專利名稱：快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于果蔬及原糧類食品中農(nóng)藥殘留檢測試紙及其檢測方法，屬膠體金免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于蔬菜生長期短且病蟲害較為嚴(yán)重，因而，在蔬菜種植過程中常常需要連續(xù)多次施藥。現(xiàn)在化蔬菜種植中用除草劑除草代替人工除草，提高勞動效率。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時間間隔短，造成采收時蔬菜中的農(nóng)藥殘留量往往較高，很容易超過國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)會嚴(yán)重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門對食品的農(nóng)藥殘留問題十分關(guān)注。但由于農(nóng)藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個惡性循環(huán)，因此全面徹底禁止高劇毒農(nóng)藥的使用將有一個較長的過程，即使是全面使用中、低毒農(nóng)藥，農(nóng)藥惡性中毒事件仍然發(fā)生。因此對分析檢測的對象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸多方面都提出了新的要求和更高標(biāo)準(zhǔn)。
毒死蜱(O-O-二乙基O-3，5，6-三氯-2-吡啶基磷酸酯)，是1965年由Dow Chemical Company推廣使用的一種高效有機磷殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟作物的害蟲防治。其對哺乳動物呈中等毒性，但對非靶標(biāo)水生生物毒性較高。而且，環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)毒死蜱殘留的情況也日趨嚴(yán)重，這對人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。其可以抑制膽堿酯酶活性。中毒癥狀有頭痛、頭暈、無力，視力模糊、惡心、嘔吐、瞳孔縮小、肌肉震顫。重者出現(xiàn)肺水腫、昏迷。對眼和皮膚也有刺激性。由于其可能傷害兒童的神經(jīng)系統(tǒng)，阻止大腦的發(fā)育，美國環(huán)境保護署(EPA)2000年6月8日宣布在2000年末停止毒死蜱在住宅(包括住宅草地和花園)、學(xué)校、托兒所、公園、醫(yī)院、私人療養(yǎng)所和購物中心住宅草地和花園內(nèi)的使用。中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會于2005年1月25日發(fā)布，2005年10月1日實施中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量(GB 2763-2005)，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)藥毒死蜱在稻谷、小麥、韭菜、葉菜類蔬菜中的最大允許殘留量為0.1mg/kg；在甘藍類蔬菜、梨果類水果、柑橘類水果中的最大允許殘留量為1mg/kg；在番茄中的最大允許殘留量為0.5mg/kg；在莖類蔬菜、棉籽油中的最大允許殘留量為0.05mg/kg。
目前，檢測農(nóng)藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法(GC/MS)?！懊敢种坡史?分光光度法”已被列為國家推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡便且成本低廉，可實現(xiàn)快速初篩，但受檢測范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高。總之，這些方法普遍存在著樣品前處理過程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時，檢測設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長的分析周期。
因此，利用競爭法原理，在傳統(tǒng)免疫檢測法的基礎(chǔ)上引入了膠體金快速檢測技術(shù)，研制出毒死蜱膠體金競爭法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達到復(fù)雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一，同時具有保存方便，有效期長的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于檢測毒死蜱是否超標(biāo)的膠體金測定試紙。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在毒死蜱殘留檢測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法按專利CN 2741052Y執(zhí)行。
毒死蜱殘留檢測試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗線是由毒死蜱合成免疫原包被。把檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當(dāng)移動至毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊時，樣品中的毒死蜱與毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動至固定有毒死蜱合成免疫原試驗線時，由于毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中毒死蜱優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與毒死蜱合成免疫原結(jié)合，因此其膠體金不能滯留于試驗線上，試驗線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有毒死蜱，毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體移動到試驗線上，毒死蜱單克隆抗體就會與毒死蜱合成免疫原發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗線的顏色深淺與樣品中毒死蜱含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由于所測毒死蜱含量不同，試驗線的顏色也不同，形成一個紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗線所反應(yīng)實際毒死蜱的量。
用競爭法制成試紙其檢測毒死蜱設(shè)定檢出量以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；設(shè)定檢出量以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；設(shè)定檢出量時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當(dāng)移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無毒死蜱，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為本發(fā)明一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為發(fā)明圖一的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為檢測顯示陽性結(jié)果圖。
圖4為檢測顯示陰性結(jié)果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實施例1.根據(jù)毒死蜱的分子結(jié)構(gòu)，推斷其分子中的抗原決定區(qū)，選用毒死蜱農(nóng)藥原藥經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成一種與毒死蜱分子結(jié)構(gòu)相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白質(zhì)大分子相連接基團的分子結(jié)構(gòu)(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質(zhì)大分子相連接制得毒死蜱免疫抗原。
2.單克隆抗體的制備(1)用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細(xì)胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與毒死蜱分子結(jié)合的單克隆抗體用于膠體金標(biāo)記。
3.膠體金的制備及與毒死蜱單克隆抗體的結(jié)合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰3～10分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把毒死蜱單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見說明書附圖，方法同專利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結(jié)果。
7.結(jié)果判斷檢測毒死蜱濃度0.5mg/kg以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽性；0.5mg/kg以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；0.5mg/kg時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國家頒布的蔬菜農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)0.5mg/kg。從而得出判斷。
權(quán)利要求1.一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、毒死蜱單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線是由毒死蜱合成免疫原包被制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設(shè)定為最低檢出量范圍為毒死蜱0.05～5mg/kg。
專利摘要一種快速檢測毒死蜱殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有毒死蜱合成免疫原試驗線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，通過膠體金免疫競爭方法制成試紙，利用免疫膠體金法來檢測果蔬中的毒死蜱殘留量是否超標(biāo)。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員檢測，真正達到復(fù)雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一，同時具有保存方便，有效期長的特點。
文檔編號G01N33/531GK2864678SQ20052014253
公開日2007年1月31日 申請日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成