專利名稱：產生或篩選調節(jié)類固醇激素受體的配體的功能性方法
技術領域：
本發(fā)明提供了功能性地設計或通過篩選鑒定維生素D受體(VDR)選擇性配體的方法，其中所述的VDR可用于治療涉及通過VDR發(fā)出信號的骨質疏松或其他紊亂。本發(fā)明涉及如下發(fā)現，即VDR與先前證明與其他核激素受體相互作用的支架蛋白MNAR相互作用并且VDR和MNAR間的配體依賴性相互作用導致Src/MAP激酶通路的活化。
背景技術：
核激素受體核激素受體是配體誘導型轉錄因子超家族，其作為一類參與了基因表達的配體依賴性轉錄控制。特異配體的結合誘導受體分子的構象變化，從而影響受體與其他轉錄因子的相互作用并最終影響前起始復合體的形成。這個過程調節(jié)基因轉錄的速率(D.J.Mangelsdorf等人，Cell 1995；83835-9)。
核激素受體超家族包括類固醇激素受體、非類固醇激素受體和孤兒受體。糖皮質激素(GR)、鹽皮質激素(MR)、孕酮(PR)、雄激素(AR)和雌激素(ER)的受體是典型的類固醇受體的例子。除了類固醇激素受體之外，這個核激素受體超家族還包括非類固醇激素如維生素D3、甲狀腺激素和類視黃醇的受體。此外，已經鑒定出一系列的編碼所謂“孤兒”受體的核受體樣序列。這些孤兒受體在結構上與核激素受體相關，并因此將其歸為核激素受體，但是還沒有鑒定出假定的配體(Cell 1995，83851-857)。
核激素受體超家族結構和功能上的特征在于包括6個不同結構和功能結構域A-F的模塊結構。更特別的是，這些受體具有可變的N末端區(qū)域(結構域域A/B)；然后是位于中心的、高度保守的DNA結合結構域(此后稱為DBD；結構域C)；可變的鉸鏈區(qū)(結構域D)；保守的配體結合結構域(此后稱為LBD；結構域E)和可變的C末端區(qū)域(結構域F，見Cell，見上文)。
大小和序列高度可變的N末端區(qū)域在超家族的不同成員之間保守性差。受體的該部分參與轉錄激活的調節(jié)。
DBD由大約66-70個氨基酸組成并具有DNA結合活性。該結構域引導受體到稱為激素應答元件(此后稱為HRE)的特異DNA序列，其位于染色體上特異靶基因的轉錄控制單位之內。類固醇受體，如GR、MR、PR和AR，識別相似的HRE DNA序列，而ER識別不同的DNA HRE序列。類固醇受體結合DNA之后與基礎轉錄機制的成分和序列特異性轉錄因子相互作用從而調節(jié)特異靶基因的表達。
LBD位于受體的C末端部分并且主要負責配體結合活性。由此，LBD是識別和結合激素配體所必需的，此外LBD還具有轉錄激活功能，從而確定了受體的激素應答特異性和選擇性。雖然LBD在結構上適度保守，但是其在核激素受體超家族各個成員間的同源性變化很大。
當核受體的激素配體進入細胞并被LBD識別時，它會與特異受體蛋白結合，從而引起受體蛋白的變構改變(Cell，見上文)。這種改變的結果是，配體/受體復合體轉變成轉錄激活狀態(tài)并且因此可以通過DBD的存在以高親合力結合染色體DNA上的相應HRE。配體/受體復合體以這種方式調節(jié)特異靶基因的表達。由該受體家族所獲得的多樣性來源于它們對不同配體反應的能力。
除了調節(jié)基因活性以外，激素受體還具有重要的和各種各樣的非基因組作用。這種非基因組活性的特征在于，其影響細胞功能如增殖和分化的一些重要信號通路的快速且瞬時激活。
更通常地，類固醇激素受體與胚胎發(fā)育、成體穩(wěn)態(tài)和器官生理學有關。多種疾病和異常歸因于類固醇激素活動的障礙。既然類固醇受體作為激素激活的轉錄調節(jié)物和激素激活的非基因組活性刺激物發(fā)揮作用，那么對于修飾這些受體、與這些受體相互作用和調節(jié)這些受體的多種方法的深入研究是一個具有極大意義的領域。例如，這些受體的突變和缺陷，以及這些受體的過度刺激和封閉可提供對激素信號轉導通路潛在機制的更深認識，從而在廣泛多種類固醇受體關聯疾病和異常的治療中提高功效。
維生素D3和VDR和細胞調節(jié)維生素D3受體(VDR)屬于核激素受體超家族。在過去的幾年中，支持多種維生素D3(Vit D3)類似物具有快速信號作用的證據越來越多。表明VitD3引起跨細胞膜的鈣細胞間運動。
Vit D3的典型信號通路利用VDR，VDR是Vit D3靶基因的轉錄因子。這個通路的作用包括細胞生長和侵襲的抑制。越來越多地認識到，胞質信號通路相似地可以調節(jié)生長和分化以及編程性細胞死亡。Vit D3通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27和p21以及抑制細胞周期蛋白D1在G1/S檢驗點抑制細胞周期。間接的機制包括TGF-β的上調和表皮生長因子受體的下調。
Vit D3可間接地通過作用于胰島素樣生長受體和腫瘤壞死因子-α或者更直接地通過Bcl-2家族系統、神經酰胺通路、死亡受體(例如Fas)和應激激活蛋白激酶通路(Jun N末端激酶和p38)誘導編程性細胞死亡。
骨質疏松和其他骨紊亂骨的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)主要由兩種不同細胞類型控制成骨細胞和破骨細胞。骨基質由成骨細胞分泌，成骨細胞是位于已存在的骨基質表面的細胞并在其上沉積新的骨層。成熟的破骨細胞為單核細胞/巨噬細胞來源的多核細胞，其重吸收鈣化的骨基質。這兩種細胞類型的活性通常嚴密協調以保持生物體骨骼的結構和完整性。然而，調節(jié)這兩種細胞類型的活性的機制仍不很理解并且很大程度上是未知的。
大量疾病和紊亂與異常的骨生長或骨質異常增加或減少有關。例如，石骨癥為骨基質的增厚并與使得破骨細胞不能吸收骨的破骨細胞成熟中的缺陷有關(見，例如Kong等人，Nature，1999，397315-323；Soriano等人，Cell 1991，64693-702；Iotsova等人，Nat.Med.1997，31285-1289)。與之相對，骨質疏松是一種特征在于破骨細胞活性增加，造成過度穿孔、易于破碎且愈合緩慢的骨骼的疾病。還已知大量的涉及異常骨生長和重吸收或與之有關的其他疾病和紊亂，這包括例如佩吉特病、成骨不全、纖維性結構不良、低磷酸酯酶癥、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、關節(jié)炎和牙周疾病。此外，位于骨骼內或遠離骨骼的多種惡性腫瘤，例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和腎癌的骨轉移以及惡性腫瘤和多發(fā)性骨髓瘤過程中的體液高鈣血可誘導骨質溶解。
此類疾病和紊亂代表著美國和其他國家的主要公眾健康焦點。例如，估計1億美國人患骨質疏松癥，其中80％為女性，而另外1億人骨質低并因此處于患此病的高風險狀態(tài)。
因此需要可用于(例如在細胞或組織樣品中)鑒定如成骨細胞和/或破骨細胞并調節(jié)或調整此類細胞活性的方法和組合物。也需要例如通過調整成骨細胞和破骨細胞活性治療異常骨生長和重吸收相關的疾病和紊亂(包括上述疾病)的方法和組合物。通過本發(fā)明解決了本領域的這些需要和其他需要。
Vit D3和骨改建在成骨細胞中，用Vit D3治療導致Src和磷脂酶C的活化以及肌醇三磷酸的形成。Vit D3提高TGF-β和TGF-β受體的表達，兩者均在骨形成和再吸收的偶聯中發(fā)揮重要作用并因此維持骨質。Vit D3也與TGF-β受體活化下游的Smad信號系統相互作用。
Vit D3對骨改建的局部控制具有重要影響。它對成骨細胞具有抗增殖和促分化作用同時通過刺激破骨細胞的活性和形成在骨再吸收中發(fā)揮關鍵作用。然而與成骨細胞不同，破骨細胞不表達VDR。因此，Vit D3通過控制一些參與調節(jié)破骨細胞發(fā)生和破骨細胞功能的細胞因子和生長因子的表達間接地調節(jié)它們。
Vit D3和皮膚在大多數皮膚細胞中檢測到了維生素D受體，這意味著角質化、毛發(fā)生長、黑素原生成、纖維發(fā)生、血管發(fā)生和免疫介導的過程是維生素D3的潛在靶標。
已經表明Vit D3通過抑制正常黑素細胞中的酪氨酸酶活性(黑素原生成或黑素產生所必需)調節(jié)黑素細胞的功能(Abdel-Malek等人，J CellPhysiol.1988；136(2)273-80)。此外，生理濃度的Vit D3在初級黑素細胞中表現出生長抑制作用并賦予對包括腫瘤壞死因子-α和紫外線輻射在內的數種編程性細胞死亡誘導劑的抗性(Sauer等人，Melanoma Res.2003；13(4)339-47)。
Vit D3和癌癥已經證明的抑制腫瘤侵襲和轉移潛能的機理包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和血管發(fā)生的抑制。
Vit D3在全身癌癥中作用的一系列證據是對細胞生長、分化、編程性細胞死亡、惡性細胞侵襲和轉移的作用的證明；癌癥的發(fā)生和后果與維生素D3及其前體的擾亂相關的流行病學發(fā)現；以及VDR功能多態(tài)性與某些癌癥發(fā)生的關系。此外，正在將Vit D3類似物研發(fā)成為癌癥化療劑。
越來越多的證據表明，在惡性黑素瘤中涉及維生素D3/1,25(OH)2D3/VDR軸。黑素瘤細胞表達VDR，并且表明1,25(OH)2D3在培養(yǎng)的黑素細胞、黑素瘤細胞和黑素瘤異種移植物中具有抗增殖和促分化作用。最近證明了其對黑素瘤細胞擴散的抑制作用。此外，據報道，患者具有低血清水平的1,25(OH)2D3，并且表明VDR多態(tài)性與惡性黑素瘤的發(fā)生和后果均相關。
同其他癌癥一樣，Vit D3在黑素瘤中具有保護作用，但是作為Vit D3主要來源的紫外線輻射是誘變性的。
雌激素和ER和細胞調節(jié)雌激素(E2)通過與ER相互作用在不同組織中行使多種生物學作用。ER的氨基酸序列分析、瞬時轉染研究和突變分析表明ER具有上述典型的模塊結構。ER的N末端A/B結構域含有反式激活功能，稱為轉錄激活功能1(TAF-1)。DBD結構域含有兩個鋅指并且負責DNA識別。LBD和第二個反式激活功能(稱為TAF-2)位于ER的C末端。
一旦ER與激素結合，則ER經歷激活和轉換步驟。激活的ER與特定雌激素效應元件(ERE)相互作用，其中所述的ERE位于雌激素調節(jié)基因的啟動子區(qū)域并且影響其靶基因的轉錄。在過去的十年中，大量的研究使得基本理解了配體(激動劑/拮抗劑)對ER的作用以及ER結構與功能間的關系。然而，對于ER的非基因組活性的機制知之甚微。
ERβ似乎與更通常已知的雌激素受體不同，后者稱為ERα。ERα和ERβ在本文統稱為ER。ERβ的DBD與ERα的90％相同。然而，ERα和ERβ的配體結合結構域(LBD)間的總體同源性低于55％。與ERα類似，ERβ可以配體依賴方式刺激從ERE開始的轉錄。
已經確立，雌激素誘導胞內第二信使(包括鈣調素和cAMP)水平快速且暫時的提高，并且雌激素誘導促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酶C的活化(Collins和Webb，1999)。實際上，大量研究已經證明雌激素誘導Src/Ras/MAP激酶磷酸化通路迅速且暫時的激活。這個通路的激活觸發(fā)有效的細胞功能，包括細胞增殖和分化。這些急性事件的時間過程與肽激素誘導的平行，因此支持了這些事件不參與雌激素的“典型”基因組作用的假設。
最近的資料還表明，雌激素受體與促分裂原活化蛋白(MAP)激酶信號級聯之間具有直接聯系。MAP激酶為響應多種信號而被磷酸化并激活的絲氨酸-蘇氨酸激酶家族。這些酶將胞外信號從多種膜受體傳遞到胞內靶標，這包括轉錄因子、細胞骨架蛋白和酶。MAP激酶家族包括胞外信號相關的激酶(ERK)、p38和c-Jun N末端激酶，其通過參與Ras、Raf和促分裂原活化蛋白激酶(MEK)依次激活的通路發(fā)出信號(S.M.Thomas，J.S.Brugge，Annual Review of Cell & Developmental Biology 13，513-609，1997)。已經報道，17β-雌二醇(E2)在肺上皮細胞、神經元細胞、成骨細胞和破骨細胞中迅速激活MAPK通路，導致產生種種活性，如誘導血管迅速膨脹、谷氨酸興奮性神經毒性之后對原代皮層神經元的神經保護以及對導致骨形成增加的破骨細胞的細胞增殖和分化的調節(jié)。
在乳腺癌來源的細胞系中，E2激活Src/Ras/Erk信號轉導通路。Src/Ras/Erk信號通路是熟知的生長因子的靶標。重要的是，這個通路的激活需要ER與Src的直接相互作用。這個通路的激活觸發(fā)不同的細胞效應，如增殖或分化。
雄激素和雄激素受體和細胞調節(jié)雄激素受體(AR)是配體激活的轉錄因子，其通過多種靶基因的調節(jié)引起高度選擇性、組織特異性的作用。
雌激素受體非基因組活性的調節(jié)物(MNAR)本發(fā)明最近鑒定了新的支架蛋白，命名為MNAR(modulator ofnongenomicactivity of estrogenreceptor)。MNAR與雌激素受體(ER)相互作用并且17β-雌二醇(E2)可提高這種相互作用。MNAR控制ER與酪氨酸激酶Src家族成員-p60src(Src)和p56lck(Lck)的相互作用。這種相互作用導致Src酶促活性的刺激和MAP激酶通路的激活(Wong等人，Proc NatlAcad Sci USA 2003；9914783-14788)。
已經證明，MNAR與Src經Src的SH3結構域通過PXXP模體相互作用，并且ER與Src經Src的SH2結構域相互作用。最近研究還表明，MNAR通過三元復合體AR/MNAR/Src介導與ER類似的AR信號(Unni等人，Cancer Res.2004；647156-68)。
這些資料表明，MNAR可在細胞過程的調節(jié)中有效地發(fā)揮更廣泛的作用。除此之外，對MNAR結構-功能組織的分析表明MNAR是允許形成多個蛋白質-蛋白質接觸的支架蛋白。MNAR分子中數個LXXLL模體的存在表明MNAR可接納多個NR的結合。除了使用LXXLL與ER相互作用之外，還驗證了MNAR與PR、GR和AR的相互作用。除此之外，延長的富含脯氨酸模體和數個典型的PXXP模體的存在暗示著與含SH3結構域的蛋白質的可能相互作用，其中所述的SH3結構域存在于多種激酶和其他信號分子中。最近研究還顯示，MNAR與Src和PI3激酶的調節(jié)亞基p85的SH3結構域相互作用。
已經非常確定核受體可使用與直接轉錄調節(jié)不同的機制調節(jié)細胞過程。ER、PR、AR和其他核受體可激活多種信號級聯放大，其調節(jié)對細胞增殖、分化和存活至關重要的基因的表達。前面提供的資料以及對MNAR功能組織的分析表明，如果MNAR不是主要連接的話，則MNAR至少可能是一種在細胞通訊級聯中使NR和其他信號分子結合的連接蛋白。
因此，提出MNAR可能代表著研發(fā)調節(jié)細胞功能的核受體的功能性選擇配體的重要靶標是合理的。
先前證實，VDR在Vit D3存在條件下與cSrc相互作用。先前還證實，Vit D3增加成骨細胞譜系的細胞中骨鈣蛋白和堿性磷酸酶的表達。
因此，本發(fā)明者著手評價MNAR過表達對骨肉瘤UMR 106細胞(ATCC CRL 1661或者ECACC 90111314)和ROS 17/2.8細胞中骨鈣蛋白和堿性磷酸酶表達的影響。考慮到骨鈣蛋白和堿性磷酸酶都是成骨細胞分化的關鍵標志，通過MNAR進行的任何調節(jié)暗示著MNAR為骨發(fā)育的重要調節(jié)物。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了核受體非基因組活性的蛋白質調節(jié)物(MNAR)與Vit D3核激素受體(VDR)間新的相互作用。具體而言，已經發(fā)現VDR結合MNAR氨基酸序列中的第五個“LXXLL”模體。通過這種配體依賴性相互作用，MNAR蛋白質與VDR相互作用并通過形成VDR/MNAR/Src三元復合體激活MAP激酶信號，引起VDR轉錄活性的提高。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定調節(jié)MNAR與VDR相互作用的配體的方法，其在MNAR多肽和VDR多肽反應混合物中加入測試化合物并評價與缺乏測試化合物條件下相同的反應混合物相比結合復合物的形成。
考慮了反應混合物是無細胞的或基于細胞的。
在另一個實施方案中，方法包括檢測VDR與測試化合物的復合物。
本發(fā)明還提供了鑒定在MNAR存在條件下調節(jié)VDR活性的配體的方法，其使含MNAR多肽的反應混合物與含功能性VDR的宿主細胞接觸并檢測在測試化合物存在或缺乏條件下的VDR活性。
在一個實施方案中，活性為MAP激酶的磷酸化。
在特別的實施方案中，激酶為Erk1和/或Erk2。
在另一個實施方案中，活性為通過VDR激活所誘導的基因的表達。
在特別的實施方案中，基因為骨鈣蛋白基因或堿性磷酸酶基因。
本發(fā)明也提供了在表達功能性VDR的細胞中調節(jié)配體依賴性活性的方法，其包括在VDR配體存在條件下使MNAR多肽與細胞接觸。
在一個實施方案中，活性為MAP激酶的磷酸化。
在特別的實施方案中，激酶為Erk1和/或Erk2。
在另一個實施方案中，活性為通過VDR激活所誘導的基因的表達。
在特別的實施方案中，基因為骨鈣蛋白基因或堿性磷酸酶基因。
附圖簡述

圖1.MNAR與VDR的配體結合結構域相互作用。全長MNAR通過體外轉錄/翻譯進行35S放射性標記并在存在或不存在100nM 1,25(OH)2Vit D3條件下與GST-VDR配體結合結構域融合蛋白孵育。用谷胱甘肽-瓊脂糖分離結合的物質并通過SDS-PAGE和放射自顯影分析。
圖2.VDR與MNAR LXXLL#5相互作用。將GST-VDR-LBD與媒介物或100nM濃度的1,25(OH)2Vit.D3孵育然后與對應于不同MNARLXXLL模體的固定化肽孵育。使用融合HRP的抗GST抗血清在WallacVictor21420多標記計數器中檢測VDR結合。從最N端的模體開始給MNAR LXXLL模體編號并分別命名為LXXLL1-9。
圖3.MNAR促進維生素D3刺激的Erk激活。對照質?；騇NAR表達質粒轉染的UMR-106細胞用10nM 1,25(OH)2Vit.D3處理0、5、10或20分鐘。收獲細胞并用蛋白質印跡分析測定Erk1和Erk2的磷酸化水平。
圖4.MNAR調節(jié)VDR依賴性基因表達。A.使用TaqMan分析從用對照質?；騇NAR表達質粒轉染并用媒介物或100nM 1,25(OH)2Vit.D3處理24小時的UMR-106細胞分離的RNA中測定骨鈣蛋白RNA水平。B.使用TaqMan分析從用對照質粒或MNAR表達質粒轉染并用載體或100nM 1,25(OH)2Vit.D3處理48小時的Ros 17/2.8細胞分離的RNA中測定堿性磷酸酶RNA水平。
圖5.此圖描述了MNAR組織的示意圖。MNAR的N末端部分由于多個LXXLL模體的存在而被命名為核受體相互作用結構域(NRID)，而由于許多脯氨酸和谷氨酸殘基的存在，MNAR的C末端區(qū)域被稱為富含脯氨酸和谷氨酸結構域(PERD)。LXXLL和PXXP模體從最N端的模體開始分別命名為1-10和1-2。
發(fā)明詳述本發(fā)明證明VDR MNAR和cSrc以配體依賴性方式相互作用。VDR/MNAR和VDR/cSrc間的直接相互作用通過VDR的配體結合結構域介導，而VDR/MNAR相互作用需要MNAR的LXXLL模體5號。此外，cSrc的SH2結構域對于VDR/Src相互作用是足夠的，而如以前所證明MNAR/Src通過Src的SH3結構域發(fā)生。
本發(fā)明證明，MNA0R與VDR相互作用并與Src形成三元復合物，并且MNAR過表達極大加強UMR 106和ROS17/2.8骨肉瘤細胞中骨鈣蛋白和堿性磷酸酶基因的表達。既然如上所述，骨鈣蛋白和堿性磷酸酶都是成骨細胞分化的關鍵標志，這些資料顯示MNAR是骨發(fā)育的重要調節(jié)物。因此，產生和鑒定調節(jié)MNAR與VDR相互作用從而調節(jié)骨鈣蛋白和堿性磷酸酶表達的功能選擇性配體對治療骨質疏松是有用的。
這些結果提供了額外證據證明MNAR是使核受體作用整合入Src介導的細胞信號中的支架蛋白，并且這些結果與MNAR作用模式一致。
定義維生素D3及其前體1,25二氫維生素D3(分別為Vit D3和1,25(OH)2D3)也稱作膽鈣化固醇、(+)-5，7-膽甾二烯-3β-醇或Racumin D(CAS號67-97-0)，并且為鈣和磷利用所必需的(通過刺激吸收)，并且為維生素A同化所必需的。
在特別實施方案中，人維生素D3受體或VDDR含有如SwisProt數據庫登錄號P11473和GeneBank登錄號J03258中所述的序列。人VDR的cDNA核苷酸序列和氨基酸序列分別在SEQ ID NO1和2中顯示。
“功能性VDR”是能發(fā)出第二信使信號(例如MAP激酶通路中的激酶如Erk1和Erk2的磷酸化)和/或能調節(jié)配體依賴性基因轉錄(如骨鈣蛋白和堿性磷酸酶轉錄)的宿主細胞中表達的VDR；或者已經證明在與天然或合成的配體接觸時能引起任何其他活性的宿主細胞中表達的VDR。
“VDR配體”包括任何天然VDR配體(如1,25(OH)2D3)和任何合成配體或類 似物。已知多于3000種的Vit D3合成類似物(Carlberg等人，ExpertOpin.Patents 2003；13(6)761-72)。
“VDR配體結合結構域”或VDR-LBD至少包含SEQ ID NO2中氨基酸序列的C末端區(qū)域或者另一種VDR直向同源物。VDR LBD序列從殘基121開始并延續(xù)到大約殘基427。LBD優(yōu)選地包括殘基110-427。
雌激素受體非基因組活性調節(jié)物(MNAR)指具有GenBank登錄號AF547989中所述核苷酸和氨基酸序列(分別是SEQ ID NO3和4)的蛋白質。如圖5所示，LXXLL模體在N端區(qū)域并編號為1-10。
如此處所使用，“三元復合物”指包括核激素受體、MNAR和Src或pI3激酶(或其他信號激酶)的復合物。在一個實施方案中，三元復合物為VDR/MNAR/Src復合物或VDR/MNAR/PI3激酶復合物。更具體地，VDR/MNAR/Src復合物通過VDR的配體結合結構域與MNAR經MNAR的5號LXXLL結構域相互作用以及與cSrc經cSrc的SH2結構域相互作用，以及通過MNAR的PXXP模體與cSrc的SH3結構域的相互作用形成。其他的三元復合物包括ER/MNAR/PI3激酶和AR/MNAR/src。
術語“骨形成”是骨合成和礦化作用的過程。成骨細胞調節(jié)這個過程。
術語“骨生長”是骨骼擴展的過程。該過程通過下列兩種方式之一發(fā)生(1)直接從間充質細胞或骨髓細胞開始的膜內骨生成；(2)從軟骨處開始的縱向或軟骨內骨生成。
術語“骨發(fā)生”與上面定義的術語骨形成同義。
正如本文通常所用，術語“涉及骨生長的紊亂”、“骨生長相關的紊亂”、“骨生長紊亂”、“骨生長疾病”和其他此類變化是指任何涉及異常骨生長、修復發(fā)育、重吸收、降解或骨組織穩(wěn)態(tài)的疾病或紊亂。涉及骨生長的紊亂可因此包括個體中骨質異常增加以及異常減少相關的疾病和紊亂。同樣，為本發(fā)明主旨的涉及骨生長的紊亂可包括但不限于破骨細胞異常(例如提高的或降低的)活性相關的紊亂。為本發(fā)明主旨的涉及骨生長的紊亂還包括成骨細胞異常(例如提高的或降低的)活性相關的紊亂。
可根據本發(fā)明的方法和組合物診斷或治療的示例性的涉及骨生長紊亂包括例如石骨癥、骨質疏松癥、佩吉特病、骨發(fā)生成骨不全、纖維性結構不良、低磷酸酯酶癥、原發(fā)性甲狀腺功能亢進、關節(jié)炎、牙周疾病和骨髓瘤血液疾病。此外，通過多種骨內惡性腫瘤或遠離骨骼的惡性腫瘤例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和腎癌的骨轉移、惡性腫瘤和多發(fā)性骨髓瘤過程中的體液高鈣血可誘導骨質溶解。
人骨鈣蛋白，也稱作骨gla蛋白質或BGP，具有GenBank登錄號NM_199173所述核酸(cDNA)和氨基酸序列并且分別為SEQ ID NO5和6。
堿性磷酸酶在有關領域中是眾所周知的。作為一個例子，在本文所述的大鼠骨肉瘤細胞系中發(fā)現的大鼠堿性磷酸酶的核酸和氨基酸序列可在GenBank登錄號J03572中找到并分別在SEQ ID NO7和8中描述。
術語“標記”指可直接檢測的或者可結合另一分子以允許檢測的實體。直接的標記包括酶、熒光團、色團、放射性同位素、染料、膠體金、膠體碳、乳膠顆粒和化學發(fā)光劑。間接的標記包括谷胱甘肽S-轉移酶(結合谷胱甘肽和抗體)；結合抗體的FLAG、myc標簽；螯合鎳的His標簽；結合抗生物素蛋白的生物素；鏈霉抗生物素(或者結合生物素的三者中的任何一個)；以及結合抗體和Fc分子的Ig恒定區(qū)結構域。
標記可共價地引入，例如使用綴合化學作為融合構件的一部分(如下文例證)。
分子生物學如本文所使用，術語“分離的”是指所提到的材料移開其通常存在的環(huán)境。因此，分離的生物材料可不含細胞成分，即發(fā)現或產生該材料的細胞成分。以核酸分子為例，分離的核酸包括PCR產物、分離的mRNA、cDNA或限制片段。在另一個實施方案中，分離的核酸優(yōu)選地從其所存在的染色體上切下，并且更優(yōu)選地不再與染色體中的、位于由分離核酸分子所包含基因的上游或下游的非調節(jié)區(qū)域、非編碼區(qū)域或其他基因連接。還在另一個實施方案中，分離的核酸缺少一個或多個內含子。分離的核酸分子包括插入質粒、粘粒、人工染色體等等的序列。因此，在特別的實施方案中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白質可與在細胞中其所結合的蛋白質或核酸或者兩者結合，或者與細胞膜結合(如果其為膜結合蛋白質的話)。分離的細胞器、細胞或組織從其在生物體中存在的解剖學位置移出。分離的材料可以被純化，但不必純化。
本文所用的術語“純化的”指在減少或消除無關材料存在條件下分離的材料，其中所述的無關材料即污染物，包括從中獲得該材料的天然材料。例如，純化的蛋白質優(yōu)選地基本不含在細胞中與其結合的其他蛋白質和核酸；純化的核酸優(yōu)選地基本不含細胞中存在的蛋白質或其他無關核酸分子。如本文所使用，術語“基本不含”在材料的分析性檢測的上下文中有效地使用。優(yōu)選地，基本不含污染物的純化材料為至少50％的純度，更優(yōu)選地為至少90％的純度，還更優(yōu)選地為至少99％的純度。可通過層析、凝膠電泳、免疫測定法、組成分析、生物測定法和本領域已知的其他方法評價純度。
純化的方法是本領域眾所周知的。例如，可通過沉淀、層析(包括制備型固相層析、寡核苷酸雜交和三螺旋層析)、超速離心和其他方法純化核酸?？赏ㄟ^多種方法純化多肽和蛋白質，其非限制性地包括制備型圓盤凝膠電泳、等電聚焦、HPLC、反相HPLC、凝膠過濾、離子交換和分配層析、沉淀作用和鹽析層析、萃取和逆流分布。為一些目的，優(yōu)選在重組系統中產生多肽，其中該蛋白質含有利于純化的額外的序列標簽，例如但不限于多聚組氨酸序列或者特異結合抗體的序列，如FLAG和GST。然后可在適當的固相基質上通過層析從宿主細胞的粗裂解物中純化多肽。備選地，所產生的抗蛋白質或抗從其衍生多肽的抗體可用作純化試劑?？赏ㄟ^多種技術純化細胞，這包括離心、基質分離(例如尼龍網分離)、淘洗和其他免疫篩選技術、耗竭(例如污染細胞的補體耗竭(complement depletion))和細胞分選(例如熒光激活的細胞分選[FACS])。其他純化方法也是可以的。經純化的材料可含有低于大約50％，優(yōu)選地低于大約75％，最優(yōu)選地低于大約90％的其最初結合的細胞成分?！盎旧霞兊摹敝赣帽绢I域已知的常規(guī)純化技術能夠達到的純度的最高程度。
在優(yōu)選的實施方案中，術語“大約”和“近似”通常是指所測定量的可接受程度的誤差，這取決于測量的性質或精度。一般地，代表性誤差程度為給定數值或數值范圍的20％以內，優(yōu)選地為10％以內，更優(yōu)選地為5％以內。備選地，特別是在生物系統中，術語“大約”和“近似”可指給定數值的一個數量級之內，優(yōu)選地為5倍之內并且更優(yōu)選地為2倍之內。除非另外指出，本文給出的數字量為近似的，這意味著當不明確指出時術語“大約”或“近似”是可推斷的。
術語“分子”是指任何明顯的或可區(qū)別的包含一個或多個原子的物質結構單位并且包括例如多肽和多聚核苷酸。
如本文所使用，術語“配體”指結合MNAR和VDR并且從而改變或影響表達VDR的細胞的功能或行為，或者阻止或改變影響(否則另一種生物活性蛋白質會對這些細胞具有影響)的分子，包括化合物、肽和肽模擬物。當提到合理的藥物設計、篩選和相互作用測定時術語配體和化合物可互換使用。
“測試物質”或“測試化合物”或“測試配體”(包括肽和肽模擬物)是這樣的物質，其已經被鑒定出或被設計成優(yōu)選通過MNAR的LXXLL模體與MNAR相互作用，從而也允許MNAR與VDR相互作用。
“先導化合物”是已經顯示通過VDR(當MNAR和VDR相互作用時)結合MNAR和調節(jié)第二信史活性(例如轉錄調節(jié))的測試化合物。
非人類動物包括但不限于實驗動物，如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠等等；家畜，如狗和貓；和農場動物，如綿羊、山羊、豬、馬和牛，并且尤其包括用人源或鼠源MNAR和/或VDR進行轉基因的此類動物。
根據本發(fā)明，可使用本領域技術范圍之內的常規(guī)分子生物學技術、微生物學技術和重組DNA技術。在文獻中充分解釋了此類技術。見例如Sambrook，Fitsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(本文稱為“Sambrook等人，1989”)；DNA CloningA PracticalApproach，第I卷和第II卷(D.N.Glover編輯，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames &S.J.Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.E.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(編輯)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc(1994)。
“基因”為編碼功能性“基因產物”的核苷酸序列。通常，基因產物為功能性蛋白質。然而，基因產物也可為細胞中另一類型的分子，如RNA(例如tRNA或rRNA)。為本發(fā)明的目的，基因產物也指在細胞中存在的mRNA序列。例如，根據本發(fā)明測量基因表達水平可相當于測量mRNA水平?；蛞部砂{節(jié)(即非編碼)序列以及編碼序列。代表性的調節(jié)序列包括啟動子序列，其決定了例如基因表達的條件。基因的轉錄區(qū)域也可包括非翻譯區(qū)域，這包括內含子、5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)和3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)。
“編碼序列”或“編碼……”的序列和表達產物，如RNA、多肽、蛋白質或酶為在表達時造成RNA、多肽、蛋白質或酶的產生的核苷酸序列；即核苷酸序列“編碼”那一RNA或者它編碼那一多肽、蛋白質或酶的氨基酸序列。
“啟動子序列”是能夠在細胞中結合RNA聚合酶并使下游(3’方向)編碼序列起始轉錄的DNA調節(jié)區(qū)域。為解釋本發(fā)明的目的，啟動子序列在其3’末端限于轉錄起始位點并向上游(5’方向)延伸到包括對于高于背景的可檢測水平起始轉錄所必需的最小數量堿基或元件。在啟動子序列之內會存在轉錄起始位點(例如常規(guī)地通過用核酸酶S1作圖發(fā)現)以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合結構域(共有序列)。
當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成RNA，之后經反式RNA剪接(如果它含有內含子)并且翻譯成蛋白質(如果序列編碼那種蛋白質的話)時，編碼序列在細胞中受轉錄和翻譯控制序列“控制”或者與轉錄和翻譯控制序列“有效地聯系”。
術語“表達”是指允許或造成基因或DNA序列中的信息顯示出來，例如通過激活參與相應基因或DNA序列轉錄和翻譯的細胞功能產生RNA(如rRNA或mRNA)或者蛋白質。細胞表達DNA序列形成“表達產物”，如RNA(例如mRNA或rRNA)或者蛋白質。表達產物本身，如得到的RNA或蛋白質也可稱作是由細胞“表達的”。
術語“轉染”是指將外來核酸引入細胞中。術語“轉化”是指將“外來”(即外在的或胞外的)基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞中，以便宿主細胞表達所引入基因或序列以產生所需物質，在本發(fā)明中所引入基因或序列通常編碼RNA，但是所引入基因或序列也可以編碼蛋白質或酶。所引入的基因或序列也可稱為“克隆的”或“外來的”基因或序列，可包括調節(jié)或控制序列(例如細胞遺傳機制使用的起始序列、終止序列、啟動子序列、信號序列、分泌序列或其他序列)。基因或序列可包括非功能序列或具有未知功能的序列。接受并表達所引入DNA或RNA的宿主細胞已經被“轉化”并且是“轉化體”或“克隆”。引入宿主細胞的DNA或RNA可來自任何來源，包括與宿主細胞相同屬或物的細胞或者不同屬或物的細胞。
術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”是指DNA或RNA序列(例如外來基因)可通過其引入宿主細胞以轉化宿主并促進所引入序列表達(例如轉錄和翻譯)的工具。載體可包括質粒、噬菌體、病毒等等并且在下文詳細討論。
“盒”指可在限定的限制酶切位點插入載體的DNA編碼序列或編碼表達產物的DNA片段。將盒的限制酶切位點進行設計以確保盒以正確的閱讀框插入。通常，外來DNA在載體DNA的一個或更多個限制酶切位點插入，然后與可傳遞的載體DNA一起由載體攜帶進入宿主細胞中。具有所插入或加入DNA的DNA片段或序列，如表達載體，也可稱為“DNA構建體”。普通類型的載體為“質?！?，其通常為易于接受其他(外來)DNA并且容易引入適當宿主細胞的雙鏈DNA分子的自包含分子，通常為細菌來源的。已經描述了在多種真核和原核宿主中復制和/或表達的大量載體，包括質粒和真菌載體。術語“宿主細胞”是指任何生物的任何細胞，其以任何方式選擇、修飾、轉化、培養(yǎng)或使用或者操作以便由細胞產生物質。例如，宿主細胞可為經操作以表達特定基因、DNA或RNA序列、蛋白質或者酶的細胞。宿主細胞還可用于篩選或者下文所述的其他測定法?？稍隗w外培養(yǎng)宿主細胞或者在非人類動物中(例如轉基因動物或瞬時轉染動物)培養(yǎng)一種或多種細胞。
術語“表達系統”是指在適當條件下，例如在由載體攜帶并引入宿主細胞的外來DNA所編碼蛋白質表達的條件下的宿主細胞和相容載體。通常的表達系統包括大腸桿菌(E.coli)宿主細胞和質粒載體；昆蟲細胞如Sf9、Hi5或S2細胞和桿狀病毒載體、果蠅細胞(Schneider細胞)和表達系統；哺乳動物宿主細胞和載體。例如，可在PC12、COS-1或C2C12細胞中表達MNAR或VDR。其他適當的細胞包括CHO細胞、Hela細胞、293T(人腎細胞)、小鼠原代成肌細胞和NIH3T3細胞。在優(yōu)選的實施方案中，細胞為骨肉瘤細胞。
術語“異源的”指非天然存在的元件的組合。例如，本發(fā)明包括嵌合RNA分子，其包含rRNA序列和不是該rRNA序列一部分的異源RNA序列。在本文中，異源RNA序列指非天然地位于核糖體RNA序列中的RNA序列。備選地，異源RNA序列可天然地位于核糖體RNA序列中，但是發(fā)現其位于rRNA序列中其非天然存在的位置。另一個例子是，異源DNA指非天然位于細胞中或細胞染色體位點中的DNA。優(yōu)選地，異源DNA包括細胞外來的基因。異源表達調調節(jié)元件為與其天然有效聯系的基因不同的基因有效聯系的調控元件。
術語“突變體”和“突變”是指遺傳物質如DNA中任何可檢測的變化或者任何過程、機制和此變化的結果。這包括基因結構(例如DNA序列)被改變的基因突變、源于任何突變過程的基因或DNA以及由修飾的基因或DNA序列表達的任何表達產物(例如RNA、蛋白質或酶)。術語“變體”也可用于指修飾的或改變的基因、DNA序列、RNA、酶、細胞等等，即任何種類的突變體。例如，本發(fā)明涉及改變的或“嵌合的”RNA分子，該RNA分子包含通過插入異源RNA序列(不是那一rRNA序列的天然一部分或者不是天然地位于那一rRNA序列的位置)改變的rRNA序列。此類嵌合RNA序列，以及編碼它們的DNA和基因在本文也稱為“突變體”序列。
此外，變體包括具有改變的化學特性(與靶標如MNAR或VDR具有增強的結合)的經修飾的蛋白質或肽片段，其包括某些通常遇到的非遺傳編碼的氨基酸，其包括但不限于[β]-丙氨酸(B-Ala)和其他ω-氨基酸，如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等等；α-氨基異丁酸(Aib)；ω-氨基己酸(Aha)；Δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；[β]-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MOS)；高精氨酸(hArg)；N-乙基賴氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丁酸(Dbu)；對氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。
術語“陣列”和“微陣列”互換地使用并且通常指不同分子的任何有序排列(例如在表面或基質上)，其中不同的分子在本文中稱作“探針”。陣列的每一個不同探針特異地識別和/或結合特定分子，其在本文中稱作“靶點”。微陣列因此用于同時檢測如樣品中多種不同靶分子的存在或缺乏。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所用的陣列為“可尋址陣列”，其中每一個不同探針與特定“地址”相關。例如，在探針固定于表面或基質上的優(yōu)選實施方案中，可尋址陣列的每一個不同探針可固定于表面或基質上特定的、已知的位置。因此，探針的靶分子在樣品中存在與否可通過簡單地測定靶點是否結合于表面或基質上那一特定位置而容易地確定。
當單鏈形式的核酸分子可以與另一核酸分子(例如cDNA、基因組DNA或RNA)在適當溫度和溶液離子強度條件下退火時，則核酸分子是與另一核酸分子“可雜交的”(見例如Sambrook等人，上文)。溫度和離子強度的條件決定了雜交的“嚴謹性”。“雜交”需要兩個核酸含有互補序列，但是堿基間的錯配也是可能的，這取決于雜交的嚴謹性。用于核酸分子雜交的適當嚴謹性取決于核酸的長度和互補程度，這些變量是本領域眾所周知的。兩個核苷酸序列間的相似性和同源性越高，則具有那些序列的核酸的雜交Tm值越高。
對于長度大于100個核苷酸的核苷酸的雜交，導出了計算Tm的公式(見Sambrook等人，上文，9.50-9.51)。
在特別的實施方案中，術語“標準的雜交條件”指大約55℃的Tm并且使用上面所述的條件。在優(yōu)選的實施方案中，Tm為60℃；在更優(yōu)選的實施方案中，Tm為65℃。在特別的實施方案中，術語“高嚴謹性”指在0.2×SSC中于68℃，在50％甲酰胺、4×SSC中于42℃雜交和/或漂洗條件，或者在能夠提供與這兩種條件之一相同雜交水平的條件下雜交和/或漂洗條件。
可使用對應于大約55℃解鏈溫度的低嚴謹性雜交條件(例如5×SSC，0.1％SDS，0.25％奶粉且不含甲酰胺；或者備選地，30％甲酰胺，5×SSC和0.5％SDS)。溫和嚴謹性雜交條件對應于更高的Tm，例如40％甲酰胺和5×SSC或6×SSC。高嚴謹性雜交條件對應于最高的Tm，例如50％甲酰胺，5×SSC或6×SSC。1×SSC溶液理解為是含0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉的溶液。
應用和用途本發(fā)明涉及MNAR與VDR相互作用從而介導配體結合VDR的發(fā)現。MNAR通過MNAR氨基酸序列(SEQ ID NO2)中的第五個LXXLL模體與VDR特異性相互作用。因此，考慮將結合該模體并從而干擾或對抗VDR結合MNAR的配體用于調節(jié)通過VDR的信號，例如通過cSrc或PI3激酶的信號。
使用本文所述的方法，也可以鑒定結合MNAR和VDR或與MNAR和VDR相互作用的先導化合物或肽，或者測試合理設計的結合MNAR和VDR或與MNAR和VDR相互作用的化合物或肽。例如，Vit D3可用于對抗測試化合物與包含MNAR-VDR的反應物的結合，以便確定在不存在vit D3的條件下測試化合物是否可以替代和介導MNAR-VDR的相互作用和/或活性。
本發(fā)明的方法至少依賴于MNAR中的LXXLL模體5號(見圖1)，VDR的氨基酸110-427，VDR的氨基酸110-427包括VDR LBD并結合MNAR。
相互作用和活性測定相互作用測定MNAR功能的激動劑或拮抗劑可通過調節(jié)MNAR和VDR或其他核類固醇激素受體間的相互作用，或者MNAR和cSrc或PI3激酶或另一種激酶間的相互作用發(fā)揮作用，或者通過調節(jié)MNAR或VDR或其他類固醇激素受體的活性發(fā)揮作用。可以使用熟知的雙雜交測定法或其他常規(guī)測定法中的任何一種來研究蛋白質-蛋白質相互作用以及這種相互作用被測試化合物的破壞?？扇菀椎卦O計體外系統以便鑒定能特異地結合本發(fā)明MNAR的先導物配體。通常，此類篩選測定法包括在足以使得兩種成分相互作用(例如結合)的條件和時間下制備包含野生型MNAR蛋白質和測試化合物的反應混合物，由此形成可檢測的復合物?？梢远喾N不同方式，包括使用微陣列開展測定法。
蛋白結合測定法和凝膠移位分析是檢測結合的有用方法。代表性的測定法包括測定結合至固定化MNAR的標記的VDR或cSrc，以及結合至固定化核受體(例如VDR)或調節(jié)物如cSrc的標記的MNAR或MNAR肽。許多適當的測定法可適應大規(guī)模、高通量的使用以便適于大量藥物篩選。所采用的特定測定法將通過MNAR相互作用的特定性質確定。測定法可采用單一MNAR、MNAR片段、MNAR融合產物、部分MNAR復合物或者包含MNAR核酸的完全基礎轉錄復合物。
可使用特異結合測定法，例如免疫測定法和生物素/抗生物素蛋白(包括鏈霉抗生物素和中性抗生素蛋白)結合相互作用完成MNAR-VDR-激酶復合物的檢測?？捎脕韺嵺`本發(fā)明的商業(yè)化的抗VDR抗體和抗激酶如cSrc、多種標簽如myc和FLAG標簽以及第二信使激酶的抗體可從幾種來源獲得，這包括R&D Systems、Minnneapolis、MN和Santa CruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。抗MNAR的抗體已經在PCT申請WO2004/031223中公開地描述，其在此全部引用作為參考。此類免疫測定法包括放射免疫測定法、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、“夾心”免疫測定法、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定法、原位免疫測定法(例如，使用膠體金、酶或放射性同位素標簽)、蛋白質印跡、沉淀反應、凝集測定法(例如凝膠凝集測定法、血細胞凝集測定法)、互補結合測定法、免疫熒光測定法、蛋白A測定法和免疫電泳測定法。在一個實施方案中，通過檢測初級抗體上的標記來檢測抗體結合。在另一個實施方案中，通過檢測次級抗體或試劑與初級抗體的結合來檢測初級抗體。在另一個實施方案中，次級抗體是標記的。用于在免疫測定法中檢測結合的許多方法是本領域已知的并且在本發(fā)明的范圍之內。
其他測定法可用于鑒定此類相互作用，這包括但不限于雙雜交測定法和表面等離子共振(SPR)測定法。酵母雙雜交測定法由Young和Ozenberger在美國專利5,989,808中描述，其在此引用作為參考。SPR描述與Wegner等人，Anal.Chem.2002，745161-5168；Cooper等人，AnalBioanal Chem.2003，377(5)834-42以及Gambari，Curr Med ChemAnti-Canc Agents.200，1(3)277-91中。
微陣列術語“陣列”和“微陣列”互換地使用并通常指不同分子的任何有序排列(例如在表面或基質上)，其中所述的分子在本文稱為“探針”。陣列的每一種不同探針特異地識別和/或結合特定分子，其在本文稱為其“靶點”。微陣列因此用于同時檢測例如樣品中大量不同靶分子的存在或缺乏。因此，探針的靶分子在樣品中存在與否可通過簡單地分析靶點是否結合于表面或基質上那一特定位置而容易地確定。
常規(guī)的微陣列通常包含固體無孔基質，如玻璃片或電腦芯片。在典型的微陣列應用中，基質與含待分析生物材料的樣品接觸。然后基質與探針分子，如標記的核酸或多肽或其他分子接觸。標記的分子與樣品中的分子結合。例如通過漂洗去掉未結合的探針分子，然后通過適當的信號檢測裝置，例如通過熒光發(fā)射閱讀微陣列。
例如，一個實施方案包含將蛋白質，如MNAR或測試配體，如VDR或cSrc錨定在固相上并在反應的最后和(通過漂洗)去掉未結合配體之后檢測固相上的蛋白質與測試配體的復合物。例如，在此方法的一個優(yōu)選實施方案中，將蛋白質錨定在固體表面并且使標記的化合物或多肽與表面接觸。將測試配體在足以使蛋白質和測試化合物或多肽間形成復合物的充足條件下孵育足夠時間之后，從表面去掉(例如通過漂洗)未結合的測試配體分子并檢測留下的標記分子。
在一個實施方案中，突變體或變體蛋白質可錨定在固體表面或支持物上?？山Y合錨定在固體表面的蛋白質的另一種標記蛋白質(測試化合物)可用蛋白水解酶處理，允許其片段與錨定在固體表面的蛋白質相互作用。漂洗之后，經處理蛋白質的短的標記肽片段仍與錨定蛋白質結合。分離這些肽并通過氨基酸序列鑒定其所來源的全長蛋白質區(qū)域。
在另一個備選的實施方案中，一種或更多種測試化合物分子與固相連接并且蛋白質分子(例如標記的MNAR多肽)與其接觸。在此實施方案中，不同測試化合物分子優(yōu)選地連接到固相上的特定位置，以便通過確定固相或表面上結合蛋白質的位置鑒定結合突變蛋白質的測試化合物。再次，突變體和變體蛋白質可用作測試化合物。
此外，可使用Vit D3作為拮抗劑對含MNAR和VDR多肽的孔進行篩選，其中在Vit D3存在和缺乏的條件下將測試化合物加入孔中。通過加入未標記的Vit D3可抑制任何測試化合物/MNAR/VDR相互作用的結合和形成。
自動多孔格式是發(fā)展最優(yōu)的高通量篩選系統。基于96孔板的自動篩選系統是最廣泛使用的?；谄桨宓暮Y選系統的當前趨勢是進一步降低反應孔的體積，由此增加每個平板的孔密度(每個平板從96孔到384孔再到1536孔)。反應體積的降低到直通量增加、生物試劑成本顯著降低以及需要通過自動裝置操作的平板數量降低。對于可用于高通量篩選的蛋白質陣列的描述，見美國專利號6,475,809，6,406,921，6,197,559，其在本文引用作為參考。
活性測定一旦設計、鑒定或表征了特異結合MNAR蛋白質的先導化合物或化合物，則可將該化合物用于測定法中以便確定其是否通過VDR調節(jié)信號。測定法的實例在下面和實施例中描述。
通常設計活性測定法以測量測試試劑存在或缺乏條件下靶蛋白的活性。活性測定法可用于鑒定先導物配體，其中所述的活性測定法包括但不限于觀察VDR轉錄活性的哺乳動物轉染測定法。例如，可針對其調節(jié)VDR轉錄活性增強(通過MNAR)的能力來篩選配體。備選地，可針對其影響第二信使信號，如Src、磷脂酶C、Erk激酶1和2的能力來篩選配體。此類化合物可調節(jié)MNAR與VDR的相互作用或者它們可調節(jié)MNAR或VDR的已知或未知的活性，這包括例如骨鈣蛋白或堿性磷酸酶的轉錄活性，或者激酶的激活或酶促活性，例如磷酸化作用。
一種用于篩選調節(jié)MNAR與VDR活性的配體的方法包括下列步驟(a)使測試化合物與包含能結合VDR的LXXLL模體的MNAR多肽接觸；(b)確定該測試化合物是否特異結合該多肽。此外，方法可包括下列步驟(a)在包含MNAR多肽和VDR受體的細胞中加入測試化合物；(b)比較加入化合物之前和之后的MNAR活性。該方法的其他步驟包括向包含缺乏MNAR活性或者具有顯著降低的MNAR活性的突變細胞的對照樣品中加入測試化合物。
存在多種鑒定影響核受體非基因組活性或基因組活性的化合物的方法。在一個實施方案中，這包括下列步驟(a)向包含MNAR和VDR復合物的細胞中加入測試化合物；和(b)比較之前和之后的基因組活性與非基因組活性。可通過常規(guī)方法測量所選擇的基因組活性。優(yōu)選地，測量的非基因組活性的增加或積極作用為例如，與MNAR缺乏條件下存在測試化合物時的基因組活性相比，在MNAR和VDR存在條件下向細胞中加入測試化合物之后轉錄的兩倍增加，并且其中加入該測試化合物之后未觀察到非基因組活性的變化。在這些方法中，細胞中優(yōu)選地存在至少一種核受體的配體，或者存在此配體激活的激酶，或者存在兩者。
備選地，當選擇測試化合物的非基因組活性時，在MNAR-VDR存在條件下向細胞中加入該測試化合物之后與在MNAR缺乏條件下測試化合物存在時的非基因組活性相比轉錄應該至少增加大約兩倍，并且其中加入該測試化合物之后未觀察到基因組活性的變化。可通過測定MNAR存在條件下VDR轉錄活性的增加或降低來測定這種作用。
在這些方法的每一種中，使用了評估化合物非基因組活性(或基因組活性)的對照，對照包括在MNAR和VDR存在條件下向細胞施用化合物，然后在MNAR缺乏條件下重復實驗并比較非基因組活性如激酶活性的水平。優(yōu)選的方法使用過表達MNAR或VDR和/或cSrc或PI3激酶，或者兩種或全部三種的細胞。通過使VDR與報告基因有效聯系來檢測化合物的基因組活性。
檢測第二信使活性的一種方式是通過激酶測定法。這可使用無細胞、基于細胞或基于動物模型的測定法完成。此類測定法可用作初次篩選所選擇的候選化合物活性的二次篩選。激酶測定法一般通過將32P摻入細胞、分離細胞蛋白質并用磷特異性抗體進行免疫印跡來檢測激酶的磷酸化狀態(tài)。此類測定法為本領域所熟知。
檢測變化的測定法，例如檢測基因轉錄成例如mRNA增加或降低的測定法為本領域所熟知。此類測定法包括RT-PCR(包括定量RT-PCR)、RNA雜交、與報告基因連接的目的基因的轉染測定法等等。
優(yōu)化一旦產生或鑒定出靶向靶標的一種或更多種藥物先導物，還經常必需優(yōu)化先導物以提高其藥效。在這個稱為先導物優(yōu)化的步驟中，合成化學家化學修飾先導物以增加或降低其與靶標的結合、修飾其對降解通路的敏感性或者修飾其藥物代謝動力學。
在實驗篩選先導物-靶標結合之前，合理的先導物優(yōu)化采用理論方法以確定給定靶標的一系列潛在先導候選物。合理的先導物優(yōu)化通過降低潛在先導物-靶標篩選的數量而降低藥物發(fā)現的時間和花費。
合理藥物設計和篩選通過MNAR介導的VDR激動劑/拮抗劑藥物發(fā)現有兩個步驟1)靶標鑒定和2)先導物鑒定和優(yōu)化。在靶標鑒定的第一個步驟中，可用特定生物通路或目的結構鑒定被稱作靶標的大分子，大分子是但不限于細胞表面受體或胞內蛋白質。一旦鑒定出潛在的靶標，必須對大量小分子篩選以確定靶標是否適于小分子結合和相互作用。
可用MNAR-VDR相互作用模型產生通過MNAR介導的VDR配體，其不影響VDR介導的轉錄，但是調節(jié)VDR介導的細胞信號，包括例如MAP激酶通路和磷脂酶C-γ通路(PLCγ)的激活。
結構鑒定通過使用X射線晶體學、中子衍射、核磁共振波譜學和其他結構確定技術確定蛋白質(如MNAR)的結構特征或MNAR與VDR的相互作用，進一步促進了調節(jié)物的鑒定和篩選。這些技術可用于調節(jié)物，包括激動劑和拮抗劑以及部分激動劑和部分拮抗劑的合理設計或鑒定。
為設計小分子或肽模擬物，獲得一種或更多種化合物肽的藥效團的三維結構是有利的。術語“藥效團”指化合物或肽模擬物上官能團的集合，其在三維空間中以與靶蛋白，例如MNAR互補的方式排列并且負責配體結合靶蛋白后的生物活性。有用的三維藥效團模型最好源自靶標的結晶學或核磁共振結構，但是也可源自基于相關靶標結構的同源模型或者來自先前發(fā)現的系列活性化合物的三維定量結構-活性關系的同源模型。
X射線晶體學技術是熟知的并且是本領域的的常規(guī)技術。例如，見Cantor & Schimmel，Biophysical Chemistry 1980(I-III卷)W.H.Freemanand Company(特別是第I卷中的1-13章和第II卷中的第13章)。也見于Macromolecular Crystallography，A-B部分(Carter & Sweet編輯)InMethods Enzymol.1997，276-277卷；Jan Drenth，Principles of ProteinX-ray Crystallography(New YorkSpringer-Verlag，1994)。
結合其天然配體的VDR的晶體結構是已知的(Rochel等人，Mol Cell.2000，5(1)173-9)。類似地，在結構和功能上重要的VDR競爭構象的氨基酸是已知的，其包括氨基酸殘基H229、D232、E269、F279和Y295(Vaisanen等人，Mol Pharmacol.2002，62(4)788-94)。因此，考慮到MNAR與VitD3結合所涉及的LXXLL模體以及VDR中對于激活而必需結合配體的關鍵區(qū)域，可將合理設計的配體進行設計來模擬這些活性的選擇性方面。
備選地，通常使用本領域熟知的核磁共振(NMR)技術確定MNAR-VDR相互作用的三維結構。優(yōu)選地，在接近模擬生理條件的水成系統中進行MNR數據獲取，以確保獲得相關結構。簡言之，NMR技術使用某些具有磁距或自旋的原子核(如1H、13C、15N和31P)的磁特性以探測此原子核的化學環(huán)境?？墒褂肗MR數據確定分子中原子間的距離，其可用于推導出三維模型或分子。
潛在配體根據本發(fā)明，配體包括肽配體(其還包括線性或環(huán)狀的肽模擬物)或化學化合物，其選擇性地模擬生物活性蛋白質的生物活性或者選擇性地封閉或選擇性地干擾生物活性蛋白質的活性，如VDR與MNAR的相互作用。
化合物可使用介導分子間，如VDR和MNAR間相互作用并且還賦予表達VDR受體(或VDR樣受體)的細胞生物活性的結構域合理地設計化合物調節(jié)物。這些結構域和可調節(jié)這些結構域活性的其他功能結構域可通過多種方法修飾以增加或降低生物活性，方法包括但不限于定點誘變。這些結構域的結構和拓撲結構都可用作合理藥物(小分子常規(guī)藥物或新碳水化合物、脂類、DNA/RNA或基于蛋白質的高分子量化合物)設計的基礎以調節(jié)(增加或降低)VDR或VDR-MNAR復合物的活性，和/或VDR/MNAR/其他蛋白質復合物的活性。例如，使用結構預測計算，可能還要結合光譜數據如核磁共振、圓二色譜和其他物理化學結構數據或者結晶學數據或者光譜數據和結晶學數據兩者，可以產生MNAR和/或VDR結構的分子模型。這些模型反過來對合理藥物設計很重要。
為進行篩選，可鑒定的化合物類別包括但不限于小分子(例如分子量低于大約2kD的，更優(yōu)選地分子量低于大約1kD的有機或無機分子)以及大分子(例如分子量高于2kD的分子)。通過這些篩選測定法鑒定的化合物也優(yōu)選地包括肽和多肽。例如，可溶的肽、組合文庫的融合肽成員(如Lam等人，Nature 1991，35482-84和Houghton等人，Nature 1991，35484-86所述的那些)；由組合化學衍生的文庫成員，如D-構象和/或L-構象氨基酸的分子文庫；磷酸肽，如隨機或部分簡并的、定向磷酸肽文庫(directedphosphopeptide library)的成員(見例如Songyang等人，Cell 1993，72767-778)。此外，具有詳細記錄的藥理活性的高純度的小的有機配體和肽激動劑文庫可從Sigma-Aldrich(LOPAC LIBRARYTM和LIGAND-SETSTM)獲得。也可從Sigma-Aldrich獲得的是稀有化合物Aldrich文庫，其是高于100,000種小分子化合物的各種文庫，包括植物提取物和微生物培養(yǎng)物。其他化合物文庫可從Tripos(LeadQuest)、TimTech(包括激酶調節(jié)物的靶向文庫)獲得。
提供化合物文庫的其他公司包括下列公司3-DimensionalPharmaceuticals，Inc.；Advanced ChemTech；Abinitio Pharma Sciences；Albany Molecular；Aramed Inc.；Annovis，Inc.(以前為Bearsden Bio，Inc.)；ASINEX；AVANT Immunotherapeutics；AXYS Pharmceuticals；Bachem；Bentley Pharmaceuticals；Bicoll Group；Biofor Inc.；BioProspectAustralia Limited；Biosepra Inc.，Cadus Pharmaceutical Corp.；Cambridge Research Biochemicals；Cetek Corporation；CharybdisTechnologies，Inc.；ChemBridge Corporation；ChemDiv，Inc.；ChemGenicsPharmaceuticals Inc.；ChemOvation Ltd.；ChemStar，Ltd.；Chrysalon；ComGenex，Inc.；Compugen Inc.；Cytolinetics；Dextra Laboratories Ltd.；Discovery Partners International Inc.；Discovery Technologies Ltd.；Diversa Corporation；Dovetail Technologies，Inc.；Drug Discovery Ltd.；ECM Pharma；Galilaeus Oy；Janssen Pharmaceutica；Jerini Bio Tools；J-Star Research；KOSAN Biosciences，Inc.；KP PharmaceuticalTechnology，Inc.；Lexicon Genetics Inc.；Libris Discovery；MicroBotanica，Inc.；MicroChemistry Ltd.；MicroSource Discovery Systems，Inc.；MidwestBio-tech Inc.；Molecular Design & Discovery；MorphoSys AG；Nanosyn，Inc.；Ontogen Corporation；Organix，Inc.；Pharmacopeia，Inc.；PherinPharmaceuticals；Phytera，Inc.；PTRL East，Inc.；REPLICor Inc.；RSPAmino Acid Analogues，Inc.；Sanofi-Synthelab Pharmaceuticals；Sequitur，Inc.；Signature BioScience Inc.；Spectrun Info Ltd.；TalonCheminformatics Inc.；Telik，Inc.；Tera Biotechnology Corporation.；Tocris Cookson；Torrey Pines Institute for Molecular Studies；TregaBiosciences，Inc.和WorldMolecules/NMD。
此外，哈佛醫(yī)學院支持的化學與細胞生物學研究所(ICCB)提供下列用于篩選的化學文庫，包括天然產物文庫Chem Bridge DiverSet E(16,320種化合物)；Bionet1(4,800種化合物)；CEREP(4,800種化合物)；Maybridge1(8,800種化合物)；Maybridge2(704種化合物)；Peakdale1(2,816種化合物)；Peakdale2(352種化合物)；ChemDiv Combilab andInternational(28,864種化合物)；Mixed Commercial Plate1(252種化合物)；Mixed Commercial Plate 2(320種化合物)；Mixed Commercial Plate 3(251種化合物)；Mixed Commercial Plate 4(331種化合物)；ChemBridgeMicrformat(50,000種化合物)；Commercial Diversity Set1(5,056種化合物)；NCI收集物Structural Diversity Set，Version 2(1,900種化合物)；Mechanistic Diversity Set(879種化合物)；Open Collection 1(90,000種化合物)；Open Collection 2(10,240種化合物)；已知的生物活性收集物NINDS Custom Collection(1,040種化合物)；ICCB Bioactives1(489種化合物)；SpecPlus Collection(960種化合物)；ICCB Discretes Collections。下列ICCB化合物由哈佛ICCB的化學家和其他合作研究所單獨收集ICCB1(190種化合物)；ICCB 2(352種化合物)；ICCB 3(352種化合物)；ICCB 4(352種化合物)。天然產物提取物NCI海洋提取物(352孔)；有機級分-NCI植物和真菌提取物(1,408孔)；菲律賓植物提取物1(200孔)；ICCB-ICG定向多樣性合成(DOS)收集物；DDS1(DOS Diversity Set)(9600孔)。
在優(yōu)選的實施方案中，設計的化合物或肽文庫為基于靶標的。有多種技術可有效用于構建更集中化合物文庫而不是大的多樣文庫。ChemicalComputing Group，Inc.(Montreal)已經研發(fā)出具有新的高通量藥物設計方法的軟件。公司的方法使用高通量篩選(HTS)實驗數據建立隨機QSAR(定量結構活性關系)模型，其隨后用于在虛擬組合文庫中選擇結構單元。其基于統計估測而不是標準的回歸分析。
此外，ArQule，Inc.(Wobum，MA)也整合了技術進行化合物高通量、自動化的生產并提供足量的已知結構和高純度的這些化合物進行先導物優(yōu)化。對于化合物發(fā)現的每一階段，其AMAPTM(自動分子裝配工廠)進行高通量化學合成。
相似的化合物經常在在線數據庫上或CD-ROM上提供以進行化合物的“挑取(cherry picking)”。見例如AbInitio Pharma Sciences；ActiMol；AralBiosynthetics；ASDI Biosciences；Biotechnology Corporation of America；Chembridge；ChemDiv；Florida Centre-Heterocyclic Compounds；Microsource/MSDI；NorthStar；Peakdale；Texas Retaining Group；Zelinsky Institute；Advanced ChemTech；Ambinter；AnalVtiCon Discovery；Aurora Fine Chemicals；Biofocus；Bionet/Key；Comgenex；Key Organics；Labo Test；Polyphor；SPECS and Biospecs和Bharavi Laboratories。
肽用于篩選的肽文庫可從下列來源獲得American Peptide Co.，Inc.；BIOMOL Research Laboratories Inc.；Cell Sciences Inc.；GenoMechanix，LLC；Phoenix Pharmaceuticals Inc.；United States Biological；AdvancedChemTech Inc.；AerBio Ltd.；Amphotech Ltd.；AnaSpec Inc.；ANAWATrading SA；Biomar Diagnostic Systems GmbH；BioSource InternationalInc.；Dalton Chemical Laboratories Inc.；Enzyme Systems Products Inc.；Peptides International Inc.；Princeton BioMolecules Corp.；ProteinTechnologies Inc.；Sigma-RBI；Synpep Corp.和Xaia Custom Peptides。
另一種方法使用重組噬菌體產生大的文庫。使用“噬菌體方法”(Scott和Smith，Science 1990，249386-390；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，876378-6382；Devlin等人，Science 1990，49404-406)可構建大的文庫(106-108種化學實體)。另一種方法主要使用化學方法，其中實例是Geysen方法(Geysen等人，Molecular Immunology 1986，23709-715；Geysen等人，J.Immunol.Meth.1987，102259-274)和Fodor等人的方法(Science 1991，251767-773)。Furka等人(第14屆國際生物化學會議，1988，第5卷，摘要FR013；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.1991，37487-493)、Houghton(美國專利號4,631,211)和Rutter等人(美國專利號5,010,175)描述了產生可作為激動劑或拮抗劑檢測的肽混合物的方法。噬菌體展示試劑盒可從例如Ph.D.TM獲得。
通過鑒定參與蛋白質-蛋白質相互作用，例如MNAR和VDR的相互作用的生物活性蛋白質的特異線性和約束的不連續(xù)部分，可以合理地設計和產生肽。通過鑒定這樣的特異且不連續(xù)部分，可構建模擬生物活性蛋白質的活性、或者封閉生物活性蛋白質的活性、或者選擇性激活生物活性蛋白質的生物活性肽。因此，可構建這樣的生物活性肽，其作為作用于哺乳動物細胞的配體通過結合那些細胞的受體位點而改變或影響其功能或行為，或者阻止天然生物活性蛋白質與細胞受體的結合由此防止生物活性蛋白質影響細胞或者選擇性地調節(jié)受體。
可由本領域的技術人員用熟知的技術和易于獲得的原料合成肽。根據本發(fā)明，提到合成或構建肽在本文解釋為是指產生在序列或結構上與所鑒定的參與蛋白質-蛋白質相互作用的MNAR和VDR的相應區(qū)域相似的肽?？墒褂帽绢I域已知的任何方法產生這些肽，這包括但不限于化學合成以及在真核或原核表達系統中的體外或體內生物合成。肽可以只由對應的區(qū)域組成或者它們包含相應序列和額外序列。
本發(fā)明的肽可在產生的同時為生物活性的或者需要修飾以采用生物活性的三維構象。通常，肽在產生的同時為有活性的。然而，一些修飾對活性是必需的，并且為了提高或改變活性一些修飾是需要的。
可以根據本發(fā)明使用標準技術進行的修飾包括但不限于環(huán)化、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化或者加入或去掉氨基酸殘基，這包括經過通常在天然肽和/或模擬物中不存在的化學鍵幫助產生有用三維構象的氨基酸殘基，其包括但不限于下列中所述的那些氨基酸殘基Freidinger等人，1980，Science 210656；Hinds等人，1988，J.Chem.Soc.Chem.Comm，1447；Kemp等人，1984，J.Org.Chem.492286；Kemp等人，1985，J.Org.Chem.505834；Kemp等人，1988，Tetrahedron Lett.295077；Jones等人，1988，Tetrahedron Lett.293853。
此外，可根據本發(fā)明用標準的技術進行修飾以產生環(huán)或多環(huán)結構的二聚體或寡聚體。
肽模擬物肽模擬物為其中對MNAR的至少一部分進行修飾以便使肽模擬物的三維結構基本保持與成熟MNAR蛋白質的相關相互作用區(qū)域的三維結構相同的化合物，并且化合物保留結合和調節(jié)VDR的能力。在一個實施方案中，將肽模擬物設計成以配體依賴性方式結合VDR。在另一個實施方案中，肽模擬物作為單個分子模擬了MNAR(與VDR)結合區(qū)域和VDR天然或合成配體的區(qū)域，從而以類似于MNAR-配體-VDR相互作用的方式調節(jié)VDR。
肽模擬物可為這樣的肽類似物，其本身為在MNAR序列中含一個或更多個取代和其他修飾的環(huán)肽。備選地，可用非肽結構替換至少部分序列，以便基本保留MNAR的三維結構。換言之，例如LXXLL序列中的一個、兩個或三個氨基酸殘基可由非肽結構替換以促進結合。
此外，MNAR的其他肽部分也可(但非必需)用非肽結構替換。肽模擬物(肽和非肽基類似物)具有改善性質(例如降低的蛋白質水解、增加的滯留或增加的生物利用率)。肽模擬物通常具有改善的口服利用率，其使它們尤其適于治療如癌癥和骨質疏松癥的疾病。應該注意到，肽模擬物可具有或不具有相似的二維結構，但是共有共用的三維結構特征和幾何學特征。每一種肽模擬物還可具有一個或更多個獨特的額外結合元件。本發(fā)明提供了鑒定肽模擬物的方法。多種肽修飾是本領域已知的并可用于產生模擬肽的化合物。見例如國際專利申請?zhí)朩O 01/53331。此類修飾也可用于本發(fā)明以產生模擬肽的化合物以及下面所述的特異修飾。
理論上，所有肽模擬物具有與例如MNAR的LXXLL模體三維結構基本相似的三維結構。通常，如果用QUANTA程序(QUTANT，可從Molecular Simulations Inc.，San Diego，Calif.獲得)中的分子相似性組件計算，它們的藥效團原子坐標具有低于或等于1埃的均方根差(RMSD)，那么稱兩種三維結構在結構上彼此基本相似。所有的肽模擬物具有至少一個基本類似于MNAR的至少一個低能三維結構的低能三維結構。
體內篩選在本發(fā)明的一個實施方案中，鑒定、檢測或優(yōu)化了抑制蛋白質-蛋白質復合物的活性和形成的藥物以預防例如骨質疏松癥，轉基因小鼠或敲除小鼠，如成骨細胞消融(osteoblast ablation)小鼠(Mizuno等人，BiochemBiophys Res Commun.1998，29，247(3)610-5)或過表達可溶破骨細胞分化因子的小鼠(Mizuno等人，Bone Miner Metab.2002，20(6)337-44)?？衫们贸蜣D基因動物測定系統檢測通過調節(jié)藥物靶蛋白如MNAR的表達或活性來減輕或抑制骨質疏松或其他骨疾病的藥物，具體而言是調節(jié)MNAR和VDR和/或cSrc或PI3激酶相互作用的藥物。
在本發(fā)明的另一方面，可使用MNAR轉基因或敲除小鼠進一步闡明MNAR在骨疾病中和與MNAR相互作用的類固醇激素受體相關的任何其他紊亂中的作用，或者闡明MNAR可與之相互作用并調節(jié)其活性的其他蛋白質。
用于本發(fā)明的轉基因動物可通過任何方法制備，這包括但不限于胚胎干細胞(ES)的修飾和注射異形核到胚細胞中，并且此類方法為本領域已知(見例如，Coffman，Semin.Nephrol.17404，1997；Esther等人，Lab.Invest.74953，1996；Heddle，Environ Mol Mutagen 321104，1998；Werner等人，Arzneimittelforschung 48870 80，1998；美國專利號4,736,866(Leder和Steward)；4,870,009(Evans等人)；5,718,883(Harlan和June)；5,614,396(Bradley等人)；和5,650,503(Archibald等人))。
“敲除的哺乳動物”是在其基因組中含有通過基因打靶方法失活的特異基因的哺乳動物(例如小鼠)(見例如美國專利號5,777,195和5,616,491)。敲除的哺乳動物可為雜合敲除(即一個缺陷等位基因和一個野生型等位基因)或純合敲除突變體。
“敲入”哺乳動物是內源基因由異源基因取代的哺乳動物(Roamer等人，New Biol.1991；3331)。優(yōu)選地，異源基因“被敲入”到目的位置，評價對象(在這種情況下基因可以是報告基因；見Elegant等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；9511897，1998)是異源基因的表達或功能，從而將異源基因的表達與從適當啟動子的轉錄聯系起來。這可用突變重組位點(Araki等人，Nucleic Acids Res，1997，25868)或PCR(Zhang和Henderson，Biotechniques，1998，25784)通過異源重組、轉座子(Westphal和Leder，Curr Biol 1997，7530)實現。例如，轉基因“敲入”動物可以通過將MNAR基因穩(wěn)定插入到轉基因動物的基因組中而產生；或者通常例如基因活化技術對動物進行遺傳操作使其組成型表達內源MNAR而產生。
骨疾病、皮膚疾病和癌癥的治療如本文所使用，術語“治療有效量”是指產生藥用效果的化合物的數量，其中所述的藥用效果為當向易患或患有以骨損失為特征的疾病的個體施用治療有效量的化合物時個體的骨損失速度降低。一般通過與將不含有效成分的組合物施用于類似情況個體時的效果可比的效果來確定治療有效量。
例如，可選擇性刺激MAP激酶活性的VDR配體具有重要的節(jié)制使用骨(bone-sparing)作用而不影響鈣穩(wěn)態(tài)，其可用于治療骨質疏松。備選地，選擇性地調節(jié)VDR介導的細胞信號的VDR配體可用于治療皮膚癌患者。這將顯著改善使用Vit D3的治療，因為這些藥物不具有Vit D3的高鈣血作用。最后，合理設計配體的選擇性特性會降低或消除許多與Vit D3治療相關的副作用，如經常造成惡心、頭痛、骨痛、高血壓和腎損傷的高鈣血。
實施例還通過特定實施例對本發(fā)明進行了描述。然而，此類實施例的使用僅為描述性的并且絕不限制本發(fā)明或任何例證術語的范圍和含義。同樣地，本發(fā)明不限于本文所述的任何特定優(yōu)選實施方案。的確，本發(fā)明的許多修改和變化對于閱讀該說明書后的本領域技術人員而言是顯而易見的，并且可在不偏離其精神和范圍情況下進行。因此本發(fā)明僅通過后附權利要求以及與授權權利要求相當的全部范圍進行限制。
下面的實驗表明，VDR與MNAR以配體依賴性方式相互作用并且這種相互作用通過MNAR LXXLL模體5號介導。VDR在Vit D3存在條件下與cSrc(經cSrc的SH2結構域)相互作用，并且MNAR過表達通過MNAR-cSrc相互作用(通過src SH3結構域的PXXP模體)和Erk激酶1和Erk激酶2的磷酸化增加Vit D3誘導的MAP激酶通路的激活。
基于下述的涉及ER/MNAR/PI3激酶的三元復合物形成的觀察結果，還可以預期VDR1/MNAR/PI3激酶的相互作用。與cSrc相似，MNAR經PI3激酶p85亞基的SH3結構域與PI3激酶相互作用。
這些結果提供了額外的證據，即MNAR是將核受體相互作用整合入激酶介導的細胞信號中的支架蛋白，并且與前面提出的MNAR作用模式一致。
實施例1MNAR與VDR的結合方法試劑1,25(OH)2Vit D3購自Sigma。對應于不同MNAR LXXLL模體的生物素化的肽由Wyeth Research的肽化學組合成和純化。谷胱甘肽瓊脂糖珠從Sigma獲得。抗磷酸酪氨酸抗體，SuperSignal Elisa Pico過氧化物酶底物和Reacti-BindTMNeutrAvidinTM包被的微量滴定板來自Pierce。
GST pull dow相互作用分析VDR配體結合結構域(即氨基酸110-427)的GST融合物(命名為GST-VDR-LBD)在BL-21細胞中表達并與谷胱甘肽瓊脂糖-4B(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ結合。用Promega TNT Quick CoupledTranscription/Translation System(Madison，WI)轉錄/翻譯野生型MNAR并進行35S放射性標記，然后在溶于結合緩沖液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mM DTT，1mM PMSF，1mM EDTA，0.05％NP-40，1×蛋白酶混合物)中的100nM 1,25(OH)2Vit D3存在或缺乏條件下與結合于谷胱甘肽瓊脂糖4B的GST-VDR-LBD融合蛋白室溫孵育1小時。然后用結合緩沖液洗滌珠子4次，通過加入SDS緩沖液洗脫結合的蛋白質并通過SDS-PAGE和放射自顯影分析。
基于ELISA的VDR-MNAR相互作用分析使用快速的非同位素ELISA型方法表征VDR-MNAR相互作用。合成對應于不同MNAR LXXLL模體(從最N端模體依次命名為1-9)的生物素化肽并固定于Reacti-BindTMNeutrAvidinTM包被的微量滴定板上(PierceBiotechnology，Rockford，IL)。用結合緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM DTT，1mM EDTA，0.01％NP-40，0.01％BSA)洗滌微量滴定板兩次。將肽用100μl結合緩沖液稀釋達50μM的終濃度并與Reacti-BindTMNeutrAvidinTM包被的微量滴定板室溫孵育1小時，用結合緩沖液洗滌4次。將用媒介物或1μM 1,25(OH)2D3預孵育的GST-VDR-LBD與對應每一MNAR LXXLL模體的固定化肽于室溫相互作用2小時。用結合緩沖液洗滌平板4次，與HRP融合的抗GST抗體(Sigma，St.Louis，MO)在結合緩沖液中孵育1小時，然后洗滌4次以上。使用SuperSignalELISA Pico化學發(fā)光底物(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)檢測抗原/抗體復合物，用Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer Lifesciences，Boston，MA)閱讀信號。
結果MNAR與VDR的配體結合結構域相互作用GST pull-down證明MNAR和VDR相互作用。圖1提供的資料表明，MNAR以配體依賴性方式與VDR-LBD直接相互作用。
VDR與MNAR LXXLL模體5號相互作用MNAR含有10個假定LXXLL模體，其潛在地介導MNAR與核激素受體的相互作用。使用HRP融合的抗GST抗體的ELISA測定法結果(圖2)證明，VDR配體結合結構域以配體依賴方式與對應于MNAR LXXLL模體5號的肽相互作用。
實施例2VDR活性通過MNAR的激動劑激活方法蛋白質印跡分析按照制造商推薦方法使用Lipofectamine 2000試劑用對照載體或MNAR表達載體轉染UMR-106細胞。轉染后，在補充2％活性炭吸附FBS的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細胞48小時。48小時之后，用10nM 1,25(OH)2D3處理細胞達所示時間。漂洗細胞并收獲于冷的PBS中，然后離心并去掉上清。用2倍體積的裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1mMNa2EDTA，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM焦磷酸鈉，1mM β-甘油磷酸，1mM Na2VO4，1μg/μl亮抑酶肽)裂解細胞。通過離心去掉細胞碎片并將等量的蛋白質進行SDS-PAGE。分離的蛋白質轉到硝酸纖維素膜上并通過蛋白質印跡分析測定MNAR、ERK和p-ERK的水平。
定量PCR(TaqMan)分析按照制造商推薦方法使用Lipofectamine 2000試劑用對照載體或MNAR表達載體轉染UMR-106和ROS 17/2.8。轉染后在補充2％活性炭吸附FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。轉染后16小時用100nM 1,25(OH)2Vit D3處理細胞24或48小時。裂解細胞并用RNeasy Kit(Quiagen)分離總RNA。進行定量PCR(TaqMan)以確定UMR-106細胞中的骨鈣蛋白水平和ROS17/2.8細胞中的堿性磷酸酶水平。
結果MNAR提高維生素D刺激的Erk活性用對照載體或MNAR表達載體轉染UMR-106細胞并用10nM1,25(OH)2Vit D3處理0、5、10或20分鐘。用抗磷酸化Erk1和磷酸化Erk2的抗體的蛋白質印跡分析評價UMR-106細胞提取物中Erk1和Erk2的磷酸化水平(圖3)。在MNAR缺乏條件下用1,25(OH)2Vit D3處理UMR-106細胞10或20分鐘導致磷酸化Erk1和Erk2的水平增加。然而，MNAR過表達導致Erk磷酸化的顯著增加。這些結果表明，MNAR控制1,25(OH)2Vit D3誘導的MAP激酶通路的激活。
MNAR調節(jié)維生素D依賴的基因表達用從1,25(OH)2Vit D3處理的UMR 106細胞和Ros 17/2.8細胞分離的RNA進行定量PCR以確定MNAR是否可以影響1,25(OH)2Vit D3誘導的基因表達。用對照質?；騇NAR表達質粒轉染UMR-106細胞，分離RNA并用TaqMan分析法分析(圖4A)。用1,25(OH)2Vit D3處理本身不影響骨鈣蛋白表達的水平。然而，MNAR過表達造成骨鈣蛋白的基礎水平和1,25(OH)2Vit D3刺激水平的強烈增加。
也確定了MNAR是否影響成骨細胞分化的重要標志—堿性磷酸酶(AP)的表達。從用媒介物或1,25(OH)2Vit.D3處理的對照質?；騇NAR表達質粒轉染的Ros 17/2.8細胞分離RNA并用于TaqMan分析(圖4B)。MNAR的過表達強烈地提高1,25(OH)2Vit D3誘導的AP表達水平。這些結果證明，MNAR可以調節(jié)1,25(OH)2Vit.D3依賴的基因表達和成骨細胞分化，并且還表明MNAR在Vit D3介導的骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
實施例3通過MNAR對ER中PI3激酶的調節(jié)方法最近顯示MNAR通過形成ER/MNAR/PI3激酶三元復合物影響ER中PI3/Akt激酶介導的信號。預期MNAR會對通過VDR發(fā)出信號的PI3/Akt激酶具有相似的作用。
轉染和細胞裂解物制備按照制造商建議的方法使用Lipofectamine 2000試劑用對照、MNAR表達載體、非特異性siRNA或MNAR特異性siRNA轉染MCF-7細胞。轉染后細胞在補充2％活性炭吸附FBS的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48小時。48小時之后，用10nM 17β-雌二醇處理細胞達所示時間。漂洗細胞并收獲于冷的PBS中，然后離心并去掉上清。用2倍體積的裂解緩沖液(20mMTris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton，2.5mM焦磷酸鈉，1mM β-甘油磷酸，1mM Na2VO4，1μg/μl亮抑酶肽)裂解細胞。通過離心去掉細胞碎片。對于RNA干擾，由DharmaconInc開發(fā)獲得非特異性siRNA或MNAR特異性siRNA。
免疫沉淀和激酶測定法在4℃用抗ERα單克隆抗體(D12，Santa Cruz)從細胞裂解物中(1mg/ml蛋白質)免疫沉淀ERα60分鐘，然后加入20μl 50％蛋白G瓊脂糖懸浮液并且再孵育60分鐘。離心樣品并用1ml裂解緩沖液洗滌沉淀4次然后通過免疫印跡分析。用抗p85多克隆抗體(Upstate Biotech)從細胞裂解物(1mg/ml蛋白質)中免疫沉淀p85。
為進行PI3-K反應，如上所述從細胞裂解物中免疫沉淀p85。根據制造商的說明用Echelon Biosciences的PI3激酶ELISA試劑盒檢測免疫沉淀物的激酶活性。簡言之，通過向p85免疫沉淀物中加入5μl 10×反應緩沖液和10μl PI(4，5)P2底物溶液(10μM)在50μl體積中進行反應。PI3-K激酶反應完成之后，首先混合反應產物并與PI(3，4，5)P3檢測抗體孵育，然后加入到PI(3，4，5)P3包被的微量滴定板中進行競爭性結合。用過氧化物酶連接的第二種檢測試劑和比色檢測法檢測PI(3，4，5)P3檢測抗體與平板的結合。比色信號與通過PI3-K活性產生的PI(3，4，5)P3數量成反比。
使用Cell Signaling的試劑盒(目錄號9840)用抗Akt抗體在免疫沉淀物中檢測Akt激酶活性。簡言之，向Akt免疫沉淀物中加入1mg GSK-3融合蛋白作為底物。在制造商提供的反應緩沖液中進行激酶反應。通過蛋白質印跡分析法分析激酶反應中產生的p-GSK-3水平。
蛋白質印跡分析來自細胞裂解物的等量蛋白質進行SDS-PAGE。將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上并通過蛋白質印跡分析檢測Akt和p-Akt的水平。Akt抗體購自Cell Signaling(抗Akt抗體，目錄號9272；抗p-Akt抗體，目錄號9271)。
結果在MCF-7細胞中ERα、MNAR和p85相互作用以前顯示ER與PI3激酶的p85亞基相互作用(Migliaccio等人，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.2002；83(1-5)31-5)。這里首次評價了內源ER、MNAR和PI3-K的調節(jié)亞基p85是否在MCF7細胞中相互作用。為說明這個問題，用10nM雌二醇刺激休眠的MCF-7細胞20分鐘或者不進行刺激。用裂解緩沖液裂解細胞并將細胞裂解物用于使用抗ERα抗體或抗p85α抗體的免疫沉淀。用抗p85α、抗ERα或抗MNAR抗體通過免疫印跡分析每一免疫沉淀物。結果顯示雌二醇處理觸發(fā)了MNAR、p85和ERα的免疫共沉淀。在對照免疫沉淀物中未檢測到結合。這些資料表明，在MCF7細胞中內源MNAR-ERα和p85相互作用。具體而言，MNAR經p85的SH3結構域與p85相互作用。
MNAR在PI3-K的雌二醇依賴性激活中的作用為研究MNAR對PI3-K的雌二醇誘導激活的影響，用MNAR表達質?；蛳抡{MNAR表達的MNAR特異性siRNA轉染MCF-7細胞。轉染后48小時，細胞用10nM雌二醇處理20分鐘或不進行處理，收獲并評價細胞裂解物中PI3-K活性的水平。測量通過p85免疫沉淀物產生的PtdIns-3P以評價PI3激酶活性。結果顯示，用雌二醇處理MCF-7細胞導致PI3激酶活性的刺激。MNAR過表達增加PI3-K的雌激素依賴性活化。與之不同的是，用MNAR特異性siRNA減少細胞的MNAR造成通過雌二醇的PI3-K激活水平降低。此外，PI3-K抑制劑LY294002以及ER拮抗劑ICI 182780封閉了雌二醇對PI3-K活性的作用。這些資料表明，MNAR-ER和p85的相互作用導致PI3激酶的激活。
MNAR調節(jié)Akt的雌二醇依賴性激活已經確定PI3激酶的激活導致Akt的激活，并且Akt是PI3-K啟動信號的主要調節(jié)物。Akt通過調節(jié)下游靶標的活性促進細胞存活和細胞周期進程。為評價MNAR是否影響對雌二醇作出反應的Akt的磷酸化和激活，用MNAR表達質?；騇NAR特異性siRNA轉染MCF-7細胞。轉染48小時之后，用10nM雌二醇處理細胞20分鐘或者不處理。然后制備細胞裂解物并用蛋白質印跡分析法分析磷酸化Akt的水平。發(fā)現用雌二醇處理MCF-7細胞增加磷酸化Akt的水平。除此之外，在用MNAR特異性siRNA轉染的細胞中觀察到Akt磷酸化的強烈減弱，但是在用非特異siRNA轉染的細胞中未觀察到減弱。這些結果與用MNAR表達質粒轉染的細胞中檢測到的與用空載體轉染的細胞相比磷酸化Akt水平強烈增加一致。這些資料表明MNAR調節(jié)對雌二醇作出反應的Akt磷酸化水平。
為確定增加的Akt磷酸化是否導致其活化，用空載體或用于MNAR過表達的質粒轉染MCF-7細胞。轉染后48小時，用雌二醇處理細胞20分鐘或不處理，然后收獲細胞并用抗Akt抗體免疫沉淀Akt。使用從GSK-3衍生的多肽底物用沉淀的Akt進行激酶反應。眾所周知，激活的Akt磷酸化GSK-3。使用蛋白質印跡分析法分析GSK-3的磷酸化水平。該實驗的結果證明，MNAR過表達刺激雌二醇誘導的Akt活化。
總之，這些資料證明MNAR在對雌二醇作出反應的PI3/Akt激酶通路的激活中發(fā)揮重要作用。通過相互作用和VDR/MNAR/p85三元復合物形成，從通過vDR的PI3/Akt激酶信號中預期得到同樣的結果。
本發(fā)明的范圍不受本文所述特定實施方案的限制。的確，除本文所述那些之外，來自前面描述和附圖的本發(fā)明的多種修改對于本領域技術人員而言是顯而易見的。此類修改意在落入后附權利要求的范圍之內。
還應該理解，所有的數值為近似的，并為描述而提供。
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序列表<110>惠氏公司(WYETH)<120>產生或篩選調節(jié)類固醇激素受體的配體的功能性方法<130>2200916-WO0<150>60/548,352<151>2004-02-27<160>8<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>4604<212>DNA<213>人<400>1ggaacagctt gtccacccgc cggccggacc agaagccttt gggtctgaag tgtctgtgag60acctcacaga agagcacccc tgggctccac ttacctgccc cctgctcctt cagggatgga 120ggcaatggcg gccagcactt ccctgcctga ccctggagac tttgaccgga acgtgccccg 180gatctgtggg gtgtgtggag accgagccac tggctttcac ttcaatgcta tgacctgtga 240aggctgcaaa ggcttcttca ggcgaagcat gaagcggaag gcactattca cctgcccctt 300caacggggac tgccgcatca ccaaggacaa ccgacgccac tgccaggcct gccggctcaa 360acgctgtgtg gacatcggca tgatgaagga gttcattctg acagatgagg aagtgcagag 420gaagcgggag atgatcctga agcggaagga ggaggaggcc ttgaaggaca gtctgcggcc 480caagctgtct gaggagcagc agcgcatcat tgccatactg ctggacgccc accataagac 540ctacgacccc acctactccg acttctgcca gttccggcct ccagttcgtg tgaatgatgg 600tggagggagc catccttcca ggcccaactc cagacacact cccagcttct ctggggactc 660ctcctcctcc tgctcagatc actgtatcac ctcttcagac atgatggact cgtccagctt 720ctccaatctg gatctgagtg aagaagattc agatgaccct tctgtgaccc tagagctgtc 780ccagctctcc atgctgcccc acctggctga cctggtcagt tacagcatcc aaaaggtcat 840tggctttgct aagatgatac caggattcag agacctcacc tctgaggacc agatcgtact 900gctgaagtca agtgccattg aggtcatcat gttgcgctcc aatgagtcct tcaccatgga 960cgacatgtcc tggacctgtg gcaaccaaga ctacaagtac cgcgtcagtg acgtgaccaa 1020agccggacac agcctggagc tgattgagcc cctcatcaag ttccaggtgg gactgaagaa 1080
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Leu Pro Gly Leu Leu Thr Ser Leu Leu Gly Leu Arg Pro Glu Cys Glu180 185 190Gln Ser Ala Leu Glu Gly Met Lys Ala Cys Met Thr Tyr Phe Pro Arg195 200 205Ala Cys Gly Ser Leu Lys Gly Lys Leu Ala Ser Phe Phe Leu Ser Arg210 215 220Val Asp Ala Leu Ser Pro Gln Leu Gln Gln Leu Ala Cys Glu Cys Tyr225 230 235 240Ser Arg Leu Pro Ser Leu Gly Ala Gly Phe Ser Gln Gly Leu Lys His245 250 255Thr Glu Ser Trp Glu Gln Glu Leu His Ser Leu Leu Ala Ser Leu His260 265 270Thr Leu Leu Gly Ala Leu Tyr Glu Gly Ala Glu Thr Ala Pro Val Gln275 280 285Asn Glu Gly Pro Gly Val Glu Met Leu Leu Ser Ser Glu Asp Gly Asp290 295 300Ala His Val Leu Leu Gln Leu Arg Gln Arg Phe Ser Gly Leu Ala Arg305 310 315 320Cys Leu Gly Leu Met Leu Ser Ser Glu Phe Gly Ala Pro Val Ser Val325 330 335Pro Val Gln Glu Ile Leu Asp Phe Ile Cys Arg Thr Leu Ser Val Ser340 345 350Ser Lys Asn Ile Ser Leu His Gly Asp Gly Pro Leu Arg Leu Leu Leu355 360 365Leu Pro Ser Ile His Leu Glu Ala Leu Asp Leu Leu Ser Ala Leu Ile370 375 380Leu Ala Cys Gly Ser Arg Leu Leu Arg Phe Gly Ile Leu Ile Gly Arg385 390 395 400Leu Leu Pro Gln Val Leu Asn Ser Trp Ser Ile Gly Arg Asp Ser Leu
405 410 415Ser Pro Gly Gln Glu Arg Pro Tyr Ser Thr Val Arg Thr Lys Val Tyr420 425 430Ala Ile Leu Glu Leu Trp Val Gln Val Cys Gly Ala Ser Ala Gly Met435 440 445Leu Gln Gly Gly Ala Ser Gly Glu Ala Leu Leu Thr His Leu Leu Ser450 455 460Asp Ile Ser Pro Pro Ala Asp Ala Leu Lys Leu Arg Ser Pro Arg Gly465 470 475 480Ser Pro Asp Gly Ser Leu Gln Thr Gly Lys Pro Ser Ala Pro Lys Lys485 490 495Leu Lys Leu Asp Val Gly Glu Ala Met Ala Pro Pro Ser His Arg Lys500 505 510Gly Asp Ser Asn Ala Asn Ser Asp Val Cys Ala Ala Ala Leu Arg Gly515 520 525Leu Ser Arg Thr Ile Leu Met Cys Gly Pro Leu Ile Lys Glu Glu Thr530 535 540His Arg Arg Leu His Asp Leu Val Leu Pro Leu Val Met Gly Val Gln545 550 555 560Gln Gly Glu Val Leu Gly Ser Ser Pro Tyr Thr Ser Ser Arg Cys Arg565 570 575Arg Glu Leu Tyr Cys Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Pro Ser Pro580 585 590Arg Cys Pro Pro Pro Leu Ala Cys Ala Leu Gln Ala Phe Ser Leu Gly595 600 605Gln Arg Glu Asp Ser Leu Glu Val Ser Ser Phe Cys Ser Glu Ala Leu610 615 620Val Thr Cys Ala Ala Leu Thr His Pro Arg Val Pro Pro Leu Gln Pro625 630 635 640
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Glu Lys Glu Gln Asp Asp Thr Ala Ala Met Leu Ala Asp Phe Ile1100 1105 1110Asp Cys Pro Pro Asp Asp Glu Lys Pro Pro Pro Pro Thr Glu Pro1115 1120 1125Asp Ser1130<210>5<211>498<212>DNA<213>人<400>5cgcagccacc gagacaccat gagagccctc acactcctcg ccctattggc cctggccgca 60ctttgcatcg ctggccaggc aggtgcgaag cccagcggtg cagagtccag caaaggtgca120gcctttgtgt ccaagcagga gggcagcgag gtagtgaaga gacccaggcg ctacctgtat180caatggctgg gagccccagt cccctacccg gatcccctgg agcccaggag ggaggtgtgt240gagctcaatc cggactgtga cgagttggct gaccacatcg gctttcagga ggcctatcgg300cgcttctacg gcccggtcta gggtgtcgct ctgctggcct ggccggcaac cccagttctg360ctcctctcca ggcacccttc tttcctcttc cccttgccct tgccctgacc tcccagccct420atggatgtgg ggtccccatc atcccagctg ctcccaaata aactccagaa gaggaatctg480aaaaaaaaaa aaaaaaaa 498<210>6<211>100<212>PRT<213>人<400>6Met Arg Ala Leu Thr Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu Cys1 5 10 15Ile Ala Gly Gln Ala Gly Ala Lys Pro Ser Gly Ala Glu Ser Ser Lys20 25 30Gly Ala Ala Phe Val Ser Lys Gln Glu Gly Ser Glu Val Val Lys Arg35 40 45Pro Arg Arg Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro
50 55 60Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys65 70 75 80Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe85 90 95Tyr Gly Pro Val100<210>7<211>2415<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>7cacggcgctc cttagggcca ccgctcggcg cgccgggaca gaccctcccc actcctgcct 60gcaggatcgg aacgtcaatt aacggctgac actgcccccc acctcttccc acccatctgg 120gctccagcga ggaacggatc tcggggtaca ccatgatctt gccattttta gtactggcca 180tcggaccctg ccttaccaac tcatttgtgc cagagaaaga gaaagacccc agttactggc 240gacagcaagc ccaagagacc ttgaaaaatg ccctgaaact ccaaaaactc aacaccaacg 300tggccaagaa catcatcatg ttcctgggag atggtatggg cgtctccaca gtgacagctg 360cccgcatcct taagggccag ctacaccaca acacgggcga ggagacacgg ctggagatgg 420acaagttccc ctttgtggct ctctccaaga cgtacaacac caacgctcag gtccccgaca 480gcgcgggcac tgccactgcc tacttgtgtg gcgtgaaggc caacgagggc accgtgggag 540tgagcgcggc cactgagcgc acgcgatgca acaccactca ggggaacgag gtcacgtcca 600tcctgcgctg ggccaaggat gctgggaagt ccgtgggcat cgtgaccacc actcgggtga 660accacgccac tcccagtgca gcctatgcgc actcggccga tcgggactgg tactcggaca 720atgagatgcg cccagaggct ctgagccagg gctgcaagga catcgcctat cagctaatgc 780acaacatcaa ggacatcgat gtgatcatgg gtggtggccg gaagtacatg taccccaaga 840acagaactga tgtggaatat gaactggatg agaaggccag gggcaccaga ctggatggcc 900tggacctcat cagcatttgg aagagcttca aacctagaca caagcactcc cactatgtct 960ggaaccgcac tgaactgctg gcccttgacc cctccagggt ggactacctc ttaggtctct1020ttgagcccgg ggacatgcag tatgagttga atcggaacaa cctgactgac ccttccctct1080cggagatggt ggaggtggcc ctccggatcc tgacaaagaa tcccaaaggc ttcttcttgc1140
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20 25 30Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr35 40 45Asn Val Ala Lys Asn Ile Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val50 55 60Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn65 70 75 80Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala85 90 95Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly100 105 110Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val115 120 125Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly130 135 140Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser145 150 155 160Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala165 170 175Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met180 185 190Arg Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu195 200 205Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys210 215 220Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu225 230 235 240Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp245 250 255
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485 490 495Cys Ala Trp Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu500 505 510Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Arg Thr Leu515 520
權利要求
1.鑒定調節(jié)MNAR與維生素D3受體相互作用的配體的方法，其中方法包括(a)使測試化合物與反應混合物接觸，其中所述反應混合物包含(i)含第五個LXXLL模體的MNAR多肽；和(ii)含配體結合結構域的維生素D3受體多肽，其中反應混合物條件允許MNAR多肽與維生素D3受體多肽結合形成結合復合物；(b)檢測在測試化合物存在條件下反應混合物中結合復合物形成的水平；(c)比較測試化合物存在條件下所形成的結合復合物的水平與該測試化合物缺乏條件下所形成的結合復合物的水平，其中在測試化合物存在條件下所形成的結合復合物水平的增加表示測試化合物可為先導化合物。
2.權利要求1的方法，其中MNAR多肽包含SEQ ID NO4所列氨基酸序列。
2.權利要求1的方法，其中反應混合物是基于細胞的。
3.權利要求1的方法，其中反應混合物是無細胞的。
4.權利要求1的方法，其中MNAR多肽包含最小的LXXLL模體5號。
5.權利要求1的方法，其中方法還包括檢測測試化合物與維生素D3受體多肽的結合。
6.鑒定在MNAR與維生素D3受體相互作用時調節(jié)維生素D3受體活性的配體的方法，其中方法包括(a)使測試化合物與反應混合物接觸，其中所述反應混合物包含(i)MNAR多肽；和(ii)包含功能性維生素D3受體多肽的宿主細胞，其中反應混合物條件允許MNAR多肽與維生素D3受體結合形成結合復合物；(b)檢測在測試化合物存在條件下反應混合物中維生素D3受體的活性；(c)比較測試化合物存在條件下的活性水平與所述化合物缺乏條件下的活性水平，其中測試化合物存在條件下活性水平的增加表明測試化合物可為調節(jié)VDR活性的配體。
7.權利要求6的方法，其中MNAR多肽包含SEQ ID NO4所列氨基酸序列。
8.權利要求6的方法，其中MNAR多肽包含LXXLL模體5號。
9.權利要求6的方法，其中方法還包括檢測測試化合物與維生素D3受體多肽的結合。
10.權利要求6的方法，其中宿主細胞為骨肉瘤細胞。
11.權利要求10的方法，其中骨肉瘤細胞為UMR 106細胞或ROS17/2.8細胞。
12.權利要求6的方法，其中所檢測的活性是Erk 1或Erk 2激酶的磷酸化。
13.權利要求6的方法，其中所檢測的活性是通過維生素D3受體激活誘導的基因的表達。
14.權利要求13的方法，其中基因為骨鈣蛋白或堿性磷酸酶基因。
15.權利要求14的方法，其中基因為具有SEQ ID NO5所列核苷酸序列或者與SEQ ID NO5所列核苷酸序列雜交的核苷酸序列的骨鈣蛋白基因。
16.權利要求14的方法，其中基因為具有SEQ ID NO7所列核苷酸序列或者與SEQ ID NO7所列核苷酸序列雜交的核苷酸序列的堿性磷酸酶基因。
17.調節(jié)細胞中VDR配體依賴性活性的方法，其包括使MNAR多肽與反應混合物接觸，其中所述反應混合物包含(i)包含功能性維生素D3受體多肽的宿主細胞；和(ii)維生素D3配體，其中，與在MNAR多肽缺乏條件下反應混合物中維生素D3受體的活性相比，在MNAR多肽存在條件下反應混合物中維生素D3受體的活性是不同的。
18.權利要求17的方法，其中宿主細胞為骨肉瘤細胞。
19.權利要求18的方法，其中骨肉瘤細胞為UMR 106細胞或ROS17/2.8細胞。
20.權利要求17的方法，其中所檢測的活性是Erk 1或Erk 2激酶的磷酸化。
21.權利要求17的方法，其中所檢測的活性是通過維生素D3受體激活誘導的基因表達的增加。
22.權利要求21的方法，其中基因為骨鈣蛋白或堿性磷酸酶基因。
23.權利要求22的方法，其中基因為具有SEQ ID NO5所列核苷酸序列或者與SEQ ID NO5所列核苷酸序列雜交的核苷酸序列的骨鈣蛋白基因。
24.權利要求22的方法，其中基因為具有SEQ ID NO7所列核苷酸序列或者與SEQ ID NO7所列核苷酸序列雜交的核苷酸序列的堿性磷酸酶基因。
25.包含MNAR的LXXLL模體5號和可檢測標記的肽，其中肽為MNAR的片段。
26.權利要求25的肽，其中肽為LPGLLTSLL。
27.權利要求25的肽，其中標記為生物素。
28.包含權利要求1所述組分的組合物。
29.鑒定通過VDR受體調節(jié)信號的配體的方法，其中方法包括(a)使測試化合物與反應混合物接觸，該反應混合物包含(i)含第五個LXXLL模體的MNAR多肽；(ii)含配體結合結構域的維生素D3受體多肽；和(iii)功能性cSrc或PI3激酶；其中反應混合物條件允許MNAR多肽與維生素D3受體多肽和cSrc或PI3激酶結合形成三元復合物；(b)檢測在測試化合物存在條件下反應混合物中三元復合物形成的水平；(c)比較在測試化合物存在條件下所形成的三元復合物的水平與在該測試化合物缺乏條件下所形成的結合復合物的水平，其中在測試化合物存在條件下所形成的三元復合物水平的增加表示測試化合物可為先導化合物。
30.鑒定在MNAR與維生素D3受體相互作用時調節(jié)維生素D3受體活性的配體的方法，其中方法包括(a)使測試化合物與反應混合物接觸，其中所述反應混合物包含(i)MNAR多肽；和(ii)包含功能性維生素D3受體多肽和功能性cSrc或PI3激酶的宿主細胞，其中反應混合物條件允許MNAR多肽與維生素D3受體以及cSrc或PI3激酶結合形成三元復合物；(b)檢測測試化合物存在條件下反應混合物中維生素D3受體的活性；(c)比較測試化合物存在條件下的活性水平與所述測試化合物缺乏條件下的活性水平，其中在測試化合物存在條件下活性水平的增加表明測試化合物可為調節(jié)VDR活性的配體。
31.權利要求30的方法，其中激酶為PI3激酶。
32.權利要求31的方法，其中所檢測的活性為Akt激酶的磷酸化。
全文摘要
本申請顯示了核激素配體激活受體超家族成員維生素D3受體(VDR)與支架蛋白MNAR相互作用的發(fā)現。特別是在成骨細胞中，該相互作用導致了VDR、MNAR和酪氨酸激酶家族的Src或PI3激酶形成三元復合物而介導細胞信號。
文檔編號G01N33/567GK1946737SQ200580013242
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權日2004年2月27日
發(fā)明者F·巴萊塔, G·奧唐奈, B·J·切斯基斯 申請人:惠氏公司