專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于果蔬及原糧類(lèi)食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法，屬膠體金免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于蔬菜生長(zhǎng)期短且病蟲(chóng)害較為嚴(yán)重，因而，在蔬菜種植過(guò)程中常常需要連續(xù)多次施藥?，F(xiàn)在化蔬菜種植中用除草劑除草代替人工除草，提高勞動(dòng)效率。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時(shí)間間隔短，造成采收時(shí)蔬菜中的農(nóng)藥殘留量往往較高，很容易超過(guò)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)會(huì)嚴(yán)重影響人類(lèi)健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門(mén)對(duì)食品的農(nóng)藥殘留問(wèn)題十分關(guān)注。但由于農(nóng)藥的毒性和害蟲(chóng)的抗藥性形成一個(gè)惡性循環(huán)，因此全面徹底禁止高劇毒農(nóng)藥的使用將有一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程，即使是全面使用中、低毒農(nóng)藥，農(nóng)藥惡性中毒事件仍然發(fā)生。因此對(duì)分析檢測(cè)的對(duì)象、種類(lèi)、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸多方面都提出了新的要求和更高標(biāo)準(zhǔn)。
霜霉威(N-[3-(二甲基氨基)丙基]氨基甲酸丙酯鹽酸鹽)，是一種低毒的新型殺菌劑，屬氨基甲酸酯類(lèi)。其作用機(jī)理是抑制病菌細(xì)胞膜成分的磷脂和脂肪酸的生物合成，抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子囊的形成和萌發(fā)。最近美國(guó)擬實(shí)施的農(nóng)藥殘留新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定霜霉威在部分農(nóng)產(chǎn)品中的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為萵苣葉65mg/kg、小麥麥粒0.05mg/kg、小麥麥稈0.1mg/kg、小麥草料0.3mg/kg、小麥干草0.3mg/kg、葫蘆1.5mg/kg、番茄醬5mg/kg、果菜2mg/kg。我國(guó)雖然對(duì)農(nóng)作物中霜霉威的殘留限量尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)可循，但美國(guó)是我國(guó)主要的農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易伙伴，其農(nóng)藥殘留新標(biāo)準(zhǔn)的擬實(shí)施對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口美國(guó)產(chǎn)生一定的影響。
目前，檢測(cè)農(nóng)藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法(GC/MS)?！懊敢种坡史?分光光度法”已被列為國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便且成本低廉，可實(shí)現(xiàn)快速初篩，但受檢測(cè)范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實(shí)現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測(cè)成本較高?？傊?，這些方法普遍存在著樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時(shí)，檢測(cè)設(shè)備昂貴，并要求有專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期。
因此，利用競(jìng)爭(zhēng)法原理，在傳統(tǒng)免疫檢測(cè)法的基礎(chǔ)上引入了膠體金快速檢測(cè)技術(shù)，研制出霜霉威膠體金競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員檢測(cè)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述存在的一些問(wèn)題，提供了一種適用于檢測(cè)霜霉威是否超標(biāo)的膠體金測(cè)定試紙。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在霜霉威殘留檢測(cè)試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(xiàn)和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線(xiàn)，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法按專(zhuān)利CN 2741052Y執(zhí)行。
霜霉威殘留檢測(cè)試紙的控制線(xiàn)是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗(yàn)線(xiàn)是由霜霉威合成免疫原包被。把檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果蔬汁中，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊時(shí)，樣品中的霜霉威與霜霉威單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)至固定有霜霉威合成免疫原試驗(yàn)線(xiàn)時(shí)，由于霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中霜霉威優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與霜霉威合成免疫原結(jié)合，因此其膠體金不能滯留于試驗(yàn)線(xiàn)上，試驗(yàn)線(xiàn)處沒(méi)有紅色線(xiàn)顯示，即只有一條紅色控制線(xiàn)為陽(yáng)性；相反如果樣品中沒(méi)有霜霉威，霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體移動(dòng)到試驗(yàn)線(xiàn)上，霜霉威單克隆抗體就會(huì)與霜霉威合成免疫原發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗(yàn)線(xiàn)上，即二條紅色線(xiàn)為陰性，這就是免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理。試驗(yàn)線(xiàn)的顏色深淺與樣品中霜霉威含量高低成反比。從陽(yáng)性過(guò)渡到陰性，由于所測(cè)霜霉威含量不同，試驗(yàn)線(xiàn)的顏色也不同，形成一個(gè)紅色顏色梯度差，以這種原理檢測(cè)出OD值，從而推斷出試驗(yàn)線(xiàn)所反應(yīng)實(shí)際霜霉威的量。
用競(jìng)爭(zhēng)法制成試紙其檢測(cè)霜霉威設(shè)定檢出量以上，觀(guān)察窗處出現(xiàn)一條紅線(xiàn)為陽(yáng)性；沒(méi)定檢出量以下出現(xiàn)雙紅線(xiàn)為陰性；設(shè)定檢出量時(shí)在試驗(yàn)線(xiàn)處為一條模糊陰影線(xiàn)為界限值，從而得出判斷。
當(dāng)移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線(xiàn)時(shí)，無(wú)論樣品中有無(wú)霜霉威，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會(huì)與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線(xiàn)顯示紅色。因此控制線(xiàn)無(wú)色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測(cè)時(shí)樣品液面超過(guò)MAX線(xiàn)或試紙已經(jīng)過(guò)期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無(wú)須專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為本發(fā)明一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為發(fā)明圖一的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為檢測(cè)顯示陽(yáng)性結(jié)果圖。
圖4為檢測(cè)顯示陰性結(jié)果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線(xiàn)，4、試驗(yàn)線(xiàn)，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
1.根據(jù)霜霉威的分子結(jié)構(gòu)，推斷其分子中的抗原決定區(qū)，選用霜霉威農(nóng)藥原藥經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成一種與霜霉威分子結(jié)構(gòu)相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白質(zhì)大分子相連接基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質(zhì)大分子相連接制得霜霉威免疫抗原。
2.單克隆抗體的制備(1)用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與霜霉威分子結(jié)合的單克隆抗體用于膠體金標(biāo)記。
3.膠體金的制備及與霜霉威單克隆抗體的結(jié)合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰3～10分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把霜霉威單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動(dòng)速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖，方法同專(zhuān)利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入蔬菜浸汁中(液面不得超過(guò)MAX線(xiàn)圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，5分鐘時(shí)觀(guān)察結(jié)果。
7.結(jié)果判斷若該試紙的最低檢出量設(shè)定為10mg/kg，則檢測(cè)霜霉威濃度10mg/kg以上，觀(guān)察窗處出現(xiàn)一條紅線(xiàn)為陽(yáng)性；10mg/kg以下出現(xiàn)雙紅線(xiàn)為陰性；10mg/g時(shí)在試驗(yàn)線(xiàn)處為一條模糊陰影線(xiàn)為界限值，此界限值為國(guó)家頒布的蔬菜農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)10mg/kg。從而得出判斷。
權(quán)利要求1.一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、霜霉威單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(xiàn)(8)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(xiàn)(4)和一條多克隆抗體控制線(xiàn)(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線(xiàn)是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線(xiàn)是由霜霉威合成免疫原包被制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，其特征在于金標(biāo)墊是由霜霉威單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線(xiàn)的檢測(cè)值設(shè)定為最低檢出量范圍為霜霉威0.05～100mg/kg。
專(zhuān)利摘要一種快速檢測(cè)霜霉威殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有霜霉威合成免疫原試驗(yàn)線(xiàn)和一條多克隆抗體控制線(xiàn)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，通過(guò)膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)方法制成試紙，利用免疫膠體金法來(lái)檢測(cè)果蔬中的霜霉威殘留量是否超標(biāo)。該方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員檢測(cè)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK2893705SQ20052014253
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
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