專(zhuān)利名稱(chēng)：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α靶基因的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或監(jiān)控代謝異常的治療方法和組合物。本發(fā)明也涉及用于鑒定代謝異常治療用化合物的方法和組合物。具體地講，本發(fā)明的方法包括Pa9、Pa13和Pa21三種PPARα靶基因的用途。
背景技術(shù)：
肥胖癥、糖尿病、高血壓和高脂血癥等代謝異常，在大多數(shù)工業(yè)化社會(huì)中是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。這類(lèi)代謝異常使個(gè)體易患冠狀動(dòng)脈病、中風(fēng)和其它心血管疾病。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)在脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝中起到關(guān)鍵作用并參與代謝障礙。
PPAR是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于核受體亞家族。激活PPAR與其它核受體即類(lèi)視黃醇X受體形成異質(zhì)二聚體，并改變靶基因的轉(zhuǎn)錄。激活PPAR與稱(chēng)為過(guò)氧化物酶體增殖物應(yīng)答元件(PPRE，其位于靶基因啟動(dòng)子上)的特異性DNA序列結(jié)合，增加了轉(zhuǎn)錄起始率。迄今為止所鑒定的大多數(shù)PPRE都是由間隔一個(gè)核苷酸的典型AGGTCA序列的直接重復(fù)序列組成(Schoonjans等，1996，BiochimBiophys Acta，130293-109)。三種PPAR亞型已經(jīng)表征為PPARα、PPARδ和PPARγ。在褐色脂肪組織、肝、心、腎和肌肉細(xì)胞中觀察到較高水平的PPARα表達(dá)，在此它調(diào)節(jié)脂肪酸的分解代謝。PPARδ廣泛表達(dá)，其功能現(xiàn)已闡明。PPARγ主要存在于脂肪組織、結(jié)腸和巨噬細(xì)胞中，并且參與脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)貯藏和葡萄糖平衡(Lee等，2003，出處同上)。
PPAR的配體包括膳食脂肪酸以及用于治療高脂血癥或II型糖尿病的大量藥物。例如，貝特類(lèi)藥物(fibrate)是一類(lèi)降低血清甘油三酯的藥物，是PPARα的合成激動(dòng)劑。貝特類(lèi)藥物的實(shí)例包括但不限于吉非貝齊、苯扎貝特、非諾貝特、氯貝丁酯和新開(kāi)發(fā)的微粉化非諾貝特。PPARα的其它合成激動(dòng)劑包括但不限于GW2331、WY14643和L165041(Mukherjee等，2002，J Steroid Biochem Mol Biol.81(3)217-25)。噻唑烷二酮類(lèi)(TZD)是一類(lèi)胰島素敏感藥物，是高親和性PPARγ激動(dòng)劑。TZD的實(shí)例包括但不限于文迪雅(羅格列酮)和Resulin(曲格列酮)。
某些PPARα激動(dòng)劑(例如貝特類(lèi))的作用看來(lái)具有種屬特異性(Vosper等，2002，Pharmacology & Therapeutics，9547-62)。在嚙齒動(dòng)物中給予貝特會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)平衡的關(guān)鍵性基因，例如HD(3-酰烯基CoA脫氫酶)基因、ACOX(脂酰CoA氧化酶)基因和ME(蘋(píng)果酸酶(MalicEnzyme))基因(Castelein等，1994 J.Biolo.Chem.26926754-758)。這與PPARα-裸鼠的研究結(jié)果是一致的，表明PPARα在維持嚙齒動(dòng)物的肝、脂肪細(xì)胞和骨骼肌等葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝的主要靶組織的β-氧化途徑的組成型活性上起到關(guān)鍵性作用(Leone等，1999，Proc.Natl.Acsd.Sci.U.S.A.967473-7478)。在人和若干其它“非敏感”物種(例如豚鼠和狨猴(marmoset))中給予貝特類(lèi)，所誘導(dǎo)的基因看來(lái)不如貝特類(lèi)在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)的那么多(Stael等，1997，Current PharmaceuticalDesign 31-14)。在人肝細(xì)胞或幾種其它“非敏感”物種的肝中，沒(méi)有觀察貝特類(lèi)對(duì)過(guò)氧化物酶體脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)。但是，這些“非敏感”動(dòng)物確實(shí)對(duì)貝特類(lèi)表現(xiàn)出有效的降脂反應(yīng)。
對(duì)PPARα所調(diào)節(jié)的新的人體基因進(jìn)行鑒定，是理解貝特類(lèi)在病人中的治療機(jī)制的關(guān)鍵。新的PPARα靶基因?qū)τ谪愄仡?lèi)和其它PPARα激動(dòng)劑活性的臨床監(jiān)測(cè)來(lái)說(shuō)具有價(jià)值。另外，新的PPARα靶基因?qū)⒂兄诳焖勹b定和開(kāi)發(fā)用于治療代謝異常的新化合物。此外，新的PPARα靶基因還將有助于開(kāi)發(fā)治療代謝異常的新方法。
發(fā)明概述目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本文所說(shuō)的基因Pa9、Pa13和Pa21是人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因。
因此，就一般方面而言，本發(fā)明提供測(cè)定患者PPARα的生物活性的方法。該方法包括測(cè)定患者基因表達(dá)水平的步驟，所述基因選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
就另一個(gè)一般方面而言，本發(fā)明提供評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性的方法。該方法包括下述步驟a)測(cè)定治療期間或治療之后患者體內(nèi)選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表達(dá)水平；和b)將步驟a)中測(cè)定的表達(dá)水平與治療之前患者體內(nèi)所述基因表達(dá)水平進(jìn)行比較；其中，治療期間或治療之后患者體內(nèi)所述基因表達(dá)水平增加，表明對(duì)患者代謝異常的治療是有效的。
本發(fā)明的特征也在于試劑盒，該試劑盒用于評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性。試劑盒可包括核酸探針，該探針在嚴(yán)格性雜交條件下與選自以下的核酸分子雜交SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQID NO5或其互補(bǔ)序列。試劑盒也可包括抗體，該抗體與選自以下的多肽分子特異性結(jié)合SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6。試劑盒還可包括使用說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)用于確定對(duì)患者代謝異常的治療是否有效。
就另一個(gè)一般方面而言，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法。該方法的一個(gè)實(shí)例包括下述步驟a)使PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)與包含緩沖劑和試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b)測(cè)定PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達(dá)水平；和c)將步驟(b)的結(jié)果與其中PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)僅與緩沖液接觸的對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行比較。該方法的其它實(shí)例包括下述步驟a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和候選化合物或試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b)測(cè)定試驗(yàn)化合物對(duì)多肽活性的影響；和c)將步驟(b)的結(jié)果與其中多肽僅與緩沖液接觸的對(duì)照進(jìn)行比較。
本發(fā)明的另一個(gè)一般方面涉及患者代謝異常的治療方法。該方法包括給予患者治療有效量的組合物的步驟，該組合物能改變患者細(xì)胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達(dá)模式或生物活性。
就又一個(gè)基本方面而言，本發(fā)明提供PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含功能性PPARα蛋白和核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報(bào)道基因編碼序列。本發(fā)明也包括分離的核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報(bào)道基因編碼序列。
就其它方面而言，根據(jù)以下公開(kāi)內(nèi)容(包括發(fā)明詳述及其優(yōu)選實(shí)施方案和所附權(quán)利要求書(shū))，本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示Pa9微陣列注釋(annotation)序列(GenBank檢索號(hào)W30988)與人FDRG基因序列(GenBank檢索號(hào)AX278133)之間的DNA序列比對(duì)。
圖2顯示Pa13微陣列注釋序列(GenBank檢索號(hào)N26311)與人TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因序列(GenBank檢索號(hào)AB000584)之間的DNA序列比對(duì)。
圖3顯示Pa21微陣列注釋序列(GenBank檢索號(hào)H49601)與人C20orf139基因序列(GenBank檢索號(hào)NM_080725)之間的DNA序列比對(duì)。
圖4說(shuō)明在SKMU細(xì)胞中，PPARα特異性siRNA降低PPARα基因表達(dá)水平。
圖5說(shuō)明在PPARα表達(dá)降低的SKMU細(xì)胞中，WY14643減少了對(duì)Pa9基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
圖6說(shuō)明在PPARα表達(dá)降低的SKMU細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到WY14643對(duì)Pa13基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
圖7說(shuō)明在PPARα表達(dá)降低的SKMU細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到WY14643對(duì)Pa21基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語(yǔ)“包括”、“含有”、“具有”和“包含”均使用其開(kāi)放式、非限制性含義。
下面是本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)使用的縮寫(xiě)詞bp＝堿基對(duì)cDNA＝互補(bǔ)DNAC20orf139＝染色體20可讀框139ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定FDRG＝血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白kb＝千堿基；1000堿基對(duì)nt＝核苷酸PAGE＝聚丙烯酰胺凝膠電泳PBMC＝外周血單核細(xì)胞PCR＝聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PPARα＝過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體αPPRE＝過(guò)氧化物酶體增殖物應(yīng)答元件RT PCR＝逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SDS＝十二烷基硫酸鈉SiRNA＝小干擾RNASKMU＝骨骼肌SSC＝氯化鈉/檸檬酸鈉TZDs＝噻唑烷二酮UTR＝非翻譯區(qū)
WAT＝白色脂肪組織。
多肽或核酸的“活性”、“生物活性”或“功能活性”，是指按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體內(nèi)或體外進(jìn)行測(cè)定時(shí)多肽或核酸分子所具有的活性。這類(lèi)活性可以是直接活性或間接活性，前者例如與第二種蛋白質(zhì)的酶活性相關(guān)或?qū)Φ诙N蛋白質(zhì)的酶活性，后者例如由該蛋白質(zhì)與第二種蛋白質(zhì)相互作用所介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)活性。
本文所用的“生物樣品”是指含有細(xì)胞或組織物的樣品或者由細(xì)胞或組織物組成的樣品，例如分離自患者的細(xì)胞或生物流體?！盎颊摺笨梢允遣溉閯?dòng)物，例如大鼠、小鼠、猴子或人，它們作為治療、觀察或試驗(yàn)的對(duì)象。生物樣品的實(shí)例包括例如痰液、血液、血細(xì)胞(例如白細(xì)胞)、羊水、血漿、精液、骨髓、組織或穿刺活檢樣品、尿液、腹膜液、胸腔積液和細(xì)胞培養(yǎng)物。生物樣品也可包括組織切片，例如用于組織學(xué)目的的冷凍切片。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品是來(lái)自病人的“臨床樣品”。生物樣品也可以稱(chēng)為“患者樣品”。試驗(yàn)生物樣品是作為分析、監(jiān)測(cè)或觀察對(duì)象的生物樣品。對(duì)照生物樣品是試驗(yàn)生物樣品的陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照。通常，對(duì)照生物樣品含有與試驗(yàn)生物樣品類(lèi)型相同的靶組織、細(xì)胞和生物流體。
“細(xì)胞”是指適于檢測(cè)方法靈敏度的至少一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。適于本發(fā)明的細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，但優(yōu)選真核細(xì)胞，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
“克隆”是由單細(xì)胞或共同祖先經(jīng)有絲分裂而來(lái)的細(xì)胞群體。
“細(xì)胞系”是原代細(xì)胞的克隆，其在體外能穩(wěn)定生長(zhǎng)多代。
“基因”是參與產(chǎn)生肽、多肽或蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段，包括編碼區(qū)以及編碼區(qū)前(“5′UTR”)后(“3′UTR”)的非編碼區(qū)。“基因”也可包括各編碼區(qū)段(“外顯子”)之間的間插非編碼序列(“內(nèi)含子”)?！皢?dòng)子”是指參與RNA聚合酶的結(jié)合從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子通常是基因上游(“5′-”)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?！罢{(diào)節(jié)序列”是指能控制基因表達(dá)的基因部分?！罢{(diào)節(jié)序列”可包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件，例如聚腺苷酸化信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和/或操縱子?！熬幋a區(qū)”是指通過(guò)三聯(lián)密碼編碼氨基酸和翻譯起始信號(hào)及終止信號(hào)的基因部分。
“基因表達(dá)微陣列分析”是指這樣的檢測(cè)方法其中使探針寡核苷酸“微陣列”與目標(biāo)核酸樣品(例如靶樣品、例如來(lái)自特定組織類(lèi)型的多聚腺苷酸mRNA或其逆轉(zhuǎn)錄物)接觸。參見(jiàn)例如Nees等(2001)，Curr Cancer Drug Targets，1(2)155-75。接觸是在雜交條件下進(jìn)行，然后除去未結(jié)合核酸。所得到的雜交核酸模式提供所檢測(cè)樣品的基因特征相關(guān)信息?；虮磉_(dá)分析可同時(shí)檢測(cè)上千個(gè)基因的表達(dá)，提供大量的基因相互作用和功能的信息?；虮磉_(dá)分析具有各種不同用途，例如鑒定基因表達(dá)，找出基因表達(dá)與特定表型之間的關(guān)系，篩選疾病易感型體質(zhì)并鑒定特定藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的效果(例如在毒性試驗(yàn)中)。本文所用的“微陣列”是指一種基質(zhì)，例如基本上是平面的基質(zhì)，例如生物芯片或基因芯片，其空間上分布有多種聚合物分子并穩(wěn)定締合或固定在基質(zhì)表面上。示例性的微陣列模式包括寡核苷酸陣列和點(diǎn)陣列?；虮磉_(dá)微陣列分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。有關(guān)綜述參見(jiàn)例如Yang等(2002)，Nat Rev genet 3(8)579-88)，或美國(guó)專(zhuān)利第6,004,755號(hào)，所述文獻(xiàn)公開(kāi)了使用DNA微陣列進(jìn)行定量基因表達(dá)分析的方法。
“人Pa9基因”是指這樣的基因(1)在嚴(yán)格性雜交條件下與具有SEQ ID NO1核苷酸序列的核酸分子特異性雜交；(2)編碼具有SEQID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對(duì)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)?！皣?yán)格性雜交條件”具有本領(lǐng)域已知含義，描述于Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)。示例性的嚴(yán)格性雜交條件包括在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在約45℃雜交，接著在0.2xSSC和0.1％SDS中、在50-65℃洗滌一次或多次?！叭薖a9基因”包括人NL2TIE配體同源多肽基因(描述于US6348350)和人FDRG基因(描述于WO0177151)。示例性的人Pa9基因包括人Pa9結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因。“多態(tài)性”是指群體內(nèi)個(gè)體中在特定基因座上的一系列基因變異體。
“分離的”核酸分子是基本上與其它核酸分子分離的核酸分子?！胺蛛x的”核酸分子可以是例如這樣的核酸分子不含在該核酸來(lái)源生物基因組DNA的5′和3′端天然側(cè)接該核酸分子的至少一個(gè)核苷酸序列。分離的核酸分子包括但不限于獨(dú)立于其它序列的分離的核酸分子(例如由PCR或限制性?xún)?nèi)切核酸酶處理而產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)，以及摻入到載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)內(nèi)的核酸分子，或者摻入到原核生物或真核生物基因組DNA內(nèi)的先前分離的核酸。另外，分離的核酸分子可包含作為雜合或融合核酸分子組成部分的核酸分子。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含來(lái)自其細(xì)胞或組織來(lái)源的細(xì)胞材料或其它污染蛋白，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)則基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。術(shù)語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括蛋白質(zhì)制劑，其中所述蛋白從細(xì)胞中分離或重組產(chǎn)生后與該細(xì)胞組分分離。因此，基本上不含細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)制劑其含有小于約30％、20％、10％或5％(干重)異源蛋白(在本文中也稱(chēng)為“污染蛋白”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或其生物活性部分是重組產(chǎn)生時(shí)，也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基含量小于約20％、10％或5％的蛋白質(zhì)制劑體積。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是通過(guò)化學(xué)合成而來(lái)的，則優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，即與參與該蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)品彼此分離。因此，該蛋白制劑含有小于約30％、20％、10％、5％(干重)的并非目標(biāo)多肽的化學(xué)前體或化合物。分離的生物活性多肽可具有幾種不同的物理形式。分離的多肽可以呈全長(zhǎng)新生或?yàn)榧庸さ亩嚯男问?，或者是部分加工的多肽或加工多肽的組合?？梢越?jīng)特異性蛋白水解切割事件，對(duì)全長(zhǎng)新生的多肽進(jìn)行翻譯后修飾，導(dǎo)致形成全長(zhǎng)新生多肽的片段。片段或片段的物理結(jié)合可具有全長(zhǎng)多肽相關(guān)生物活性，然而，各片段相關(guān)生物活性的程度可以是不同的。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”用于標(biāo)記試劑(例如核酸探針或抗體)時(shí)，包括通過(guò)將檢測(cè)物質(zhì)與試劑偶聯(lián)從而用試劑直接標(biāo)記(即物理連接)，以及用其它能直接標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接標(biāo)記?？芍苯訖z測(cè)的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記和放射性同位素。說(shuō)明性的放射性同位素標(biāo)記包括例如35S、32p和3H。優(yōu)選的熒光劑是吸收光波長(zhǎng)約為300-900nm的熒光劑，更優(yōu)選約400-800nm的熒光劑，其中最大吸收光波長(zhǎng)范圍優(yōu)選在約500-800nm?？捎糜趩螛?biāo)記引物的熒光劑實(shí)例包括熒光素、羅丹明、BODIPY、花青染料等。熒光劑進(jìn)一步描述于Smith等，Nature(1986)，321647-679。間接標(biāo)記的實(shí)例包括用熒光標(biāo)記的第二抗體以及帶有生物素的末端標(biāo)記的DNA探針來(lái)檢測(cè)第一抗體，使得可以用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素等來(lái)檢測(cè)它們。對(duì)于標(biāo)記核酸分子來(lái)說(shuō)的“末端標(biāo)記”是指標(biāo)記部分存在于至少鄰近末端區(qū)域。優(yōu)選的末端標(biāo)記具有在核酸分子5′端的部分。標(biāo)記也可在3′端，使用例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。
“Pa13基因”是指這樣的基因(1)在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與人Pa13cDNA(SEQ ID NO3)具有大于約60％的核苷酸序列同一性；(2)編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與人Pa13蛋白(SEQ ID NO4)具有大于約60％的氨基酸序列同一性；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對(duì)本文所述的人Pa13蛋白。“人Pa13基因”包括人TGF-β超家族蛋白(Yokoyama-Kobayashi等，1997，J Biochem(Tokyo).122(3)622-6，GenBank蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)號(hào)BAA19151)。
“Pa13基因”可以在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與SEQ ID NO3具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，Pa13基因編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO4具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa13基因”包括人Pa13結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因及其在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動(dòng)物中的直向同源物。
“Pa21基因”是指這樣的基因(1)在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與人Pa21cDNA(SEQ ID NO5)具有大于約60％核苷酸序列同一性；(2)編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與人Pa21蛋白(SEQ ID NO6)具有大于約60％的氨基酸序列同一性；或(3)編碼能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)，該抗體針對(duì)本文所述的人Pa21蛋白。人“Pa21基因”包括人C20orf139基因(Strausberg等，2002 Dec 24，Proc Natl Acad Sci USA.；99(26)16899-903.Epub 2002Dec 11.，GenBank蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)號(hào)NP_542763)。
“Pa21基因”可以在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子與SEQ ID NO5具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，“Pa21基因”編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO6具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa21基因”包括人Pa21結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性的基因及其在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動(dòng)物中的直向同源物。
本文所用的“過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α”或“PPARα”是指這樣的多肽(1)與人PPARα蛋白具有大于約60％氨基酸序列同一性(Sher等，1993.Biochemistry.32(21)5598-604，GenBank蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)號(hào)NP_005027)；(2)能與抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)結(jié)合，該抗體針對(duì)本文所述的人PPARα蛋白；或(3)由多核苷酸所編碼，該多核苷酸在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子序列與人PPARαcDNA(GenBank核苷酸檢索號(hào)NM_005036)具有大于約60％核苷酸序列同一性。
“PPARα”可以是這樣的多肽與人PPARα蛋白具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，“PPARα”是由多核苷酸所編碼的多肽，該多核苷酸在嚴(yán)格性雜交條件下與核酸分子特異性雜交，該核酸分子序列與人PPARαcDNA具有大于約65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的核苷酸序列同一性。示例性的“PPARα”蛋白包括人PPARα蛋白結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)性以及在包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴子在內(nèi)的其它動(dòng)物中的PPARα直向同源物。“功能性PPARα”是指全長(zhǎng)PPARα蛋白或任何保留PPARα生物活性的片段PPARα蛋白，例如當(dāng)它一旦與膳食脂肪酸、貝特類(lèi)或其它PPARα激動(dòng)劑結(jié)合，即可激活包括本文所公開(kāi)的Pa9、Pa13和Pa21在內(nèi)的宿主靶基因的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語(yǔ)“PPARα靶基因”或“PPARα的靶基因”包括其表達(dá)受PPARα調(diào)節(jié)的任何類(lèi)型和來(lái)源的基因。這類(lèi)基因的實(shí)例是嚙齒動(dòng)物的脂肪酸?；?CoA氧化酶、3-烯?；鵆o-A脫氫酶和蘋(píng)果酸酶，以及本文所述的Pa9、Pa13和Pa21基因。具體地講，術(shù)語(yǔ)“PPARα靶基因”包括其啟動(dòng)子序列、尤其是其PPARα結(jié)合序列，例如過(guò)氧化物酶體增殖物應(yīng)答元件(PPRE)。靶基因可以以任何DNA構(gòu)象的形式存在。它們可存在于細(xì)胞內(nèi)，或者可以以分離的形式存在。靶基因也可與其它序列結(jié)合在一起，尤其是與編碼報(bào)告蛋白的序列結(jié)合在一起。
“重組宿主細(xì)胞”是已被外源DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)采用各種將DNA轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中的已知技術(shù)，將外源DNA導(dǎo)入本文所用的細(xì)胞時(shí)，該細(xì)胞就被外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以整合(共價(jià)連接)到染色體DNA上成為細(xì)胞基因組，或不整合。例如，外源DNA可以附加體(例如質(zhì)粒)形式保留。或者，對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞而言，外源DNA整合到染色體內(nèi)，使其通過(guò)染色體復(fù)制而遺傳給子細(xì)胞。該穩(wěn)定性由以下事實(shí)證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠建立由含有外源DNA的子細(xì)胞群體組成的細(xì)胞系或克隆。重組宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括細(xì)菌(例如大腸桿菌E.coli)、真菌細(xì)胞(例如酵母)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括人、牛、豬、猴和嚙齒類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞系)和昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如源自果蠅屬(Drosophila)和蠶的細(xì)胞系)?？梢赃M(jìn)一步理解術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”不僅是指特定患者細(xì)胞，而且也指該細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)樵谶B續(xù)傳代中因突變或環(huán)境影響會(huì)發(fā)生某些修飾，所以這樣的子代實(shí)際上可能與母細(xì)胞不同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。
“序列”是指聚合物中單體的線性順序，例如多肽中氨基酸的順序或者多核苷酸中核苷酸的順序。
正如本領(lǐng)域已知的，“序列同一性或相似性”是指經(jīng)序列比較而測(cè)定的兩個(gè)以上多肽序列或兩個(gè)以上多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也指多肽序列或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，視情況而定，可經(jīng)所述序列鏈間比對(duì)而確定。
為了測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的％同一性或相似性，為了最佳比較的目的，將序列進(jìn)行比對(duì)(例如將空位引入第一氨基酸序列或核酸序列中，以便與第二氨基酸序列或核酸序列進(jìn)行最佳比對(duì))。然后，對(duì)相應(yīng)氨基酸位或核苷酸位的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢迷诘诙蛄械南鄳?yīng)位置上被相同或相似氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則這些分子在該位置是相同的或相似的。兩個(gè)序列間的％同一性或相似性是序列共享相同或相似位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性＝相同位置數(shù)/位置總數(shù)(例如重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列具有相同長(zhǎng)度。
同一性和相似性都可容易地求出。在計(jì)算％同一性時(shí)，只計(jì)算準(zhǔn)確的匹配。測(cè)定序列間同一性或相似性的常用方法包括例如公開(kāi)于以下文獻(xiàn)的方法Carillo等(1988)，SIAM J.AppliedMath.48，1073。設(shè)計(jì)測(cè)定同一性的優(yōu)選方法，得到所測(cè)序列間的最大匹配。測(cè)定同一性和相似性的方法已經(jīng)編成了計(jì)算機(jī)程序。
用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)實(shí)例是以下文獻(xiàn)的算法Karlin等(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，該算法在以下文獻(xiàn)中被修改Karlin等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。所述算法已經(jīng)結(jié)合到Altschul等(1990)，J Mol.Biol 215403-410的NBLAST和XBLAST程序中。為了比較目的而得到帶空位的比對(duì)，可使用以下文獻(xiàn)所述的Gapped BLASTAltschul等(1997)，NucleicAcids Res.253389-3402。或者，可以使用PSI-Blast，進(jìn)行迭代搜索，檢測(cè)分子間的距離關(guān)系。當(dāng)使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相關(guān)程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見(jiàn)例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。另外，也可使用FASTA方法(Atschul等(1990)，J.Molec.Biol.215，403)。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)實(shí)例是Myers等(1988)，CABIOS 411-17的算法。該算法結(jié)合到ALIGN程序(2.0版)中，作為GCG序列比對(duì)軟件包的組成部分(Devereux等(1984)，Nucleic AcidsResearch 12(1)，387)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本上相似”是指包括相同序列以及其上經(jīng)缺失、取代或添加而得到的修飾序列的多核苷酸或多肽序列，所述序列保持任何生物活性部分并具有其任何保守基序。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)博士或其它臨床醫(yī)師所確定的活性化合物或藥物在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人中引發(fā)生物反應(yīng)或藥物反應(yīng)(包括減輕所治療疾病的癥狀)的量。確定本發(fā)明藥物組合物治療有效量的方法是本領(lǐng)域已知的。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)⑵渖线B接的其它核酸轉(zhuǎn)移的核酸分子。一類(lèi)載體是“質(zhì)?！?，是指其中可以插入額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。其它類(lèi)型的載體是其中可以插入額外DNA區(qū)段的病毒載體。某些載體在所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)一旦導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，整合在宿主細(xì)胞基因組上并且隨宿主基因組復(fù)制而復(fù)制。此外，某些載體，例如表達(dá)載體，能夠指導(dǎo)與其操作性連接的基因的表達(dá)。一般而言，用于重組DNA技術(shù)的載體通常呈質(zhì)粒形式。然而，本發(fā)明包括其它形式的載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起到等同的作用。
評(píng)價(jià)代謝異常的治療有效性的方法就一般方面而言，本發(fā)明提供測(cè)定患者PPARα的生物活性的方法。該方法包括測(cè)定患者體內(nèi)所述基因表達(dá)水平的步驟，所述基因選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
本發(fā)明提供評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性的方法。代謝異?？梢允茄惓?dyslipidaernia)或與血脂異常相關(guān)疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、血栓形成或冠狀動(dòng)脈病、高血壓、絞痛、慢性腎衰竭、外周血管病、中風(fēng)、II型糖尿病、葡萄糖耐量減低(IGT)和代謝綜合征(X綜合征)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于評(píng)價(jià)涉及PPARα激動(dòng)劑或調(diào)節(jié)劑的治療有效性。PPARα激動(dòng)劑的實(shí)例包括但不限于吉非貝齊、苯扎貝特、非諾貝特、氯貝丁酯、微粉化非諾貝特、GW2331、WY14643、L165041及其衍生物。
采自患者的生物樣品可用于測(cè)定患者體內(nèi)選自Pa9、Pa13或Pa21的PPARα靶基因的表達(dá)水平?？梢允褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適方法(例如通過(guò)穿刺活檢)，獲取生物樣品。例如，生物樣品可以得自PPARα表達(dá)集中的褐色脂肪組織、肝、心、腎或肌肉。生物樣品也可得自脂肪組織或外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)測(cè)定PPARα靶基因的mRNA量，來(lái)測(cè)定該靶基因的表達(dá)水平?？梢允褂酶鞣N技術(shù)，測(cè)定生物樣品中特定基因的mRNA的量。例如，可以通過(guò)使生物樣品與能夠特異性檢測(cè)mRNA的化合物或試劑接觸，從而測(cè)定mRNA。通常使用能夠與mRNA特異性雜交的標(biāo)記核酸探針。例如，對(duì)人Pa9mRNA具有特異性的核酸探針可以是全長(zhǎng)人Pa9cDNA，其具有SEQ ID NO1或其部分的核苷酸序列，例如長(zhǎng)度至少為15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其可以在嚴(yán)格性雜交條件下與人Pa9mRNA雜交。在嚴(yán)格性條件下，對(duì)人Pa9mRNA具有特異性的核酸探針不僅將會(huì)與該mRNA雜交，而且還會(huì)與生物樣品中存在的其它mRNA雜交。用于本發(fā)明的核酸探針包括在嚴(yán)格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO1、3或5雜交的探針。
測(cè)定生物樣品中特定基因的mRNA含量的其它技術(shù)是定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)?？梢酝ㄟ^(guò)逆轉(zhuǎn)錄，從樣品制備來(lái)自基因(例如人Pa9基因)的互補(bǔ)DNA(cDNA)。通過(guò)PCR，使用在嚴(yán)格性雜交條件下能夠與Pa9cDNA雜交的寡核苷酸引物，可以擴(kuò)增cDNA。用于RT-PCR的試劑盒是市售的，例如來(lái)自Applied Biosystems(Foster City，CA)的“One-Step RT-PCR Master Mix Reagent”試劑盒。
最近十幾年來(lái)，原位雜交一直廣泛用于研究細(xì)胞或組織特定區(qū)室的mRNA的分布和表達(dá)。用于原位雜交的核酸探針?lè)N類(lèi)包括不同長(zhǎng)度的單鏈寡核苷酸、單鏈RNA探針(核糖核酸探針(riboprobe))或雙鏈cDNA序列?？梢詫?zhuān)門(mén)針對(duì)任何已知表達(dá)的核酸序列來(lái)設(shè)計(jì)探針。各種不同放射性同位素和非同位素標(biāo)記是市售的，可用于原位雜交。有關(guān)原位雜交方法的綜述，參見(jiàn)McNicol等(1997)，J.Pathol 182(3)250-61。測(cè)定生物樣品中特定基因的mRNA含量的其它有用的技術(shù)包括DNA微陣列分析、斑點(diǎn)印跡和RNA雜交。
在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)測(cè)定PPARα靶基因所編碼的多肽含量，來(lái)確定生物樣品中PPARα靶基因的表達(dá)水平?？赏ㄟ^(guò)使生物樣品與能夠特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)的化合物或試劑接觸，來(lái)測(cè)定生物樣品中該蛋白質(zhì)含量。例如，用于檢測(cè)人Pa9蛋白的優(yōu)選試劑是能夠與該多肽部分特異性結(jié)合的抗體。在一個(gè)優(yōu)選方法中，可以使用對(duì)偶聯(lián)可檢測(cè)標(biāo)記的人Pa9蛋白具有特異性的抗體，用于檢測(cè)人Pa9蛋白質(zhì)?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體?？梢允褂猛暾目贵w分子或其片段(例如Fab或F(ab′)2)?？贵w可以通過(guò)專(zhuān)家實(shí)驗(yàn)室而得到。例如，可以在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)，開(kāi)發(fā)出針對(duì)對(duì)Pa9、Pa13或Pa21蛋白具有特異性的合成肽序列的抗體，使得能夠更大程度地便于研究這些目的靶標(biāo)。
檢測(cè)多肽(例如Pa9、Pa13或Pa21蛋白)的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光以及免疫組織化學(xué)。實(shí)施這些方法的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，(1989))。
另外，可以通過(guò)無(wú)創(chuàng)性定量方法，例如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)造影，測(cè)定活的人體器官中PPARα靶基因的表達(dá)水平(Sedvall等，(1988)Psychopharmacol.Ser.，527-33)。例如，可以將痕量Pa9蛋白結(jié)合放射性示蹤物經(jīng)靜脈注射到患者體內(nèi)，然后對(duì)患者體內(nèi)褐色脂肪組織、肝、心、腎、肌肉或其它器官中放射性標(biāo)記的分布進(jìn)行造影。PET造影以及其它無(wú)創(chuàng)性定量造影的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(有關(guān)綜述參見(jiàn)Passchier等，(2002)Methods 27278)。
可以得到完整的檢測(cè)試劑盒，其中包含檢測(cè)PPARα靶基因表達(dá)水平所需的所有試劑，通常還有優(yōu)化方案。
確定患者代謝異常的治療有效性的試劑盒因此，本發(fā)明的特征也在于用于確定患者代謝異常的治療有效性的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選包括適于密封在至少一個(gè)容器中的區(qū)室化載體。載體還包括能夠測(cè)定生物樣品中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的多肽或mRNA的試劑，以及測(cè)定生物樣品中多肽或mRNA含量的方法(例如酶或底物)。試劑盒也可包括對(duì)照樣品或系列對(duì)照樣品，這些對(duì)照樣品可以被檢測(cè)并與所含有的試驗(yàn)樣品對(duì)比。試劑盒的各組分可封裝在單獨(dú)容器中，所有不同容器可放在單一包裝中，并附有使用說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)用于確定對(duì)患者代謝異常的治療是否有效。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，試劑盒可包括例如(1)第一抗體(例如與固體支持物連接的抗體)，該抗體與Pa9、Pa13或Pa21基因所編碼的多肽結(jié)合；并且任選地，(2)不同的第二抗體，該抗體與多肽或第一抗體結(jié)合并且與可檢測(cè)試劑綴合；和(3)基本上純化的由Pa9、Pa13或Pa21基因所編碼的多肽，作為陽(yáng)性對(duì)照。例如，基于抗體的試劑盒可包括抗體，該抗體與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽特異性結(jié)合?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于開(kāi)發(fā)抗體。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可包括例如寡核苷酸，例如標(biāo)記寡核苷酸，其可在嚴(yán)格性雜交條件下與Pa9、Pa13或Pa21基因的mRNA雜交。例如，該試劑盒可包括標(biāo)記的寡核苷酸，其可在嚴(yán)格性雜交條件下與序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3或其互補(bǔ)序列雜交?；蛘撸撛噭┖锌砂ㄒ粚?duì)引物，用于從基因Pa9、Pa13或Pa21mRNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增核酸分子。例如，該試劑盒可包括一對(duì)引物，用于從SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3擴(kuò)增核酸分子。
對(duì)于基因Pa9、Pa13和Pa21作為新的PPARα靶基因的鑒定，也允許新篩選方法或測(cè)定的開(kāi)發(fā)，用于鑒定化合物在治療代謝疾病中的潛在功效。
用于治療代謝異常的化合物的鑒定方法本發(fā)明的一般方面涉及用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法。該方法包括化合物的鑒定，該類(lèi)化合物能改變?nèi)薖a9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達(dá)水平，或者能改變?nèi)薖a9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼多肽的生物活性。
可以采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室模式或適于高通量的測(cè)定，實(shí)施化合物的鑒定方法。術(shù)語(yǔ)“高通量”是指允許同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)便易行的篩選的測(cè)定設(shè)計(jì)，并且可以包括機(jī)器人操作能力。高通量測(cè)定的其它所需特征是經(jīng)過(guò)優(yōu)化以降低試劑用量或使操作次數(shù)最小化、以便獲得所需分析的測(cè)定設(shè)計(jì)。測(cè)定模式的實(shí)例包括96孔板或384孔板、漂浮液滴(levitating droplet)和“芯片實(shí)驗(yàn)室(lab on a chip)”微通道芯片，用于液體處理實(shí)驗(yàn)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，當(dāng)塑料模板和液體處理裝置的微型化是先進(jìn)的，或者當(dāng)設(shè)計(jì)出改進(jìn)的測(cè)定裝置時(shí)，使用本發(fā)明的測(cè)定可以更有效地篩選更多樣品。
用于篩選的候選化合物可選自各種化學(xué)類(lèi)別，優(yōu)選選自有機(jī)化合物類(lèi)。盡管候選化合物可以是大分子，但是優(yōu)選候選化合物是小分子有機(jī)化合物，即分子量大于50但小于2500的化合物。候選化合物具有一個(gè)或多個(gè)與多肽結(jié)構(gòu)相互作用所需的化學(xué)官能團(tuán)。優(yōu)選候選化合物具有至少一個(gè)氨基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)這樣的官能團(tuán)，更優(yōu)選至少三個(gè)這樣的官能團(tuán)。候選化合物可包括環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)部分和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)部分，所述部分被一個(gè)或多個(gè)以上示例的官能團(tuán)所取代。候選化合物也可以是生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、固醇類(lèi)、類(lèi)異戊二烯、嘌呤、嘧啶、以上物質(zhì)的衍生物或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，或其組合等。當(dāng)化合物是核酸時(shí)，該化合物優(yōu)選是DNA或RNA分子，盡管具有非天然鍵或亞單位的修飾核酸也包括在內(nèi)。
候選化合物可得自各種來(lái)源，包括合成或天然化合物文庫(kù)。例如許多方法可用于隨機(jī)和定向合成各種不同的有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)的隨機(jī)寡核苷酸、合成有機(jī)組合文庫(kù)、隨機(jī)肽的噬菌體展示文庫(kù)等。也可采用任何本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)的各種方法，獲取候選化合物，包括生物文庫(kù)；空間可尋址的平行固相或液相文庫(kù)；需要重疊合法的合成文庫(kù)方法；“一珠一化合物”文庫(kù)方法；以及使用親合色譜選擇的合成文庫(kù)方法(參見(jiàn)例如Lam(1997)，Anticancer Drug Des.12145)?；蛘?，可以使用呈細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫(kù)，或者可以常規(guī)制備天然化合物文庫(kù)。此外，天然和合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物可以經(jīng)常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行常規(guī)修飾。
此外，可以對(duì)已知藥理學(xué)試劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生所述試劑的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物?？梢噪S機(jī)選擇候選化合物，或者可以根據(jù)與PPARα結(jié)合和/或調(diào)節(jié)PPARα活性功能的現(xiàn)有化合物，來(lái)選擇候選化合物。例如，候選試劑的一個(gè)來(lái)源是基于已知PPARα活化劑或抑制劑的分子文庫(kù)，其中在分子的一個(gè)或多個(gè)位置上改變化合物結(jié)構(gòu)，使其含有更多或更少的化學(xué)部分或不同的化學(xué)部分。在產(chǎn)生類(lèi)似活化劑/抑制劑文庫(kù)中，可以對(duì)分子結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行定向、隨機(jī)取代和/或添加，或定向與隨機(jī)組合的取代和/或添加。
各種其它試劑也可包含在混合物中。這些試劑包括例如鹽、緩沖劑、中性蛋白(例如白蛋白)和去垢劑，這些試劑可用于促進(jìn)優(yōu)化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合。所述試劑也可降低反應(yīng)組分的非特異性或背景相互作用。也可使用改進(jìn)測(cè)定效果的其它試劑，例如核酸酶抑制劑、抗微生物試劑等。
本領(lǐng)域中可找到合成分子文庫(kù)的方法實(shí)例，例如Zuckermann等(1994)，J Med.Chem.372678?；衔镂膸?kù)可以存在于溶液中(例如Houghten(1992)，Biotechniques 13412-421)，或者在珠子(Lam(1991)，Nature 35482-84)、芯片(Fodor(1993)，Nature 364555-556)、細(xì)菌(美國(guó)專(zhuān)利第5,223,409號(hào))、孢子(美國(guó)專(zhuān)利第5,571,698號(hào))、質(zhì)粒(Cull等(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(參見(jiàn)例如Scott和Smith(1990)，Science 249386-390)中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a)使PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)與包含緩沖劑和試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b)測(cè)量PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達(dá)水平；和任選將步驟(b)的結(jié)果與試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所測(cè)定的PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)的對(duì)照進(jìn)行比較。
用于治療代謝異常的鑒定化合物包括可增加或降低PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達(dá)的任何化合物。例如，該化合物可以在PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中與PPARα結(jié)合并直接調(diào)節(jié)PPARα的生物活性，導(dǎo)致PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)增加或降低。化合物也可與細(xì)胞組分結(jié)合，從而在PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中與PPARα相互作用并間接調(diào)節(jié)PPARα相關(guān)生物活性，導(dǎo)致PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)增加或降低?；衔镞€可通過(guò)與PPARα生物活性無(wú)關(guān)的機(jī)制，增加或降低PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)。
“PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)”在其最廣泛含義上是指響應(yīng)PPARα基因刺激(例如當(dāng)使用PPARα激動(dòng)劑時(shí))的單細(xì)胞、組織和復(fù)雜多細(xì)胞生物體(例如哺乳動(dòng)物)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)是包含功能性PPARα蛋白和至少一種選自Pa9、Pa13和Pa21基因的PPARα靶基因的動(dòng)物、組織或細(xì)胞。PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)可以是內(nèi)源PPARα和內(nèi)源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21的天然宿主。例如，人肝細(xì)胞HuH7細(xì)胞、人原代脂肪細(xì)胞和人原代骨骼肌細(xì)胞(SKMC)都是可用于本發(fā)明的天然PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)。PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)也可以是用于PPARα的重組宿主細(xì)胞。技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于獲取這樣的具有重組PPARα的PPARα反應(yīng)系統(tǒng)。例如，對(duì)于至少一種內(nèi)源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21，可以通過(guò)將編碼功能性PPARα蛋白的外源DNA導(dǎo)入天然宿主細(xì)胞中，構(gòu)建PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)?？梢圆捎蒙鲜龇椒ǎㄟ^(guò)測(cè)量PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA或蛋白含量，來(lái)確定該P(yáng)PARα-反應(yīng)系統(tǒng)中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)水平。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)包括功能性PPARα蛋白和核酸分子，該核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報(bào)道基因編碼序列。該系統(tǒng)在響應(yīng)PPARα調(diào)節(jié)劑時(shí)允許報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，可以根據(jù)報(bào)道基因活性，間接測(cè)定PPARα靶基因的表達(dá)水平。例如，當(dāng)螢光素酶(luc)基因用作報(bào)道基因時(shí)，可以根據(jù)PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)的生物發(fā)光量來(lái)測(cè)定PPARα靶基因的表達(dá)水平。其它報(bào)道基因包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥(niǎo)嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因?？梢匀菀椎販y(cè)得報(bào)道基因的生物活性。試劑盒是市售的，便于測(cè)定報(bào)道基因活性。
技術(shù)人員已知的任何合適方法都可用于構(gòu)建包含報(bào)道基因編碼序列的核酸，該報(bào)道基因編碼序列與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接。人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列包括分別與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因天然相關(guān)的或控制這些基因的基因表達(dá)的任何核苷酸序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括一個(gè)或多個(gè)潛在PPRE。例如，SEQ ID NO19或其部分的核苷酸序列代表人Pa13基因的調(diào)節(jié)序列；而SEQ ID NO20或其部分的核苷酸序列代表人Pa21基因的調(diào)節(jié)序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b)測(cè)定試驗(yàn)化合物對(duì)多肽活性的影響；和c)將步驟(b)的結(jié)果與缺乏試驗(yàn)化合物的對(duì)照進(jìn)行比較。
結(jié)合測(cè)定可用于鑒定與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽結(jié)合、并能潛在增加或降低多肽生物活性的化合物。一個(gè)示例性結(jié)合測(cè)定包括下述步驟(a)將試驗(yàn)化合物與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽和多肽的標(biāo)記配體一起孵育；(b)將所述多肽與未結(jié)合的標(biāo)記配體分離開(kāi)來(lái)；和(c)通過(guò)降低標(biāo)記配體與多肽結(jié)合的量，鑒定抑制配體與多肽結(jié)合的化合物。標(biāo)記的多肽配體的實(shí)例是對(duì)多肽具有特異性的標(biāo)記抗體?？梢允褂帽磉_(dá)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的宿主細(xì)胞(重組或天然)用于結(jié)合測(cè)定。優(yōu)選將由宿主細(xì)胞制備的細(xì)胞膜用于結(jié)合測(cè)定。更優(yōu)選基本上純化的人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽用于結(jié)合測(cè)定。
有多種方式可將所述多肽與未結(jié)合的標(biāo)記配體分離開(kāi)來(lái)。通常，將至少一種組分固定在固體基質(zhì)上，未結(jié)合組分可從該基質(zhì)上容易地分離出來(lái)。固體基質(zhì)可由許多材料制成，并且可制成各種形狀，例如微量滴定板、微珠、浸棒(dipstick)、樹(shù)脂顆粒等。優(yōu)選選擇使信噪比最大化、背景結(jié)合最小化以及便于分離和成本低廉的基質(zhì)。
例如通過(guò)從貯池中取出珠子或浸棒，倒空或稀釋貯池(例如微量滴定板孔)，或者用洗滌液或溶劑漂洗珠子、顆粒、色譜柱或?yàn)V器，來(lái)進(jìn)行分離。分離步驟優(yōu)選包括多步漂洗和洗滌。例如，當(dāng)固體基質(zhì)是微量滴定板時(shí)，各孔可用洗滌液洗滌數(shù)次，該洗滌液通常包含不參與特異性結(jié)合的孵育混合物的組分，例如鹽、緩沖劑、去垢劑、非特異性蛋白質(zhì)等。當(dāng)固體基質(zhì)是磁珠時(shí)，該磁珠可以用洗滌液洗滌一次或多次并用磁力進(jìn)行分離。
各種標(biāo)記可用于標(biāo)記配體，例如可直接檢測(cè)(例如放射性、發(fā)光、光密度或電密度等)或間接檢測(cè)(例如表位標(biāo)記(例如FLAG表位)、酶標(biāo)記(例如辣根過(guò)氧化物酶)等)的標(biāo)記。
在本發(fā)明的不止一個(gè)以上測(cè)定方法的實(shí)施方案中，最好將多肽或其配體固定化，便于將多肽的結(jié)合形式與未結(jié)合形式分離開(kāi)來(lái)，并且適于測(cè)定的自動(dòng)化。在候選化合物存在或不存在時(shí)，可以在適于所含有的反應(yīng)物的任何容器中完成試驗(yàn)化合物與多肽的結(jié)合，或多肽與靶分子的相互作用。所述容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供多肽的融合蛋白，該蛋白中添加了允許一個(gè)或兩個(gè)多肽及其配體與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如，具有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的多肽的融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后將其與試驗(yàn)化合物或試驗(yàn)化合物和多肽的標(biāo)記配體結(jié)合，再將混合物在有助于復(fù)合物形成的條件(例如在鹽和pH的生理?xiàng)l件下)下孵育。孵育后，珠子或微量滴定板各孔經(jīng)洗滌除去任何未結(jié)合組分，如上所述直接或間接測(cè)定復(fù)合物形成。或者，可以將復(fù)合物從基質(zhì)上解離下來(lái)，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定本發(fā)明多肽的結(jié)合或活性水平。
將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選測(cè)定。例如，可使用生物素和鏈霉抗生物素綴合，將多肽或其配體固定化。
采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，PierceChemicals；Rockford，IL)，可以由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化多肽或靶分子，并固定在鏈霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的各孔上?；蛘?，與多肽具有反應(yīng)性、但不干擾多肽與其靶分子結(jié)合的抗體，可以衍生到板的各孔上，并且多肽可以通過(guò)抗體綴合而捕獲在板的各孔上。除上述GST固定化復(fù)合物的方法之外，測(cè)定所述復(fù)合物的方法還包括使用對(duì)本發(fā)明多肽或靶分子具有反應(yīng)性的抗體的復(fù)合物免疫測(cè)定，以及依賴(lài)于多肽相關(guān)酶活性檢測(cè)的酶聯(lián)測(cè)定。
基因Pa9、Pa13和Pa21作為新的PPARα靶基因的鑒定，也允許開(kāi)發(fā)代謝異常的新治療方法。
代謝異常的治療方法因此，本發(fā)明的另一個(gè)一般方面涉及患者代謝異常的治療方法。該方法包括給予患者治療有效量的組合物的步驟，所述組合物能改變患者細(xì)胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達(dá)模式或生物活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療方法包括給予患者化合物的步驟，該化合物能夠增加或降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)或生物活性。可使用上述化合物鑒定方法，來(lái)鑒定這些化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞中使用靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因治療，治療患者代謝異常。例如，反義療法可用于降低細(xì)胞中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)，當(dāng)需要降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)或活性時(shí)。
基于反義策略的原理是根據(jù)這一假說(shuō)通過(guò)mRNA和互補(bǔ)反義種類(lèi)之間的胞內(nèi)雜交，可以達(dá)到基因表達(dá)的序列-特異性抑制。雜合RNA雙鏈體的形成可干擾靶mRNA(例如基因Pa9、Pa13或Pa21的mRNA)的加工/轉(zhuǎn)運(yùn)/翻譯和/或穩(wěn)定性。雜交是發(fā)生反義效應(yīng)所需的。反義策略可使用各種方法，包括使用反義寡核苷酸，注射反義RNA和反義RNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。反義鏈與有義鏈雜交所誘導(dǎo)的表型效應(yīng)是基于例如蛋白質(zhì)水平、蛋白質(zhì)活性測(cè)定和靶mRNA水平的標(biāo)準(zhǔn)的變化。
反義核酸可以與靶基因的完整編碼鏈或其部分互補(bǔ)。反義核酸分子也可以與靶基因編碼鏈的全部或部分非編碼區(qū)互補(bǔ)。非編碼區(qū)(“5′UTR和3′UTR”)是側(cè)接編碼區(qū)的5′和3′序列，它們不能翻譯成氨基酸。優(yōu)選非編碼區(qū)是靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)區(qū)。
反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是例如取自SEQ ID NO1、3或5互補(bǔ)序列的約15、25、35、45或65個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。優(yōu)選該序列長(zhǎng)度為至少18個(gè)核苷酸，以便與靶mRNA序列實(shí)現(xiàn)足夠強(qiáng)的退火，以防止序列翻譯(Izant等，1984，Cell，361007-1015；Rosenberg等，1985，Nature，313703-706)?？梢圆捎没瘜W(xué)合成和酶促連接反應(yīng)，使用本領(lǐng)域已知方法，構(gòu)建反義核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或不同修飾的核苷酸(其設(shè)計(jì)用來(lái)增加分子的生物穩(wěn)定性或增加反義核酸和有義核酸間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性)，化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、懷丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。反義核酸分子可以是CC-端基異構(gòu)核酸分子。CC-端基異構(gòu)核酸分子與互補(bǔ)RNA構(gòu)成特異性雙鏈雜合體，其中與常規(guī)P-單位不同，這些鏈彼此平行排列(Gaultier等(1987)Nucleic Acids Res.156625-6641)。反義核酸分子也可包括2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類(lèi)似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
或者，也可采用生物方法，用表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生反義核酸，該載體中已經(jīng)如上所述以反義方向亞克隆了核酸。反義表達(dá)載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)控制下產(chǎn)生，其活性可通過(guò)導(dǎo)入載體的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)決定。為了得到足夠胞內(nèi)濃度的反義分子，優(yōu)選載體構(gòu)建體，其中反義核酸分子處于強(qiáng)pol II或pol III啟動(dòng)子控制之下。有關(guān)使用反義基因的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的討論，參見(jiàn)Weintraub等(1985，Trends in Genetics，第1(1)卷，第22-25頁(yè))。
通常，通過(guò)微量注射、脂質(zhì)體包被，將反義核酸給予患者，或者通過(guò)含反義序列的載體的表達(dá)原位產(chǎn)生反義核酸。反義核酸分子的給藥途徑的實(shí)例包括在組織部位直接注射。當(dāng)病毒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，可將反義核酸連接到介導(dǎo)反義核酸轉(zhuǎn)移的病毒載體上。合適的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等?；蛘撸梢孕揎椃戳x核酸分子，以靶向所選細(xì)胞，然后系統(tǒng)給藥。例如，對(duì)于系統(tǒng)給藥來(lái)說(shuō)，可以修飾反義分子，使其與所選細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原特異性結(jié)合，例如通過(guò)將反義核酸分子與結(jié)合在細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體連接在一起。
一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，反義核酸分子與編碼Pa9、Pa13或Pa21蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，因而抑制表達(dá)，例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。雜交可通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)，形成穩(wěn)定的雙鏈體，或者例如在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子的情況下，通過(guò)雙螺旋的大溝內(nèi)的特異性相互作用。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括使用小干擾RNA(siRNA)。當(dāng)對(duì)應(yīng)于沉默基因的雙鏈RNA(dsRNA)存在于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，許多生物體具有通過(guò)稱(chēng)為RNA干擾的過(guò)程而使基因表達(dá)沉默的機(jī)制。使用dsRNA來(lái)降低特定基因活性的技術(shù)首先是用秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)而開(kāi)發(fā)的，該技術(shù)被稱(chēng)為RNA干擾，即RNAi(Fire等，(1998)，Nature 391806-811)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNAi用于許多生物體中，最近又在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(有關(guān)綜述參見(jiàn)Moss，(2001)，Curr Biol 11R772-5)。當(dāng)RNAi顯示出參與產(chǎn)生21-25個(gè)核苷酸的小RNA，人們有了重大進(jìn)展(Hammond等，(2000)Nature 404293-6；Zamore等，(2000)Cell10125-33)。這些小的干擾RNA或siRNA可能起初來(lái)源于較大dsRNA，這些較大dsRNA開(kāi)始加工并與靶RNA互補(bǔ)，最終使靶RNA降解。siRNA本身是在兩端具有短突出端的雙鏈。它們的作用是指導(dǎo)RNA，在互補(bǔ)區(qū)指導(dǎo)靶的單一切割(Elbashir等，(2001)Genes Dev 15188-200；Zamore等，(2000)Cell 10125-33)。
包含約21-25個(gè)與SEQ ID NO1、3或5的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸的SiRNA可用于本發(fā)明的治療方法。產(chǎn)生siRNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如WO0175164 A2介紹了從體外系統(tǒng)產(chǎn)生長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸(nt)的siRNA并用所述siRNA來(lái)干擾細(xì)胞或生物體內(nèi)基因的mRNA的方法。也可以使用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)制備siRNA。例如目前報(bào)道了一個(gè)稱(chēng)為pSUPER的載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)siRNAs的合成(Brummelkamp等，(2002)Science 296550-3)。使用siRNA來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)例見(jiàn)實(shí)施例3。
本發(fā)明提供治療患者的代謝異常的方法，該方法包括下述步驟(a)將靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的siRNA導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，用于在患者細(xì)胞內(nèi)降解；和(b)將(a)所產(chǎn)生的細(xì)胞維持在siRNA干擾患者細(xì)胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的條件下?？墒褂帽疚乃龅姆戳x核酸的類(lèi)似方法，將siRNA導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用基因治療，通過(guò)將能夠表達(dá)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，增加人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)。在提高人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表達(dá)或生物活性是有益的情況下，所述基因治療對(duì)疾病治療尤其有用。
一種進(jìn)行離體基因治療的方法概述于美國(guó)專(zhuān)利第5,399,346號(hào)，也見(jiàn)于該專(zhuān)利文件史所提交的文獻(xiàn)，所有這些文獻(xiàn)都是公眾可得的文件。一般而言，基因治療包括在體外將基因的功能性拷貝導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，然后將基因工程細(xì)胞返還到患者體內(nèi)?；虻墓δ苄钥截愂翘幱谡{(diào)節(jié)元件的可操作性控制之下，這允許在基因工程細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該基因。大量轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)以及合適表達(dá)載體都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，其中的一些描述于PCT申請(qǐng)WO95/00654。體內(nèi)基因治療使用載體，例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、牛乳頭瘤病毒和皰疹病毒，例如EB病毒。也可以使用需要體外感染的非病毒方法，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。這類(lèi)方法可包括磷酸鈣、DEAE葡聚糖、電穿孔和原生質(zhì)體融合。對(duì)于將DNA傳遞給細(xì)胞來(lái)說(shuō)，靶向脂質(zhì)體也是潛在有益的。
作為一個(gè)實(shí)例，可將編碼靶基因的DNA分子首先克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。由載體表達(dá)靶基因的過(guò)程，可以被其內(nèi)源啟動(dòng)子或逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列或?qū)δ承┌屑?xì)胞具有特異性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。然后可將載體導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，在靶細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)靶基因?；蚩蓛?yōu)選以這樣的形式傳遞給細(xì)胞該細(xì)胞可采用該基因形式來(lái)編碼足夠的蛋白質(zhì)，以提供有效功能。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常是優(yōu)選基因傳遞載體，尤其是用于基因治療，因?yàn)槠涓腥镜母咝屎头€(wěn)定整合和表達(dá)?；蛘?，可通過(guò)非病毒技術(shù)，包括使用配體-DNA綴合物或腺病毒-配體-DNA綴合物的受體介導(dǎo)靶向DNA轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染膜融合或直接微量注射，將編碼靶基因的DNA分子轉(zhuǎn)移給細(xì)胞，用于基因治療。這些方法及其變化方法對(duì)于離體以及體內(nèi)基因治療來(lái)說(shuō)是合適的。適用于本發(fā)明方法的基因治療分子方法學(xué)方案描述于GeneTherapy Protocols，Paul D主編，Robbins，Human press，Totowa NJ，1996。
治療期間，給予個(gè)體的本發(fā)明核酸分子的有效量可因以下各因素而異，包括患者類(lèi)型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)狀況；待治療病癥的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的肝腎功能；和所用的具體核酸分子。具有基因治療專(zhuān)業(yè)技能的內(nèi)科醫(yī)師或獸醫(yī)可確定并指定預(yù)防、抵抗或阻止疾病進(jìn)程所需有效量。達(dá)到既產(chǎn)生功效又無(wú)毒性的濃度范圍的最佳準(zhǔn)確性，需要根據(jù)核酸分子對(duì)靶位點(diǎn)利用度的動(dòng)力學(xué)的方案。這涉及到對(duì)參與基因治療的核酸分子的分布、平衡和消除方面的考慮。
本文公開(kāi)的基因治療可以常規(guī)試驗(yàn)所確定的合適劑量單獨(dú)使用，以便得到PPARα靶基因活性的最佳增加或降低，同時(shí)使任何潛在毒性最小化。另外，最好也可以與其它藥物聯(lián)合用藥或序貫用藥。當(dāng)聯(lián)合給予幾種藥物以達(dá)到所需效果時(shí)，可以調(diào)整給藥劑量。這些不同藥物的劑量可以獨(dú)立優(yōu)化，并聯(lián)合給予以達(dá)到協(xié)同結(jié)果，其中與任一種藥物單獨(dú)使用相比，病理減少得更多。
以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是卻并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1對(duì)人體細(xì)胞中由PPARα激動(dòng)劑所調(diào)節(jié)的靶基因的鑒定DNA微陣列技術(shù)用于鑒定人體細(xì)胞中由貝特類(lèi)或其它PPARα激動(dòng)劑所調(diào)節(jié)的靶細(xì)胞。
人肝細(xì)胞HuH7細(xì)胞是肝上皮細(xì)胞，得自Japan Health ScienceResearch Resources Bank(Osaka，Japan)。人原代脂肪細(xì)胞是專(zhuān)門(mén)用于脂肪合成和貯存的結(jié)締組織細(xì)胞，得自Zen-Bio，Inc(Research TrianglePark，NC)。人原代骨骼肌細(xì)胞(SKMC)得自Cambrex Bio Science(Walkersville，MD)。PPARα激動(dòng)劑Wy14643(Agatha等，2000，Archivesof Biochemistry and Biophysics 380353-359)和非諾貝特分別得自Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)和Sigma(St Louis，MO)。
將人HuH7細(xì)胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Gibco，NY)中培養(yǎng)。細(xì)胞用經(jīng)活性炭吸附脫脂的小牛血清(5％)(Sigma，St Louis，MO)處理約4-18小時(shí)。然后，將細(xì)胞用不同濃度的PPARα激動(dòng)劑(Wy14643或非諾貝特)處理約20-24小時(shí)。將人SKM細(xì)胞在骨骼肌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science，Walkersville，MD)中培養(yǎng)，再用不同濃度的PPARα激動(dòng)劑(Wy14643或非諾貝特)處理約18-20小時(shí)。將人原代脂肪細(xì)胞在前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基(Cat #PM_1，Zen-Bio，Inc.，Research Triangle Park，NC)中培養(yǎng)，再用不同濃度的PPARα激動(dòng)劑(Wy14643或非諾貝特)處理約18-20小時(shí)。
從細(xì)胞中分離出總RNA，進(jìn)行DNA微陣列處理。使用JJPRD版MEGA和MEGAB DNA微陣列(約6,000個(gè)基因/芯片)?？偣卜治隽思s12,000個(gè)基因。超過(guò)40片靶芯片和MEG-GA芯片用于實(shí)驗(yàn)分析。從用PPARα配體處理的細(xì)胞中，測(cè)定了超過(guò)12,000個(gè)基因的表達(dá)水平，并與用溶媒對(duì)照處理的細(xì)胞的表達(dá)水平進(jìn)行比較。使用軟件OMNI-Viz(OmniViz，Inc.Richland，WA)，對(duì)其基因表達(dá)水平被PPARα激動(dòng)劑增加或降低的基因進(jìn)行系統(tǒng)搜索。在所分析的1種、2種或所有3種細(xì)胞(人脂肪細(xì)胞、SKM細(xì)胞和HuH7細(xì)胞)中，鑒定出約24個(gè)基因由于PPARα激動(dòng)劑處理而在基因表達(dá)中具有超過(guò)約1.8倍的變化。根據(jù)這些基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)TaqMan探針，并使用實(shí)時(shí)定量PCR(RTQPCR)，以證實(shí)基因表達(dá)的變化。證實(shí)了在所有的三種人體細(xì)胞中，Pa9、Pa13和Pa21三種基因受到PPARα激動(dòng)劑的調(diào)節(jié)。
按照生產(chǎn)商提供的方案，從培養(yǎng)細(xì)胞純化總RNA(Trizon methods，Invitrogen Inc.Ca)。分別根據(jù)GenBank序列檢索號(hào)W30988、AB000584和NM_080725，設(shè)計(jì)用于Pa9、Pa13和Pa21的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物和熒光探針(TagMan探針)。使用軟件PrimerDesign(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，Ca)，設(shè)計(jì)引物和探針。用于Pa9的PCR引物是SEQ ID NO7(5′-CCTGCAGCCA TTCCAACCT)和SEQ ID NO8(5′-TCCCTTCTTA AGCTTCTGCCG)。用于Pa9的熒光探針是SEQ IDNO9(6FAM-CAGTACTTCC GCTCCATCCC ACAGCA)。用于Pa13的PCR引物是SEQ ID NO10(5′-AGCAGTCCTG GTCCTTCCAC T)和SEQ ID NO11(5′-AATCGGGTGT CTCAGGAACC T)。用于Pa13的熒光探針是SEQ ID NO12(6FAM-ACCTCAGTTG TCCTGCCCTGTGGAATG)。用于Pa21的PCR引物是SEQ ID NO13(5′-TGCTCGTTAC TTCATGGTCC C)和SEQ ID NO14(5′-TCCACCCCTC CTTCCTTGA)。用于Pa21的熒光探針是SEQ ID NO15(6FAM-TGGCTGCTGT ATCCCCAAGA ATCATGTC)。所有引物和探針都由Keystone實(shí)驗(yàn)室(Camarillo，Ca)合成。
逆轉(zhuǎn)錄(RT)和PCR在一個(gè)步驟中進(jìn)行，使用ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)中的“One-Step RT-PCR Master MixReagent”試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。每次反應(yīng)在25μl總體積中進(jìn)行，該總體積內(nèi)含有40ng總RNA。反應(yīng)條件是48℃30分鐘，60℃30分鐘，94℃5分鐘，接著是94℃20秒和60℃1分鐘的40次循環(huán)。18S核糖體RNA的引物是由Applied Biosystems開(kāi)發(fā)和提供的。人18S核糖體RNA的測(cè)定用作測(cè)定和裝入錯(cuò)誤標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部控制。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，用Ct值(算法PCR曲線與計(jì)算域值線交叉的循環(huán)次數(shù))采集PCR數(shù)據(jù)，用該數(shù)值求出ΔCt(靶基因的Ct減去18S核糖體RNA對(duì)照的Ct)。使用如文獻(xiàn)所述的等式2-ΔΔCt，計(jì)算相對(duì)mRNA水平(Heid等，1996，Genome Res.6986-994)。
PPARα激動(dòng)劑Wy14643或非諾貝特增加人HuH7細(xì)胞(表1)、原代SKMU細(xì)胞(表2)或原代脂肪細(xì)胞(表3)內(nèi)Pa9、Pa13或Pa21基因表達(dá)。毫不奇怪，基因表達(dá)模式在不同細(xì)胞類(lèi)型中是不同的，因?yàn)榛蛘{(diào)節(jié)極大地受細(xì)胞環(huán)境的影響。這些靶基因Pa9、Pa13和Pa21是PPARα激動(dòng)劑特異性的，因?yàn)閺?qiáng)效PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮在其有效濃度時(shí)在人HuH7肝細(xì)胞內(nèi)不能顯著增加這些基因的表達(dá)(表4)。
表1人HuH7肝細(xì)胞中的基因表達(dá)
表2人原代骨骼肌細(xì)胞中的基因表達(dá)
表3人原代脂肪細(xì)胞中的基因表達(dá)
表4人HuH7肝細(xì)胞中的基因表達(dá)
實(shí)施例2基因PA9、13和21的生物信息特征國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)資助的生物信息程序(NCBI；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于DNA序列分析。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)用于檢索DNA序列。SwissPro數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/swissprot)用于檢索蛋白質(zhì)序列。BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)用于基因搜索。Motif程序(http://motif.genome.ad ip)用于搜索功能性DNA結(jié)構(gòu)(基序、調(diào)節(jié)序列、結(jié)構(gòu)域等)。LocusLink程序(http://www.nobi.nlm.nih.gov/LocusLink)用于搜索序列和基因座的描述性信息。另外，Wisconsin軟件包(GCG，Genetics Computer Group)用于序列編輯和序列裝配(SEQED)、序列比較(GAP、BESTFIT、PILEUP)和DNA序列翻譯(TRANSLATION)。
1)Pa9用于微陣列的Pa9基因序列的原始注釋是GenBank檢索號(hào)W30988類(lèi)似于人血纖蛋白原相關(guān)蛋白HFREP-1前體的智人(Homosapiens)cDNA克隆。BLAST搜索表明W30988序列(序列中的多個(gè)“n”是因?yàn)闇y(cè)序誤差)與幾個(gè)GenBank序列條目共享約97％(339/349；比較得分是e-162)的序列同一性，所述GenBank序列條目例如GenBank檢索號(hào)BC023647、AF202636、AF169312、AF153606、AB056477、E39784 BD075801、AX578037、AX464136、AX278133、AX201322、AX079971、AX079874、AX068560、AR243163和AR194215。這些GenBank序列條目看來(lái)是相同的并編碼約406個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。所編碼的蛋白質(zhì)在US6348350中稱(chēng)為人NL2TIE配體同源多肽，而在WO0177151中稱(chēng)為人血纖蛋白原結(jié)構(gòu)域相關(guān)(FDRG)蛋白。蛋白質(zhì)的其它注釋包括血管生成素樣蛋白PP1158和TIE受體酪氨酸激酶配體同源物等。
WO0177151(實(shí)施例12)公開(kāi)了當(dāng)用10μg/ml吡格列酮(一種PPARγ激動(dòng)劑)處理穩(wěn)定表達(dá)PPARγ的NIH3T3成纖維細(xì)胞達(dá)2小時(shí)后，鼠FDRG表達(dá)水平在該細(xì)胞內(nèi)增加了10倍。另外，WO0177151(實(shí)施例13)公開(kāi)了在Zucker糖尿病肥胖大鼠中，當(dāng)用慢性曲格列酮(一種PPARγ激動(dòng)劑)治療該動(dòng)物時(shí)，鼠FDRG表達(dá)在白色脂肪組織(WAT)中被下調(diào)3-5倍。這些觀察結(jié)果與嚙齒動(dòng)物中FDRG成為PPARγ的靶基因是一致的。
另外，Kersten等(2000，J.Biolo.Chem.27528488-493)表明，與鼠FDRG相同的鼠FIAF(禁食誘導(dǎo)脂肪因子)的表達(dá)在PPARα裸小鼠肝內(nèi)下降。他們也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)WY14643處理后，在PPARα野生型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)鼠FIAF的表達(dá)增加，而在PPARα裸小鼠肝細(xì)胞內(nèi)卻不增加。另外，他們表明，鼠FIAF的表達(dá)在雜合PPARγ突變小鼠WAT中減少。這些結(jié)果與FDRG在嚙齒動(dòng)物中成為PPARα(肝內(nèi))和PPARγ(WAT內(nèi))的靶基因是一致的。
然而，人們不能因?yàn)镕DRG是嚙齒動(dòng)物體內(nèi)PPARα或PPARγ的靶基因，就簡(jiǎn)單地下結(jié)論說(shuō)它在人體內(nèi)就是PPARα或PPARγ的靶基因。貝特類(lèi)或其它PPARα激動(dòng)劑的作用是種屬特異性的，而在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)許多被貝特類(lèi)或其它PPARα激動(dòng)劑誘導(dǎo)的基因在人體內(nèi)卻不被誘導(dǎo)。另外，因?yàn)樾∈驠DRG與人FDRG共享相對(duì)低的序列同一性在cDNA水平上約73％序列同一性，在蛋白質(zhì)水平上約76％序列同一性，所以小鼠和人體內(nèi)FDRG的基因調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同。
SEQ ID NO1提供了人FDRG基因(AX278133)的核苷酸序列，W30988與FDRG基因間的序列比對(duì)見(jiàn)圖1。序列比對(duì)的檢測(cè)表明，W30988與人FDRG基因間的序列差異主要是因?yàn)閃30988的測(cè)序誤差所致。進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR，以測(cè)定人FDRG基因的基因表達(dá)是否受PPARα的調(diào)節(jié)。采用類(lèi)似于實(shí)施例1所述的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，測(cè)定用30μM或100μM Wy14643刺激的人骨骼肌細(xì)胞中基因Pa9和基因FDRG的表達(dá)水平。用于測(cè)定Pa9基因表達(dá)的PCR引物和探針是如實(shí)施例1所述的SEQ ID NO7、8和9。這些引物和探針可在嚴(yán)格性雜交條件下與W30988雜交。設(shè)計(jì)用于測(cè)定FDRG基因表達(dá)的PCR引物和熒光探針，使得它們可與FDRG基因雜交，該基因在與W30988核苷酸序列共享序列同一性的區(qū)域之外。FDRG基因的引物和探針是SEQ ID NO16即5′-AGCCCCCTTT CTGAGTGCA、SEQ ID NO17即5′-CCCTTGGTCC ACGCCTCTA和SEQ ID NO18即6FAM-TGAGATCGAG GCTGCAGGAT ATGCTCA。如表5所示，Wy14643誘導(dǎo)Pa9基因表達(dá)，在30μM的濃度時(shí)達(dá)3.64倍，而在100μM的濃度時(shí)達(dá)6.45倍。對(duì)同一RNA樣品的測(cè)定表明，Wy14643誘導(dǎo)FDRG基因表達(dá)，在30μM的濃度時(shí)達(dá)4.37倍，而在100μM的濃度時(shí)達(dá)7.8倍。從不同系列的人SKM RNA樣品可以獲得類(lèi)似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)Pa9基因(W30988)和FDRG基因(NM_139314)之間的序列同源性，以及本文所述的mRNA定量測(cè)定數(shù)據(jù)，可以合理地得出以下結(jié)論1)W30988實(shí)際上是NM_139314全長(zhǎng)cDNA序列的部分序列；2)包含W30988序列的人Pa9基因與人FDRG基因相同；和3)人FDRG基因確實(shí)被PPARα上調(diào)。
表5人原代骨骼肌細(xì)胞中的基因表達(dá)
2)Pa13用于微陣列的Pa13基因序列的原始注釋是GenBank檢索號(hào)N26311，即一種沒(méi)有其它功能性注釋的cDNA克隆。BLAST搜索表明N26311的核苷酸序列與公開(kāi)于WO0194629的多個(gè)懷疑的癌細(xì)胞基因克隆共享約98％(416/424)的序列同一性，所述基因克隆例如GenBank檢索號(hào)AX329948。另外，N26311與幾個(gè)其它GenBank序列條目共享約95％(387/404)同一性，所述GenBank序列條目包括GenBank檢索號(hào)U88323、AF019770、AB000584、E09952、AX468429、AX408886、AR236374、AR127403、BC000529、AX052609、AR091376、E10038和AR107279。這些GenBank序列條目看來(lái)是相同的并編碼約308個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。該編碼蛋白質(zhì)的GenBank注釋包括TGF-β超家族蛋白質(zhì)、胎盤(pán)骨形態(tài)發(fā)生蛋白PLAB、巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞因子-1(MIC-1)、TGF-β超家族蛋白質(zhì)、被具有抗腫瘤特性的基因激活的非甾體抗炎藥、肝癌中表達(dá)的基因和前列腺生長(zhǎng)因子等。先前已經(jīng)建立或描述了蛋白質(zhì)與糖尿病(或肥胖癥，或高脂血癥)之間無(wú)相關(guān)性。
這些GenBank條目AB000584的代表性核苷酸序列示于SEQ IDNO3，N26311與AB000584間的序列比對(duì)見(jiàn)圖2。對(duì)序列比對(duì)的檢測(cè)表明，N26311與AB000584間的序列差異主要是因?yàn)镹26311的測(cè)序誤差所致。因此，包含N26311核苷酸序列的人Pa13基因可能與AB000584所述的TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因相同(Yokoyama-Kobayashi等，1997，J Biochem(Tokyo).122(3)622-6)。采用與TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因雜交的PCR引物和探針(SEQ ID NO10、11和12)，確實(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因被PPARα上調(diào)，該TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因在與N26311的核苷酸序列共享序列同源性的區(qū)域之外(參見(jiàn)實(shí)施例1的數(shù)據(jù))。
另外，在人Pa13基因5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)鑒定出潛在PPRE。SEQID NO19顯示5′-UTR，從緊接TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因ATG翻譯起始位點(diǎn)上游的-2538bp至-1bp，該TGF-β超家族蛋白質(zhì)基因與Pa13基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是從人類(lèi)基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank檢索號(hào)AC008397的152956bp至155493bp下載的。在SEQID NO19的堿基970和2508上鑒定出兩個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在SEQ ID NO19的堿基160、564和1033上鑒定出各自包含AGGTCA序列的3個(gè)潛在PPRE。在SEQ ID NO19內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了具有TGACCT、AGGTCG或GGGTCA序列的幾個(gè)其它潛在PPRE位點(diǎn)。該結(jié)果與Pa13基因在人體細(xì)胞中受到PPAR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是一致的。
3)Pa21用于微陣列的Pa21基因序列的原始注釋是GenBank檢索號(hào)H49601類(lèi)似于過(guò)敏毒素趨化性受體的cDNA克隆。BLAST搜索表明H49601的核苷酸序列與幾個(gè)GenBank序列條目共享約93％(384/410)的序列同一性，所述GenBank序列條目包括GenBank檢索號(hào)AF075053、AL833944、AL121758、BC017001、AK098418和AX368959。這些GenBank序列條目看來(lái)是相同的。大多數(shù)GenBank條目的注釋是具有未知功能的cDNA克隆。一些注釋?xiě)岩墒前┘?xì)胞基因克隆。H49601也與GenBank檢索號(hào)NM_080725(SEQ ID NO5)的互補(bǔ)序列共享93％(384/410)的序列同一性，該GenBank檢索號(hào)NM080725編碼137個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)。該蛋白先前被稱(chēng)為染色體20可讀框139(C20orf139)。先前已經(jīng)建立或描述了C20orf139與糖尿病(或肥胖癥，或高脂血癥)之間無(wú)相關(guān)性。
H49601與NM_080725間的序列比對(duì)見(jiàn)圖3。序列比對(duì)的檢測(cè)表明，H49601與NM_080725間的序列差異主要是因?yàn)镠49601的測(cè)序誤差所致。因此，包含H49601的核苷酸序列的Pa21基因可能與NM080725中描述的C20orf139基因相同。采用與C20orf139基因雜交的PCR引物和探針(SEQ ID NO13、14和15)，確實(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人C20orf139基因被PPARα上調(diào)，該C20orf139基因在與H49601核苷酸序列共享序列同源性的區(qū)域之外(參見(jiàn)實(shí)施例1的數(shù)據(jù))。
另外，在C20orf139基因5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)鑒定出潛在PPRE。SEQ ID NO20顯示5′-UTR，從緊接C20orf139基因ATG翻譯起始位點(diǎn)上游的-1bp至-3000bp，該C20orf139基因與Pa21基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是從人類(lèi)基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank檢索號(hào)Hs20_11544的568887bp至571886bp下載的。發(fā)現(xiàn)2個(gè)“AGGTCA”P(pán)PRE位點(diǎn)分別在-2201bp和-2866bp。發(fā)現(xiàn)3個(gè)“TGACCT”位點(diǎn)分別在-872bp、-893bp、-2344bp。該結(jié)果與C20orf139在人體細(xì)胞中受到PPAR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是一致的。
實(shí)施例3降低的PPARα導(dǎo)致降低對(duì)Pa9、Pa13或Pa21基因表達(dá)的誘導(dǎo)采用siRNA技術(shù)，首次建立具有降低的PPARα表達(dá)的人SKM細(xì)胞。然后測(cè)定Pa9、Pa13和Pa21在這些細(xì)胞中的基因表達(dá)，證實(shí)這些基因確實(shí)受到PPARα的調(diào)節(jié)。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，設(shè)計(jì)出對(duì)PPARα具有特異性的SiRNA寡聚物并用于在人SKMU細(xì)胞中敲減(knock-down)或降低PPARα表達(dá)水平(Brummelkamp等，2002，Science，296550-553)。使用GenBank檢索號(hào)S74349(人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α，cDNA；PPARα)作為模板并使用軟件Target Finder(Ambion，Austin，TX)，最初設(shè)計(jì)出4套siRNA寡聚物。在這4套寡聚物中，發(fā)現(xiàn)有2套更有效，因而選擇這2套進(jìn)行PPARα-敲減(knockdown)研究。這2套siRNA序列對(duì)應(yīng)于相對(duì)起始密碼子的第一核苷酸的cDNA的907bp至927bp(SEQ ID NO21，5′-AACGATCAAG TGACATTGCT A)和1106bp至1126bp(SEQ ID NO22，5′-AACTGGATGA CAGTGATATC T)。寡聚物由Ambion Inc.(Austin，TX)化學(xué)合成。通用陰性對(duì)照siRNA寡聚物購(gòu)自Ambion。
提前一天制備人原代骨骼肌細(xì)胞(hSKM，由Cambrex(MD)提供)，次日以4.67×104細(xì)胞/60mm碟的密度進(jìn)行轉(zhuǎn)染(約20％匯合度)。將細(xì)胞在無(wú)抗生素的SKGM培養(yǎng)基(Cambrex，MD)中、在37℃、5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。
按照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，將siRNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)染前，先將siPORT胺(Ambion，TX)用無(wú)抗生素和血清的SKGM培養(yǎng)基(10μl siPORT/ml)稀釋?zhuān)賹iRNA(50nM)加入到混合物中。將SKM細(xì)胞(提前在多個(gè)碟中制備)用2ml所得混合物轉(zhuǎn)染4小時(shí)。向各碟加入8ml新鮮SKGM培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)，使細(xì)胞生長(zhǎng)最大化并降低由轉(zhuǎn)染劑導(dǎo)致的潛在細(xì)胞毒性。作為對(duì)照，將細(xì)胞也用單獨(dú)siPORT胺或siPORT胺加上通用陰性對(duì)照siRNA來(lái)轉(zhuǎn)染。
用改良Qiagen RNeasy方法(Qiagen，Ca)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，從某些轉(zhuǎn)染碟中，分離出總RNA。用實(shí)時(shí)PCR證實(shí)PPARα表達(dá)水平確實(shí)被siRNA敲減。在所用的優(yōu)化條件下，發(fā)現(xiàn)SKM細(xì)胞內(nèi)PPARα表達(dá)水平被siRNA降低了70-80％(圖4)。
證實(shí)實(shí)驗(yàn)后，將PPARα-敲減細(xì)胞用不同化合物再處理16小時(shí)。再?gòu)募?xì)胞中分理出總RNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，用實(shí)施例1所述的RT-PCR技術(shù)定量測(cè)定目標(biāo)靶基因(例如Pa9、Pa13和Pa21)的表達(dá)水平。結(jié)果表明A)經(jīng)Wy14643處理后，在PPARα表達(dá)水平降低的SKM細(xì)胞中，Pa9表達(dá)水平僅增加了2.35倍，相比之下，在PPARα表達(dá)水平?jīng)]有降低的細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)，則增加了33.48倍(圖5)；B)對(duì)于Pa13基因(圖6)和Pa21基因(圖7)，也觀察到類(lèi)似結(jié)果；和C)在PPARα表達(dá)水平降低的SKM細(xì)胞中，已知的非PPARα靶基因即PPARd的表達(dá)水平?jīng)]有變化。
由上文可知，本發(fā)明第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)了本文所定義的人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因，是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因。盡管提供了以上詳述和優(yōu)選實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明本發(fā)明及其各種特征和優(yōu)勢(shì)，但是，可以理解，本發(fā)明并不是由上文限定，而是按照專(zhuān)利法原則之下的合理詮釋?zhuān)伤綑?quán)利要求書(shū)予以限定。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定來(lái)自患者的生物樣品中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)活性的方法，該方法包括測(cè)定樣品中選自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表達(dá)水平的步驟。
2.一種評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性的方法，該方法包括下述步驟a.測(cè)定治療期間或治療之后患者體內(nèi)選自人Pa9基因、Pa13和Pa21的基因表達(dá)水平；和b.將步驟a)中測(cè)定的表達(dá)水平與治療之前患者體內(nèi)所述基因表達(dá)水平進(jìn)行比較；其中治療期間或治療之后患者體內(nèi)所述基因表達(dá)水平增加，表明對(duì)患者代謝異常的治療是有效的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常是血脂異?；蜓惓Ｏ嚓P(guān)疾病。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、血栓形成或冠狀動(dòng)脈病、高血壓、絞痛、慢性腎衰竭、周?chē)懿?、中風(fēng)、II型糖尿病或代謝綜合征即X綜合征。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述代謝異常的治療包括能夠調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的生物活性的藥物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述藥物是PPARα激動(dòng)劑。
7.權(quán)利要求2的方法，該方法還包括從患者獲取生物樣品的步驟，其中測(cè)定所述生物樣品中所述基因在患者體內(nèi)的表達(dá)水平。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述來(lái)自患者的生物樣品是外周血單核細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述來(lái)自患者的生物樣品來(lái)自脂肪組織、肝、心、腎或肌肉。
10.權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)測(cè)量患者體內(nèi)所述基因的mRNA含量來(lái)確定所述基因的表達(dá)水平。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴(yán)格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO1雜交的核酸探針，用于測(cè)量患者的人Pa9mRNA含量。
12.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴(yán)格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO3雜交的核酸探針，用于測(cè)量患者的人Pa13mRNA含量。
13.權(quán)利要求10的方法，其中在嚴(yán)格性雜交條件下能夠與SEQ IDNO5雜交的核酸探針，用于測(cè)量患者的人Pa21mRNA含量。
14.權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)測(cè)量所述患者體內(nèi)所述基因編碼的多肽含量，來(lái)確定所述基因的表達(dá)水平。
15.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO2特異性結(jié)合的抗體，用于測(cè)量患者的人Pa9蛋白含量。
16.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO4特異性結(jié)合的抗體，用于測(cè)量患者的人Pa13蛋白含量。
17.權(quán)利要求14的方法，其中能夠與SEQ ID NO6特異性結(jié)合的抗體，用于測(cè)量患者的人Pa21蛋白含量。
18.一種用于評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性的試劑盒，該試劑盒包括在嚴(yán)格性雜交條件下與選自以下的核酸分子雜交的核酸探針SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5或其互補(bǔ)序列。
19.一種用于評(píng)價(jià)患者代謝異常的治療有效性的試劑盒，該試劑盒包括與選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的多肽分子特異性結(jié)合的抗體。
20.權(quán)利要求18或19的試劑盒，該試劑盒還包括使用說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)用于確定對(duì)患者代謝異常的治療是否有效。
21.一種用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a.使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所編碼的多肽與包含緩沖劑和候選化合物或試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b.測(cè)定所述試驗(yàn)化合物對(duì)所述多肽活性的影響；和c.將步驟(b)的結(jié)果與其中所述多肽僅與緩沖液接觸的對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行比較。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽是由宿主細(xì)胞表達(dá)的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽與分離的膜制備物締合。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述多肽是純化的。
25.一種用于治療患者代謝異常的化合物的鑒定方法，該方法包括下述步驟a.使PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)與包含緩沖劑和候選化合物或試驗(yàn)化合物的溶液接觸；b.測(cè)量PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因表達(dá)水平；和c.將步驟(b)的結(jié)果與缺乏試驗(yàn)化合物的對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行比較。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)是動(dòng)物、組織或細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)包括功能性PPARα蛋白和受人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述功能性PPARα蛋白是由PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)源表達(dá)的。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述功能性PPARα蛋白是由導(dǎo)入所述PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)中的外源DNA分子重組表達(dá)的。
30.權(quán)利要求27的方法，其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因分別是人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因。
31.權(quán)利要求27的方法，其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列控制的基因是報(bào)道基因。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述報(bào)道基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、螢光素酶(luc)基因、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥(niǎo)嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
33.一種PPARα-反應(yīng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含功能性PPARα蛋白和核酸分子，所述核酸分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報(bào)道基因編碼序列。
34.一種分離的核酸分子，所述分子包含與人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因調(diào)節(jié)序列操作性連接的報(bào)道基因編碼序列。
35.權(quán)利要求34的分離的核酸分子，其中所述報(bào)道基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、螢光素酶(luc)基因、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和鳥(niǎo)嘌呤黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
36.一種治療患者代謝異常的方法，該方法包括將治療有效量的組合物給予患者的步驟，所述組合物能改變患者細(xì)胞內(nèi)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表達(dá)或生物活性，其中所述組合物不是已知的PPARα激動(dòng)劑或拮抗劑。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述組合物是siRNA，所述siRNA靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA，用于在患者細(xì)胞內(nèi)降解。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述組合物是能夠在患者細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明的特征是鑒定出新的人過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的靶基因及該新靶基因在治療或監(jiān)測(cè)代謝異常的治療以及在鑒定用于治療代謝異常的化合物中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1930305SQ200580007912
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月14日
發(fā)明者L·周, E·V·克賴(lài)恩, K·T·德馬雷斯特 申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司