗2次，二氧六環(huán)沖洗1次；(3).加入200μl 0.5M戊二醛硼酸鹽緩沖溶液到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，棄去。加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次；再加入200μl 0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然后用PBS緩沖溶液沖洗3次，即得到本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池。
實施例3(1).向由PS構(gòu)成的基體1內(nèi)加入400μl基體1活化劑。室溫放置1分鐘，棄去溶液后立即加入200μl由中層2 nylon-6活化劑溶解的14％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1的內(nèi)表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2 nylon-6膜層；(2).加入400μl 3％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去。用二氯甲烷沖洗2次，二氧六環(huán)沖洗1次；所述的TOTFB合成方法是按文獻(酶固定于尼龍的化學，生物化學.J.1975，147593-603 A chemistry for the Immobilization of Enzymeson nylon.Biochem.J.1975，147593-603)合成方法合成；(3).將200μl 0.5M戊二醛硼酸鹽溶液加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次；再加入200μl0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然后用PBS溶液沖洗3次，即得本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池。
實施例4(1).向由PS構(gòu)成的基體1內(nèi)加入400μl基體(1)活化劑，室溫放置1分鐘，棄去溶液后立即加入200μl用中層2 nylon-6活化劑溶解的15％nylon-6溶液。沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1的內(nèi)表面，形成nylon-6厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2 nylon-6膜層；(2).加入400μl 2％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去，用二氯甲烷沖洗2次，二氧六環(huán)沖洗1次；(3).將200μl戊二醛硼酸鹽緩沖溶液(pH＝7.6)的加入到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘后加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次；再加入200μ溶于0.1M碳酸鹽緩沖溶液(pH＝9.5)0.5M的1，6己二胺溶液，室溫放置3小時，倒掉，然后用PBS溶液沖洗3次，即得本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池。
實施例5(1).向由PS構(gòu)成的基體1內(nèi)加入400μl基體1活化劑。室溫放置1分鐘，棄去溶液后立即加入200μl由中層2 nylon-6活化劑溶解的16％nylon-6溶液，沿中軸線慢速旋轉(zhuǎn)(40次/分)基體1，使nylon-6快速、堅固、均勻地結(jié)合于基體1的內(nèi)表面，形成nylon-6膜層厚度為0.1-0.2mm的白色不透明的反射樣品池中層2 nylon-6膜層；(2).加入400μl 1％TOTFB的二氯甲烷溶液到上述(1)的樣品池中，室溫放置4-10分鐘，棄去。用二氯甲烷沖洗2次，二氧六環(huán)沖洗1次；(3).加入200μl 0.5M戊二醛硼酸鹽緩沖溶液到上述(2)的樣品池中，37℃溫育15分鐘，加入0.2M pH＝7.2磷酸鹽(PBS)緩沖溶液沖洗三次；再加入200μl0.5M1，6己二胺碳酸鹽緩沖溶液(pH＝9.50)，室溫放置3小時，倒掉。然后用PBS溶液沖洗3次，即得本實用新型的固相白色不透明反射式樣品池。
權(quán)利要求1.一種固相白色不透明反射式樣品池，是一個有底的圓臺型或圓柱型的杯狀體，其特征在于，是由基體(1)、中層(2)、內(nèi)表面層(3)構(gòu)成；所述的基體(1)是聚苯乙烯(PS)，中層(2)是聯(lián)結(jié)于基體(1)聚苯乙烯(PS)的內(nèi)表面的nylon-6膜層，內(nèi)表面層(3)是與中層(2)的nylon-6膜層以共價結(jié)合的多胺基層。
專利摘要本實用新型屬于固相時間分辨熒光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及固相白色不透明反射式樣品池。它是一個有底的圓臺型或圓柱型的杯狀體，由基體(1)、中層(2)、內(nèi)表面層(3)構(gòu)成；所述的基體(1)是聚苯乙烯(PS)，中層(2)是固定于基體(1)聚苯乙烯(PS)的內(nèi)表面的nylon－6膜層，內(nèi)表面層(3)是與中層(2)的nylon－6膜層以共價結(jié)合的多胺基層。以共價化學結(jié)合代替物理吸附，增大抗原或抗體的結(jié)合量，顯著提高結(jié)合免疫配基的活性，使免疫檢測靈敏度增強。本實用新型既可用于免疫分析，還可以用做親和層析固相結(jié)合劑，且可以反復使用，其功能及成本均比常用的聚丙烯酰胺凝膠為優(yōu)，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/53GK2833594SQ20052012278
公開日2006年11月1日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者潘利華, 馬世鹽, 蘇賽飛, 李珍 申請人:中國科學院長春應(yīng)用化學研究所