專利名稱：疾病相關(guān)朊病毒的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物和人朊病毒病的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
傳染性海綿狀腦病(TSE)或朊病毒病是動(dòng)物和人的致死性神經(jīng)變性性疾病。經(jīng)過(guò)數(shù)月至數(shù)十年的較長(zhǎng)潛伏期，才出現(xiàn)臨床疾病。TSE的臨床癥狀包括癡呆和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)力喪失。八十年代發(fā)現(xiàn)，TSE的共同特征是受染動(dòng)物和人中宿主編碼的朊病毒蛋白(PrPc)的異常抗蛋白酶同種型(PrPres或PrPSc)的蓄積。PrPSc的發(fā)現(xiàn)提供了一種分子標(biāo)記物，它對(duì)于所有朊病毒病是特異的，也是感染顆粒主要而很可能唯一的成分，此感染顆粒稱為朊病毒。
為了解瘙癢病傳染性，通過(guò)分析敘利亞倉(cāng)鼠腦的表觀分子質(zhì)量為27-30kDa的蛋白酶K處理部分，發(fā)現(xiàn)了抗蛋白酶的PrPSc核，稱為PrP27-30。PrP-27-30的N末端測(cè)序在非感染動(dòng)物中引起宿主編碼PrP基因的克隆以及朊病毒蛋白(PrPC)蛋白酶敏感同種型的識(shí)別。TSE的關(guān)鍵致病性事件是宿主編碼的朊病毒蛋白(PrPC)構(gòu)象改變?yōu)橹虏⌒酝N型，它被稱為PrPSc(在實(shí)驗(yàn)性瘙癢病感染嚙齒動(dòng)物中首次識(shí)別后)。這種構(gòu)象改變包括PrPC的α-螺旋結(jié)構(gòu)重折疊為PrPSc的β-片狀。這種重折疊的朊病毒蛋白PrPSc只是在其三級(jí)結(jié)構(gòu)上與PrPC不同，因此它具有相同的氨基酸序列以及相同的翻譯后修飾，諸如N-連接糖基化和GPI錨。PrPSc聚集為淀粉樣小纖維，并在神經(jīng)組織和較小范圍的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中蓄積。
在感染宿主中，PrPSc水平與朊病毒滴度成正比。應(yīng)用TSE劑對(duì)嚙齒動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室接種后，通常在發(fā)病前數(shù)周可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到PrPSc，而且其水平到達(dá)最大并可在動(dòng)物死亡前持續(xù)數(shù)月。在無(wú)癥狀階段，在淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中均易檢測(cè)到傳染性和PrPSc。最近，還發(fā)現(xiàn)PrPSc可在經(jīng)口感染瘙癢病的倉(cāng)鼠和實(shí)驗(yàn)室感染的轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉組織中蓄積。
盡管人類認(rèn)識(shí)所有朊病毒病的原型-綿羊和山羊的瘙癢病-已超過(guò)兩個(gè)世紀(jì)，但自從1986年在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)一種新型動(dòng)物朊病毒病-牛海綿狀腦病(BSE)以來(lái)，這種病便發(fā)展為一種動(dòng)物傳染病。感染BSE家畜進(jìn)入人類食物鏈到達(dá)何種程度仍在進(jìn)行討論，而且這些問(wèn)題已成為許多研究的主題。倫敦Imperial College(Donnelly，C.A.，F(xiàn)erguson，N.M.，Ghani，A.C.& Anderson，R.M.，StatisticalMethods in Medical Research 12，177-190(2003))發(fā)表的最新研究提出，根據(jù)新的流行病數(shù)據(jù)，高達(dá)1.6Mio感染BSE家畜可能已走上了英國(guó)消費(fèi)者的餐桌。
人朊病毒病包括克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、Gerstmann-Straeussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠癥(FFI)和庫(kù)魯病。這些疾病表明了朊病毒病通常的三種表現(xiàn)，即疾病的散發(fā)類型(所有CID病例的80-90％)、與人PrP基因突變相關(guān)的遺傳類型(家族性GSS、家族性CJD和FFI)以及通過(guò)移植、感染或攝入朊病毒污染組織的產(chǎn)品而獲得的感染類型(醫(yī)源性CJD、vCJD和庫(kù)魯病)。隨著1996年新型克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病在英國(guó)出現(xiàn)，則開(kāi)始了一場(chǎng)針對(duì)食物傳播病原體所致人類疾病的斗爭(zhēng)。迄今為止，英國(guó)已經(jīng)報(bào)道了146例變異型CJD(vCJD)，而且讓人感興趣的科學(xué)證據(jù)表明BSE和vCJD之間存在因果關(guān)系。因?yàn)樵谶@些患者中未確定任何明顯的危險(xiǎn)因素，所以暴露于BSE污染食品似乎很有可能是一種因果聯(lián)系。尤其迫切的是在患者出現(xiàn)臨床癥狀之前檢測(cè)vCJD，因?yàn)樗蓸O大地減小血液供應(yīng)和醫(yī)院設(shè)備被污染的危險(xiǎn)性。最近，一名英國(guó)患者在接受輸血后6.5年發(fā)生vCJD，而此獻(xiàn)血員在獻(xiàn)血后3.5年出現(xiàn)vCJD癥狀(Llewelyn etal.，2004，The Lancet 363，417-421)。此情況增加了vCJD可能通過(guò)輸血傳播的可能性，而且強(qiáng)調(diào)了對(duì)血液及其成分進(jìn)行朊病毒診斷性檢測(cè)的必要性。在本發(fā)明中公開(kāi)了一種TSE感染哺乳動(dòng)物血漿中疾病相關(guān)類型PrP的檢測(cè)方法。
因?yàn)镻rPSc是朊病毒病唯一可靠的分子標(biāo)記，所以免疫學(xué)檢測(cè)腦組織中抗蛋白酶的PrPSc部分是快速診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)，此試驗(yàn)常用于BSE和瘙癢病的活動(dòng)性監(jiān)測(cè)。由于該病臨床前階段中PrPSc緩慢蓄積的動(dòng)力學(xué)，現(xiàn)有診斷能力嚴(yán)重受限于潛伏期中對(duì)該病的早期檢測(cè)。這里公開(kāi)的本發(fā)明提供了臨床前階段中朊病毒病的檢測(cè)方法。
盡管PrPSc最初被定義為一種部分抗蛋白酶和去污劑不溶解的同種型PrP，但已經(jīng)識(shí)別的幾種朊病毒病與異常PrP相關(guān)，這些異常PrP缺乏典型的蛋白酶抵抗性。與這些朊病毒病相關(guān)的PrP類型稱為“蛋白酶敏感性”P(pán)rPSc，這樣可將它們與抗蛋白酶的PrPSc類型區(qū)別開(kāi)。
對(duì)動(dòng)物或人組織中朊病毒蛋白疾病相關(guān)構(gòu)象的檢測(cè)被認(rèn)為是對(duì)朊病毒病的診斷。為了區(qū)分疾病相關(guān)PrP與細(xì)胞前體PrPC，可能用蛋白酶處理以完全破壞PrPC，但僅僅除去了PrPSc的蛋白酶敏感N-末端部分，或者也可以應(yīng)用一種可區(qū)分PrPC和PrPSc的抗體。我們的專利申請(qǐng)WO 98/37210和Korth等(1997，Nature 39074-77)的題目為“朊病毒的免疫學(xué)檢測(cè)”中已經(jīng)公開(kāi)了這種抗體，它僅與自然PrPSc反應(yīng)，而不與PrPC反應(yīng)，在此引用這篇論文以公開(kāi)這種抗體，并對(duì)其進(jìn)行描述。
目前用于診斷朊病毒病的大多數(shù)試驗(yàn)是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織上進(jìn)行的，該組織是在顯示臨床疾病或者懷疑患有疾病的動(dòng)物或人死后獲得的。這種診斷檢測(cè)方法依賴于使用預(yù)處理，以水解朊病毒蛋白的蛋白酶敏感類型，然后通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)朊病毒蛋白的抗蛋白酶類型。但是，這些方法不能檢測(cè)PrPSc的蛋白酶敏感類型。例如，專利申請(qǐng)WO 00/52197要求保護(hù)在TSE感染哺乳動(dòng)物血清中檢測(cè)PrPSc的方法。此方法的主要缺點(diǎn)在于，應(yīng)用蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理，以水解蛋白酶敏感性PrP。
現(xiàn)在迫切需要一種簡(jiǎn)單而有效的檢測(cè)TSE相關(guān)抗蛋白酶類型PrP和蛋白酶敏感類型PrP的方法和診斷試劑盒，以便在活體哺乳動(dòng)物中對(duì)該疾病進(jìn)行檢測(cè)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供活體動(dòng)物和人的朊病毒病的檢測(cè)方法和診斷試劑盒。
這種方法的優(yōu)勢(shì)是，通過(guò)篩選血液以確定疾病相關(guān)PrP的存在，可檢測(cè)出傳染性海綿狀腦病的攜帶者，而且例如此方法可防止vCJD意外地通過(guò)輸血傳播。
定義名詞“PrP”指朊病毒蛋白同種型的共同氨基酸序列，而不是不同的構(gòu)象。
名詞“PrPC”指正常哺乳動(dòng)物中大量存在的朊病毒蛋白同種型，而且與TSE無(wú)關(guān)。
名詞“PrPD”指疾病(TSE)相關(guān)類型的PrP，它被定義為正常宿主朊病毒蛋白構(gòu)象改變的同種型。PrPD包括疾病相關(guān)PrP的抗蛋白酶類型和蛋白酶敏感類型。
名詞“PrPD”與例如羊、?；蛉藰?gòu)象改變的PrP同義，這里的羊、牛或人僅是引用的一些實(shí)例。
名詞“抗體”指通過(guò)動(dòng)物免疫或者通過(guò)體外選擇/淘選步驟而產(chǎn)生的任何抗體。該抗體可為多克隆或者單克隆抗體，包括其片段，諸如Fab或單鏈抗體。此抗體可為基因工程抗體，諸如嵌合或人源化抗體。
發(fā)明總結(jié)按照本發(fā)明，公開(kāi)了一種檢測(cè)動(dòng)物或人PrPD的方法，此方法包括采集樣品，此樣品優(yōu)選是血液或易于從活體哺乳動(dòng)物中獲得的其他體液，然后將此樣品與僅識(shí)別PrPD的抗體接觸，最后應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體/PrPD復(fù)合物的量。
本發(fā)明的方法考慮到與TSE相關(guān)同種型PrPD既可為蛋白酶敏感同種型，也可為抗蛋白酶同種型存在。在上下文中提到，應(yīng)用特異性捕獲抗體處理樣品，此捕獲抗體可識(shí)別TSE相關(guān)同種型PrPD上的構(gòu)象表位。選擇對(duì)TSE相關(guān)同種型PrPD特異的，但不是朊病毒蛋白的抗蛋白酶同種型所必須標(biāo)示的表位。通過(guò)應(yīng)用可識(shí)別所述構(gòu)象表位的捕獲抗體，可獲得最佳結(jié)果，尤其是在可含有TSE相關(guān)PrPD的樣品中，此TSE相關(guān)PrPD既可為蛋白酶敏感同種型中也可為抗蛋白酶同種型。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用此方法分析包括僅為蛋白酶敏感同種型的PrPD的樣品。按照本發(fā)明，僅通過(guò)應(yīng)用捕獲抗體即可處理這些樣品。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，檢測(cè)PrPD的方法是對(duì)血漿進(jìn)行的，按照作為本發(fā)明一部分的一種步驟由血液樣品制備此血漿。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，用化學(xué)品處理血漿樣品，使抗體/PrPD復(fù)合物的結(jié)合條件達(dá)到最佳。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，應(yīng)用抗體15B3僅檢測(cè)PrPD，而不檢測(cè)正常類型的PrP?？蓮娜鹗刻K黎世的Prionics AG獲得抗體15B3，WO 98/37210公開(kāi)了產(chǎn)生這些抗體的方法。WO 98/37210中公開(kāi)的可產(chǎn)生抗體15B3的Hybridomacells被保藏于DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，登記號(hào)為DSM ACC2298。
在本發(fā)明另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)免疫學(xué)方法直接或間接檢測(cè)抗體/PrPD復(fù)合物。
本發(fā)明另一種實(shí)施方式提供了應(yīng)用夾心ELISA法檢測(cè)抗體/PrPD復(fù)合物的方法，此方法應(yīng)用一種識(shí)別朊病毒蛋白N一末端的標(biāo)記抗體。
本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式是應(yīng)用檢測(cè)PrPD的方法檢驗(yàn)人血液樣品，以確定該血液是否可安全用于輸血。
本發(fā)明另一種優(yōu)選實(shí)施方式中提供了用于診斷活體哺乳動(dòng)物TSE的診斷試劑盒。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述按照本發(fā)明，在診斷TSE中PrPD的檢測(cè)方法包括1)采集動(dòng)物或人的血液樣品2)由血液樣品制備全血、血漿、血清、紅細(xì)胞(RBC)或白細(xì)胞(WBC)，并處理血漿，以便分析物PrPD與抗體結(jié)合3)用作為捕獲抗體的PrPD特異抗體孵育此血液樣品4)沖洗抗體/PrPD復(fù)合物，除去污染的蛋白5)用敏感的免疫學(xué)分析檢測(cè)抗體/PrPD復(fù)合物。
下面將參照具體實(shí)施例更詳細(xì)地對(duì)個(gè)別步驟進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)清楚，公開(kāi)的方法和成分并不受限于特殊樣品、化學(xué)藥劑、抗體、標(biāo)記物或方法，這些都可以改變。除非另行定義，這里所用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。
抽取哺乳動(dòng)物的血液樣品，將其置于含抗凝劑的容器中，此抗凝劑諸如為EDTA、枸櫞酸鈉或肝素。優(yōu)選抗凝劑為EDTA，而應(yīng)用其他抗凝劑也可具有相似的結(jié)果。通過(guò)1000xg離心分離血漿和血細(xì)胞。其他優(yōu)選樣品為體液，諸如唾液、尿或腦脊液。如果應(yīng)用血清，則將血液抽至不含抗凝劑的容器中，并在室溫下使血液凝結(jié)至少30分鐘，然后1000xg離心，分離血塊和血清。
將血漿樣品與含去污劑的等量緩沖液混合，防止PrPC與抗體發(fā)生非特異性結(jié)合。適于阻斷非特異性結(jié)合的去污劑有很多種，而且本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員對(duì)它們很熟悉。優(yōu)選去污劑有月桂酰肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉、磺基三甲銨乙內(nèi)酯、Triton X-100、NP-40、ZWITTERGENT、Tween-20、Tween-80。特定分析方式所用的優(yōu)選去污劑以及用于特定物種的優(yōu)選去污劑可以改變。優(yōu)選濃度為0.05-1％。
將血漿樣品與抗體接觸。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，應(yīng)用對(duì)疾病相關(guān)類型PrPD特異的抗體。優(yōu)選抗體為抗體15B3，已顯示它對(duì)PrPD是特異的，但也可以類似方式應(yīng)用其他抗體。在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體包被在微量滴定板的孔上，或者包被在珠上以捕獲樣品中的PrPD。然后通過(guò)免疫學(xué)方法，應(yīng)用識(shí)別PrP的檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體與PrPD的復(fù)合物。通過(guò)各種免疫學(xué)方法可完成檢測(cè)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知這些方法，它們可包括蛋白印跡法(免疫印跡法)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫-PCR或者熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)。應(yīng)用可與酶綴合的朊病毒蛋白的抗體可進(jìn)行直接檢測(cè)，所述酶諸如為過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或者熒光分子或核酸?？商娲氖牵蓱?yīng)用未標(biāo)記初級(jí)抗體(抗朊病毒蛋白抗體)和標(biāo)記的次級(jí)抗體進(jìn)行間接檢測(cè)。
通過(guò)下面非限制性實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明實(shí)施例1BSE陰性和陽(yáng)性牛血漿中PrPD的檢測(cè)。
實(shí)施例2瘙癢病陰性和陽(yáng)性羊血漿中PrPD的檢測(cè)。
實(shí)施例3瘙癢病陰性和陽(yáng)性羊腦勻漿中PrPD的檢測(cè)。
實(shí)施例4瘙癢病陰性和陽(yáng)性羊血清中的PrPD的檢測(cè)。
實(shí)施例5瘙癢病陰性和陽(yáng)性羊白細(xì)胞中PrPD的檢測(cè)。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1是顯示實(shí)施例1結(jié)果的圖表。在此實(shí)施例中，對(duì)感染BSE(Pos 1-Pos 2)和正常牛(Neg 1-Neg 23)的血漿樣品進(jìn)行夾心免疫法，15B3用作捕獲抗體，可識(shí)別PrP N-末端的抗體用作檢測(cè)抗體。
附圖2是顯示實(shí)施例2結(jié)果的圖表。在此實(shí)施例中，對(duì)感染瘙癢病(Pos 1-Pos 6)和正常羊(Neg 1-Neg 16)的血漿樣品進(jìn)行夾心免疫法，15B3用作捕獲抗體，可識(shí)別PrP N-末端的抗體用作檢測(cè)抗體。
附圖3是顯示實(shí)施例3結(jié)果的圖表。所示數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用FACS分析可區(qū)分瘙癢病陽(yáng)性腦勻漿(B)和瘙癢病陰性腦勻漿(A)。灰色曲線顯示抗體15B3包被珠所接收的熒光信號(hào)。黑線顯示同種型對(duì)照珠所獲得的熒光信號(hào)。
附圖4是顯示實(shí)施例4結(jié)果的圖表。所示數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用FACS分析可區(qū)分源自感染瘙癢病羊的血清(B)和源自未感染瘙癢病羊的血清(A)。在陽(yáng)性樣品(B)中采用在陰性樣品(A)中設(shè)定為5％的右上象限，并清楚地顯示出5-32％的變化。
附圖5是顯示實(shí)施例5結(jié)果的圖表。所示數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用FACS分析可區(qū)分源自感染瘙癢病羊的白細(xì)胞(B)和源自未感染瘙癢病羊的白細(xì)胞(A)。在陽(yáng)性樣品(B)中采用在陰性樣品(A)中設(shè)定為5％的右上象限，并清楚地顯示出5-36.9％的變化。
實(shí)施例1附圖1所示圖表顯示第一種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。其數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用夾心免疫測(cè)定法可將BSE陽(yáng)性血漿樣品與陰性樣品區(qū)分開(kāi)。這里顯示兩次測(cè)量值的均值，而誤差棒顯示與高值的差異。
室溫下，用稀釋于pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、0.1％牛血清白蛋白(BSA)的2μg/ml抗-IgM抗體包被96孔平板1小時(shí)。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS將平板沖洗3遍，除去未結(jié)合的抗體。然后，將平板封阻2小時(shí)，并用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS沖洗3遍。室溫下，將濃度為2μg/ml于pH7.4的PBS中的構(gòu)象特異性抗體15B3與抗-IgM結(jié)合1小時(shí)。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS將平板沖洗3遍后，用含0.4％脫氧膽酸鹽(DOC)的Tris緩沖鹽水(TBS)1∶1稀釋的110μl BSE陰性和陽(yáng)性牛的血漿被加至這些平板上，并在室溫下將它們孵育1.5小時(shí)。用含0.2％DOC的TBS將未結(jié)合蛋白沖掉。在含有pH 7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的緩沖液中將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體805稀釋為10ng/ml，此抗體可識(shí)別PrP的氨基酸25-40，并將其加至孔中1小時(shí)。用含0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS沖洗3遍，除去未結(jié)合抗體。將100ml化學(xué)發(fā)光底物溶液加至孔中，并在平板發(fā)光計(jì)中讀數(shù)。值表示為相對(duì)光單位。
實(shí)施例2附圖2的圖表顯示第二種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所示數(shù)據(jù)表明應(yīng)用夾心免疫測(cè)定法可將羊瘙癢病陽(yáng)性血漿樣品與陰性樣品區(qū)分開(kāi)。這里顯示兩次測(cè)量值的均值，而誤差棒顯示與高值的差異。
按照實(shí)施例1所述，用15B 3抗體包被平板。用含0.2％ Sarcosyl的TBS1∶1稀釋的瘙癢病陰性和陽(yáng)性羊的血漿被加至平板上，并在室溫下孵育1.5小時(shí)。用含0.1％ Sarcosyl的TBS將未結(jié)合蛋白沖掉。在含有pH7.4的PBS、0.02％ Casein、0.1％Tween-20的緩沖液中將POD標(biāo)記的單克隆抗體805稀釋為10ng/ml，此抗體可識(shí)別PrP的氨基酸25-40，并將其加至孔中1小時(shí)。用含0.05％Tween-20的pH7.4的PBS沖洗3遍，除去未結(jié)合抗體。將100ml化學(xué)發(fā)光底物溶液加至孔中，并在平板發(fā)光計(jì)中讀數(shù)。值表示為相對(duì)光單位。
實(shí)施例3附圖3的圖表顯示第三種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所示數(shù)據(jù)表明應(yīng)用FACS分析可將瘙癢病陽(yáng)性腦勻漿與陰性樣品區(qū)分開(kāi)。這里顯示了一個(gè)直方圖，其中y軸表示事件，x軸表示FL-2檢測(cè)器所測(cè)定的熒光相對(duì)強(qiáng)度。
室溫下，在旋轉(zhuǎn)輪上，將60ng單克隆15B 3抗體或同種型對(duì)照IgM抗體(Becton Dickinson 550963)包被在3μl pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，進(jìn)行1小時(shí)，此磷酸鹽緩沖鹽水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS沖洗小珠三遍，除去未結(jié)合抗體。將這些小珠加至1ml含0.25％Sarkosyl的Tris緩沖鹽水(TBS)和10μl 10％瘙癢病陽(yáng)性或陰性腦勻漿中，并在4℃，在旋轉(zhuǎn)輪上孵育過(guò)夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS將小珠沖洗三遍，除去未結(jié)合蛋白。然后將這些小珠加入200μl含2μg生物素化單克隆抗體805的pH 7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室溫于旋轉(zhuǎn)輪上孵育15分鐘。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH7.4的PBS沖洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中的2.5μg鏈親和素-藻紅蛋白共軛物(Becton Dickinson554061)，并在室溫下再孵育5分鐘。通過(guò)沖洗除去未結(jié)合共軛物后，將這些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通過(guò)FACS(熒光激活細(xì)胞分選法)(MoFlow)分析。對(duì)FSC/SSC以線性模型獲得讀數(shù)，對(duì)FL2以對(duì)數(shù)模型獲取讀數(shù)。以listmode形式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。FL2基線在未預(yù)先進(jìn)行樣品孵育的15B3小珠上設(shè)定。
實(shí)施例4附圖4的圖表顯示第四種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所示數(shù)據(jù)表明應(yīng)用FACS分析可將瘙癢病陽(yáng)性血清(B)與陰性樣品(A)區(qū)分開(kāi)。這里顯示斑點(diǎn)印跡，其中y軸表示顆粒大小(向前散射)，x軸表示FL2檢測(cè)器所測(cè)定的熒光相對(duì)強(qiáng)度。
室溫下，在旋轉(zhuǎn)輪上，將60ng單克隆15B3抗體包被在3μl pH7.4磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，進(jìn)行1小時(shí)，此磷酸鹽緩沖鹽水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS沖洗小珠三遍，除去未結(jié)合抗體。將這些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris緩沖鹽水(TBS)和250μl分別獲自感染瘙癢病動(dòng)物和未感染瘙癢病動(dòng)物的血清中，并于4℃，在旋轉(zhuǎn)輪上孵育過(guò)夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS將小珠沖洗三遍，除去未結(jié)合蛋白。然后將這些小珠加入200μl含2μg生物素化單克隆抗體805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室溫于旋轉(zhuǎn)輪上孵育15分鐘。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH 7.4的PBS沖洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg鏈親和素-藻紅蛋白共軛物(Becton Dickinson 554061)，并在室溫下再孵育5分鐘。通過(guò)沖洗除去未結(jié)合共軛物后，將這些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通過(guò)FACS(MoFlow)分析。對(duì)FSC/SSC以線性模型獲得讀數(shù)，對(duì)FL2以對(duì)數(shù)模型獲得讀數(shù)。以listmode形式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。FL2基線在未預(yù)先進(jìn)行樣品孵育的15B3小珠上設(shè)定。
實(shí)施例5附圖5的圖表顯示第五種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所示數(shù)據(jù)表明應(yīng)用FACS分析可將從瘙癢病陽(yáng)性(B)羊中提取的白細(xì)胞與瘙癢病陰性羊(A)的白細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。這里顯示斑點(diǎn)印跡，其中y軸表示顆粒大小(向前散射)，x軸表示FL2檢測(cè)器所測(cè)定的熒光相對(duì)強(qiáng)度。
室溫下，在旋轉(zhuǎn)輪上，將60ng單克隆15B3抗體包被在3μl pH7.4磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的磁性抗-IgM Dynabeads(Dynal 110.15)上，進(jìn)行1小時(shí)，此磷酸鹽緩沖鹽水含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)。用含0.1％BSA的pH7.4的PBS沖洗小珠三遍，除去未結(jié)合抗體。將這些小珠加入500μl含0.2％Sarkosyl的Tris緩沖鹽水(TBS)和2百萬(wàn)個(gè)分別獲自感染瘙癢病動(dòng)物和未感染瘙癢病動(dòng)物的白細(xì)胞中，并在4℃，在旋轉(zhuǎn)輪上孵育過(guò)夜。此后，用含0.2％Sarkosyl的TBS將小珠沖洗三遍，除去未結(jié)合蛋白。然后將這些小珠加入200μl含2μg生物素化單克隆抗體805的pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein中，并在室溫于旋轉(zhuǎn)輪上孵育15分鐘。用200μl含0.1％Tween-20和0.02％Casein的pH7.4的PBS沖洗三遍后，加入含于200μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20、0.02％Casein的2.5μg鏈親和素-藻紅蛋白共軛物(Becton Dickinson 554061)，并在室溫下再孵育5分鐘。通過(guò)沖洗除去未結(jié)合共軛物后，將這些小珠置于400μl pH7.4的PBS、0.1％Tween-20和0.02％Casein中，并通過(guò)FACS(MoFlow)分析。對(duì)FSC/SSC以線性模型獲得讀數(shù)，對(duì)FL2以對(duì)數(shù)模型獲得得數(shù)。以listmode形式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。FL2基線在未預(yù)先進(jìn)行樣品孵育的15B3小珠上設(shè)定。
權(quán)利要求
1.體液和體液成分中，尤其是血液或者尿液中朊病毒蛋白同種型(PrPD)的檢測(cè)方法，其中此同種型PrPD與TSE相關(guān)，而且它既可為蛋白酶敏感同種型，也可為抗蛋白酶同種型存在，此檢測(cè)方法包括a.用捕獲抗體處理體液或其成分，此捕獲抗體可識(shí)別TSE相關(guān)同種型PrPD上的構(gòu)象表位，此表位是對(duì)該TSE相關(guān)同種型PrPD特異的，但不必定表明朊病毒蛋白的抗蛋白酶同種型，以及b.檢測(cè)可能的PrPD-捕獲抗體復(fù)合物。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中體液包含僅為蛋白酶敏感同種型的PrPD。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中應(yīng)用附加的檢測(cè)抗體處理體液或其成分，此附加的檢測(cè)抗體可識(shí)別朊病毒蛋白(PrP)的N末端。
4.按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)血漿進(jìn)行PrPD的檢測(cè)方法，此血漿由血液樣品制備。
5.按照權(quán)利要求的方法，其中用化學(xué)品處理血漿樣品，使此抗體/PrPD復(fù)合物的結(jié)合條件達(dá)到最佳。
6.按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中抗體15B3用作捕獲抗體。
7.按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法直接或者間接檢測(cè)抗體/PrPD復(fù)合物。
8.前述權(quán)利要求的方法在血液或者血液成分，尤其是與人體輸血相關(guān)的檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了朊病毒蛋白疾病相關(guān)構(gòu)象的檢測(cè)方法，此蛋白為傳染性海綿狀腦病(TSE)的指征，該方法包括感染活體動(dòng)物和人的臨床前檢測(cè)，以及死后檢測(cè)方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，將受試者的組織或體液樣品與一種抗體接觸，此抗體僅與非變性條件下的朊病毒蛋白疾病相關(guān)構(gòu)象結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1947017SQ200580012923
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者M·皮羅, D·茨瓦爾德, J·施密德, K·比菲格爾, F·庫(kù)恩, B·厄施, A·拉貝爾 申請(qǐng)人:普利奧尼克斯股份公司