專利名稱：樣品遞呈裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于進(jìn)行分析測(cè)定的樣品遞呈裝置。此外，本發(fā)明涉及樣品遞呈裝置的制造和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
包括樣品的某種化學(xué)和生物學(xué)分析的大多數(shù)科學(xué)領(lǐng)域需要研究人員能夠鑒定和測(cè)定在水溶液中發(fā)現(xiàn)的化合物或分析物(如測(cè)定血漿中的蛋白質(zhì)或測(cè)定流體徑流中的殺蟲(chóng)劑)。在本文中，分析物通常指研究人員感興趣的液體樣品的組分。一般用容器(如試管、多孔板或比色皿)或其它遞呈裝置(如載玻片或生物芯片)的方式將含有分析物的液體樣品遞呈給分析測(cè)定設(shè)備。由于人們對(duì)快速測(cè)定大量樣品(稱為樣品的″高通量″測(cè)定)最感興趣，所以開(kāi)發(fā)可用于與自動(dòng)分析設(shè)備連接的標(biāo)準(zhǔn)化容器和裝置吸引了大量關(guān)注。例如，在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，對(duì)篩選候選藥物感興趣的研究人員常常用各種分析技術(shù)(如熒光偏振檢測(cè))篩選成千上萬(wàn)、甚至幾百萬(wàn)可能的候選藥物，其中許多技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)的384孔板來(lái)容納含有候選藥物的樣品溶液。因此，樣品遞呈裝置是許多科學(xué)領(lǐng)域中研究人員分析設(shè)備中非常重要的組件，這些科學(xué)領(lǐng)域包括基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)、臨床診斷以及環(huán)境或生物毒素或物質(zhì)的分析(如評(píng)價(jià)環(huán)境污染和篩選可能用于生物恐怖主義的物質(zhì))。
在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中，例如，焦點(diǎn)分別是鑒定和研究DNA/RNA和蛋白質(zhì)/肽。這些領(lǐng)域總地涉及活生物體中化學(xué)和生物部分的系統(tǒng)研究、它們的相互作用以及區(qū)分它們所需的分析技術(shù)。當(dāng)前生物和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的主要關(guān)注點(diǎn)是理解復(fù)雜的生命系統(tǒng)，而非單個(gè)細(xì)胞組件。具體說(shuō)，基因組學(xué)的主要目的是測(cè)序和產(chǎn)生整個(gè)生物體的基因內(nèi)容的大型數(shù)據(jù)庫(kù)。已經(jīng)編譯了細(xì)菌、酵母、線蟲(chóng)、果蠅和人(最近)的基因組。類似地，蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞在特定時(shí)間表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的研究，其主要目的是獲得部分蛋白質(zhì)氨基酸序列，其可與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配工具一起使用來(lái)鑒定整個(gè)蛋白質(zhì)(與完全測(cè)序蛋白質(zhì)相反)。蛋白質(zhì)的鑒定使得人們能夠研究蛋白質(zhì)表達(dá)(對(duì)于鑒定在不同條件下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和疾病狀態(tài)的生物標(biāo)記很重要)以及研究蛋白質(zhì)相互作用(這能幫助建立細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖)。理解蛋白質(zhì)的作用對(duì)我們理解生命系統(tǒng)很重要，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生物物質(zhì)的主要組分，并且基本上進(jìn)行了所有的重要生物功能(從調(diào)節(jié)反應(yīng)到運(yùn)輸氧氣)，以提供細(xì)胞和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。如基因組學(xué)一樣，蛋白質(zhì)組學(xué)這一急速發(fā)展的領(lǐng)域產(chǎn)生了關(guān)于人類和其它生物的蛋白質(zhì)組的信息，雖然這些信息仍然不完整，但將大多數(shù)這些信息儲(chǔ)存于或?qū)?chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中。預(yù)計(jì)未來(lái)我們對(duì)生命系統(tǒng)的大部分理解都來(lái)自這些基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。
在臨床診斷領(lǐng)域，研究人員關(guān)注多種分析物的鑒定和測(cè)定。感興趣的分析物可以是實(shí)際候選藥物，例如臨床試驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行的生物利用度研究，其揭示出候選藥物在整個(gè)生物體中分布的程度?；蛘?，感興趣分析物可能反映對(duì)候選藥物的生理反應(yīng)，例如在測(cè)定存在或不存在激酶反應(yīng)的磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物的情況下。因?yàn)榧っ笇?duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖很重要，所以在患有生長(zhǎng)異常的疾病(如癌癥)的患者中觀察到激酶活性水平高。因此，導(dǎo)致激酶活性降低的藥物可能是抗癌藥物，檢測(cè)這些候選藥物的效力的分析方法常常關(guān)注于測(cè)定存在或不存在激酶反應(yīng)產(chǎn)物形式的分析物。在臨床診斷和藥物開(kāi)發(fā)中重要的直接和間接測(cè)定分析物的這些和其它方法依賴于有助于進(jìn)行檢測(cè)的分析技術(shù)和樣品遞呈裝置的存在。
樣品遞呈裝置的重要性絕不限于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。例如，對(duì)測(cè)定環(huán)境污染(或修復(fù))程度感興趣的研究人員需要能夠篩選所有種類的環(huán)境樣品，包括水、空氣和土壤樣品。用于分析這些樣品的許多分析技術(shù)包括對(duì)液體樣品的分析，比如進(jìn)行水質(zhì)研究時(shí)或用有機(jī)和/或無(wú)機(jī)溶劑稀釋以去除各種組分從而提取的土壤樣品的情況。因此，可遞呈用于分析的液體樣品的樣品遞呈裝置是完成這些分析測(cè)定的重要工具。
在9.11之后的世界上，政府需要有助于檢測(cè)化學(xué)和生物物質(zhì)的軍用和民用的平臺(tái)和分析技術(shù)。生物戰(zhàn)爭(zhēng)檢測(cè)的挑戰(zhàn)包括樣品采集和區(qū)分無(wú)毒與有毒生物體。用于生物物質(zhì)的現(xiàn)有戰(zhàn)場(chǎng)技術(shù)利用高溫分解將生物化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎觅|(zhì)譜(MS)較容易地檢測(cè)的小分子。然而，希望開(kāi)發(fā)一種依靠蛋白質(zhì)或肽生物標(biāo)記的技術(shù)，因?yàn)樗痊F(xiàn)有方法特異性更高，可用于與呼吸測(cè)試、尿檢或采血技術(shù)結(jié)合測(cè)定與戰(zhàn)爭(zhēng)物質(zhì)的潛在接觸。對(duì)獨(dú)立的生物傳感器如警報(bào)裝置用于戰(zhàn)場(chǎng)和公眾領(lǐng)域也有極大興趣。所有這些方法都對(duì)樣品采集、預(yù)處理和將樣品遞呈給檢測(cè)器提出了挑戰(zhàn)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種分析技術(shù)來(lái)鑒定和測(cè)定液體樣品中的感興趣化合物，如血清中的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽，環(huán)境樣品中的環(huán)境毒素和物質(zhì)。雖然各分析技術(shù)以其自身的方式應(yīng)用，但各自至少部分依賴于所用樣品遞呈裝置的類型。因此，這些裝置固有的限制可能負(fù)面影響用這些分析技術(shù)測(cè)定感興趣化合物。
而且，關(guān)注于鑒定、分離或測(cè)定液體樣品中分析物的許多分析技術(shù)需要對(duì)樣品進(jìn)行單獨(dú)的預(yù)處理步驟-即在對(duì)樣品用具體分析技術(shù)分析以測(cè)定感興趣分析物的存在和量之前處理樣品。例如，許多蛋白質(zhì)細(xì)胞提取技術(shù)產(chǎn)生復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，并摻入會(huì)干擾質(zhì)譜分析的去污劑和鹽，這些去污劑和鹽必須在分析該蛋白之前去除?，F(xiàn)有的制造和純化方法是耗時(shí)的。其它純化方法如用于純化蛋白的液相色譜和凝膠電泳，通?；厥盏臉悠敷w積大于10μL，在用各種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)(如MALDI-MS)分析之前需要額外的濃縮。現(xiàn)有分析技術(shù)的需求-和與其聯(lián)用的樣品遞呈裝置-強(qiáng)調(diào)了樣品純化、樣品制備、自動(dòng)數(shù)據(jù)采集和自動(dòng)數(shù)據(jù)分析的重要性。
例如，用于蛋白質(zhì)組學(xué)的最常見(jiàn)和優(yōu)選的質(zhì)譜類型是襯質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)。MALDI-MS是標(biāo)準(zhǔn)激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜的變型，其中在酸性、UV吸收性化學(xué)基質(zhì)(如煙酸)摩爾過(guò)量非常多的情況下，分子質(zhì)量相對(duì)高的蛋白質(zhì)沉積在表面上。此技術(shù)可以完整狀態(tài)解吸這些高分子量的不穩(wěn)定大分子。質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)組研究中的重要分析工具，因?yàn)樗灾械瘸杀咎峁┝松倭繕悠返臏?zhǔn)確質(zhì)量、靈敏的檢測(cè)和快速分析。
然而，MALDI-MS具有各種缺點(diǎn)，具體是與樣品制備相關(guān)的問(wèn)題。總之，當(dāng)今MALDI-MS樣品支持物有嚴(yán)重的樣品體積限制，因?yàn)樗鼈兣c超過(guò)2μL的樣品體積不相容。通常采用至多2μL的體積，該體積所產(chǎn)生干燥點(diǎn)(dried-droplet)的直徑為1mm-2mm。(Karas，M.和Hillenkamp，F(xiàn). Anal Chem.1988，60，2299-2301，納入本文作參考)。因?yàn)樵趩挝稽c(diǎn)數(shù)據(jù)采集期間激光僅照射干燥點(diǎn)的一小部分(0.015mm2-0.030mm2)，所以不能保證檢測(cè)到樣品中的所有蛋白。此外，樣品體積(至多2μL)顯著小于通常在純化后回收的樣品體積，必須在MALDI-MS之前進(jìn)一步濃縮它們；例如，通?；厥盏囊合嗌V和電泳方法純化的肽和蛋白質(zhì)樣品體積大于10μL。結(jié)果是，這些樣品必須在MALDI-MS之前進(jìn)一步濃縮。許多樣品也含有會(huì)干擾質(zhì)譜分析的去污劑和鹽，必須在MALDI-MS之前去除。
與MALDI-MS相關(guān)的另一缺點(diǎn)是缺少樣品均一性。干燥點(diǎn)方法用于樣品施加時(shí)，即使體積小至2μL也可產(chǎn)生樣品不均一引起的問(wèn)題。通常采用和干燥0.5-2.0μL的樣品體積，它能提供直徑為1-2mm的干燥點(diǎn)。(Karas，M.和Hillenkamp，F(xiàn).Anal.Chem.1988，60，2299-2301，納入本文作參考)。結(jié)果，在單位點(diǎn)數(shù)據(jù)采集期間激光僅照射了一小部分干燥點(diǎn)(0.015mm2-0.030mm2)。不幸的是，已知即使0.5-2.0μL的小體積也導(dǎo)致樣品不均一(分析物的不均一沉積)，這導(dǎo)致當(dāng)激光聚焦于干燥點(diǎn)的不同區(qū)域上時(shí)，峰的出現(xiàn)、強(qiáng)度、分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性顯著不同(Strupat，K.；Karas，M.；Hillenkamp，F(xiàn).Int′l.J.Mass Spectrom.Ion Processes 1991，111，89-102；Cohen，S.L.和Chait，B.T.Anal.Chem.1996，68，31-37；和Amado，F(xiàn).M.L.；Domingues，P.；Santana-Marques，M.G；Ferrer-Correia，A.J.；Tomer，K.B.Rapid Commun.MassSpectrom.1997，11，1347-1352，將所有這些文獻(xiàn)納入本文作參考)。這些現(xiàn)象使得需要嚴(yán)格檢查質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及為每個(gè)樣品累積大量單位點(diǎn)譜圖。因此，每天每臺(tái)設(shè)備僅可分析幾百個(gè)樣品，常常排除了自動(dòng)數(shù)據(jù)采集。
已證明，在點(diǎn)直徑降低到激光直徑的數(shù)量級(jí)時(shí)可最大程度降低樣品不均一的問(wèn)題。在這種情況下，可同時(shí)照射大部分樣品，改進(jìn)了靈敏度和重現(xiàn)性(Little，D.P；Cornish，T.J.；ODonnell，M.J.；Braun，A.；Cotter，R.J.；Koster，H.Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.1997，69，4540-4546；和Gobom，J.；Nordhoff，E.；Mirgorodskaya，E.；Ekman，R.；Roepstorff，P.J.Mass Spectrom.1999，34，105-116，納入本文作參考)。進(jìn)一步描述了美國(guó)專利號(hào)6,287,872所述的樣品支持物(Schuerenberg，M.；Lubbert，C；Eickhoff，H.；Kalkum，M.；Lehrach，H；Nordhoff，E.Anal.Chem.2000，72，3436-3442，納入本文作參考)，其中證明，將分析物的沉積限定在小的點(diǎn)直徑不僅降低了樣品不均一相關(guān)的問(wèn)題，而且使檢測(cè)靈敏度顯著提高。其缺點(diǎn)是獲得此所需點(diǎn)大小的問(wèn)題，必須將樣品體積降低到2μL以下。
為克服這些樣品體積和雜質(zhì)問(wèn)題，研究人員采用設(shè)計(jì)的樣品支持物或用于預(yù)處理樣品的小柱。這種樣品支持物的例子是購(gòu)自Bruker Daltonics GmbH的AnchorChipTM。AnchorChipTM產(chǎn)品通過(guò)在精確限定的位置中濃縮樣品而提高M(jìn)ALDI-MS靈敏度，其特別包括一薄層不可潤(rùn)濕的疏水材料，該材料攜帶了一排可潤(rùn)濕親水點(diǎn)。與使用AnchorChipTM相關(guān)的主要限制是施加于各錨點(diǎn)的液體樣品體積需要限于0.50μL-3.0μL(在AnchorChipTM靶點(diǎn)上制備樣品的十一條通用規(guī)則(ElevenGeneral Rules for Sample Preparation on AnchorChipTMTargets)的第一條，參見(jiàn)AnchorChipTMTechnology，修訂版1.6，Bruker Daltonics GmbH，2000年11月，納入本文作參考)；生產(chǎn)商在產(chǎn)品文獻(xiàn)中提供的例子將液體樣品滴體積進(jìn)一步限制為0.5μL或1.0μL。另一限制是分析物和污染物(鹽、去污劑)常常在激光照射區(qū)得到濃縮。因此，首先必須在ZipTip或相似小柱樣品制備裝置上對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽和/或濃縮，然后才能將樣品施加在質(zhì)譜樣品支持物上，如上所述。(ZipTips由Millipore Corp.生產(chǎn)，它是用反向色譜介質(zhì)包裝小移液器尖頭制備的用于樣品濃縮和脫鹽的微柱。(Rusconi，F(xiàn).；Schmitter，J.-M.；Rossier，J.；Ie Maire，M.Anal Chem.1998，70，3046-3052，納入本文作參考))。然而，采用自制微柱或市售ZipTips非常耗時(shí)，這增加了相當(dāng)大的成本，經(jīng)證明其難以自動(dòng)化并常常僅能中度回收樣品材料。因此，AnchorChipsTM具有與其它現(xiàn)有MALDI-MS樣品支持物相關(guān)的許多相同限制。
開(kāi)發(fā)了MALDI-MS的替代技術(shù)，以進(jìn)行血清樣品的蛋白質(zhì)特征分析。此技術(shù)稱為表面增強(qiáng)的激光解吸電離質(zhì)譜(SELDI-MS)，它在發(fā)現(xiàn)卵巢癌以及區(qū)分前列腺癌和良性前列腺增生的生物標(biāo)記中已產(chǎn)生結(jié)果。在SELDI-MS期間，首先在具有用作親和力捕獲裝置的功能化表面的樣品支持物上選擇性保留分析物。然后在捕獲點(diǎn)用激光解吸使保留的分析物電離，以便在不影響從保留(retentive)表面上回收分析物的情況下檢測(cè)分析物，正如其它歸化(hyphenated)液相色譜-質(zhì)譜方法所需要的那樣。SELDI-MS參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,719,060；5,894,063；6,020,208；6,027,942；6,124,137；6,225,047和6,579,719，將所有文獻(xiàn)納入本文作參考。雖然最近報(bào)道了一些結(jié)果，但SELDI-MS法在實(shí)施中常常有問(wèn)題，因?yàn)樵诩す饨馕婋x期間，對(duì)保留生物分析物而言最佳的表面可能對(duì)于分析物遞呈而言并非最佳。
采用了用于分離和純化分析物如蛋白質(zhì)的其它技術(shù)。例如，通過(guò)耗時(shí)的技術(shù)-2D凝膠電泳和多維液相色譜制造和純化生物樣品的方法是熟知的，較快的低靈敏度技術(shù)如自耗柱或移液器尖頭與色譜床也是熟知的。用于分離蛋白質(zhì)混合物的凝膠電泳可以是一維或二維。在1D凝膠電泳，也稱為SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)中，僅用分子量分離蛋白質(zhì)混合物。在2D凝膠電泳，也稱為2D-PAGE中，通過(guò)等電點(diǎn)、然后是分子量來(lái)分離混合物。該技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是該方法的分辨率差，即各解析點(diǎn)可能含有一種以上的蛋白質(zhì)。另一缺點(diǎn)是用于觀察分離的染料不染所有蛋白質(zhì)。如果采用一個(gè)以上的色譜柱，液相色譜(LC)就稱為″高效液相色譜″(HPLC)或″多維液相色譜″。LC的優(yōu)點(diǎn)通常是可獲得多種不同的柱化學(xué)。與凝膠電泳(不能有效分離較小的肽)相反，可用LC分離肽混合物與酶消化物。固相抽提(SPE)提供了快速純化方式，它用于許多領(lǐng)域，從有機(jī)合成到環(huán)境樣品采集。它比液-液抽提或HPLC快，它消耗的溶劑較少，可用于從氣體或液體樣品中抽提分離物。許多裝置中提供了SPE技術(shù)，如移液器尖頭、柱、膜和384孔板等。
在藥物發(fā)現(xiàn)中，開(kāi)發(fā)了用于已知分析方法的又一樣品遞呈裝置。例如，采用Empore卡(http://www.3m.com/empore)、嵌入膜中的C18 RP(反向)吸附劑的ADMET(吸收分布代謝排泄毒理學(xué))研究被認(rèn)為能夠減少樣品純化的步驟并降低存檔和濃縮的可能性，因?yàn)榧虞d的樣品保持干燥。樣品純化需要三個(gè)步驟將樣品加載到卡上，將該卡轉(zhuǎn)移到洗脫器中，將100％樣品直接洗脫到質(zhì)譜儀中。如果洗脫體積保持得盡可能低，可用Empore卡將肽消化樣品加載到MS上，否則低濃度肽低于檢測(cè)限度。
因此，需要可與各種分析方法聯(lián)用以高靈敏地檢測(cè)生物和化學(xué)部分的樣品遞呈裝置。而且，需要與通常用液相色譜和電泳分離以及其它類型的分離/純化技術(shù)回收的樣品體積相容的樣品遞呈裝置，該裝置將含有分析物的液體樣品引導(dǎo)到限定區(qū)域以最大程度減少與樣品不均一相關(guān)的問(wèn)題，該裝置導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度增加。這種樣品遞呈裝置的可用性會(huì)使得能夠進(jìn)行自動(dòng)化樣品處理，例如，生命科學(xué)工業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)多孔板處理器和液體處理機(jī)器人。更重要地，它們也能夠直接采集色譜洗出液，然后對(duì)其進(jìn)行MALDI-MS分析。而且，這些能力加總起來(lái)能增加用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種分析技術(shù)對(duì)生物和化學(xué)部分進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)定的通量。以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其它益處。
發(fā)明概述本發(fā)明樣品遞呈裝置提供了用于鑒定化學(xué)和生物實(shí)體的各種分析方法所用的已知樣品遞呈裝置的有吸引力的替代方式。此外，本發(fā)明提供了制備樣品遞呈裝置的方法以及用它們對(duì)液體樣品中所含分析物進(jìn)行各種分析測(cè)定的方法。本發(fā)明樣品遞呈裝置的獨(dú)特特性解決了與已知分析技術(shù)相關(guān)的以及與其聯(lián)用的樣品遞呈裝置或容器的許多缺點(diǎn)(上述)。
在諸如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)、臨床診斷、生物傳感器和環(huán)境毒素和物質(zhì)的檢測(cè)等領(lǐng)域中，質(zhì)譜是用于鑒定化學(xué)和生物部分的技術(shù)，其中常常僅有非常少量的樣品可用，希望能夠快速高通量篩選大量樣品。其它分析物檢測(cè)方法如熒光偏振、免疫熒光光譜、凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜也可用于高通量檢測(cè)生物和化學(xué)部分，因此也可與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用。
本發(fā)明樣品遞呈裝置提供了用于各種分析方法的已知樣品遞呈裝置的有吸引力的替代方式。例如，本發(fā)明允許選擇性保留分析物并將體積高達(dá)100μL的分析物濃縮在生物芯片表面上。此外，因?yàn)樵诮?jīng)設(shè)計(jì)基本不結(jié)合或抵抗結(jié)合(分析物)的樣品遞呈裝置的一部分上檢測(cè)分析物，與在基于生物芯片的親和力捕獲裝置或裝置表面與分析物具有顯著親和力的其它樣品遞呈裝置的表面上進(jìn)行直接檢測(cè)相比，該這種可以高靈敏度檢測(cè)分析物。
本發(fā)明還最大程度降低了與將分析物從一個(gè)表面轉(zhuǎn)移到另一個(gè)表面上帶來(lái)的可能損失，因?yàn)樵趦?yōu)選實(shí)施方式中，現(xiàn)有樣品遞呈裝置僅需要一次液體操作。這一點(diǎn)，再加上該樣品遞呈裝置表面的抵抗分析物特性，使在已知方法中發(fā)生的感興趣分析物的損失降低。與SELDI-MS相反，本發(fā)明不包括使親和力捕獲裝置的捕獲點(diǎn)上結(jié)合的分析物解吸，而采用從分析物與其表面的親和或結(jié)合不可檢測(cè)的表面上解吸分析物的樣品遞呈裝置。
此外，可以可控方式操作液體樣品并將其移動(dòng)到本發(fā)明樣品遞呈裝置表面上。這允許將樣品濃縮到分析物基本不結(jié)合于樣品遞呈裝置表面的分析區(qū)。而且，這允許將含有分析物的樣品轉(zhuǎn)移到表面上的不同區(qū)中，各區(qū)對(duì)分析物的特性不同，允許在檢測(cè)之前純化、分離和/或修飾分析物。此外，本發(fā)明包括表面上各個(gè)部分的特性可以因各種化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射)而改變的樣品遞呈裝置，以便在樣品處理期間操縱這些表面對(duì)分析物的特性。可將表面特性的這些改變?cè)O(shè)計(jì)為可逆或不可逆的。
以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明樣品遞呈裝置的這些和其它特征。本發(fā)明包括樣品遞呈裝置、制造樣品遞呈裝置的方法和使用樣品遞呈裝置的方法。
樣品遞呈裝置本發(fā)明涉及用于進(jìn)行分析測(cè)定的樣品遞呈裝置。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括樣品遞呈裝置，它具有對(duì)于待分析各種樣品的潤(rùn)濕性不同的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的表面。這些潤(rùn)濕性不同的區(qū)域產(chǎn)生保留、濃縮和移動(dòng)液體樣品中分析物的能力不同的區(qū)域。這些區(qū)域可以是各種形狀和大小，可以互相連續(xù)或不連續(xù)。
本發(fā)明樣品遞呈裝置可由不同區(qū)域構(gòu)成，其中一個(gè)是保留液體樣品最佳的區(qū)域。本發(fā)明樣品遞呈裝置還可包括不同的潤(rùn)濕性區(qū)域，其中一個(gè)是高靈敏檢測(cè)分析物最佳的區(qū)域。
本發(fā)明樣品遞呈裝置可包括二維或三維表面，各表面具有潤(rùn)濕性不同的兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
本發(fā)明樣品遞呈裝置包括基片，基片可由各種材料制成，包括但不限于(例如)玻璃、半導(dǎo)體、金屬、聚合物(如塑料)和其它羥化材料，如硅上的SiO2、鋁上的Al2O3等。該基片優(yōu)選為金屬如金，或半導(dǎo)體如硅。
本發(fā)明樣品遞呈裝置還包括用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行表面修飾的基片，以在該基片表面產(chǎn)生各種區(qū)域，這些區(qū)域具有不同的潤(rùn)濕性特性。這種表面修飾包括但不限于將自身組裝單層(SAM)、聚合物(直鏈和支鏈)和L-B(Langmuir-Blodgett)組合體加在基片上。以SAM為例，當(dāng)加在基片上時(shí)，SAM產(chǎn)生可接觸液體樣品的樣品遞呈裝置表面。根據(jù)所用具體SAM的組成，本發(fā)明樣品遞呈裝置表面對(duì)液體樣品中的分析物可具有不同的潤(rùn)濕性和親和力(或缺少潤(rùn)濕性和親和力)特性。SAM可加在本發(fā)明樣品遞呈裝置上，以產(chǎn)生其特性反映出具體區(qū)域所用SAM的不同區(qū)域。本發(fā)明也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它表面修飾技術(shù)。
對(duì)于樣品遞呈裝置表面可包括的區(qū)域類型，主要根據(jù)它們對(duì)待分析樣品的不同潤(rùn)濕性來(lái)表征它們，這進(jìn)而產(chǎn)生保留或結(jié)合液體樣品中分析物的能力不同的區(qū)域。這些區(qū)域廣義上稱為″邊界區(qū)″、″液體保留區(qū)″和″分析區(qū)″。本發(fā)明僅需要存在兩種類型的區(qū)域，但是也考慮了包括兩種以上類型的區(qū)域。本發(fā)明也可包括各類型的一個(gè)以上區(qū)域-如，樣品遞呈裝置可包括多個(gè)液體保留區(qū)，各自對(duì)液體樣品和/或其中所含分析物的特性不同。
第一種類型的區(qū)域稱為″邊界區(qū)″，包括對(duì)待分析樣品基本不可潤(rùn)濕的區(qū)域。該邊界區(qū)是與其它區(qū)域相比對(duì)樣品的接觸角最高的區(qū)域。
第二種類型的區(qū)域稱為″液體保留區(qū)″，與邊界區(qū)相比，它對(duì)待分析樣品的潤(rùn)濕性相對(duì)較高(相對(duì)低于分析區(qū)的潤(rùn)濕性，下述)。液體保留區(qū)的接觸角相對(duì)低于邊界區(qū)的接觸角(其接觸角相對(duì)高于分析區(qū)的接觸角，下述)。初始時(shí)，液體保留區(qū)的接觸角也可等于或低于分析區(qū)的接觸角，但由于化學(xué)或物理刺激，液體保留區(qū)可在化學(xué)或物理刺激之前具有高于分析區(qū)的接觸角，這導(dǎo)致液體樣品被導(dǎo)向一個(gè)區(qū)域而非另一個(gè)。
液體保留區(qū)可以有兩個(gè)子類型。在一個(gè)子類型中，液體保留區(qū)被設(shè)計(jì)用于進(jìn)行液體樣品保留，而基本抵抗分析物的結(jié)合。在第二種子類型中，設(shè)計(jì)液體保留區(qū)以保留液體樣品，而且顯著結(jié)合液體樣品中的分析物，因此可稱為″捕獲區(qū)″，因?yàn)樗东@了分析物。第二種子類型也可包括顯著結(jié)合分析物、但進(jìn)行化學(xué)或物理刺激如UV輻射、通電或加熱后變得基本不結(jié)合分析物的表面。
第三種類型的區(qū)域稱為″分析區(qū)″，與其它區(qū)域相比，它是對(duì)樣品而言潤(rùn)濕性最高(接觸角最低)的區(qū)域。設(shè)計(jì)分析區(qū)，使其抵抗分析物的結(jié)合?？蓛?yōu)化分析區(qū)的大小、形狀和表面特性以增加分析所需分析物的靈敏度。
本發(fā)明樣品遞呈裝置的液體容量取決于區(qū)域的大小。對(duì)于3mm直徑的圓形區(qū)域，液體容量可高達(dá)約100μl。樣品遞呈裝置可含有此量的液體樣品而無(wú)需物理邊界、庫(kù)或孔。各區(qū)域可精確定位，以幫助各種分析設(shè)備如質(zhì)譜設(shè)備上的高通量自動(dòng)化或與其相容。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可稱為″靶芯片″，縮寫(xiě)為T(mén)n，其中″n″是指代樣品遞呈裝置表面上不同區(qū)域數(shù)量的數(shù)值，″n″可以是2-無(wú)窮大的任何數(shù)值。因此，例如，T2靶芯片具有兩個(gè)區(qū)域，T3靶芯片具有三個(gè)區(qū)域等。本發(fā)明考慮了含有比2個(gè)或3個(gè)多很多區(qū)域的樣品遞呈裝置，不以任何方式限定區(qū)域的數(shù)目。隨著區(qū)域數(shù)增加，總效果形成梯度。靶芯片是由經(jīng)設(shè)計(jì)抵抗分析物結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域組成的樣品遞呈裝置。
例如，對(duì)于T2靶芯片，樣品遞呈裝置包括兩個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)和分析區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的-即分析區(qū)是抵抗分析物結(jié)合的。在分析之前的干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面有效限定了分析物。
對(duì)于T3靶芯片，樣品遞呈裝置包括三個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)、液體保留區(qū)和分析區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的-即液體保留區(qū)和分析區(qū)是抵抗分析物結(jié)合的。在干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面將分析物有效濃縮到分析區(qū)。
因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置可包括不同區(qū)域，各自對(duì)分析物的吸收最少。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可稱為″捕獲芯片″或″捕獲/濃縮芯片″，縮寫(xiě)為Xn，其中″n″是指代樣品遞呈裝置表面上區(qū)域數(shù)量的數(shù)值，″n″可以是2-無(wú)窮大的任何數(shù)值。因此，例如，X2捕獲芯片具有兩個(gè)區(qū)域，X3捕獲芯片具有三個(gè)區(qū)域等。本發(fā)明考慮了含有比2個(gè)或3個(gè)多很多的區(qū)域的樣品遞呈裝置，不以任何方式限定區(qū)域的數(shù)目。隨著區(qū)域數(shù)增加，總效果形成梯度。捕獲芯片和捕獲/濃縮芯片是由經(jīng)設(shè)計(jì)結(jié)合分析物的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域組成的樣品遞呈裝置。
例如，對(duì)于X2捕獲芯片，樣品遞呈裝置包括兩個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)和捕獲區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為能夠根據(jù)捕獲區(qū)表面的化學(xué)或生物特性捕獲分析物-即捕獲區(qū)結(jié)合分析物。在分析之前的干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面有效限定了分析物。
對(duì)于X3捕獲/濃縮芯片，樣品遞呈裝置包括三個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)、捕獲區(qū)和分析區(qū)。將邊界區(qū)設(shè)計(jì)為基本不可潤(rùn)濕的。將捕獲區(qū)設(shè)計(jì)為能夠捕獲和結(jié)合分析物。將分析區(qū)設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的。在捕獲區(qū)和分析區(qū)之間轉(zhuǎn)移分析物，這是在用各種已知分析檢測(cè)方法之一分析前進(jìn)行的。在分析之前的干燥步驟中，含有液體樣品的分析區(qū)表面有效限定了分析物。可根據(jù)捕獲區(qū)表面特性將液體樣品從捕獲區(qū)轉(zhuǎn)移到分析區(qū)-即，如果捕獲區(qū)的潤(rùn)濕性程度低于分析區(qū)，在沒(méi)有物理介入的情況下液體樣品從捕獲區(qū)流向分析區(qū)?；蛘?，可設(shè)計(jì)捕獲區(qū)，使其特性可因化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射)而改變，使捕獲區(qū)的潤(rùn)濕性程度低于分析區(qū)，從而使液體樣品從捕獲區(qū)流向分析區(qū)。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的又一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可以是上述靶點(diǎn)和捕獲芯片的組合。在此實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置由具有不同功能的表面組成。這些類型的樣品遞呈裝置可包括通過(guò)機(jī)械方法(如通過(guò)移液器操作)或其它方式(如通過(guò)區(qū)域之間潤(rùn)濕性的差異)將液體樣品從一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個(gè)區(qū)域。例如，″捕獲-轉(zhuǎn)移-濃縮芯片″縮寫(xiě)為X2-轉(zhuǎn)移-T3，是由X2芯片和T3芯片組成的，其中X2芯片由兩個(gè)區(qū)域(即邊界區(qū)和捕獲區(qū))組成，T3芯片由三個(gè)區(qū)域(即邊界區(qū)、液體保留區(qū)和分析區(qū))組成。在X2芯片捕獲區(qū)和T3芯片的液體保留區(qū)之間轉(zhuǎn)移(機(jī)械或其它方式)分析物。此外，包括捕獲區(qū)和液體保留區(qū)組合的樣品遞呈裝置的實(shí)施方式還可以組合方式用于在檢測(cè)液體樣品中的分析物之前分離、濃縮、純化和修飾這些分析物。因此，例如，可將液體樣品加在T2芯片上，使樣品中的分析物限定在分析區(qū)中。然后，可將該樣品轉(zhuǎn)移到含有邊界區(qū)、捕獲區(qū)和分析區(qū)的X3芯片。在此實(shí)例中，可設(shè)計(jì)捕獲區(qū)使其結(jié)合(從而去除)液體樣品中的脂質(zhì)部分，以便當(dāng)樣品施加于X3芯片時(shí)，它從邊界區(qū)移動(dòng)到捕獲區(qū)(潤(rùn)濕性程度較高)，樣品中的脂質(zhì)部分結(jié)合于捕獲區(qū)表面，剩余的樣品移動(dòng)到分析區(qū)(因?yàn)樗臐?rùn)濕性程度最高)。在此實(shí)例中，將脂質(zhì)樣品限定在T2芯片上，然后脂質(zhì)移動(dòng)到X3芯片上，以便在分析區(qū)分析的最終樣品是濃縮和純化的脂質(zhì)。因?yàn)榭稍O(shè)計(jì)捕獲區(qū)使其結(jié)合多種不同的分析物，并且因?yàn)榭刹捎眠@些區(qū)域的各種組合，所以可產(chǎn)生具有各種純化、濃縮、分離和修飾能力(相對(duì)于一種或多種分析物)的樣品遞呈裝置。
將液體樣品從一個(gè)樣品遞呈裝置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝置的機(jī)制可以不同。采用上述例子，可用機(jī)械方法(如通過(guò)移液器操作)移動(dòng)T2的濃縮樣品并將其置于單獨(dú)的X3樣品遞呈裝置上?；蛘撸琓2和X3樣品遞呈裝置可通過(guò)一個(gè)區(qū)域相連，該區(qū)域的潤(rùn)濕性可因化學(xué)或物理刺激(如UV輻射)而改變，以在這兩個(gè)區(qū)域之間的區(qū)域暴露于UV輻射導(dǎo)致其潤(rùn)濕性高于T2裝置的分析區(qū)但低于X3裝置的捕獲區(qū)時(shí)，使T2樣品遞呈裝置的分析區(qū)中的濃縮樣品轉(zhuǎn)移到X3裝置的捕獲區(qū)中，使樣品從T2移動(dòng)到X3。通過(guò)許多表面(具有不同潤(rùn)濕性和分析物結(jié)合特性)及其結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生具有各種純化、濃縮、分離和修飾能力(相對(duì)于一種或多種分析物)的樣品遞呈裝置。
本發(fā)明樣品遞呈裝置還提供了具有不同形狀或圖案的潤(rùn)濕性不同的區(qū)域。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可具有同心圓形區(qū)域，其中心區(qū)是分析區(qū)，周圍是液體保留區(qū)，周圍是邊界區(qū)。因?yàn)榭捎酶鞣N光致圖案化技術(shù)產(chǎn)生這些區(qū)域，并且因?yàn)橐阎庵聢D案化技術(shù)能提供極其不同的所得圖案，所以各種區(qū)域有大量可能的形狀、圖案和結(jié)構(gòu)。而且，潤(rùn)濕性不同的區(qū)域的各種特性可以產(chǎn)生能夠?qū)⒎治鑫飳?dǎo)向表面上一個(gè)或多個(gè)特定或預(yù)定位置(如可尋址位點(diǎn)、通道或區(qū)域)的樣品遞呈裝置。
本發(fā)明樣品遞呈裝置適用于處理生物和非生物液體樣品。它們也適用于各種分析物檢測(cè)方法，(例如)包括但不限于質(zhì)譜、各種色譜法、免疫熒光光譜以及檢測(cè)和測(cè)定液體樣品中的分析物的其它已知分析方法。
設(shè)計(jì)上述各種變型，以最靈活地設(shè)計(jì)和使用比已知方法遞呈用于檢測(cè)和分析的分析物的能力提高的樣品遞呈裝置。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置能夠?qū)⒎治鑫飳?dǎo)向經(jīng)設(shè)計(jì)提高了分析物檢測(cè)的高靈敏度的分析區(qū)。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置改進(jìn)了分析物的沉積。
樣品遞呈裝置的制造本發(fā)明又一實(shí)施方式包括產(chǎn)生或制造上述樣品遞呈裝置的方法。
在表面由自身組裝單層(SAM)組成(根據(jù)所用SAM的不同形成不同區(qū)域)的實(shí)施方式中，本發(fā)明樣品遞呈裝置可包括由已知光致圖案化技術(shù)產(chǎn)生的多種SAM區(qū)。因此，本發(fā)明還包括用光致圖案化技術(shù)(一種優(yōu)選方法)產(chǎn)生由SAM組成的樣品遞呈裝置的方法。
一般用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾或圖案化本發(fā)明樣品遞呈裝置的基片表面。例如，可用施加自身組裝單層(SAM)的方法修飾或圖案化基片表面，這種方法修飾樣品遞呈裝置的基片表面，并且其暴露的表面可將特定的化學(xué)特性賦予基片。為具體基片選擇各種SAM，包括1°、2°、3°或4°組合物，以將獨(dú)特的表面特征和特性提供給基片表面。具體說(shuō)，施加多種SAM導(dǎo)致基片的圖案化，以使其含有多個(gè)區(qū)域，各區(qū)域具有不同的表面特征和特性。圖案化SAM的方法是本領(lǐng)域已知的，包括UV光致圖案化、照相平板圖案化、微模壓、電子束圖案化和活性離子蝕刻。
在基片表面上產(chǎn)生的區(qū)域可以是任何形狀，優(yōu)選圓形。此外，這些區(qū)域可以互相連續(xù)或不連續(xù)-即這些區(qū)域可以全部互相連續(xù)，或者一個(gè)或多個(gè)區(qū)域可以與另外的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域不連續(xù)。在樣品遞呈裝置的基片表面上產(chǎn)生的區(qū)域優(yōu)選具有對(duì)待分析樣品潤(rùn)濕性不同的多個(gè)區(qū)域。
作為本發(fā)明另一實(shí)施方式，提供了制造能夠準(zhǔn)確定位分析物以幫助自動(dòng)數(shù)據(jù)采集的樣品遞呈裝置的方法。
樣品遞呈裝置的使用和應(yīng)用在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明樣品遞呈裝置可與各種分析技術(shù)和步驟聯(lián)用。因此，本發(fā)明包括使用上述樣品遞呈裝置的方法。更具體說(shuō)，本發(fā)明包括用本發(fā)明樣品遞呈裝置(在一個(gè)樣品遞呈裝置或多個(gè)樣品遞呈裝置上)鑒定樣品中是否存在分析物和分析多種樣品的方法。
可以檢測(cè)、鑒定或測(cè)定液體樣品中分析物的任何分析方法基本上均可與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用。這些分析方法的例子包括但不限于MALDI-MS或電霧化電離MS。對(duì)我們來(lái)說(shuō)，該樣品遞呈裝置尤其適合與高通量分析測(cè)定技術(shù)聯(lián)用，例如，用于以促進(jìn)高通量數(shù)據(jù)采集的方式構(gòu)建樣品遞呈裝置分析區(qū)的MALDI-MS。
也可用本發(fā)明樣品遞呈裝置操作液體樣品和其中所含的分析物。根據(jù)樣品遞呈裝置表面經(jīng)設(shè)計(jì)可具有的不同的潤(rùn)濕性特性和捕獲特性，可設(shè)計(jì)樣品遞呈裝置使其操作、濃縮、定位、貯存、轉(zhuǎn)移(用或不用機(jī)械介入)、回收(用或不用機(jī)械介入)、分析、修飾或加工(在樣品遞呈裝置上使用分析物修飾試劑)、或分餾液體樣品或其中所含分析物。而且，因?yàn)榭稍O(shè)計(jì)本發(fā)明樣品遞呈裝置使其響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射、加壓、電磁輻射)完成任何這些功能，本發(fā)明樣品遞呈裝置可以可逆地或不可逆地完成這些功能，并且還可響應(yīng)于外力進(jìn)行這些功能的各種組合。
任何液體樣品(和分析物)均可與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用。例如，可用本發(fā)明分析從液相色譜回收的組分?？捎帽景l(fā)明分析酶消化物，這些酶消化物是用由2D凝膠電泳上剪下的蛋白質(zhì)點(diǎn)或由親和色譜收集的組分(即ICAT(同位素編碼的親和標(biāo)簽))制備的。也可用本發(fā)明分析從生物傳感器中回收的樣品。本發(fā)明也可用于用標(biāo)準(zhǔn)多孔形式的機(jī)器人和測(cè)定進(jìn)行1∶1樣品轉(zhuǎn)移。實(shí)際上，可用本發(fā)明樣品遞呈裝置處理和操作獲自基本上任何來(lái)源的液體樣品，無(wú)論這種樣品是實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如上述酶消化物或生物傳感器樣品的例子)，獲自環(huán)境的樣品(如來(lái)自江河的水質(zhì)樣品)，或者直接獲自活生物的樣品(如人尿樣品)。
本發(fā)明也可用于儲(chǔ)存樣品，用于存檔目的或進(jìn)一步分析。換句話說(shuō)，不需要在將液體樣品轉(zhuǎn)移到分析區(qū)后立即檢測(cè)和分析液體樣品中所含分析物。
因此，本發(fā)明各種實(shí)施方式提供了具有各種液體處理功能的樣品遞呈裝置，包括但不限于樣品/分析物處理，以及液體沉積、保留、轉(zhuǎn)移、定位和再定位以及儲(chǔ)存。
特征和優(yōu)點(diǎn)除了上述發(fā)明概述部分所述的本發(fā)明許多特征和優(yōu)點(diǎn)以外，其它特征和優(yōu)點(diǎn)至少包括可在基本上不結(jié)合分析物的一個(gè)表面上進(jìn)行檢測(cè)液體樣品中存在的分析物的分析方法，如MALDI-MS，使分析靈敏度增加、結(jié)果重現(xiàn)性提高、不同捕獲區(qū)的結(jié)果相當(dāng)。
對(duì)于樣品液體處理，可分析的樣品體積提高-對(duì)于3mm直徑的區(qū)域高達(dá)約100μl，可將表面圖案化，使其具有SBS(生物分子篩選協(xié)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)孔形式(即96/384/1536孔形式)，從而能夠與普通機(jī)器人和其它高通量分析方法接界。
可使各種分析方法(如MALDI-MS)的通量增加，因?yàn)榫_地安置了區(qū)域的位置，用于高通量數(shù)據(jù)采集。對(duì)于MALDI-MS，分析區(qū)是最優(yōu)尺寸的(即小于2mm2，優(yōu)選小于1mm2)。樣品/基質(zhì)具有改進(jìn)的結(jié)晶特性，導(dǎo)致分析區(qū)內(nèi)的電離一致性提高。與干燥點(diǎn)分析相比，較小分析區(qū)導(dǎo)致測(cè)定面積較小，從而實(shí)現(xiàn)高通量分析。
本發(fā)明樣品遞呈裝置使得能夠通過(guò)濃縮分析區(qū)中分析物的方式分析稀釋的樣品。
分離液體樣品中的分析物可能不需要多個(gè)分離步驟，如將分析物結(jié)合于離子交換色譜柱，然后必須在后續(xù)洗滌步驟中從柱上分離分析物。實(shí)際上，通過(guò)采用具有經(jīng)設(shè)計(jì)能結(jié)合不同分析物的不同表面化學(xué)的SAM，可能高特異性地分離和純化具體分析物。
可用本發(fā)明樣品遞呈裝置處理各種液體樣品和分析物，本發(fā)明裝置避免了上述已知遞呈裝置和分析方法的缺點(diǎn)。但本發(fā)明樣品遞呈裝置尤其適用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域和激光解吸電離質(zhì)譜，就象以下所詳述的那樣，要求權(quán)利的裝置的用途不以任何方式僅限于該領(lǐng)域。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1a描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置，其中中心分析區(qū)與周圍的液體保留區(qū)互相同中心，其中邊界區(qū)圍繞著液體保留區(qū)。
圖1b描述了圖1a所示樣品遞呈裝置的橫截面圖。
圖2描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面，其中該表面進(jìn)一步由16對(duì)分析區(qū)和液體保留區(qū)組成，這些分析區(qū)和液體保留區(qū)互相同中心，共有邊界區(qū)圍繞著這些分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)。在這種情況下，樣品遞呈裝置組織成對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)96孔板的結(jié)構(gòu)。
圖3描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面，其中一部分分析區(qū)和液體保留區(qū)互相連續(xù)，共有邊界區(qū)圍繞著互相不連續(xù)的那部分分析區(qū)和液體保留區(qū)，分析區(qū)的表面積小于液體保留區(qū)。
圖4a描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面，其中分析區(qū)的形狀經(jīng)設(shè)計(jì)能夠幫助自動(dòng)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖4b描述了擴(kuò)大的分析區(qū)，表示約占100μm2的36個(gè)區(qū)域，它對(duì)應(yīng)于在質(zhì)譜期間可由激光采樣的單個(gè)區(qū)域。
圖5描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面，其中該表面進(jìn)一步由96對(duì)分析區(qū)和液體保留區(qū)組成，這些分析區(qū)和液體保留區(qū)互相同中心，共有邊界區(qū)圍繞著分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)。在這種情況下，樣品遞呈裝置組織成對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)96孔板的結(jié)構(gòu)。延長(zhǎng)液體保留區(qū)以最大程度增加液體容量并最大程度減小相鄰區(qū)域的距離。將蛇形圖案覆蓋在前兩排樣品遞呈裝置上，說(shuō)明在自動(dòng)組分收集期間色譜法洗出液的液流沉積的路徑。
圖6a-6h說(shuō)明本發(fā)明樣品遞呈裝置的制造涉及的步驟，用金上的烷基硫醇進(jìn)行表面修飾，用UV-光致圖案化進(jìn)行表面圖案化。
圖7a-71說(shuō)明本發(fā)明樣品遞呈裝置的制造涉及的步驟，用金上的烷基硫醇進(jìn)行表面修飾，用照相平板術(shù)進(jìn)行表面圖案化。
圖8a-8l說(shuō)明本發(fā)明樣品遞呈裝置的制造涉及的步驟，用硅上的烷基硅烷進(jìn)行表面修飾，用照相平板術(shù)進(jìn)行表面圖案化。
圖9a-9f描述了沉積到本發(fā)明樣品遞呈裝置表面上的大量樣品水溶液在對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的區(qū)域內(nèi)干燥的過(guò)程中的各個(gè)階段。
圖10a-10d描述了與具有液體保留區(qū)而沒(méi)有分析區(qū)的樣品遞呈裝置相關(guān)的表面和液體干燥特征。圖10e-10h描述了與具有分析區(qū)而沒(méi)有液體保留區(qū)的樣品遞呈裝置相關(guān)的表面和液體干燥特征。
圖11a-11h描述了液滴在本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面上干燥期間用視頻接觸角設(shè)備記錄的圖像，其中分析區(qū)的直徑為0.6mm，液體保留區(qū)的直徑為1.5mm。
圖12是與圖11a-11h所示圖像相關(guān)的接觸角、液體寬度和液體高度的總結(jié)圖。
圖13說(shuō)明了沉積的液體體積為5μL-70μL的本發(fā)明樣品遞呈裝置。
圖14a說(shuō)明了在5μL-40μL液體沉積在本發(fā)明樣品遞呈裝置上后立即拍攝的本發(fā)明樣品遞呈裝置。各液滴含有等量的α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)。
圖14b說(shuō)明了由于圖14a所示樣品遞呈裝置上樣品干燥而濃縮并導(dǎo)向分析區(qū)的HCCA。將同心區(qū)的目測(cè)參比疊加在干燥的HCCA上。
圖15說(shuō)明了用樣品遞呈裝置抽提用于分析的所需分析物的方法的變型。
圖16a說(shuō)明所需分析物結(jié)合在樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)上。也顯示了相關(guān)質(zhì)譜譜圖。
圖16b說(shuō)明所需分析物集中在樣品遞呈裝置的分析區(qū)上。也顯示了相關(guān)質(zhì)譜譜圖。
圖17a說(shuō)明用捕獲芯片處理的被1M NaCl污染的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖17b說(shuō)明用捕獲芯片處理的被1M尿素污染的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖17c說(shuō)明用捕獲芯片處理的被1M TRIS污染的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖17d說(shuō)明用捕獲芯片處理的被1M NaCl污染的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖18a說(shuō)明直接施加在X3芯片上的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖18b說(shuō)明ZipTip過(guò)濾后施加在T3芯片上的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖18c說(shuō)明直接施加在不銹鋼表面上的樣品的質(zhì)譜譜圖。
圖19a說(shuō)明用TFA方案獲自X3-型表面的譜圖。
圖19b說(shuō)明用MOPS方案獲自X3-型表面的譜圖。
圖19c說(shuō)明獲自T3-型表面的清潔消化物的譜圖。
圖20是證實(shí)存在NHS-酯基的FTIR譜。
圖21顯示了用樣品遞呈裝置以不同抗體(抗ACTH C-末端與抗ACTH N-末端與非特異性小鼠IgG)進(jìn)行抗原檢測(cè)的結(jié)果。將兩種抗原類型(ACTH 18-39(C-末端)和ACTH 1-39(全長(zhǎng))用于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)以結(jié)合各抗體表面。+和-號(hào)標(biāo)記表明是否檢測(cè)到分析物。濃度(括號(hào)中)是產(chǎn)生相應(yīng)正/負(fù)結(jié)果的受試的實(shí)際抗原溶液濃度。
圖22說(shuō)明實(shí)施例XXVI中產(chǎn)生的IMAC-Fe X3芯片上的125 fmol β-酪蛋白凝膠消化物的譜圖。
圖23說(shuō)明放置在T3芯片上的100 fmol磷酸化酶b溶液消化物+5 fmol β-酪蛋白溶液消化物的譜圖。
圖24說(shuō)明在實(shí)施例XXVI中產(chǎn)生的IMAC-Fe X3芯片上處理后100 fmol磷酸化酶b溶液消化物+5 fmol β-酪蛋白溶液消化物的譜圖。
圖25說(shuō)明在實(shí)施例XXVI中產(chǎn)生的IMAC-Fe X3芯片上檢測(cè)樣品溶液中含有磷酸化酪氨酸的肽，肽的濃度不同(50 fmol、5 fmol和500 amol)。(*說(shuō)明磷酸化酪氨酸肽的譜峰的位置)。
圖26說(shuō)明用實(shí)施例XXVII中產(chǎn)生的、IMAC-Ni X3芯片處理含有His-標(biāo)簽的(m/Z～9500)和非His-標(biāo)簽的泛素(m/Z～8500)的混合物后該混合物的譜圖。如圖26所示，僅可觀察到帶有His-標(biāo)簽的泛素變體。
圖27a說(shuō)明包括三個(gè)同心圓的樣品遞呈裝置的一種變型。構(gòu)造這些圓的表面，使其促進(jìn)液體向中心區(qū)移動(dòng)。
圖27b說(shuō)明樣品遞呈裝置的另一種變型，其中提供了用于接受樣品液體的″液滴區(qū)″。
圖27c說(shuō)明具有四個(gè)整合液滴區(qū)的樣品遞呈裝置的另一種變型。
圖27d說(shuō)明包括用于跨樣品遞呈裝置表面運(yùn)輸液體的液體運(yùn)輸區(qū)的樣品遞呈裝置的另一種變型。
圖27e說(shuō)明包括液滴區(qū)、液體運(yùn)輸區(qū)、液體保留區(qū)和分析區(qū)的樣品遞呈裝置的又一種變型。一個(gè)或多個(gè)區(qū)域可具有化學(xué)活性表面，以與準(zhǔn)備用樣品遞呈裝置處理的樣品溶液中的分析物結(jié)合或反應(yīng)。
圖28a說(shuō)明一種樣品遞呈裝置變型上加工位點(diǎn)陣列的一部分。
圖28b說(shuō)明圖28a所示陣列的單個(gè)加工位點(diǎn)之一。
圖29說(shuō)明用光電發(fā)射器和光檢測(cè)器測(cè)定樣品遞呈裝置上遞呈的分析物的一個(gè)應(yīng)用。
圖30說(shuō)明在樣品遞呈裝置上檢測(cè)/測(cè)定分析物的系統(tǒng)的另一個(gè)變型。在此變型中，將遞呈裝置與使樣品遞呈裝置上的分析物電離和將電離的顆粒導(dǎo)向檢測(cè)器的設(shè)備一起使用。
圖31說(shuō)明另一應(yīng)用，其中通過(guò)樣品遞呈裝置傳送能量以分析樣品遞呈裝置上遞呈的樣品。
優(yōu)選實(shí)施方式詳述應(yīng)參照附圖閱讀以下詳述，其中相同編號(hào)在全部附圖中指代相似元件。附圖不必按比例繪制，附圖描述了所選實(shí)施方式，不旨在限制本發(fā)明范圍。該詳述以舉例方式而非限制方式說(shuō)明了本發(fā)明的原理。此說(shuō)明書(shū)顯然能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員制造和使用本發(fā)明，并描述了本發(fā)明的集中實(shí)施方式、適應(yīng)形式、變型、替代方式和用途，包括當(dāng)前認(rèn)為是實(shí)施本發(fā)明最佳方式的內(nèi)容。
定義除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。除非另有說(shuō)明，本文所用以下術(shù)語(yǔ)具有下述含義。
″分析物″指想要檢測(cè)的樣品組分。該術(shù)語(yǔ)可指樣品中的單個(gè)組分或多個(gè)組分。
″樣品″指獲自生物或非生物來(lái)源的、在樣品遞呈裝置表面上遞呈的任何材料?？蓪⑻烊?、未處理形式和/或處理后的樣品施加于樣品遞呈裝置，其中處理包括但不限于修飾、分餾、提取和濃縮。本發(fā)明樣品可以是液體或非液體樣品。
″基片″指能夠遞呈或支持表面的材料。
″表面″指主體或基片的外邊界或上邊界。
″基本上不結(jié)合″或″抵抗結(jié)合″或″抵抗分析物結(jié)合″指與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用的某些表面不能將分析物可檢測(cè)地親和或結(jié)合到表面上的特性。雖然可能發(fā)生一些結(jié)合，但是經(jīng)過(guò)特別設(shè)計(jì)，這些表面最大程度降低了結(jié)合，使結(jié)合水平低于所用分析方法的檢測(cè)限度。
″表面張力″指由于表面附近的分子內(nèi)聚力不等使沉積在表面上的液滴傾向于收縮到最小可能接觸面積的液體特性。
″潤(rùn)濕性″指液體樣品濕潤(rùn)固體表面的程度。除非另有說(shuō)明，液體樣品是水性液體。
″接觸角″指固體表面平面和起源于三相接觸點(diǎn)(固/液/氣)的液體邊界的切線之間的夾角。
″基質(zhì)″指用于質(zhì)譜技術(shù)，如MALDI-MS或SELDI-MS的材料，用于吸收激光能量和將該能量轉(zhuǎn)移給分析物分子，使得能夠電離不穩(wěn)定的大分子。在SELDI-MS中，該基質(zhì)稱為″EAM″或″能量吸收分子″。常常用作檢測(cè)生物分析物的基質(zhì)的試劑包括但不限于反式-3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸，SA)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)和2，5-二羥基苯甲酸(DHBA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它合適基質(zhì)。
″SAM″指自身組裝單層。SAM是將合適基材浸入活性表面活性劑型的有機(jī)溶劑溶液中自發(fā)形成的分子組合體。
也必須注意到，本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)所用單數(shù)形式″一個(gè)″、″一種″和″這種″包括復(fù)數(shù)含義，除非文中另有明確說(shuō)明。因此，例如，術(shù)語(yǔ)″一個(gè)分子″可以指一個(gè)分子或分子組合，″一種流體″可移植一種或多種流體，或其混合物。
樣品遞呈裝置的描述以下對(duì)本發(fā)明樣品遞呈裝置的描述提供了比上述發(fā)明概述更詳細(xì)的說(shuō)明。然而，還參照附圖、本發(fā)明樣品遞呈裝置的制造方法以及本發(fā)明樣品遞呈裝置的用途和應(yīng)用描述了本發(fā)明樣品遞呈裝置，詳細(xì)描述見(jiàn)下。
如上所述，本發(fā)明樣品遞呈裝置提供了用于鑒定化學(xué)和生物實(shí)體的各種分析方法所用的已知樣品遞呈裝置的有吸引力的替代方式。此外，本發(fā)明提供了制備樣品遞呈裝置的方法以及用它們對(duì)液體樣品中所含分析物進(jìn)行各種分析測(cè)定的方法。本發(fā)明樣品遞呈裝置的獨(dú)特特性解決了與已知分析技術(shù)相關(guān)的以及與其聯(lián)用的樣品遞呈裝置或容器的許多缺點(diǎn)(上述背景部分所述)。
更具體說(shuō)，本發(fā)明樣品遞呈裝置提供了用于各種分析方法的已知樣品遞呈裝置的有吸引力的替代方式。它們具有額外的益處，例如，允許體積高達(dá)100μL的液體樣品中的分析物選擇性保留并濃縮在生物芯片表面上。此外，因?yàn)橛山?jīng)設(shè)計(jì)基本不結(jié)合或抵抗結(jié)合(分析物)的樣品遞呈裝置的一部分檢測(cè)分析物，與在基于生物芯片的親和力捕獲裝置或裝置表面與分析物具有顯著親和力的其它樣品遞呈裝置的表面上直接檢測(cè)相比，該裝置能夠以高靈敏度檢測(cè)分析物。
本發(fā)明還最大程度降低了將分析物從一個(gè)表面轉(zhuǎn)移到另一個(gè)表面上所帶來(lái)的可能損失，因?yàn)樵趦?yōu)選實(shí)施方式中，現(xiàn)有樣品遞呈裝置僅需要一次液體操作。這一點(diǎn)，再加上該樣品遞呈裝置表面的抵抗分析物特性，導(dǎo)致感興趣分析物的損失降低。
此外，因?yàn)榉治鑫锊幌裨诶鏢ELDI-MS生物芯片中一樣結(jié)合于親和捕獲裝置像，所以可以可控方式操作液體樣品并將其移動(dòng)到本發(fā)明樣品遞呈裝置表面上。這允許將樣品濃縮到分析物基本不結(jié)合于樣品遞呈裝置表面的分析區(qū)。而且，這允許將含有分析物的樣品轉(zhuǎn)移到表面上不同區(qū)中，各區(qū)對(duì)分析物的特性不同，允許在檢測(cè)之前純化、分離和/或修飾分析物。
本發(fā)明包括表面上各個(gè)部分的特性可以因各種化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射)而改變的樣品遞呈裝置，以便在樣品處理期間操縱這些表面對(duì)分析物的特性。可將表面特性的這些改變?cè)O(shè)計(jì)為可逆或不可逆的。
因此，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行分析測(cè)定的樣品遞呈裝置。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括樣品遞呈裝置，它具有對(duì)于待分析各種樣品的潤(rùn)濕性不同的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的表面。這些潤(rùn)濕性不同的區(qū)域產(chǎn)生保留、濃縮和移動(dòng)液體樣品中分析物的能力不同的區(qū)域。這些區(qū)域可以是各種形狀和大小，可以互相連續(xù)或不連續(xù)。本發(fā)明樣品遞呈裝置包括二維或三維表面，各表面具有潤(rùn)濕性不同的兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
本發(fā)明樣品遞呈裝置包括基片，基片可由各種材料制成，包括但不限于(例如)玻璃、硅酸鹽、半導(dǎo)體、金屬、聚合物(如塑料)和其它羥化材料，如硅上的SiO2、鋁上的Al2O3等。該基片優(yōu)選為金屬如金，或半導(dǎo)體如硅。本發(fā)明樣品遞呈裝置還包括用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行表面修飾的基片，以在該基片表面產(chǎn)生各種區(qū)域，這些區(qū)域具有不同的潤(rùn)濕性特性。這種表面修飾包括但不限于將自身組裝單層(SAM)、聚合物(直鏈和支鏈)和L-B組合體加在基片上。以SAM為例，當(dāng)加在基片上時(shí)，SAM產(chǎn)生可接觸液體樣品的樣品遞呈裝置表面。根據(jù)所用具體SAM的組成，本發(fā)明樣品遞呈裝置表面對(duì)液體樣品中的分析物可具有不同的潤(rùn)濕性和親和力(或缺少潤(rùn)濕性和親和力)特性。SAM可加在本發(fā)明樣品遞呈裝置上，以產(chǎn)生其特性反映出具體區(qū)域所用SAM的不同區(qū)域。本發(fā)明也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它表面修飾技術(shù)。
本發(fā)明樣品遞呈裝置由不同區(qū)域組成，其中一個(gè)最適于保留液體樣品。本發(fā)明樣品遞呈裝置還可包括潤(rùn)濕性不同的區(qū)域，其中一個(gè)最適于高靈敏地檢測(cè)分析物。
對(duì)于樣品遞呈裝置表面可包括的區(qū)域類型，主要根據(jù)它們對(duì)待分析樣品的不同潤(rùn)濕性來(lái)表征它們，這進(jìn)而產(chǎn)生保留或結(jié)合液體樣品中分析物的能力不同的區(qū)域。這些區(qū)域廣義上稱為″邊界區(qū)″、″液體保留區(qū)″和″分析區(qū)″。本發(fā)明僅需要存在兩種類型的區(qū)域，但是也考慮了包括兩種以上類型的區(qū)域。本發(fā)明也可包括各類型的一個(gè)以上區(qū)域-如，樣品遞呈裝置可包括多個(gè)液體保留區(qū)，各自對(duì)液體樣品和/或其中所含分析物的特性不同。各區(qū)域可精確定位，以幫助各種分析設(shè)備如質(zhì)譜設(shè)備上的高通量自動(dòng)化或與其相容。
″邊界區(qū)″包括對(duì)待分析樣品基本不可潤(rùn)濕的區(qū)域。該邊界區(qū)是與其它區(qū)域相比對(duì)樣品的接觸角最高的區(qū)域。
與邊界區(qū)相比，″液體保留區(qū)″對(duì)待分析樣品的潤(rùn)濕性相對(duì)較高(相對(duì)低于分析區(qū)的潤(rùn)濕性，下述)。液體保留區(qū)的接觸角相對(duì)低于邊界區(qū)的接觸角(其接觸角相對(duì)高于分析區(qū)的接觸角，下述)。初始時(shí)，液體保留區(qū)的接觸角也可等于或低于分析區(qū)的接觸角，但由于化學(xué)或物理刺激，液體保留區(qū)可在化學(xué)或物理刺激之前具有高于分析區(qū)的接觸角，這導(dǎo)致液體樣品被導(dǎo)向一個(gè)區(qū)域而非另一個(gè)。而且，液體保留區(qū)可以有兩個(gè)子類型。在一個(gè)子類型中，液體保留區(qū)被設(shè)計(jì)用于進(jìn)行液體樣品保留，而基本抵抗分析物的結(jié)合。在第二種子類型中，設(shè)計(jì)液體保留區(qū)以保留液體樣品，而且顯著結(jié)合液體樣品中的分析物，因此可稱為″捕獲區(qū)″，因?yàn)樗东@了分析物。第二種子類型也可包括顯著結(jié)合分析物、但進(jìn)行化學(xué)或物理刺激如UV輻射、通電或加熱后變得基本不結(jié)合分析物的表面。
與其它區(qū)域相比，″分析區(qū)″是對(duì)樣品的潤(rùn)濕性最高(接觸角最低)的區(qū)域。設(shè)計(jì)分析區(qū)，使其抵抗分析物的結(jié)合?？蓛?yōu)化分析區(qū)的大小、形狀和表面特性以增加分析所需分析物的靈敏度。
除其它優(yōu)點(diǎn)之外，由于區(qū)域間潤(rùn)濕性的差異，本發(fā)明樣品遞呈裝置能夠保留和處理液體樣品的體積大于用于樣品處理的其它生物芯片。雖然本發(fā)明樣品遞呈裝置的液體容量取決于區(qū)域大小；但對(duì)于3mm直徑的圓形區(qū)域，液體容量可高達(dá)約100μl，至少高達(dá)約70μl。樣品遞呈裝置可含有此量的液體樣品而無(wú)需物理邊界、庫(kù)或孔。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可稱為″靶芯片″，縮寫(xiě)為T(mén)n，其中″n″是指代樣品遞呈裝置表面上不同區(qū)域數(shù)量的數(shù)值，″n″可以是2-無(wú)窮大的任何數(shù)值。因此，例如，T2靶芯片具有兩個(gè)區(qū)域，T3靶芯片具有三個(gè)區(qū)域等。本發(fā)明考慮了含有比2個(gè)或3個(gè)多很多的區(qū)域的樣品遞呈裝置，不以任何方式限定區(qū)域的數(shù)目。隨著區(qū)域數(shù)增加，總效果形成梯度。靶芯片是由經(jīng)設(shè)計(jì)抵抗分析物結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域組成的樣品遞呈裝置。例如，對(duì)于T2靶芯片，樣品遞呈裝置包括兩個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)和分析區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的-即分析區(qū)是抵抗分析物結(jié)合的。在分析之前的干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面有效限定了分析物。對(duì)于T3靶芯片，樣品遞呈裝置包括三個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)、液體保留區(qū)和分析區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的-即液體保留區(qū)和分析區(qū)是抵抗分析物結(jié)合的。在干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面將分析物有效濃縮到分析區(qū)。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置可包括不同區(qū)域，各自對(duì)分析物的吸收最少。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可稱為″捕獲芯片″或″捕獲/濃縮芯片″，縮寫(xiě)為Xn，其中″n″是指代樣品遞呈裝置表面上區(qū)域數(shù)量的數(shù)值，″n″可以是2-無(wú)窮大的任何數(shù)值。因此，例如，X2捕獲芯片具有兩個(gè)區(qū)域，X3捕獲芯片具有三個(gè)區(qū)域等。本發(fā)明考慮了含有比2個(gè)或3個(gè)多很多的區(qū)域的樣品遞呈裝置，不以任何方式限定區(qū)域的數(shù)目。隨著區(qū)域數(shù)增加，總效果形成梯度。捕獲芯片和捕獲/濃縮芯片是由經(jīng)設(shè)計(jì)結(jié)合分析物的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域組成的樣品遞呈裝置。負(fù)責(zé)捕獲分析物的部分一般包括設(shè)計(jì)為捕獲區(qū)的區(qū)別特征的特定表面修飾。這些表面修飾可包括特異性(如單克隆抗體)或非特異性(如根據(jù)靜電吸引結(jié)合的帶電基團(tuán))結(jié)合或以這些吸引力的任何組合結(jié)合分析物的生物和化學(xué)部分。除了能夠捕獲感興趣的分析物之外，這些表面修飾也可保留液體樣品中的分析物，以進(jìn)行后續(xù)修飾。因此，例如，包括表面修飾是單克隆抗體的捕獲區(qū)的本發(fā)明樣品遞呈裝置可結(jié)合液體樣品中的互補(bǔ)抗原并保留這些抗原，而其余液體樣品通過(guò)物理轉(zhuǎn)移或潤(rùn)濕性差異移動(dòng)到本裝置表面的另一部分中?？赏ㄟ^(guò)向樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)加入其它化合物(如加入能切掉該抗原的一部分的酶)修飾保留的抗原。然后，可將修飾的抗原轉(zhuǎn)移到該樣品遞呈裝置的另一部分進(jìn)行進(jìn)一步處理，或用已知技術(shù)從該裝置上除去以進(jìn)行分析。
例如，對(duì)于X2捕獲芯片，樣品遞呈裝置包括兩個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)和捕獲區(qū)。將接觸液體樣品的區(qū)域表面設(shè)計(jì)為能夠根據(jù)捕獲區(qū)表面的化學(xué)或生物特性捕獲分析物-即捕獲區(qū)結(jié)合分析物。在分析之前的干燥步驟中，接觸液體樣品的區(qū)域表面有效限定了分析物。對(duì)于X3捕獲/濃縮芯片，樣品遞呈裝置包括三個(gè)區(qū)域-即邊界區(qū)、捕獲區(qū)和分析區(qū)。將邊界區(qū)設(shè)計(jì)為基本不可潤(rùn)濕的。將捕獲區(qū)設(shè)計(jì)為能夠捕獲和結(jié)合分析物。將分析區(qū)設(shè)計(jì)為抵抗分析物結(jié)合的。在捕獲區(qū)和分析區(qū)之間轉(zhuǎn)移分析物，這是用各種已知分析檢測(cè)方法之一分析前進(jìn)行的。在分析之前的干燥步驟中，含有液體樣品的分析區(qū)表面有效限定了分析物?？筛鶕?jù)捕獲區(qū)表面特性將液體樣品從捕獲區(qū)轉(zhuǎn)移到分析區(qū)-即，如果捕獲區(qū)的潤(rùn)濕性程度低于分析區(qū)，在沒(méi)有物理介入的情況下液體樣品從捕獲區(qū)流向分析區(qū)?；蛘撸稍O(shè)計(jì)捕獲區(qū)，使其特性可因化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射)而改變，使捕獲區(qū)的潤(rùn)濕性程度低于分析區(qū)，從而使液體樣品從捕獲區(qū)流向分析區(qū)。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可以是上述靶點(diǎn)和捕獲芯片的組合。在此實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置由具有不同功能的表面組成。這些類型的樣品遞呈裝置可包括通過(guò)機(jī)械方法(如通過(guò)移液器操作)或其它方式(如通過(guò)區(qū)域之間潤(rùn)濕性的差異)將液體樣品從一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個(gè)區(qū)域。例如，″捕獲-轉(zhuǎn)移-濃縮芯片″縮寫(xiě)為X2-轉(zhuǎn)移-T3，是由X2芯片和T3芯片組成的，其中X2芯片由兩個(gè)區(qū)域(即邊界區(qū)和捕獲區(qū))組成，T3芯片由三個(gè)區(qū)域(即邊界區(qū)、液體保留區(qū)和分析區(qū))組成。在X2芯片捕獲區(qū)和T3芯片的液體保留區(qū)之間轉(zhuǎn)移(機(jī)械或其它方式)分析物。
這些樣品遞呈裝置可包括一個(gè)以上″捕獲區(qū)″，從而該表面可能對(duì)一種或多種分析物具有結(jié)合親和力。在液體樣品從樣品遞呈裝置表面上的一個(gè)區(qū)域移動(dòng)到另一個(gè)區(qū)域時(shí)，依次結(jié)合分析物的能力是本發(fā)明特征，它能幫助分析液體樣品的多種不同組分，而無(wú)需用機(jī)械介入將它們物理分離。本發(fā)明樣品遞呈裝置的不同潤(rùn)濕性特性可將液體樣品引導(dǎo)到該裝置的不同區(qū)域中，在該過(guò)程中留下結(jié)合于不同捕獲區(qū)的分析物，從而依次處理液體樣品。
更具體說(shuō)，包括捕獲區(qū)和液體保留區(qū)組合的樣品遞呈裝置的實(shí)施方式還可以組合方式用于在檢測(cè)液體樣品中的分析物之前分離、濃縮、純化和修飾這些分析物。因此，例如，可將液體樣品加在T2芯片上，使樣品中的分析物限定在分析區(qū)中。然后，可將該樣品轉(zhuǎn)移到含有邊界區(qū)、捕獲區(qū)和分析區(qū)的X3芯片。在此實(shí)例中，可設(shè)計(jì)捕獲區(qū)使其結(jié)合(從而去除)液體樣品中的脂質(zhì)部分，以便當(dāng)樣品施加于X3芯片時(shí)，它從邊界區(qū)移動(dòng)到捕獲區(qū)(潤(rùn)濕性程度較高)，樣品中的脂質(zhì)部分結(jié)合于捕獲區(qū)表面，剩余的樣品移動(dòng)到分析區(qū)(因?yàn)樗臐?rùn)濕性程度最高)。在此實(shí)例中，將脂質(zhì)樣品限定在T2芯片上，然后脂質(zhì)移動(dòng)到X3芯片上，以便在分析區(qū)分析的最終樣品是濃縮和純化的脂質(zhì)。因?yàn)榭稍O(shè)計(jì)捕獲區(qū)使其結(jié)合多種不同的分析物，并且因?yàn)榭刹捎眠@些區(qū)域的各種組合，所以可產(chǎn)生具有各種純化、濃縮、分離和修飾能力(相對(duì)于一種或多種分析物)的樣品遞呈裝置。
將液體樣品從一個(gè)樣品遞呈裝置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝置的機(jī)制可以不同。采用上述例子，可用機(jī)械方法(如通過(guò)移液器操作)移動(dòng)T2的濃縮樣品并將其置于單獨(dú)的X3樣品遞呈裝置上?；蛘?，T2和X3樣品遞呈裝置可通過(guò)一個(gè)區(qū)域相連，該區(qū)域的潤(rùn)濕性可因化學(xué)或物理刺激(如UV輻射)而改變，以在這兩個(gè)區(qū)域之間的區(qū)域暴露于UV輻射導(dǎo)致其潤(rùn)濕性高于T2裝置的分析區(qū)但低于X3裝置的捕獲區(qū)時(shí)，使T2樣品遞呈裝置的分析區(qū)中的濃縮樣品轉(zhuǎn)移到X3裝置的捕獲區(qū)中，使樣品從T2移動(dòng)到X3。通過(guò)許多表面(具有不同潤(rùn)濕性和分析物結(jié)合特性)及其結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生具有各種純化、濃縮、分離和修飾能力(相對(duì)于一種或多種分析物)的樣品遞呈裝置。
本發(fā)明樣品遞呈裝置-在上述各實(shí)施方式中-還可提供具有不同形狀和圖案的潤(rùn)濕性不同的區(qū)域(附圖中描述了幾個(gè)例子)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品遞呈裝置可具有同心圓形區(qū)域，其中心區(qū)是分析區(qū)，周圍是液體保留區(qū)，周圍是邊界區(qū)。因?yàn)榭捎酶鞣N光致圖案化技術(shù)產(chǎn)生這些區(qū)域，并且因?yàn)橐阎庵聢D案化技術(shù)能提供極其不同的所得圖案，所以各種區(qū)域有大量可能的形狀、圖案和結(jié)構(gòu)。而且，潤(rùn)濕性不同的區(qū)域的各種特性可以產(chǎn)生能夠?qū)⒎治鑫飳?dǎo)向表面上一個(gè)或多個(gè)特定或預(yù)定位置(如可尋址位點(diǎn)、通道或區(qū)域)的樣品遞呈裝置。本文中可尋址僅僅指預(yù)定位點(diǎn)、通道或區(qū)域可由與本發(fā)明樣品遞呈裝置協(xié)同工作的自動(dòng)處理設(shè)備指定，，以便用分析設(shè)備處理保留在這些指定位置上的液體樣品或分析物，以測(cè)定感興趣分析物。此外，可從樣品遞呈裝置中取出這些預(yù)定位置上遞呈的液體樣品或分析物，由另一樣品遞呈裝置進(jìn)行后續(xù)處理或操作(如修飾、純化、濃縮等)。
本發(fā)明樣品遞呈裝置適用于處理生物和非生物液體樣品。它們也適用于各種分析物檢測(cè)方法，(例如)包括但不限于質(zhì)譜、各種色譜法、免疫熒光光譜以及檢測(cè)和測(cè)定液體樣品中的分析物的其它已知分析方法。
設(shè)計(jì)上述各種變型，以最靈活地設(shè)計(jì)和使用比已知方法遞呈用于檢測(cè)和分析的分析物的能力提高的樣品遞呈裝置。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置能夠?qū)⒎治鑫飳?dǎo)向經(jīng)設(shè)計(jì)提高了分析物檢測(cè)的高靈敏度的分析區(qū)。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置改進(jìn)了分析物的沉積。
本發(fā)明樣品遞呈裝置還可包括能夠接受和保留的液體樣品體積高達(dá)約100μL、至少高達(dá)約70μL的裝置。本發(fā)明樣品遞呈裝置也可用作樣品定位裝置，它用于指導(dǎo)分析物沉積在小于約2平方毫米(2mm2)、優(yōu)選小于約1mm2的表面積上。引導(dǎo)分析物沉積到小于約1mm2的表面積上可有助于改進(jìn)分析物的沉積，同時(shí)自動(dòng)數(shù)據(jù)采集的容易性和檢測(cè)靈敏度增加。因此，本發(fā)明樣品遞呈裝置提供了在液體保持容量和分析物可控沉積方面很有實(shí)用性的表面。在優(yōu)選實(shí)施方式中，這種特征組合將相對(duì)于已知樣品支持物的檢測(cè)靈敏度從約4倍增加到約100倍以上。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明樣品遞呈裝置由基片組成，基片表面又由組織成同心排列的三個(gè)連續(xù)區(qū)域組成，其中液體保留區(qū)圍繞著中心分析區(qū)，邊界區(qū)圍繞著液體保留區(qū)?；蛘?，本發(fā)明樣品遞呈裝置可由基片組成，其表面又由組織成相鄰排列的三個(gè)連續(xù)區(qū)域組成，其中分析區(qū)的一部分和液體保留區(qū)的一部分互相連續(xù)，共有邊界區(qū)圍繞著互不連續(xù)的分析區(qū)和液體保留區(qū)的這些部分。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的一個(gè)實(shí)施方式中，分析區(qū)表面的接觸角優(yōu)選小于約40°，更優(yōu)選小于約30°，最優(yōu)選小于約20°。分析區(qū)表面優(yōu)選與分析物的親和或結(jié)合最小。液體保留區(qū)表面的接觸角優(yōu)選約為40°-95°，更優(yōu)選約為60°-95°，最優(yōu)選約為80°-95°，而且優(yōu)選與分析物的親和或結(jié)合最小。邊界區(qū)表面的接觸角優(yōu)選大于約95°，更優(yōu)選大于約105°，最優(yōu)選大于約115°，而且優(yōu)選對(duì)液體樣品的潤(rùn)濕性最小。
在本發(fā)明樣品遞呈裝置的另一實(shí)施方式中，分析區(qū)的接觸角比液體保留區(qū)的接觸角小至少約10°，優(yōu)選至少約20°，更優(yōu)選至少約30°，最優(yōu)選至少約40°，其中液體保留區(qū)的接觸角比邊界區(qū)的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約15°，最優(yōu)選小至少約20°。在本發(fā)明樣品遞呈裝置的一個(gè)實(shí)施方式中，液體保留區(qū)的表面積優(yōu)選比分析區(qū)的表面積大至少約4倍，更優(yōu)選大至少約10倍，最優(yōu)選大至少約50倍，分析區(qū)的表面積優(yōu)選小于約1mm2，更優(yōu)選約為0.2mm2-0.8mm2，最優(yōu)選約為0.4mm2-0.6mm2。
本發(fā)明樣品遞呈裝置還可由基片組成，其中基片表面還可由(但不限于)1-1536對(duì)分析區(qū)和液體保留區(qū)組成，分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)排列成同心對(duì)或相鄰對(duì)，共有邊界區(qū)圍繞著分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)。由多對(duì)分析區(qū)和液體保留區(qū)組成的樣品遞呈裝置優(yōu)選構(gòu)建成類似于標(biāo)準(zhǔn)96孔板、384孔板和1536孔板的形式，以與標(biāo)準(zhǔn)化多孔板處理器和實(shí)驗(yàn)室液體處理機(jī)器人相容。
附圖描述以下描述僅為示范性，補(bǔ)充其它所述本發(fā)明公開(kāi)，不限制本發(fā)明范圍。
參照?qǐng)D1a和1b，說(shuō)明了本發(fā)明樣品遞呈裝置，顯示基片1，基片表面又由組織成同心排列的三個(gè)連續(xù)區(qū)域組成，其中液體保留區(qū)3圍繞著中心分析區(qū)2，邊界區(qū)4圍繞著液體保留區(qū)3。分析區(qū)2表面的接觸角優(yōu)選小于約40°，更優(yōu)選小于約30°，最優(yōu)選小于約20°，而且優(yōu)選與分析物的結(jié)合最小。液體保留區(qū)3表面的接觸角優(yōu)選約為40°-95°，更優(yōu)選約為60°-95°，最優(yōu)選約為80°-95°，而且優(yōu)選與分析物的結(jié)合最小。邊界區(qū)4表面的接觸角優(yōu)選大于約95°，更優(yōu)選大于約105°，最優(yōu)選大于約115°，而且優(yōu)選對(duì)液體樣品潤(rùn)濕性最小。
參照?qǐng)D1a和1b，本發(fā)明樣品遞呈裝置的優(yōu)選實(shí)施方式是具有以下特征的裝置分析區(qū)2的接觸角比液體保留區(qū)3的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約20°，更優(yōu)選小至少約30°，最優(yōu)選小至少約40°；液體保留區(qū)3的接觸角比邊界區(qū)4的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約15°，最優(yōu)選小至少約20°；液體保留區(qū)3的表面積比分析區(qū)2的表面積優(yōu)選大至少約4倍，更優(yōu)選大至少約10倍，最優(yōu)選大至少約50倍；分析區(qū)2的表面積優(yōu)選小于約2mm2，更優(yōu)選約為0.2mm2-1.8mm2，最優(yōu)選約為0.4mm2-1.6mm2。
參照?qǐng)D2，本發(fā)明樣品遞呈裝置由基片5組成，其表面進(jìn)一步由16個(gè)分析區(qū)6和液體保留區(qū)7的同心對(duì)組成，共有邊界區(qū)8圍繞著所有這些同心對(duì)。在這種情況下，將靶點(diǎn)和液體保留區(qū)對(duì)排列在可使六個(gè)這種裝置組合成對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)96孔板的形式的9mm中心上。
參見(jiàn)圖2，本發(fā)明樣品遞呈裝置的優(yōu)選實(shí)施方式是具有以下特征的裝置分析區(qū)6的接觸角比液體保留區(qū)7的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約20°，更優(yōu)選小至少約30°，最優(yōu)選小至少約40°；液體保留區(qū)7的接觸角比邊界區(qū)8的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約15°，最優(yōu)選小至少約20°；液體保留區(qū)7的表面積比分析區(qū)6的表面積優(yōu)選大至少約4倍，更優(yōu)選大至少約10倍，最優(yōu)選大至少約50倍；分析區(qū)6的表面積優(yōu)選小于約2mm2，更優(yōu)選約為0.2mm2-1.8mm2，最優(yōu)選約為0.4mm2-1.6mm2。
重要的是，必須注意到分析區(qū)或液體保留區(qū)都不必呈圖1a所示的圓形。分析區(qū)和液體保留區(qū)可以采取相對(duì)于某具體應(yīng)用來(lái)優(yōu)化樣品遞呈裝置的性能時(shí)所需的各種形狀。此外，重要的是，必須注意到分析區(qū)或液體保留區(qū)不必如圖1a和2所示互相同心。分析區(qū)和液體保留區(qū)可根據(jù)相對(duì)于某具體應(yīng)用來(lái)優(yōu)化樣品遞呈裝置的性能的需要來(lái)定位。
參照?qǐng)D3，本發(fā)明樣品遞呈裝置由基片9組成，基片9的表面進(jìn)一步由組織成相鄰排列的三個(gè)連續(xù)區(qū)域組成，其中分析區(qū)10的一部分和液體保留區(qū)11的一部分互相連續(xù)，共有邊界區(qū)12圍繞著互不連續(xù)的分析區(qū)和液體保留區(qū)的這些部分。分析區(qū)10表面的接觸角優(yōu)選小于約40°，更優(yōu)選小于約30°，最優(yōu)選小于約20°，而且優(yōu)選與分析物的結(jié)合最小。液體保留區(qū)11表面的接觸角優(yōu)選約為40°-95°，更優(yōu)選約為60°-95°，最優(yōu)選約為80°-95°，而且優(yōu)選與分析物的結(jié)合最小。邊界區(qū)12表面的接觸角優(yōu)選大于約95°，更優(yōu)選大于約105°，最優(yōu)選大于約115°，而且優(yōu)選相對(duì)于液體樣品的潤(rùn)濕性最小。
還參見(jiàn)圖3，本發(fā)明樣品遞呈裝置的優(yōu)選實(shí)施方式是具有以下特征的裝置分析區(qū)10的接觸角比液體保留區(qū)11的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約20°，更優(yōu)選小至少約30°，最優(yōu)選小至少約40°；液體保留區(qū)11的接觸角比邊界區(qū)12的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約15°，最優(yōu)選小至少約20°；液體保留區(qū)11的表面積比分析區(qū)10的表面積優(yōu)選大至少約4倍，更優(yōu)選大至少約10倍，最優(yōu)選大至少約50倍；分析區(qū)10的表面積優(yōu)選小于約1mm2，更優(yōu)選約為0.2mm2-0.8mm2，最優(yōu)選約為0.4mm2-0.6mm2。
重要的是，必須注意到分析區(qū)或液體保留區(qū)都不必呈圖1a、2和3所示的圓形。分析區(qū)和液體保留區(qū)可以采取相對(duì)于某具體應(yīng)用來(lái)優(yōu)化樣品遞呈裝置的性能時(shí)所需的各種形狀。
參照?qǐng)D4a，本發(fā)明樣品遞呈裝置由基片13組成，基片13的表面進(jìn)一步由組織成同心排列的三個(gè)連續(xù)區(qū)域組成，其中液體保留區(qū)15圍繞著中心分析區(qū)14，邊界區(qū)16圍繞著液體保留區(qū)15。參照?qǐng)D4b，分析區(qū)14的形狀(正方形)可有助于自動(dòng)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因?yàn)樗拇笮?duì)應(yīng)于36個(gè)區(qū)的光柵。
參照?qǐng)D5，本發(fā)明樣品遞呈裝置由基片17組成，基片17由96對(duì)分析區(qū)18和液體保留區(qū)19組成，共有邊界區(qū)20圍繞著所有這些分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)。在這種情況下，將這些同心對(duì)排列在對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)96孔板的9mm中心上。延長(zhǎng)液體保留區(qū)19，以最大程度增加液體保持容量并最大程度減小各排中相鄰區(qū)域的間距。將蛇形圖案覆蓋在前兩排樣品遞呈裝置上，說(shuō)明在自動(dòng)組分收集期間色譜洗出液的液流沉積的路徑。
還參見(jiàn)圖5，本發(fā)明樣品遞呈裝置的優(yōu)選實(shí)施方式是具有以下特征的裝置分析區(qū)18的接觸角比液體保留區(qū)19的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約20°，更優(yōu)選小至少約30°，最優(yōu)選小至少約40°；液體保留區(qū)19的接觸角比邊界區(qū)20的接觸角優(yōu)選小至少約10°，更優(yōu)選小至少約15°，最優(yōu)選小至少約20°；液體保留區(qū)19的表面積比分析區(qū)18的表面積優(yōu)選大至少約4倍，更優(yōu)選大至少約10倍，最優(yōu)選大至少約50倍；分析區(qū)18的表面積優(yōu)選小于約2mm2，更優(yōu)選約為0.2mm2-1.8mm2，最優(yōu)選約為0.4mm2-1.6mm2。
樣品遞呈裝置的制造本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括產(chǎn)生或制造上述樣品遞呈裝置的方法。例如，在表面由一個(gè)或多個(gè)自身組裝單層(SAM)組成(根據(jù)所用SAM的不同形成不同區(qū)域)的實(shí)施方式中，本發(fā)明樣品遞呈裝置可包括由已知光致圖案化技術(shù)產(chǎn)生的各種SAM區(qū)。因此，本發(fā)明還包括用光致圖案化技術(shù)(一種優(yōu)選方法)產(chǎn)生由SAM組成的樣品遞呈裝置的方法。
更常見(jiàn)地，一般用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾或圖案化本發(fā)明樣品遞呈裝置的基片表面。例如，可用施加一個(gè)或多個(gè)自身組裝單層(SAM)的方法修飾或圖案化基片表面，這種方法修飾樣品遞呈裝置的基片表面，并且其暴露的表面可賦予基片特定的化學(xué)特性。為具體基片選擇各種SAM，包括1°、2°、3°或4°組合物，以將獨(dú)特的表面特征和特性提供給基片表面。具體說(shuō)，施加多種SAM導(dǎo)致基片圖案化，以使其含有多個(gè)區(qū)域，各區(qū)域具有不同的表面特征和特性。圖案化SAM的方法是本領(lǐng)域已知的，包括UV光致圖案化、照相平板圖案化、微模壓、電子束圖案化和活性離子蝕刻。
在基片表面上產(chǎn)生的區(qū)域可以是任何形狀，優(yōu)選圓形。此外，這些區(qū)域可以互相連續(xù)或不連續(xù)-即這些區(qū)域可以全部互相連續(xù)，或者一個(gè)或多個(gè)區(qū)域可以與另外的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域不連續(xù)。在樣品遞呈裝置的基片表面上產(chǎn)生的區(qū)域優(yōu)選具有對(duì)待分析樣品潤(rùn)濕性不同的多個(gè)區(qū)域。
作為本發(fā)明另一實(shí)施方式，提供了制造能夠準(zhǔn)確定位分析物以幫助自動(dòng)數(shù)據(jù)采集的樣品遞呈裝置的方法。
更具體說(shuō)，以下描述了表面圖案化方法、合適基片的選擇、自身組裝單層的制備以及進(jìn)行表面修飾的其它方法。這些描述僅為示范性，不限制本發(fā)明范圍。
用以下幾種方法之一使本發(fā)明樣品遞呈裝置的表面圖案化，這些方法優(yōu)選包括但不限于(1)UV-光致圖案化由錢幣金屬表面上的烷基硫醇制備的自身組裝單層(SAM)；(2)照相平板圖案化由錢幣金屬表面上的烷基硫醇制備的SAM；(3)微模壓由錢幣金屬表面上的烷基硫醇制備的SAM；和(4)照相平板圖案化由硅或玻璃表面上的烷基硅烷制備的SAM；(5)電子束圖案化和(6)活性離子蝕刻。優(yōu)選通過(guò)應(yīng)用美國(guó)專利號(hào)5,514,501所述UV-光致圖案化方法，或美國(guó)專利號(hào)5,512,131所述微模壓方法實(shí)現(xiàn)樣品遞呈裝置表面的圖案化，將這兩項(xiàng)專利納入本文作參考?；蛘?，可通過(guò)文獻(xiàn)所述和本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的照相平板圖案化方法實(shí)現(xiàn)樣品遞呈裝置表面的圖案化。
參照?qǐng)D6a-6h，描述了由金上的烷基硫醇組成的SAM的UV-光致圖案化的逐步過(guò)程。最初，通過(guò)濕法和氬等離子體蝕刻結(jié)合的方法適當(dāng)?shù)厍鍧嵑线m基片21如硅晶片(750μm)。首先將鉻或鈦和鎢(9∶1)的粘附層(25-50μm)施加在硅晶片表面，然后施加金薄膜22(100-1000nm)。用根據(jù)金屬沉積(厚度)/單位時(shí)間調(diào)校的噴鍍(氣相淀積)法完成金屬沉積。可用完整硅晶片或從硅晶片上切割的單個(gè)塊進(jìn)行噴鍍。
參照?qǐng)D6b，將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第一單層23。然后用乙醇洗滌表面修飾的基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍铩Ｓ商峁┙佑|角大于約100°并且對(duì)液體樣品的潤(rùn)濕性最小的表面的烷基硫醇制備第一單層23。
參照?qǐng)D6c，將表面修飾的基片光致圖案化的方法如下在氧氣存在下通過(guò)第一掩膜24暴露于紫外線光源，以氧化暴露區(qū)域中存在的單體，從而產(chǎn)生與金表面親和力低的單體磺酸鹽(sulfonate)。掩膜25的開(kāi)孔(opening)導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。
參照?qǐng)D6d和6e，隨后洗滌金表面去除了單體磺酸鹽并提供未修飾的金區(qū)域26。將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第二單層27。然后用乙醇洗滌表面修飾的基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍铩Ｓ商峁┙佑|角約為40°-95°的表面、并提供與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硫醇制備第二單層27。
參照?qǐng)D6f，使圖案化基片進(jìn)一步光致圖案化的方法如下在氧氣存在下通過(guò)第二掩膜28暴露于紫外線光源，以氧化暴露區(qū)域中存在的單體，從而產(chǎn)生與金表面親和力低的單體磺酸鹽。掩膜29的開(kāi)孔導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。
參照?qǐng)D6g和6h，隨后洗滌金表面去除了單體磺酸鹽并提供未修飾的金區(qū)域30。將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第三單層31。然后用乙醇洗滌表面修飾的基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍?。由提供接觸角小于約40°、與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硫醇制備第三單層31。
以此方式，實(shí)施由金上的烷基硫醇制備的自身組裝單層的UV-光致圖案化的逐步過(guò)程，以制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。上述由金上的烷基硫醇制備的自身組裝單層的UV-光致圖案化方法是示范性的，本發(fā)明并不僅限于所述方法。
參照?qǐng)D7a-7h，描述了由金上的烷基硫醇組成的SAM的照相平板圖案化的逐步過(guò)程。適當(dāng)?shù)厍鍧嵑线m基片32如硅晶片，在該基片上噴鍍粘附層和金薄膜33(100-1000nm)。
參照?qǐng)D7b，將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第一單層34。然后用乙醇洗滌表面修飾的基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍?。由提供接觸角小于約40°、與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硫醇制備第一單層34。
參照?qǐng)D7c，在平板印刷之前用光致抗蝕劑35涂布表面修飾的基片。該抗蝕劑可以是陰性或陽(yáng)性。陰性抗蝕劑導(dǎo)致暴露區(qū)域中抗蝕劑的溶解性降低，從而相對(duì)于掩膜產(chǎn)生陰圖。陽(yáng)性抗蝕劑導(dǎo)致暴露區(qū)域中抗蝕劑的溶解性增加，從而相對(duì)于掩膜產(chǎn)生陽(yáng)圖。描述了陽(yáng)性抗蝕劑的應(yīng)用?？赏ㄟ^(guò)浸漬型方法施涂抗蝕劑，但優(yōu)選用旋涂器施涂。使用生產(chǎn)商推薦的抗蝕劑厚度和固化時(shí)間作為指南。
參照?qǐng)D7d，通過(guò)暴露于紫外線光源使表面修飾的基片光致圖案化，根據(jù)需要與所用具體抗蝕劑聯(lián)用?？捎稍S多通用材料制備光掩膜36，這些材料包括但不限于石英上的鉻、邁拉(Mylar)、乙酸酯(acetate)和金屬模板。掩膜37中的開(kāi)孔導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。
參照?qǐng)D7e，一開(kāi)始用所用抗蝕劑專用的市售溶液處理基片，該溶液能溶解暴露區(qū)域的抗蝕劑，而使未暴露于紫外線光源的區(qū)域38保持相對(duì)不溶。去除暴露的抗蝕劑后，可用氧等離子體或UV/臭氧處理來(lái)氧化暴露區(qū)域中的烷基硫醇單體，從而產(chǎn)生與金表面親和低的單體磺酸鹽。然后洗滌金表面以去除單體磺酸鹽并提供未修飾的金區(qū)域39。
參照?qǐng)D7f，將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第二單層40。然后用乙醇洗滌該基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍?。由提供接觸角為40°-95°、還提供與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硫醇制備第二單層40。
參照?qǐng)D7g和7h，通過(guò)再用已知能溶解未暴露的抗蝕劑的幾種有機(jī)溶劑之一(如丙酮、1-甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)等)洗滌該基片去除剩余的光致抗蝕劑38，在平板印刷之前用新鮮的光致抗蝕劑41涂布現(xiàn)在由兩個(gè)不同區(qū)域組成的圖案化基片，如上所述。
參照?qǐng)D7i和7j，通過(guò)第二光掩膜42暴露于紫外線光源，使圖案化基片光致圖案化，如上所述。掩膜43的開(kāi)孔導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。一開(kāi)始用所用抗蝕劑專用的市售溶液處理基片，該溶液能溶解暴露區(qū)域的抗蝕劑，而使未暴露于紫外線光源的區(qū)域44保持相對(duì)不溶。去除暴露的抗蝕劑后，可用氧等離子體或UV/臭氧處理來(lái)氧化暴露區(qū)域中的烷基硫醇單體，從而產(chǎn)生與金表面親和低的單體磺酸鹽。然后洗滌金表面以去除單體磺酸鹽并提供未修飾的金區(qū)域45。
參照?qǐng)D7k和7l，將基片放在含有0.05-5mM烷基硫醇的乙醇溶液中孵育1-24小時(shí)，以在金表面上組裝第三單層46。然后用乙醇洗滌該基片，以去除過(guò)量烷基硫醇，在氮?dú)饬髦懈稍?。由提供接觸角大于100°并且對(duì)液體樣品的潤(rùn)濕性最小的表面的烷基硫醇制備第三單層46。最后，通過(guò)再用已知能溶解未暴露的抗蝕劑的幾種有機(jī)溶劑之一洗滌該基片去除剩余的光致抗蝕劑44，提供由三種不同區(qū)域組成的圖案化表面。
以此方式，實(shí)施由金上的烷基硫醇組成的SAM的照相平板圖案化的逐步過(guò)程，以制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。應(yīng)該注意到，可任意選擇所述圖案化的順序(分析區(qū)、然后是液體保留區(qū)、然后是邊界區(qū))，也證明顛倒的順序(邊界區(qū)、然后是液體保留區(qū)、然后是分析區(qū))與所述順序同樣適用。上述由金上的烷基硫醇制備的自身組裝單層的照相平板圖案化過(guò)程是示范性的，本發(fā)明并不僅限于所述方法。
許多烷基硫醇單體適用于制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。已經(jīng)描述了合成烷基硫醇單體，將它們組裝成單層以及根據(jù)組裝表面的表面張力對(duì)它們進(jìn)行分類(Laibinis，P.E.；Palmer，B.J.；Lee，S.-W.；Jennings，G.K.(1998)″合成有機(jī)硫醇并將它們組裝成金上的單層″(The Synthesis of Organothiols and Their Assembly into Monolayers onGold)，《薄膜》(Thin Films)，第24卷(Ulman，A.編)1-41頁(yè)，Academic Press，San Diego，CA)，納入本文作參考。
上述綜述文章根據(jù)組裝表面的表面能將烷基硫醇SAM相關(guān)的末端部分進(jìn)行分類。提供高潤(rùn)濕性表面并因此適合制備分析區(qū)單體的部分包括但不限于CO2H、B(OH)2、PO3H2、CONH2和OH。據(jù)報(bào)道，上述各部分能提供接觸角小于約40°的表面。通常來(lái)說(shuō)，提供高潤(rùn)濕性表面的部分由氫鍵受體、氫鍵供體及其組合組成。提供中等潤(rùn)濕性的表面并因此適合制備液體保留區(qū)單體的末端部分包括但不限于CN(60°，10)、O2CCH3(63°，11)、CO2CH3(67°，10)、NHCOCH3(68°，11)、SCOCH3(70°，11)、OCH3(74°，11)、CONHCH3(76°，11)、NHCOCF3(77°，11)和CO2CH2CH3(89°，10)。括號(hào)中顯示了與組裝表面相關(guān)的接觸角和相應(yīng)烷基鏈長(zhǎng)度。通常來(lái)說(shuō)，提供中等潤(rùn)濕性表面的部分傾向于由參與偶極-偶極相互作用的官能團(tuán)組成。提供最小潤(rùn)濕性表面并因此適合制備邊界區(qū)單體的末端部分包括但不限于O(CH2)2CH3(104°，11)、O(CH2)3CH3(113°，16)、NHCO(CF2)7CF3(114.5°，2)、O(CH2)4CH3(115°，16)、O(CH2)5CH3(115°，16)、OCH2CF2CF3(118°，11)和(CF2)5CF3(118°，2)。括號(hào)中顯示了與組裝表面相關(guān)的接觸角和相應(yīng)烷基鏈長(zhǎng)度。通常來(lái)說(shuō)，提供最小潤(rùn)濕性表面的部分傾向于由疏水和疏油的官能團(tuán)組成。
本發(fā)明樣品遞呈裝置的靶點(diǎn)和液體保留區(qū)優(yōu)選由在組裝表面上產(chǎn)生蛋白質(zhì)抗性的單體制備。根據(jù)蛋白質(zhì)吸附特異性鑒定了由金上的烷基硫醇制備的許多SAM。迄今報(bào)道的抵抗蛋白質(zhì)的大多數(shù)表面都獲自具有寡聚(環(huán)氧乙烷)(OCH2CH2)單元的單體。Prime和Whiteside首先描述了這些表面的用途(Prime，K.L.和Whitesides，G.M.J. Am.Chem.Soc.，1993，115，10714-21，納入本文作參考)。研究了抵抗蛋白質(zhì)吸附的表面的結(jié)構(gòu)-特性關(guān)系(Ostuni，E.；Chapman，R.G.；Holmlin，R.E.；Takayama，S.；Whitesides，G.M.Langmuir，2001，17，5605-5620，納入本文作參考)。近年來(lái)，已證明許多兩性SAM具有良好的抵抗蛋白質(zhì)吸附的特性(Holmlin，R.E.；Chen，X.；Chapman，R.G.；Takayama，S.；Whitesides，G.M.Langmuir，2001，17，2841-50，納入本文作參考)，因此這些兩性SAM由于組合了高潤(rùn)濕性表面和對(duì)蛋白質(zhì)吸附的良好抵抗而可能用作分析區(qū)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，由通式I的單體制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的分析區(qū)，通式I為HS(CH2)11-(OCH2CH2)mOH，式中m是3-7。此通式的單體提供接觸角約為30°-38°的表面。雖然這些表面的接觸角可能不是最低，但由于它們?cè)谧畲蟪潭冉档偷鞍踪|(zhì)結(jié)合方面的優(yōu)異性能，所以優(yōu)選使用它們。而且，通式I的分析區(qū)單體優(yōu)選與提供接觸角大于約60°的表面的液體保留區(qū)單體聯(lián)用。
類似和優(yōu)選地，由通式II的單體制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的液體保留區(qū)，通式II為HS(CH2)11-(OCH2CH2)mR，式中m＝3-7，R基團(tuán)是影響表面張力和潤(rùn)濕性的末端部分。R基團(tuán)優(yōu)選但不僅僅選自以下基團(tuán)之一OCH3、OCH2CN、CO2CH3、CONHCH3和CO2CH2CH3部分。上述各末端部分提供了接觸角約為62°-89°的表面。
或者和優(yōu)選地，可由式HS(CH2)11OCH2C6H5的單體制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的液體保留區(qū)。末端芐基部分(CH2C6H5)在處理溶解于有機(jī)溶劑的樣品時(shí)特別有用，并提供接觸角約為90°的表面。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，由對(duì)液體樣品產(chǎn)生最小潤(rùn)濕性的單體制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的邊界區(qū)，其中分析物溶解于水性緩沖液、有機(jī)溶劑和其混合物。已證明遞呈末端全氟化部分的單體在這個(gè)方面特別有用(Naud，C；Calas，P.；Blancou，H.；Commeyras，A.J Fluorine Chem.，2000，104，173-183，納入本文作參考)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是由式HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH的單體制備分析區(qū)、由式HS(CH2)11(OCH2CH2)3OCH3的單體制備液體保留區(qū)、由式HS(CH2)11OCH2CH2(CF2)5CF3的單體制備邊界區(qū)。此種單體組合提供了分析區(qū)、液體保留區(qū)和邊界區(qū)的接觸角分別約為38°、62°和117°的表面。
本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式是由式HS(CH2)11(OCH2CH2)3OH的單體制備分析區(qū)由式HS(CH2)11OCH2C6H5的單體制備液體保留區(qū)、由式HS(CH2)11OCH2CH2(CF2)5CF3的單體制備邊界區(qū)。此種單體組合提供了分析區(qū)、液體保留區(qū)和邊界區(qū)的接觸角分別約為38°、91°和117°的表面。
由兩種烷基硫醇單體制備了混合(二元)的自身組裝單層，以精確控制表面接觸角和潤(rùn)濕性。(Semal，S.；Bauthier，C；Voue，M.；Vanden Eynde，J.J.；Gouttebaron，R.；De Coninck，J.J.Phys.Chem.B，2000，104，6225-6232，納入本文作參考)。通過(guò)混合用于制備高潤(rùn)濕性和中等潤(rùn)濕性表面的單體在大于40°的范圍上調(diào)整接觸角。優(yōu)選用二元SAM制備分析區(qū)或液體保留區(qū)?；蛘撸刹捎萌退脑陨斫M裝單層制備分析區(qū)或液體保留區(qū)。分別由取代的烷基硫醇和雜取代的不對(duì)稱烷基二硫化物(即HS(CH2)11R1和R2(CH2)11S-S(CH2)11R3)或兩種不同取代的不對(duì)稱烷基二硫化物(即R1(CH2)11S-S(CH2)11R2和R3(CH2)11S-S(CH2)11R4)的二元混合物制備三元和四元SAM。
參照?qǐng)D8a-8l，描述了由硅上的烷基硅烷組成的SAM的照相平板圖案化的逐步過(guò)程。文獻(xiàn)中描述且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能通過(guò)與烷基二甲基氯代硅烷、烷基二甲基烷氧基硅烷，烷基三鹵代硅烷或烷基三烷氧基硅烷反應(yīng)來(lái)修飾硅和玻璃。
參照?qǐng)D8a，適當(dāng)?shù)鼗罨厦娉练e有二氧化硅的合適基片47如硅晶片，玻璃晶片或金屬基片，以共價(jià)連接于烷基硅烷，共價(jià)連接方法包括去除表面污染物，然后氧化表面產(chǎn)生硅醇(Si-OH)部分。優(yōu)選用氧等離子體簡(jiǎn)單處理該基片，用氧化性溶液(Piranha溶液)洗滌，然后再次用氧等離子體處理，提供平均硅醇密度達(dá)到4.9Si-OH/nm2的活化表面48。
參照?qǐng)D8b，表面活化后，在硅表面上組裝第一烷基硅烷單層49?？蓛H通過(guò)液相淀積或氣相淀積進(jìn)行硅烷化。優(yōu)選由提供接觸角大于100°而且對(duì)液體樣品的潤(rùn)濕性最小的表面的烷基硅烷制備第一烷基硅烷單層49。
參照?qǐng)D8c，在平板印刷之前用光致抗蝕劑50涂布硅烷化基片。該抗蝕劑可以是陰性或陽(yáng)性。陰性抗蝕劑導(dǎo)致暴露區(qū)域中抗蝕劑的溶解性降低，從而相對(duì)于掩膜產(chǎn)生陰圖。陽(yáng)性抗蝕劑導(dǎo)致暴露區(qū)域中抗蝕劑的溶解性增加，從而相對(duì)于掩膜產(chǎn)生陽(yáng)圖。整個(gè)圖6中描述了陽(yáng)性抗蝕劑的使用?？赏ㄟ^(guò)浸漬型方法施涂抗蝕劑，但優(yōu)選用旋涂器施涂。使用生產(chǎn)商推薦的抗蝕劑厚度和固化時(shí)間作為指南。
參照?qǐng)D8d，通過(guò)暴露于紫外線光源使該基片光致圖案化，根據(jù)需要與所用具體抗蝕劑聯(lián)用?？捎稍S多通用材料制備光掩膜51，這些材料包括但不限于石英上的鉻、邁拉(Mylar)、乙酸酯和金屬模板。掩膜52中的開(kāi)孔導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。
參照?qǐng)D8e和8f，一開(kāi)始用所用抗蝕劑專用的市售溶液處理基片，該溶液能溶解暴露區(qū)域的抗蝕劑，而使未暴露于紫外線光源的區(qū)域53保持相對(duì)不溶。去除暴露的抗蝕劑后，可用氧等離子體處理來(lái)活化表面54，以進(jìn)行進(jìn)一步硅烷化。在活化的硅表面上組裝第二烷基硅烷單層55。可僅通過(guò)液相淀積或氣相淀積進(jìn)行硅烷化。由提供接觸角約為40°-95°、還提供與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硅烷制備第二烷基硅烷單層55。
參照?qǐng)D8g和8h，通過(guò)再用已知能溶解未暴露的抗蝕劑的幾種有機(jī)溶劑之一(如丙酮、1-甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)等)洗滌該基片去除剩余的光致抗蝕劑53，在平板印刷之前用光致抗蝕劑56涂布由兩個(gè)不同區(qū)域組成的圖案化基片，如上所述。
參照?qǐng)D8i和8j，通過(guò)光掩膜57暴露于紫外線光源，使圖案化基片進(jìn)一步光致圖案化，如上所述。掩膜58的開(kāi)孔導(dǎo)致產(chǎn)生大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。然后用所用抗蝕劑專用的市售溶液處理基片，該溶液能溶解暴露區(qū)域的抗蝕劑，而使未暴露于紫外線光源的區(qū)域59保持相對(duì)不溶。去除暴露的抗蝕劑后，用氧等離子體處理來(lái)活化制備中的表面60，以進(jìn)行進(jìn)一步硅烷化。
參照?qǐng)D8k和8l，在活化的硅表面上組裝第三單層61?？蓛H通過(guò)液相淀積或氣相淀積進(jìn)行硅烷化。由提供接觸角小于約40°、還提供與分析物結(jié)合最小的表面的烷基硅烷制備第三烷基硅烷單層61。最后，通過(guò)再用已知能溶解未暴露的抗蝕劑的幾種有機(jī)溶劑之一洗滌該基片去除剩余的光致抗蝕劑59，提供由三種不同區(qū)域組成的圖案化表面。
以此方式，實(shí)施由硅上的烷基硅烷制備的SAM的照相平板圖案化的逐步過(guò)程，以制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。應(yīng)該注意到，可任意選擇所述圖案化的順序(邊界區(qū)、然后是液體保留區(qū)、然后是分析區(qū))，也證明顛倒的順序(分析區(qū)、然后是液體保留區(qū)、然后是邊界區(qū))與所述順序同樣適用。上述由硅上的烷基硅烷制備的自身組裝單層的照相平板圖案化方法是示范性的，本發(fā)明并不僅限于上述方法。
許多烷基硅烷適合用于制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。烷基硅烷大部分是市售的，應(yīng)該了解它們的合成和在表面修飾中的應(yīng)用。(Shriver-Lake，L.C.(1998)″用于生物材料固定的硅烷-修飾表面″(Silane-modified surfaces for biomaterial immobilization)《分析中固定的生物分子實(shí)用方法》(Immobilized Biomolecules in AnalysisA PracticalApproach)(Cass，T.和Ligler，F(xiàn).S.編)，第1章，Oxford University Press，Oxford，UK，納入本文作參考)。
采用與上述方法有些不同的方法，首先可用合適烷基硅烷衍生活化的硅表面，合適烷基硅烷具有通過(guò)加上產(chǎn)生所需潤(rùn)濕性的末端部分而進(jìn)一步官能化的親核部分?；蛘?，當(dāng)可獲得具有合適末端部分的烷基硅烷時(shí)，可在一個(gè)步驟中修飾表面。適合用于制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的末端部分包括但不限于上述部分。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，一開(kāi)始由3-氨基丙基三甲氧基硅烷制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的分析區(qū)，然后進(jìn)一步官能化，以提供通式III的固定化硅烷，通式III為(XO)3Si-CH2CH2CH2NHCOCH2(OCH2CH2)nOH，其中X是與硅表面或相鄰固定化硅烷的連接，n為4-8。通式III的單體提供接觸角約為30°-40°的表面。雖然這些表面可能接觸角不是最低，但由于它們?cè)谧畲蟪潭冉档偷鞍踪|(zhì)結(jié)合方面的優(yōu)異性能，所以優(yōu)選使用它們。而且，通式III的分析區(qū)單體優(yōu)選與提供接觸角大于約60°的表面的液體保留區(qū)單體聯(lián)用。
類似和優(yōu)選地，一開(kāi)始由3-氨基丙基三甲氧基硅烷制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的液體保留區(qū)，然后進(jìn)一步官能化，以提供通式IV的固定化硅烷，通式IV為(XO)3SiCH2CH2CH2NHCOCH2(OCH2CH2)nR′，其中X是與基片或相鄰單體的連接，n為4-8，R′基團(tuán)是影響表面張力和潤(rùn)濕性的末端部分。R′基團(tuán)優(yōu)選但不僅僅選自以下基團(tuán)之一CH3、CH2CN、CH2CO2CH3、CH2CONHCH3和CH2CO2CH2CH3部分。上述各末端部分提供了接觸角約為60°-90°的表面。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，在一個(gè)步驟中由對(duì)水性樣品潤(rùn)濕性最小的通式V的烷基硅烷制備本發(fā)明樣品遞呈裝置的邊界區(qū)，通式V為(CH3)2(X′)SiCH2CH2-(CF2)7CF3，其中X′是表面活性部分。
可用各種其它表面修飾化學(xué)和表面圖案化方法制備本發(fā)明樣品遞呈裝置。在蛋白質(zhì)抗性表面的圖案化方面，近年來(lái)聚合物組合物引起了人們的興趣。一開(kāi)始由烷基硫醇或烷基硅烷SAM制備的圖案化表面通過(guò)以下方法進(jìn)一步官能化將聚合物組合物接枝(graft)到表面上或使表面上生長(zhǎng)出聚合物組合物(如Husemann，M.；Mecerreyes，D.；Hawker，J.L.；Hedrick，R.S.；Abbott，N.L.Angew.Chem.Int.Ed.1999，35，647-649；Shah，R.R.；Merreceyes，D.；Husemann，M.；Rees，L；Abbott，N.L.；Hawker，C.J.；Hedrick，J.L.Macromolecules 2000，33，597-605；Hyun，J.和Chilkoti，A.Macromolecules 2001，34，5644-5652，將這些文獻(xiàn)納入本文作參考)。近年來(lái)，出現(xiàn)了通過(guò)嵌段共聚物的吸附進(jìn)行表面圖案化的第一則報(bào)道(Deng，T.；Ha，Y.-H.；Cheng，J，Y.；Ross，C.A.；Thomas，E.L.Langmuir，2002，75，6719-6722，納入本文作參考)。已證明，接枝于SAM的聚合物薄膜抵抗蛋白質(zhì)吸附的程度與遞呈三(乙二醇)基團(tuán)的SAM相當(dāng)或比它更好(Chapman，R.G.；Ostuni，E.；Liang，M.N.；Meluleni，G.；Kim，E.；Yan，L.；Pier，G.；Warren，H.S.；Whitesides，G.M.Langmuir 2001，77，1225-1233，納入本文作參考)。
應(yīng)理解，即使?jié)櫇裥宰钚〉谋砻嬉部赡鼙３忠后w樣品的某些部分，即使僅以非特異性方式。這種表面實(shí)際上可通過(guò)以下方式產(chǎn)生本發(fā)明樣品遞呈裝置的優(yōu)點(diǎn)(例如)增強(qiáng)它們通過(guò)去除不是后續(xù)分析靶點(diǎn)的部分來(lái)增強(qiáng)濃縮分析物的能力。這尤其可用于保留可能干擾分析物分析的非生物部分的情況。然而，樣品遞呈裝置的表面不僅限于這個(gè)例子，還可包括在分析區(qū)以外的區(qū)域中結(jié)合可與含有分析物的樣品分開(kāi)處理或加工的部分的表面。實(shí)際上，可用分析生化方法分析的任何部分均可用本發(fā)明樣品遞呈裝置保留、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和進(jìn)行后續(xù)分析。因此，本發(fā)明中，在潤(rùn)濕性程度最高的區(qū)域以外的區(qū)域保留一些部分是可能的，可能需要對(duì)這些部分進(jìn)行后續(xù)分析。然而，大量感興趣分析物一般不保留在潤(rùn)濕性程度最高的區(qū)域以外的區(qū)域中。因此，在用激光解吸光譜分析分析物的例子中，潤(rùn)濕性最高的區(qū)域中保留的靶分析物不從結(jié)合于樣品遞呈裝置表面的狀態(tài)解吸。
樣品遞呈裝置的用途和應(yīng)用以下對(duì)本發(fā)明樣品遞呈裝置各種用途和應(yīng)用對(duì)描述僅為示范性，不限制本發(fā)明范圍。
本發(fā)明樣品遞呈裝置發(fā)現(xiàn)本發(fā)明樣品遞呈裝置可與各種分析技術(shù)和步驟聯(lián)用。因此，本發(fā)明包括使用上述樣品遞呈裝置的方法。更具體說(shuō)，本發(fā)明包括用本發(fā)明樣品遞呈裝置(在一個(gè)樣品遞呈裝置或多個(gè)樣品遞呈裝置上)鑒定樣品中是否存在分析物和分析多種樣品的方法。
可以檢測(cè)、鑒定或測(cè)定液體樣品中分析物的任何分析方法基本上均可與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用。這些分析方法的例子包括但不限于MALDI-MS或電霧化電離MS。對(duì)我們來(lái)說(shuō)，該樣品遞呈裝置尤其適合與高通量分析測(cè)定技術(shù)聯(lián)用，例如，用于MALDI-MS，其中構(gòu)建樣品遞呈裝置分析區(qū)以促進(jìn)高通量數(shù)據(jù)采集。也可用本發(fā)明樣品遞呈裝置操作液體樣品和其中所含的分析物。根據(jù)樣品遞呈裝置表面經(jīng)設(shè)計(jì)可具有的不同的潤(rùn)濕性特性和捕獲特性，可設(shè)計(jì)樣品遞呈裝置使其操作、濃縮、定位、貯存、轉(zhuǎn)移(用或不用機(jī)械介入)、回收(用或不用機(jī)械介入)、分析、修飾或加工(在樣品遞呈裝置上使用分析物修飾試劑)、或分餾液體樣品或其中所含分析物。而且，因?yàn)榭稍O(shè)計(jì)本發(fā)明樣品遞呈裝置使其響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(如加熱、UV輻射、加壓、電磁輻射)完成任何這些功能，本發(fā)明樣品遞呈裝置可以可逆地或不可逆地完成這些功能，并且還可響應(yīng)于外力進(jìn)行這些功能的各種組合。
基本上任何液體樣品(和分析物)均可與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用。例如，可用本發(fā)明分析從液相色譜回收的組分?？捎帽景l(fā)明分析酶消化物，這些酶消化物是用由2D凝膠電泳上剪下的蛋白質(zhì)點(diǎn)或由親和色譜收集的組分(即ICAT)制備的。也可用本發(fā)明分析從表面等離子共振生物傳感器中回收的樣品。本發(fā)明也可用于用標(biāo)準(zhǔn)多孔形式的機(jī)器人和測(cè)定進(jìn)行1∶1樣品轉(zhuǎn)移。實(shí)際上，可用本發(fā)明樣品遞呈裝置處理和操作獲自基本上任何來(lái)源的液體樣品，無(wú)論這種樣品是實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如上述酶消化物或表面等離子共振生物傳感器樣品的例子)，獲自環(huán)境的樣品(如來(lái)自江河的水質(zhì)樣品)，或者直接獲自活生物的樣品(如人尿樣品)。
本發(fā)明也可用于儲(chǔ)存樣品，用于存檔目的或進(jìn)一步分析。換句話說(shuō)，不需要在將液體樣品轉(zhuǎn)移到分析區(qū)后立即檢測(cè)和分析液體樣品中所含分析物。
因此，本發(fā)明各種實(shí)施方式提供了具有各種液體處理功能的樣品遞呈裝置，包括但不限于樣品/分析物處理，以及液體沉積、保留、轉(zhuǎn)移、定位和再定位以及儲(chǔ)存。提供了本發(fā)明樣品遞呈裝置的這些用途的一些例子。
參照?qǐng)D9a-9f，說(shuō)明了樣品干燥方法中的各個(gè)步驟。本發(fā)明樣品遞呈裝置的橫截面圖顯示在由三個(gè)不同區(qū)域組成的基片62上沉積的表面，其中液體保留區(qū)64圍繞著中心分析區(qū)63，邊界區(qū)65圍繞著液體保留區(qū)64。
參照?qǐng)D9b，在樣品遞呈裝置表面上沉積液體樣品液滴66一開(kāi)始導(dǎo)致將樣品液滴體積同時(shí)限定在分析區(qū)63和液體保留區(qū)64的表面上。與邊界區(qū)65有限的潤(rùn)濕性相關(guān)的表面張力產(chǎn)生了樣品液滴限定。沉積后，樣品液滴的接觸角約等于僅存在于液體保留區(qū)的液滴的接觸角。
參照?qǐng)D9c-9e，隨著樣品液滴由于蒸發(fā)而干燥，液滴的半徑和接觸角減小，直到液滴的半徑對(duì)應(yīng)于分析區(qū)半徑。
參照?qǐng)D9f，當(dāng)樣品液滴67的半徑和分析區(qū)63的半徑對(duì)應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣品液滴的接觸角約等于存在于分析區(qū)的液滴。隨著樣品液滴繼續(xù)因蒸發(fā)而干燥，樣品液滴的半徑不進(jìn)一步減小，而保持恒定，因?yàn)榉治鑫镌诜治鰠^(qū)表面上沉積為一層薄膜。以此方式，將體積可變(高達(dá)約100μL)的水性樣品沉積在樣品遞呈裝置表面上，干燥后提供限定在對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的面積中的一層分析物薄膜。
例如，本發(fā)明樣品遞呈裝置具有直徑為3.0mm(表面積約7.069mm2)的液體保留區(qū)和直徑為0.5mm(表面積約0.196mm2)的分析區(qū)，該裝置將分析物的沉積限定在比液體保留區(qū)的表面積小約36倍的分析區(qū)表面積上，伴隨著平均表面分析物濃度增加約36倍。因此，原理上上述樣品液滴干燥方法可能使靈敏度提高約36倍。
參照?qǐng)D10a-10d，在不存在分析區(qū)(僅存在液體保留區(qū)68和邊界區(qū)69)的情況下，樣品液滴70干燥時(shí)半徑不顯著減小，導(dǎo)致分析物沉積在液體保留區(qū)71的大部分表面上。參照?qǐng)D10e-10h，在不存在液體保留區(qū)(僅存在分析區(qū)72和邊界區(qū)73)的情況下，樣品液滴74的體積受限于分析區(qū)72的液體保持容量。樣品液滴74干燥時(shí)半徑不顯著減小，導(dǎo)致分析物沉積在分析區(qū)75的大部分表面上。
圖9b-9f所述方法使檢測(cè)靈敏度顯著增加。參照?qǐng)D9a-9d以及圖10a-10d能最好地理解此現(xiàn)象。在不存在分析區(qū)的情況下(參見(jiàn)圖10a)，在圖10a所示液體保留區(qū)68中每單位面積的平均分析物表面濃度等于總分析物濃度除以表面積。然而，在圖9a中存在分析區(qū)的情況下，分析物的沉積限定于分析區(qū)，其中每單位面積的平均分析物表面濃度等于總分析物濃度除以分析區(qū)的表面積。因此，如圖9a所示，存在分析區(qū)63能使分析物的平均表面濃度增加，增加程度等于圖10a所示液體保留區(qū)68的表面積與圖9a所示分析區(qū)63的表面積之比。由于分析區(qū)表面積顯著小于液體保留區(qū)的表面積，所以將分析物沉積限定于分析區(qū)表面積導(dǎo)致遞呈給質(zhì)譜儀的分析物的平均表面濃度顯著增加，伴隨著檢測(cè)靈敏度增加。
例如，本發(fā)明樣品遞呈裝置具有直徑為3.0mm(表面積約7.069mm2)的液體保留區(qū)和直徑為0.5mm(表面積約0.196mm2)的分析區(qū)，該裝置將分析物的沉積限定在比液體保留區(qū)的表面積小約36倍的分析區(qū)表面積上，伴隨著平均表面分析物濃度增加約36倍。因此，原理上上述樣品液滴干燥方法可能使靈敏度提高約36倍。
在圖11a-11h所示視頻接觸角圖像中證明了分析區(qū)的分析物限定特性，該特性使檢測(cè)靈敏度增加。參照?qǐng)D11a，將約1.6mm OD的液體保留區(qū)和約0.7mm OD的分析區(qū)裝在本發(fā)明樣品遞呈裝置上。為了便于觀察集中效果，將分析區(qū)安置在偏離中心的位置。將一滴水施加于生物芯片表面，觀察到它迅速將自己限定于對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)和分析區(qū)的表面積中。記錄左側(cè)和右側(cè)的起始接觸角，發(fā)現(xiàn)它們都是57.1°，該值對(duì)應(yīng)于僅由液體保留區(qū)單體制備的表面具有的值。隨著液滴因?yàn)檎舭l(fā)而干燥(參見(jiàn)圖11b-11h)，觀察到的半徑和接觸角都下降，直到液滴半徑對(duì)應(yīng)于分析區(qū)。而且，隨著液滴干燥，觀察到液滴的中心移動(dòng)到右邊，以致液滴在分析區(qū)上自發(fā)置中。發(fā)現(xiàn)圖11h中記錄的左側(cè)和右側(cè)接觸角都是35.4°，該值對(duì)應(yīng)于僅由分析區(qū)單體制備的表面具有的值。圖12中以圖表小結(jié)了與圖11a-11h所示圖像獲取一起記錄的液滴高度、寬度和接觸角數(shù)據(jù)。
圖13顯示了液體保留區(qū)出色的液體保持容量。本發(fā)明16-位點(diǎn)樣品遞呈裝置圖顯示了保留的樣品液滴體積為5μL-70μL?？雌饋?lái)顯著限制樣品液體體積的唯一因素是相鄰的分析區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)的相對(duì)鄰近。
圖14a和14b進(jìn)一步證明了分析區(qū)的分析物限定特性。第一幅圖(圖14a)是本發(fā)明16-位點(diǎn)樣品遞呈裝置，在16個(gè)位點(diǎn)中8個(gè)位點(diǎn)的表面上沉積的樣品液滴體積范圍5μL-40μL。各樣品液滴含有等量可溶性染料。第二幅圖(圖12b)是樣品液體干燥后相同的樣品遞呈裝置。現(xiàn)在染料沉積在與分析區(qū)相鄰的生物芯片表面上。分析區(qū)和液體保留區(qū)的相對(duì)大小重疊在生物芯片上，以進(jìn)行比較。在這種情況下，需要過(guò)量染料提供可見(jiàn)物質(zhì)，導(dǎo)致不存在緊密集中的分析物點(diǎn)。
可用本發(fā)明樣品遞呈裝置幫助以高靈敏度對(duì)選自(但不限于)下組的化學(xué)和生物分析物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)生物大分子如肽、蛋白質(zhì)、酶、酶底物、酶底物類似物、酶抑制劑、多核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、寡糖、多糖、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、外源凝集素、胃蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、蛋白A、凝集素、肝素、蛋白G、伴刀豆球蛋白；上述生物大分子的片段，如核酸片段、肽片段和蛋白質(zhì)片段；上述生物大分子的復(fù)合物，如核酸復(fù)合物、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物、基因轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、基因翻譯復(fù)合物、膜、脂質(zhì)體、膜受體、受體配體復(fù)合物、信號(hào)傳導(dǎo)途徑復(fù)合物、酶底物、酶抑制劑、肽復(fù)合物、蛋白質(zhì)復(fù)合物、糖復(fù)合物和多糖復(fù)合物；以及小生物分子如氨基酸、核苷酸、核苷、糖、類固醇、脂質(zhì)、金屬離子、藥物、激素、酰胺、胺、羧酸、維生素和輔酶、醇、醛、酮、脂肪酸、卟啉、類胡羅卜素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、磷酸酯和二磷酸核苷糖(nucleoside diphosphosugar)；合成小分子如藥物或治療性有效物質(zhì)、單體、肽類似物、類固醇類似物、抑制劑、誘變劑、致癌物、抗有絲分裂藥、抗生素、離子載體、抗代謝物、氨基酸類似物、抗菌劑、運(yùn)輸抑制劑、表面活性劑、含胺的組合文庫(kù)、染料、毒素、生物素、生物素化化合物、DNA、RNA、賴氨酸、乙酰葡糖胺、普施安紅(procion red)、谷胱甘肽、單磷酸腺苷、線粒體和葉綠體功能抑制劑、電子供體、運(yùn)載體和受體、蛋白酶的合成底物和類似物、磷酸酶的底物和類似物、酯酶和脂酶的底物和類似物以及蛋白質(zhì)修飾試劑。而且，可用本發(fā)明樣品遞呈裝置處理的分析物可以是非生物物質(zhì)，包括但不限于合成聚合物、如低聚物和共聚物如聚亞烷基、聚酰胺、聚(甲基)丙烯酸、聚砜、聚苯乙烯、聚醚、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚碳酸酯、聚乙烯基鹵化物、聚硅氧烷和上述任何兩種或多種物質(zhì)的共聚物，以及其它非生物分析物如殺蟲(chóng)劑。
分析物可溶解于水性緩沖液、有機(jī)溶劑或其混合物。緩沖液優(yōu)選選自由揮發(fā)性組分制備的緩沖液，包括但不限于乙酸銨、碳酸氫銨、碳酸銨、檸檬酸銨、三乙基乙酸銨和三乙基碳酸銨、三乙基甲酸銨、三甲基乙酸銨、三甲基碳酸銨和三甲基甲酸銨。應(yīng)該在分析之前對(duì)含有高濃度不揮發(fā)性去污劑(＞0.1％)的水性樣品脫鹽，因?yàn)槿ノ蹌┑拇嬖诳赡艿窒治鰠^(qū)的分析物限定特性。有機(jī)溶劑優(yōu)選選自已知可混合于水性緩沖液并能提高生物分析物的溶解性的溶劑，包括但不限于乙酸、丙酮、乙腈、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基亞砜(DMSO)、甲酸、七氟丁酸、甲醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、2，2，2-三氟乙醇和三氟乙酸。
在樣品干燥過(guò)程中可加熱樣品遞呈裝置(在加熱塊表面上、在紅外燈下或在熱空氣流中)，以幫助高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑揮發(fā)或僅僅減少樣品干燥所需的時(shí)間。
用本發(fā)明樣品遞呈裝置測(cè)定分析物的優(yōu)選分析方法--激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜需要將物質(zhì)(基質(zhì))施加在樣品遞呈裝置的表面上，以吸收能量，從而幫助電離分析物。常常用作生物分析物檢測(cè)的基質(zhì)的試劑包括反式-3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸，SA)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)和2，5-二羥基苯甲酸(DHBA)。由于上述基質(zhì)在水中的溶解性有限，這些試劑的儲(chǔ)存溶液常常含有50％-100％有機(jī)溶劑。當(dāng)與本發(fā)明樣品遞呈裝置聯(lián)用時(shí)，將含有基質(zhì)的儲(chǔ)存溶液加入水性樣品中，然后將該樣品施加在樣品遞呈裝置表面上。或者，可在樣品沉積和干燥后將含有基質(zhì)的儲(chǔ)存溶液施加在樣品遞呈裝置上。在這種情況下，優(yōu)選用含有高百分?jǐn)?shù)有機(jī)溶劑的儲(chǔ)存溶液以最大程度減少沉積在分析區(qū)表面上的分析物溶解到儲(chǔ)存溶液中。
可用本發(fā)明樣品遞呈裝置進(jìn)行許多應(yīng)用。可用于本發(fā)明的樣品類型的例子包括但不限于在分析之前不進(jìn)行任何加工而直接分析的樣品，以及由于分析該樣品之前進(jìn)行了一些加工而間接分析的樣品。
屬于在分析之前不進(jìn)行任何加工而直接分析的樣品類型的可用于本發(fā)明的樣品類型例子包括但不限于生物液體；組織和細(xì)胞提取物和部分；細(xì)胞、細(xì)菌、病毒；培養(yǎng)基；環(huán)境液體；環(huán)境空氣取樣；環(huán)境介質(zhì)提取物(土壤提取物、固體廢物提取物、抹布的洗提物、空氣濾器的洗提物)；法醫(yī)樣品和文庫(kù)(組合化學(xué)、寡核苷酸、肽、糖、脂質(zhì)、細(xì)胞和組分；染色體和病毒以及其它大蛋白和核蛋白組合體)。
屬于間接分析即分析該樣品之前進(jìn)行了一些加工的樣品類型的可用于本發(fā)明的樣品類型例子包括但不限于液相色譜(LC)輸出物；氣相色譜(GC)輸出物；凝膠洗提物；LC輸出物或凝膠洗提物的消化樣品；質(zhì)譜輸出物；表面等離子共振(SPR)或其它生物傳感器的洗提物；脫鹽柱輸出物；固相提取輸出物；液相分餾的環(huán)境樣品；上述物質(zhì)的衍生樣品；和其它化學(xué)或物理方法和它們的任何組合。
本發(fā)明樣品遞呈裝置還有助于對(duì)從進(jìn)行液相柱色譜或電泳的分餾方案回收的生物分析物進(jìn)行質(zhì)譜分析。具體說(shuō)，由于將該裝置的液體保持容量(它使得能夠直接收集色譜餾分、用電泳純化的樣品、從樣品遞呈裝置回收的樣品和之前樣品體積未減少的由生物傳感器回收的樣品)以及樣品的精確定位和檢測(cè)靈敏度提高(這使得能夠進(jìn)行自動(dòng)數(shù)據(jù)采集)的組合得到了該應(yīng)用。本發(fā)明樣品遞呈裝置提供的液體保持容量使得能夠直接收集從(但不限于)以下技術(shù)回收的組分親和色譜、疏水相互作用色譜、離子交換色譜、固定金屬離子親和色譜和大小排阻色譜，以及通過(guò)連續(xù)應(yīng)用兩種或多種列舉的色譜方法正交分離回收的組分。而且，樣品遞呈裝置在標(biāo)準(zhǔn)的96孔、384孔和1536孔形式中的可用性使得它能夠在多孔板處理裝置和實(shí)驗(yàn)室液體處理機(jī)器人上進(jìn)行基于生物芯片的樣品收集和加工。因此，可用樣品遞呈裝置提供高通量質(zhì)譜平臺(tái)，以支持蛋白質(zhì)組學(xué)和其它重要的化學(xué)和生物科技領(lǐng)域的出現(xiàn)。
同時(shí)蛋白質(zhì)鑒定常常包括用酶消化用液相柱色譜純化的或從2維電泳凝膠上剪下的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)消化物在質(zhì)譜前通常需要在反相液相色譜(RPLC)或固相抽提(SPE)上脫鹽。本發(fā)明樣品遞呈裝置適用于高效RPLC或SPE脫鹽的蛋白質(zhì)消化物的直接收集和后續(xù)分析。
例如，表面等離子共振(SPR)生物傳感器采用固定的蛋白質(zhì)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和其它生物相互作用。不幸的是，需要用大量洗脫劑從生物傳感器中回收分析物，而且樣品中的分析物濃度對(duì)于最佳質(zhì)譜來(lái)說(shuō)太低。本發(fā)明樣品遞呈裝置適用于直接收集從生物傳感器系統(tǒng)回收的分析物；可將它構(gòu)造成標(biāo)準(zhǔn)的96孔板形式，以與已經(jīng)整合到生物傳感器系統(tǒng)中的樣品收集裝置相容，并且可用它為質(zhì)譜分析自動(dòng)收集樣品，它還可濃縮大體積的液體樣品。
與已知質(zhì)譜樣品遞呈裝置相關(guān)的液體保持限度促使開(kāi)發(fā)了各種微柱液相色譜方法，該方法包括采用充滿少量色譜介質(zhì)的小移液器尖頭(如ZipTips)。微柱法使蛋白質(zhì)消化物脫鹽，伴隨著樣品體積減少，據(jù)報(bào)道這足以使樣品能夠直接施加于現(xiàn)有質(zhì)譜裝置以保留樣品。本發(fā)明樣品遞呈裝置適用于用微柱RPLC脫鹽的蛋白質(zhì)消化物的直接收集和后續(xù)分析。
通常，可用本發(fā)明樣品遞呈裝置對(duì)上述樣品完成以下操作濃縮、稀釋、定位、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、遞呈以分析、分餾、洗滌和施加后加工(包括消化、衍生和洗提)。應(yīng)理解，此舉例并不詳盡，僅提供了通常認(rèn)為可采用本發(fā)明樣品遞呈裝置的各種應(yīng)用的例子。
一旦將樣品施加于本發(fā)明樣品遞呈裝置并且對(duì)樣品進(jìn)行了在裝置上移動(dòng)液體樣品的任何上述操作后，可在樣品遞呈裝置上或從該裝置上取出后進(jìn)行以下應(yīng)用MALDI-MS；其它質(zhì)譜技術(shù)；表面等離子共振(SPR)；熒光；原子力顯微術(shù)(AFM)；光譜學(xué)；生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光；x-射線光電子光譜法；橢圓光度法；電化學(xué)檢測(cè)；磷光；以及UV、可見(jiàn)光和IR光譜學(xué)。應(yīng)理解，這僅為這種應(yīng)用的部分舉例。也應(yīng)理解，可組合和/或連續(xù)進(jìn)行任何上述分析，合適時(shí)，可對(duì)分析物直接或間接進(jìn)行這些分析。
認(rèn)為許多應(yīng)用領(lǐng)域可采用本發(fā)明樣品遞呈裝置，包括但不限于諸如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物基因組學(xué)、生理物質(zhì)組學(xué)(physiomics)、毒物組學(xué)(toxiomics)、代謝物組學(xué)(metabonomics)、藥物發(fā)現(xiàn)/藥物開(kāi)發(fā)/臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)、毒理學(xué)、診斷、環(huán)境、生物傳感器以及生物和化學(xué)武器/生物恐怖主義等領(lǐng)域。應(yīng)用該樣品遞呈裝置的幾個(gè)具體例子描述如下。以下描述僅為示范性，不限制本發(fā)明范圍。
基因組學(xué)將質(zhì)譜應(yīng)用于遺傳型和表型問(wèn)題有一個(gè)必要條件，即在電離之前使核酸分析物脫鹽。傳統(tǒng)上，在將樣品放置在MALDI源上之前進(jìn)行脫鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中，X3形式的樣品遞呈裝置可在濃縮核酸分析物的同時(shí)完成脫鹽。該實(shí)施方式由反相捕獲區(qū)和抵抗分析物結(jié)合的分析區(qū)組成。另一實(shí)施方式可由X4組成，其中可采用兩個(gè)捕獲區(qū)和一個(gè)分析區(qū)。在同心排列中，外側(cè)捕獲區(qū)會(huì)通過(guò)與固定的捕獲探針互補(bǔ)雜交而特異性結(jié)合多核苷酸分析物；內(nèi)側(cè)捕獲區(qū)進(jìn)行如上所述的脫鹽功能，分析區(qū)遞呈該分析物，以進(jìn)行檢測(cè)。在這兩個(gè)實(shí)施方式中，在同一芯片上進(jìn)行脫鹽和分析遞呈增大了通量、最大程度減少了樣品損失并降低了成本。
藥物發(fā)現(xiàn)/開(kāi)發(fā)/臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)許多藥物僅對(duì)一部分人群有效。這種現(xiàn)象的一個(gè)例子是藥物賀賽汀，它僅可用于約30％的乳腺癌患者。在賀賽汀的情況下，敏感性的遺傳基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)基礎(chǔ)貫穿在藥物設(shè)計(jì)中，但在大多數(shù)情況下，在昂貴和冗長(zhǎng)的臨床試驗(yàn)之前不能將人群分為可能的應(yīng)答者和非應(yīng)答者。解釋這種臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要挑戰(zhàn)之一是理解應(yīng)答和不應(yīng)答的生物和/或化學(xué)基礎(chǔ)。然后可將該知識(shí)用于靶定人群和進(jìn)一步改進(jìn)藥物本身。
解決此問(wèn)題的一種方法是在治療之前、期間和之后獲得患者的分布型(profile)(如蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì))，和用治療結(jié)果關(guān)聯(lián)這些分布型。本發(fā)明裝置的幾種實(shí)施方式可用于進(jìn)行這種研究?？蓪?duì)獲自患者的樣品(如血液、尿液、組織)進(jìn)行上述部分列舉的一種或多種預(yù)處理方法如多維液相色譜，將該方法產(chǎn)生的分餾物質(zhì)施加于該裝置進(jìn)行濃縮并遞呈給質(zhì)譜分析?；蛘?，可將進(jìn)行了最小加工的樣品施加于一個(gè)或多個(gè)具有特異性已知的捕獲區(qū)的本發(fā)明裝置。然后將分析物轉(zhuǎn)移到特異性互補(bǔ)的捕獲區(qū)，再轉(zhuǎn)移到分析區(qū)；或者直接轉(zhuǎn)移到分析區(qū)。以此方式，可以自動(dòng)方式連續(xù)和平行使用具有不同特異性的表面，而分餾分析物遞呈在相同分析區(qū)上用于質(zhì)譜。
質(zhì)譜既提供分布型(完整質(zhì)譜)，又提供明確鑒定感興趣的具體分子實(shí)體的機(jī)會(huì)。然后，可將質(zhì)譜收集到數(shù)據(jù)庫(kù)中，應(yīng)用多因素分析工具將這些分布型與患者反應(yīng)關(guān)聯(lián)起來(lái)。以此方式，可發(fā)現(xiàn)分布型和/或具體分子實(shí)體的模式能夠預(yù)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)；監(jiān)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng)；鑒定影響對(duì)治療的反應(yīng)的分子實(shí)體，從而可以進(jìn)行更復(fù)雜的藥物設(shè)計(jì)。
就象本文所述其它領(lǐng)域那樣，此科學(xué)查詢領(lǐng)域很大程度上依賴于測(cè)定溶液中分析物的能力。本發(fā)明樣品遞呈裝置和本文所述的它們的用途代表了可用于進(jìn)行進(jìn)一步研究的重要工具。
環(huán)境分析環(huán)境樣品中存在的污染物是全世界的努力。這些研究所面對(duì)的具體問(wèn)題包括，必須研究低濃度分析物和樣品多樣性，因?yàn)槲廴疚锟赡艽嬖谟跉怏w、液體和固體物質(zhì)中。通常，這種分析包括收集、提取、衍生化、分餾和檢測(cè)步驟。
本發(fā)明裝置可以許多方式用于分析環(huán)境樣品，這些樣品有代表性，但并不完整。具有捕獲區(qū)的裝置可用于從氣體或液體介質(zhì)中直接收集分析物。例如，用疏水性表面從水溶液中捕獲疏水性殺蟲(chóng)劑殘留可替代液/液萃取，液/液萃取耗時(shí)，并且產(chǎn)生有害廢物。然后可將收集的物質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到分析區(qū)中；先通過(guò)連續(xù)或平行轉(zhuǎn)移到特異性互補(bǔ)的捕獲區(qū)而進(jìn)行分餾，再轉(zhuǎn)移到分析區(qū)中；或從該裝置轉(zhuǎn)移以用上述部分列舉的一種或多種技術(shù)進(jìn)行分析。通常用質(zhì)譜鑒定殺蟲(chóng)劑殘留，但也可采用其它技術(shù)如免疫測(cè)定。也可如前所述用本發(fā)明裝置遞呈和/或分餾上述任何環(huán)境分析步驟產(chǎn)生的物質(zhì)。本發(fā)明裝置可用作平臺(tái)以衍生分析物并遞呈它們用于以改變的形式進(jìn)行分析。例如，可將甲硅烷基-和/或乙?；?部分加在固定在該裝置上的殺蟲(chóng)劑上，以明確地鑒定分子結(jié)構(gòu)。
生物和化學(xué)武器/生物恐怖主義美國(guó)政府需要有助于檢測(cè)化學(xué)和生物物質(zhì)的軍用和民用的平臺(tái)和分析技術(shù)。生物戰(zhàn)爭(zhēng)檢測(cè)的挑戰(zhàn)包括樣品采集和區(qū)分無(wú)毒與有毒生物體。用于生物物質(zhì)的現(xiàn)有戰(zhàn)場(chǎng)技術(shù)利用高溫分解將生物化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎肕S容易地檢測(cè)的小分子。大家非常期望依賴肽生物標(biāo)記的技術(shù)，因?yàn)檫@種技術(shù)比現(xiàn)有方法的特異性更高。為確定暴露于戰(zhàn)爭(zhēng)物質(zhì)的可能性而對(duì)個(gè)體進(jìn)行的測(cè)試應(yīng)該包括呼吸測(cè)試或抽血技術(shù)。獨(dú)立的生物傳感器如警報(bào)裝置也因?yàn)橛糜趹?zhàn)場(chǎng)和公眾領(lǐng)域而引起極大興趣。所有這些方法都對(duì)樣品采集、預(yù)處理和通過(guò)機(jī)器人或其它遠(yuǎn)程方式將樣品遞呈給檢測(cè)器提出了挑戰(zhàn)。可儲(chǔ)存、操作、濃縮或純化樣品的技術(shù)或可偶聯(lián)于當(dāng)前所用氣溶膠撞擊器(aerosol impactor)的技術(shù)可能吸引國(guó)防部門(mén)的興趣。本發(fā)明裝置可用于生物戰(zhàn)爭(zhēng)/生物恐怖事件的檢測(cè)，其應(yīng)用方式類似于環(huán)境樣品中所述。此外，可設(shè)計(jì)具有定制捕獲區(qū)的裝置，以從環(huán)境或生物液體樣品中收集感興趣微生物、對(duì)細(xì)胞(或病毒)進(jìn)行處理以釋放關(guān)鍵標(biāo)記和遞呈這些標(biāo)記用于檢測(cè)。
以下實(shí)施例提供了關(guān)于本發(fā)明樣品遞呈裝置的組成、制造和用途的額外詳情，但僅為示范性，不以任何方式限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例I制備11-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛氧基)十一碳-1-烯(1) 將3.0mL 1H，1H，2H，2H-全氟辛醇(13.7mmol)裝入棕色瓶(amber shell vial)(40mL)，加入1.4mL 50％氫氧化鉀水溶液(13.7mmol)。將該溶液加熱到80℃，攪拌30分鐘，加入3.3mL 11-溴十一碳-1-烯(1.5mmol)。將該反應(yīng)在80℃維持52小時(shí)，直到TLC分析(己烷)顯示消耗了原材料。使產(chǎn)物冷卻到室溫，加入100mL乙酸乙酯中，用水(2×50mL)和鹽水(1×50mL)萃取。用硫酸鎂干燥乙酸乙酯萃取物，過(guò)濾，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物。在硅膠快速柱(50×300mm，0％乙酸乙酯/己烷，然后是10％乙酸乙酯/己烷)上純化殘余物?；旌虾兴璁a(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生4.52g(64％)無(wú)色油狀1。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.80(m，1H)，4.95(m，2H)，3.69(t，J＝6.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.39(m，2H)，2.03(m，2H)，1.55(m，2H)，1.36(m，2H)，1.27(寬m，10H)。
實(shí)施例II制備S-[11-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛氧基)十一烷基]硫代乙酸酯(2) 在氬氣下將1.0g 1(1.9mmol)加入干燥的圓底燒瓶(100mL)中，加入10mL無(wú)水甲醇。向得到的溶液中加入426μL硫代乙酸(6.0mmol)，然后加入52mg 2，2′-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(0.2mmol)。用鋁箔遮蔽該反應(yīng)，使其暴露于低壓汞燈的光線。4小時(shí)后，TLC分析(5％乙酸乙酯/己烷)揭示出已消耗了原材料。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物。在硅膠快速柱(40×300mm，0％乙酸乙酯/己烷，然后是5％乙酸乙酯/己烷)上純化殘余物。混合含有所需產(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生856mg(76％)無(wú)色油狀2。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.69(t，J＝6.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.39(m，2H)，2.31(s，3H)，1.55(m，2H)，1.33(m，2H)，1.25(寬m，10H)。
實(shí)施例III制備11-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛氧基)十一烷-1-硫醇(3) 棕色瓶(20mL)裝有具有特氟龍線紋的硅隔板，向其中加入850mg 2(1.1mmol)和5mL 3N甲醇化(methanolic)氯化氫(15mmol)。將得到的溶液加熱到40℃ 4小時(shí)。去除溶劑，產(chǎn)生782mg(98％)無(wú)色油狀3。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.69(t，J＝6.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.6Hz，2H)，2.51(dd，J＝7.3，7.6Hz，2H)，2.39(m，2H)，1.58(m，4H)，1.32(t，J＝8.0Hz，1H)，1.25(寬m，12H)。
實(shí)施例IV制備11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一碳-1-烯(4)
將27.4mL三甘醇單甲基醚(171mmol)加入圓底燒瓶(200mL)，加入9.1mL 50％氫氧化鈉水溶液(114mmol)。將此淺黃溶液加熱到80℃，攪拌30分鐘，逐滴加入26.6mL 11-溴十一碳-1-烯(114mmol)。將該反應(yīng)維持在80℃7.5小時(shí)，直到TLC分析(100％乙酸乙酯)顯示已消耗了原材料。將產(chǎn)物冷卻到室溫，用50mL水稀釋，用己烷萃取(3×50mL)?；旌霞和檩腿∥?，用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生20g(56％)澄清的無(wú)色油狀4。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.81(m，1H)，4.96(m，2H)，3.68-3.56(m，12H)，3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，3.38(s，3H)，2.04(m，2H)，1.57(m，2H)，1.36(m，2H)，1.27(寬s，10H)。
實(shí)施例V制備S-(11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷基)硫代乙酸酯(5) 在氬氣下將5.0g 4(15.8mmol)加入干燥的圓底燒瓶(200mL)，加入10mL無(wú)水甲醇。向其中加入3.6mL硫代乙酸(50mmol)，然后加入434mg 2，2′-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(1.6mmol)。用鋁箔遮蔽該反應(yīng)，使其暴露于低壓汞燈的光線。15.5小時(shí)后，TLC分析(乙酸乙酯/己烷，1∶3)揭示出已消耗了原材料。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生具有強(qiáng)烈硫樣臭味的殘留物。在硅膠快速柱(40×300mm，30％乙酸乙酯/己烷，50％乙酸乙酯/己烷)上純化殘余物?；旌虾兴璁a(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生5.83g(94％)無(wú)色油狀5。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.67-3.54(m，12H)，3.44(t，J＝7.2Hz，2H)，3.38(s，3H)，2.86(t，J＝7.2Hz，2H)，2.32(s，3H)，1.57(m，4H)，1.36-1.26(寬m，14H)。
實(shí)施例VI制備11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷-1-硫醇(6) 棕色瓶(20mL)裝有具有特氟龍線紋的硅隔板，向其中加入5.0g 5(12.7mmol)，再加入7mL 3N甲醇化氯化氫(21mmol)。將該溶液加熱到40℃ 6小時(shí)。然后真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生4.40g(98％)無(wú)色蠟狀凝膠6。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.67-3.54(m，12H)，3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，3.37(s，3H)，2.51(dd，J＝7.3，8.0Hz，2H)，1.57(m，4H)，1.32(t，J＝7.6Hz，IH)，1.26(寬m，14H)。
實(shí)施例VII制備2-[2-(2-十一碳-10-烯氧基乙氧基)乙氧基]乙醇(7) 將67.0mL三甘醇(0.5mol)加入圓底燒瓶(250mL)，再加入8.0mL 50％氫氧化鈉水溶液(8mL，0.1mol)。將該溶液加熱到100℃，攪拌30分鐘，逐滴加入22.0mL 11-溴十一碳-1-烯(0.1mol)，產(chǎn)生深黃色溶液，其中產(chǎn)生了溴化鈉沉淀。將該反應(yīng)維持在100℃2.5小時(shí)，直到TLC分析(甲醇/乙酸乙酯/己烷，1∶1∶8)顯示已消耗了原材料。將該反應(yīng)冷卻到室溫，用300mL水稀釋，用己烷萃取(3×100mL)?；旌嫌袡C(jī)萃取物，用鹽水(50mL)洗滌，用硫酸鎂干燥并過(guò)濾。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物。在硅膠快速柱(50×400mm，甲醇/乙酸乙酯/己烷5∶5∶90)上純化殘余物。混合含有所需產(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生20.8g(69％)澄清油狀7。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.78(m，1H)5 4.93(m，2H)，3.72-3.55(m，12H)，3.42(t，J＝7.2Hz，2H)，2.64(t，J＝5.6Hz，1H)，2.01(m，2H)，1.54(m，2H)，1.34(m，2H)，1.25(寬s，10H)。
實(shí)施例VIII制備S-(11-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷基)硫代乙酸酯(8) 在氬氣下將2.0g 7(6.6mmol)加入干燥的圓底燒瓶(100mL)，加入10mL無(wú)水甲醇。向其中加入2.85mL硫代乙酸(40mmol)，然后加入271mg 2，2′-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(1.0mmol)。用鋁箔遮蔽該反應(yīng)，使其暴露于低壓汞燈的光線。6小時(shí)后，TLC分析(甲醇/乙酸乙酯/己烷，1∶1∶8)揭示出已消耗了原材料。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生黃色油狀物。在硅膠快速柱(50×300 mm，甲醇/乙酸乙酯/己烷，1∶1∶8)上純化該油狀物。混合含有所需產(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生2.44g(98％)淺黃色油狀8。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.71-3.54(m，12H)，3.42(t，J＝6.6Hz，2H)，2.83(t，J＝7.2Hz，2H)5 2.66(寬s，1H)，2.29(s，3H)，1.52(m，4H)，1.36-1.23(寬m，14H)。
實(shí)施例IX制備2-{2-[2-(11-巰基十一烷氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇(9)
棕色瓶(20mL)裝有具有特氟龍線紋的硅隔板，向其中加入2.40g 8(6.4mmol)，再加入5.0mL 3N甲醇化氯化氫(15mmol)。將得到的溶液加熱到40℃ 4小時(shí)。然后真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生2.05g(95％)無(wú)色蠟狀凝膠9。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72-3.55(m，12H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.71(寬s，IH)，2.50(dd，J＝7.6，7.4Hz，2H)，1.62-1.52(m，4H)，1.31(t，J＝7.6Hz，1H)，1.26(寬m，14H)。
實(shí)施例X制備十一碳-10-烯-氧甲基苯(10) 在氬氣下將5.0g十一碳-10-烯-1-醇(29.4mmol)加入干燥的圓底燒瓶(100mL)，再加入25mL無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺。將得到的溶液冷卻到0℃，以一部分加入2.16g 60％氫化鈉的礦物油溶液(45mmol)。在氬氣、0℃下攪拌該起泡混合物30分鐘。向冷卻、攪拌的溶液中逐滴加入7.7g溴甲基苯(45mmol)在5mL無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中的溶液，使該反應(yīng)回復(fù)到室溫，同時(shí)攪拌3小時(shí)。通過(guò)緩慢地加入100mL乙酸乙酯終止反應(yīng)，用1N鹽酸(2×50mL)和鹽水(1×50ml)萃取。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，過(guò)濾，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物(9.5g)。在硅膠快速柱(50×300mm，94∶5∶1己烷/甲苯/乙酸乙酯)上純化殘余物，混合含有所需產(chǎn)物的組分。最后，真空蒸發(fā)溶劑得到7.1g(93％)無(wú)色油狀10。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32(d，4H)，7.28(m，IH)，5.81(m，IH)，4.95(m，2H)，4.49(s，2H)，3.46(t，2H)，2.03(m，2H)，1.61(m，2H)，1.35(寬m，4H)，1.24(寬s，10H)。
實(shí)施例XI制備S-(11-芐氧基十一烷基)硫代乙酸酯(11) 首先將5.0g 10(19.2mmol)和0.520g 2，2′-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(1.92mmol)加入夾套式光反應(yīng)容器(250mL)中。密封該容器，抽真空并用氬氣回沖(幾個(gè)循環(huán))。在氬氣下，將60mL無(wú)水甲醇和0.520g硫代乙酸(92mmol)注入該反應(yīng)容器中，攪拌該容器內(nèi)含物。再次對(duì)該容器抽真空，并用氬氣回沖(幾個(gè)循環(huán))。打開(kāi)UV燈，在氬氣下輻射該混合物3小時(shí)，其間不斷攪拌。連續(xù)冷卻該反應(yīng)(水夾套)，在光反應(yīng)期間使溫度維持在38℃以下。使反應(yīng)容器冷卻到室溫，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生淺黃色油狀物(10.8g)。在硅膠快速柱(50×300mm，98∶2己烷/乙酸乙酯)上純化該油狀物，混合含有所需產(chǎn)物的組分。最后，真空去除溶劑，得到5.0g(77％)無(wú)色油狀11。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.32(d，4H)3 7.28(m，IH)，4.49(s，2H)，3.46(t，2H)，2.86(t，2H)，2.31(s，3H)，1.50-1.66(m，4H)，1.20-1.40(寬m，14H)。
實(shí)施例XII制備11-芐氧基十一烷-1-硫醇(12) 棕色瓶(40mL)裝有具有特氟龍線紋的硅隔板，向其中加入3.04g 11(9.03mmol)，然后加入2mL二氯甲烷，1mL己烷和12mL 4.9N乙醇化(ethanolic)氯化氫。將得到的溶液加熱到40℃ 4.5小時(shí)。然后真空蒸發(fā)溶劑，得到無(wú)色油狀殘余物(2.8g)。在硅膠快速柱(25×450mm，9∶1己烷/氯仿)上純化殘余物，然后混合含有所需產(chǎn)物的組分。真空蒸發(fā)溶劑，得到2.5g(94％)無(wú)色油狀12。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32(d，4H)，7.28(m，1H)，4.49(s，2H)，3.46(t，2H)，2.51(q，2H)，1.55-1.65(m，4H)，1.20-1.40(寬m，寬t，15H)。
實(shí)施例XIII在涂布金的硅基片上制備自身組裝單層將硅晶片(200mm，P型，初級(jí)硅100)切割成單個(gè)基片，對(duì)其進(jìn)行清潔以提供少于10個(gè)顆粒(0.16μm-3000μm)/基片的表面。在CPA9900噴鍍系統(tǒng)上用5×10-7mm的底壓進(jìn)行金屬沉積。在噴鍍室中，用氬氣等離子體清潔和蝕刻基片，以5/秒的速率噴鍍鈦和鎢(1∶9)的粘附層，至厚度達(dá)到250。然后以20/秒的速率噴鍍金，至厚度為1000。在氬氣流中冷卻基片，然后取出。
在單層組裝之前，用200W的氬氣等離子體處理300秒，以清潔涂布金的基片。用乙醇沖洗該基片，然后將其轉(zhuǎn)移到0.1mM 3(11-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟-辛氧基)十一烷-1-硫醇)的乙醇溶液中，在室溫下孵育1-24小時(shí)。最后，從組裝浴中取出表面修飾的基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。施加于表面修飾的基片的水?0.5μL)的接觸前角(advancing contact angle)為114°-120°。表面修飾的基片儲(chǔ)存在裝有透光的棕色抗UV蓋片的塑料容器中。
實(shí)施例XIV制備圖案化的樣品遞呈裝置如上所述制備二十四種(24)表面修飾的基片，安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板(0.002英寸)，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。將該夾具放在裝有低壓汞燈光源(能量密度為120W/cm2)的空氣冷卻的紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩⒈┞兜幕湃?.1mM 6(11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷-1-硫醇)的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。從組裝浴中取出圖案化的表面修飾的基片，用乙醇以2400rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。施加于液體保留區(qū)的水滴的接觸前角為60°-65°，當(dāng)施加于邊界區(qū)時(shí)，該角度為110°-119°。
將圖案化的表面修飾的基片安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上第二個(gè)針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。將該夾具放在紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。將暴露的基片放?.1mM 9(2-{2-[2-(11-巰基十一烷氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇)的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。最后，從組裝浴中取出圖案化兩次的表面修飾的基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。施加于分析區(qū)的水滴的接觸前角小于47°。將圖案化兩次的表面修飾的基片儲(chǔ)存于裝有棕色透光抗UV蓋片的塑料容器中。
雖然上面描述了本發(fā)明各種實(shí)施方式，但是應(yīng)理解，它們僅以示范性而非限制性方式給出。具體說(shuō)，分析區(qū)、液體保留區(qū)和邊界區(qū)的物理安排不限于上述實(shí)施例。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)受限于任何上述示范性實(shí)施方式。
實(shí)施例XV樣品容納和定位在圖11a-11h所示視頻接觸角圖像中證明了分析區(qū)的分析物限定特性，該特性使檢測(cè)靈敏度增加。參照?qǐng)D11a，將約1.6mm OD的液體保留區(qū)和約0.7mm OD的分析區(qū)裝在本發(fā)明樣品遞呈裝置上。為了便于觀察集中效果，將分析區(qū)安置在偏離中心的位置。將一滴水施加于生物芯片表面，觀察到它迅速將自己限定于對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)和分析區(qū)的表面積中。記錄左側(cè)和右側(cè)的起始接觸角，發(fā)現(xiàn)它們都是57.1°，該值對(duì)應(yīng)于僅由液體保留區(qū)單體制備的表面具有的值。隨著液滴因?yàn)檎舭l(fā)而干燥(參見(jiàn)圖11b-11h)，觀察到的半徑和接觸角都下降，直到液滴半徑對(duì)應(yīng)于分析區(qū)半徑。而且，隨著液滴干燥，觀察到液滴的中心移動(dòng)到右邊，以致液滴在分析區(qū)上自發(fā)置中。發(fā)現(xiàn)圖11h中記錄的左側(cè)和右側(cè)接觸角都是35.4°，該值對(duì)應(yīng)于僅由分析區(qū)單體制備的表面具有的值。圖12中以圖表小結(jié)了與圖11a-11h所示圖像獲取一起記錄的液滴高度、寬度和接觸角數(shù)據(jù)。
實(shí)施例XVI圖案化樣品遞呈裝置的液體保持容量圖13顯示了液體保留區(qū)出色的液體保持容量。本發(fā)明16-位點(diǎn)樣品遞呈裝置圖顯示了保留的樣品液滴體積為5μL-70μL?？雌饋?lái)顯著限制樣品液滴體積的因素僅僅是相鄰的靶點(diǎn)區(qū)和液體保留區(qū)對(duì)的相對(duì)鄰近。
實(shí)施例XVII分析物引導(dǎo)和濃縮圖14a和14b進(jìn)一步證明了分析區(qū)的分析物限定特性。第一幅圖(圖14a)是本發(fā)明16-位點(diǎn)樣品遞呈裝置，在16個(gè)位點(diǎn)中8個(gè)位點(diǎn)的表面上沉積的樣品液滴體積范圍5μL-40μL。各液滴含有等量HCCA。圖14b是由于圖14a所示樣品遞呈裝置上樣品干燥而濃縮并導(dǎo)向分析區(qū)的HCCA圖。分析區(qū)和液體保留區(qū)的相對(duì)大小重疊在HCCA上，以進(jìn)行比較。
捕獲芯片在本發(fā)明的另一方面，該樣品遞呈裝置包括一個(gè)或多個(gè)樣品結(jié)合區(qū)。該結(jié)合區(qū)可用于保留分析物，以在樣品遞呈裝置上進(jìn)一步加工和/或測(cè)定。在一項(xiàng)應(yīng)用中，結(jié)合區(qū)捕獲所需分析物后，洗滌樣品遞呈裝置的表面，以去除不想要的物質(zhì)。然后從結(jié)合區(qū)中釋放所需分析物，從而可將它們導(dǎo)向分析區(qū)以進(jìn)一步測(cè)定和/或加工?；蛘?，該結(jié)合區(qū)可用于過(guò)濾/分離/去除不想要的物質(zhì)(如鹽、去污劑、蛋白質(zhì)等)。在一項(xiàng)應(yīng)用中，至少部分不想要的物質(zhì)被保留在捕獲區(qū)中，而攜帶所需分析物的其余樣品向分析區(qū)移動(dòng)，以進(jìn)行測(cè)定和/或加工。
在一種變型中，樣品遞呈裝置可稱為″捕獲芯片″或″捕獲/濃縮芯片″，縮寫(xiě)為Xn，其中″n″是指代樣品遞呈裝置表面上區(qū)域數(shù)量的數(shù)值，″n″可以是2-無(wú)窮大的任何數(shù)值。因此，例如，X2捕獲芯片具有兩個(gè)區(qū)域，X3捕獲芯片具有三個(gè)區(qū)域等。本發(fā)明考慮了含有比2個(gè)或3個(gè)多很多的區(qū)域的樣品遞呈裝置，不以任何方式限定區(qū)域的數(shù)目。隨著區(qū)域數(shù)增加，總效果形成梯度。捕獲芯片和捕獲/濃縮芯片是由經(jīng)設(shè)計(jì)結(jié)合分析物的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域組成的樣品遞呈裝置。負(fù)責(zé)捕獲分析物的部分一般包括設(shè)計(jì)為捕獲區(qū)的區(qū)分特征的特定表面修飾。這些表面修飾可包括特異性(如單克隆抗體)或非特異性(如根據(jù)靜電吸引結(jié)合的帶電基團(tuán))結(jié)合或以這些吸引力的任何組合結(jié)合分析物的生物和/或化學(xué)部分。然后，分析前可以在表面上進(jìn)一步加工這些結(jié)合的分析物。這些加工步驟包括但不限于通過(guò)各種洗滌步驟純化感興趣分析物，通過(guò)化學(xué)、生化或物理方法修飾分析物，以及分離待用。然后，進(jìn)行化學(xué)或物理刺激后可能釋放結(jié)合的分析物，如pH改變、溶劑組成改變、UV輻射、通電或加熱。釋放后，可通過(guò)蒸發(fā)溶劑將分析物濃縮到分析區(qū)中。
在圖15所述的一個(gè)變型中，捕獲芯片180包括具有以下區(qū)域的的表面分析區(qū)182、在分析區(qū)182周圍形成同心圓的捕獲區(qū)184和圍繞捕獲區(qū)184的邊界區(qū)186，如圖15的步驟(a)所示。捕獲區(qū)184中的SAM包括用于捕獲分析物(如化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)等)的結(jié)合區(qū)188。圖15說(shuō)明用捕獲區(qū)184從液體中提取所需分子，然后將所需分子濃縮在分析區(qū)182上的例子。將含有感興趣分析物192(如蛋白質(zhì)、肽等)和所需分子194、196、198(如鹽、去污劑、污染物等)的液體190放入捕獲區(qū)184限定的邊界內(nèi)，如圖15的步驟(b)所示。分析物192結(jié)合于捕獲區(qū)184表面上的官能團(tuán)，如圖15的步驟(c)所示。提供一段時(shí)間使此結(jié)合相互作用發(fā)生后，洗掉攜帶所需分子194、196、198的液體200，如圖15的步驟(c)和(d)所示。然后，將一滴新液滴202(不含所需分子)引入到捕獲區(qū)184和分析區(qū)182上，如圖15的步驟(d)所示。然后，從捕獲區(qū)184的表面上釋放出感興趣分析物192?？赏ㄟ^(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)所需分子192的釋放在新液滴202中引入化學(xué)物質(zhì)、引入具有有助于釋放所需分子的特定固有特性的液體或溶劑、光子激發(fā)、pH改變、溫度改變或其它化學(xué)和/或物理改變。然后通過(guò)蒸發(fā)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方式從捕獲區(qū)184和分析區(qū)182上去除液體，使所需分子192濃縮在分析區(qū)182上，如圖15的步驟(e)所示。
而且，對(duì)于蛋白質(zhì)測(cè)定可能優(yōu)選SAM?？芍苯釉诨闲纬勺陨斫M裝的分子層。該基片優(yōu)選為金屬如金，或半導(dǎo)體如硅，但可包括各種材料，包括但不限于(例如)玻璃、硅酸鹽、半導(dǎo)體、金屬、聚合物(如塑料)和其它羥基化材料、如硅上的SiO2、鋁上的Al2O3等。然而，優(yōu)選形成金上的烷基硫醇或者硅或玻璃上的有機(jī)硅烷的自身組裝單層。可將SAM加在本發(fā)明樣品遞呈裝置上，以產(chǎn)生其特性反映用于具體區(qū)域的SAM的不同區(qū)域。用于形成自身組裝層的分子可具有能與基片表面反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)如末端硫羥基或硅烷基。烴鏈如烷基部分，也可形成分子的一部分。該分子也可具有側(cè)鏈很少或沒(méi)有側(cè)鏈的低聚或多聚鏈。這些鏈也可任選地具有可直接用作捕獲部分(如生物素或抗體)或進(jìn)一步衍生可產(chǎn)生捕獲表面的官能團(tuán)。包括表面修飾是單克隆抗體的捕獲區(qū)的本發(fā)明樣品遞呈裝置可結(jié)合液體樣品中的互補(bǔ)抗原并保持該抗原，而其余的液體樣品通過(guò)物理轉(zhuǎn)移或潤(rùn)濕性差異移動(dòng)到該裝置表面的另一部分。然后，可通過(guò)向該樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)中加入其它化合物(如加入切除該抗原一部分的酶)修飾保留的抗原。然后，可將修飾的抗原轉(zhuǎn)移到分析區(qū)中，或本身用作捕獲表面。類似地，包括表面修飾是生物素的捕獲區(qū)的本發(fā)明樣品遞呈裝置可結(jié)合液體樣品中鏈霉抗生物素蛋白連接的分析物，并保留該分析物，而其余的液體樣品通過(guò)物理轉(zhuǎn)移或潤(rùn)濕性差異移動(dòng)到該裝置表面的另一部分?？赏ㄟ^(guò)向該樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)中加入其它化合物修飾保留的鏈霉抗生物素蛋白連接的分析物。然后，可將修飾的分析物轉(zhuǎn)移到分析區(qū)中，或本身用作捕獲表面。
包括通過(guò)會(huì)聚(convergent)技術(shù)產(chǎn)生的捕獲區(qū)的本發(fā)明樣品遞呈裝置可通過(guò)其末端上的表面遞呈反應(yīng)性基團(tuán)產(chǎn)生。這些基團(tuán)包括但不限于胺封端或羧基封端的SAM?？杉尤氚贩磻?yīng)性或羧基反應(yīng)性物質(zhì)，以隨后產(chǎn)生捕獲區(qū)表面。因此，可用含有馬來(lái)酐部分和各種其它基團(tuán)的共聚物處理胺封端的表面，所述其它基團(tuán)包括但不限于可能部分飽和的短鏈(C4-C11)烷基、可能部分飽和的長(zhǎng)鏈(C12-C24)烷基、可能有取代或沒(méi)有取代的芳基、帶電基團(tuán)、親核基團(tuán)、親電子基團(tuán)等。這會(huì)導(dǎo)致該共聚物通過(guò)與胺末端形成的酰胺鍵結(jié)合于表面并且遞呈用作捕獲表面的聚合物官能部分。
在一個(gè)具體應(yīng)用中，邊界區(qū)186中的SAM包括11-(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛氧基)十一烷-1-硫醇(實(shí)施例III)，捕獲區(qū)184中的SAM由羧基封端的聚醚烷基硫醇(thiolate)組成(Whitesides G.M.，Lahiri J.，Isaacs L.，Tien J.Anal.Chem.1999，71(4)，777-790)，分析區(qū)182中的SAM由羥基封端的聚醚烷基硫醇(polyether alkyl thiolate)(實(shí)施例IX)組成?？商峁┖胁涣挤肿尤缏然c和十二烷基硫酸鈉，以及感興趣分析物如血清中的肽和蛋白質(zhì)樣品的液滴，用于在此捕獲芯片上加工。然后，可進(jìn)行圖15所示方法以提取所需分子用于質(zhì)譜分析。通過(guò)“洗滌樣品”步驟去除不良分子后，可在捕獲區(qū)184上進(jìn)行質(zhì)譜，產(chǎn)生圖16a所示譜圖。進(jìn)行″集中分析物″步驟，以將分析物濃縮在分析區(qū)182上。然后，可在分析區(qū)182上進(jìn)行質(zhì)譜，產(chǎn)生類似于圖16b所示的譜圖。將圖16b與圖16a的譜圖作比較，可以發(fā)現(xiàn)，集中步驟可顯著改善所需分子的質(zhì)譜測(cè)定的信噪比。雖然捕獲芯片構(gòu)型的上述例子尤其可用于血清樣品，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此捕獲芯片也可用于在對(duì)分析物進(jìn)行分析或測(cè)定之前需要純化和/或濃縮分析物的其它應(yīng)用。
在又一變型中，分析區(qū)的結(jié)構(gòu)中具有捕獲和/或結(jié)合于分析物的結(jié)合表面，而用特征為基本不結(jié)合的SAM覆蓋液體保留區(qū)和圍繞分析區(qū)的其它表面區(qū)。此設(shè)計(jì)可允許樣品液滴濃縮在分析區(qū)上，還允許分析物結(jié)合于分析區(qū)表面。然后，可對(duì)分析區(qū)表面上捕獲的分析物進(jìn)行質(zhì)譜或其它檢測(cè)機(jī)制。
在另一變型中，分析區(qū)和液體保留區(qū)的結(jié)構(gòu)中具有結(jié)合/捕獲表面。例如，可構(gòu)建液體保留區(qū)使其結(jié)合一種類型的分子，可構(gòu)建分析區(qū)使其結(jié)合不同類型的分子。具有多個(gè)結(jié)合區(qū)的這些結(jié)構(gòu)可用于分析區(qū)用于捕獲所需分子、而液體保留區(qū)用于捕獲一種或多種不良分子的應(yīng)用。或者，用一個(gè)區(qū)域捕獲一種類型的分子，而用另一區(qū)域捕獲不同類型的分子用于分析。可直接在結(jié)合區(qū)上分析分子。任選地，結(jié)合區(qū)可選擇性釋放不同類型的捕獲分子，并將這些分子運(yùn)輸?shù)椒治鰠^(qū)進(jìn)行進(jìn)一步加工或測(cè)定。
本發(fā)明的另一方面包括在表面上過(guò)濾和/或集中分析物(如化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)、生物物質(zhì)(biologics)等)的方法。優(yōu)選地，在具有多個(gè)SAM區(qū)域的表面上進(jìn)行該方法。在一個(gè)變型中，該方法包括以下步驟首先，將含有所需分析物和不需要的物質(zhì)的液體遞送到表面上；然后在該表面的第一區(qū)上捕獲或結(jié)合所需分析物；洗掉不需要的物質(zhì)；從第一區(qū)上釋放所需分析物并導(dǎo)向表面上的第二區(qū)；可使所需分析物集中和/或濃縮在第二區(qū)上；然后對(duì)所需分析物進(jìn)行分析和/或進(jìn)一步加工?？赏ㄟ^(guò)表面上不同區(qū)域中的液體表面張力不同引導(dǎo)液體流到該表面上。第二區(qū)優(yōu)選基本上不結(jié)合。此外，可在包括不同SAM確定的一系列同心環(huán)的表面上進(jìn)行該方法。
在另一變型中，將包含所需分析物和不需要的物質(zhì)的液體加到表面上。在該表面的第一區(qū)上至少捕獲一部分不需要的物質(zhì)。通過(guò)表面上不同區(qū)域的液體表面張力不同引導(dǎo)攜帶所需分析物的液體流向第二區(qū)。然后可將所需分析物濃縮和/或集中到第二個(gè)表面區(qū)域上。然后，可對(duì)第二區(qū)中的所需分析物進(jìn)行分析和/或進(jìn)一步加工?？赏ㄟ^(guò)表面上不同區(qū)域的液體表面張力不同引導(dǎo)液體流到該表面上。第二區(qū)優(yōu)選基本上不結(jié)合。此外，可在包括不同SAM確定的一系列同心環(huán)的表面上進(jìn)行該方法。本文也描述了利用樣品遞呈裝置的各種方法。
實(shí)施例XVIII
制備捕獲芯片的一個(gè)變型如實(shí)施例XIII所述制備二十四個(gè)(24)表面修飾的基片，安裝在調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板(0.002英寸)，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。將該夾具放在裝有低壓汞燈光源(能量密度為120W/cm2)的空氣冷卻的紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩⒈┞兜幕湃?.1mM 11-氨基-1-十一烷硫醇(Dojindo Molecular Technologies，Inc.產(chǎn)品號(hào)A423-10)的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。從組裝浴中取出圖案化的表面修飾的基片，用乙醇以2400rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩Ｊ┘佑谝后w保留區(qū)的水滴的接觸前角為48°-55°，當(dāng)施加于邊界區(qū)時(shí)，該角度為110°-119°。
將上述圖案化的表面修飾的基片安裝在調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上第二個(gè)針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。將該夾具放在紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。將暴露的基片放?.1mM 6(11-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}十一烷-1-硫醇)的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。最后，從組裝浴中取出圖案化兩次的表面修飾的基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。施加于分析區(qū)的水滴的接觸前角小于47°。
然后，在室溫下用含有胺反應(yīng)性位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈聚(烷基)共聚物的溶液(1mg/mL的二氯甲烷(含有0.5％v/v吡啶)溶液)處理這些兩次圖案化的表面4小時(shí)。然后，用熱氯仿洗滌該基片(2X)，然后用乙腈/乙醇/水(84∶13∶3)的混合物洗滌，然后將它們放在10％的氨溶液中30分鐘。然后用三次水洗滌替代氨溶液，對(duì)基片進(jìn)行乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌(見(jiàn)上)。施加于液體保留區(qū)的水滴的前接觸角為84-89°。
實(shí)施例XIX在捕獲芯片上純化分析物在MALDI-TOF譜中，待分析樣品的純度和組成可顯著影響分析物(如肽、蛋白質(zhì)、糖、寡核苷酸等)的電離和檢測(cè)。材料如鹽(如氯化鈉)、去污劑(如十二烷基硫酸鈉SDS)、緩沖液(如TRIS)和尿素可完全抑制分析物的檢測(cè)，尤其是稀釋樣品較多時(shí)。這些材料可能是樣品固有的，或在一些樣品加工步驟中引入的，需要在MALDI-TOF分析之前進(jìn)行額外的純化步驟。因此，用于此方法的現(xiàn)有技術(shù)通常包括反相液相色譜或固相抽提包括ZipTips，以去除這些不良污染物。當(dāng)采用這些額外的樣品純化步驟時(shí)，體積保持能力在與這些加工步驟相同的洗脫液體積內(nèi)的T3表面，可用于進(jìn)行該分析。然而，使用液體保留區(qū)(LRZ)含有長(zhǎng)鏈烷基(LCA)的X3表面可有助于檢測(cè)含有這些污染物的樣品中的分析物。為MALDI-TOF分析，通過(guò)在表面上對(duì)樣品進(jìn)行純化和后續(xù)的集中，可以不需要額外的加工步驟(以及設(shè)備和材料)。
以下說(shuō)明了用捕獲芯片分析肽的實(shí)例。將酵母烯醇酶消化物(Waters Corp.貨號(hào)186002325，SwissProt P00924)溶解于含有不同污染物的20％乙腈(ACN)/80％水的混合溶液。水部分共含有0.1％三氟乙酸(TFA)和以下物質(zhì)之一1M氯化鈉(NaCl)，1M尿素(Urea)，1M TRIS緩沖液(TRIS)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)。因此，將烯醇酶消化物分別溶解于這四種溶液中，將分析物的終濃度調(diào)整為1fmol/μL。
將10μL等份的含有分析物的溶液(10fmol總分析物)施加于實(shí)施例XVIII所述X3芯片的液體保留區(qū)(LRZ)(16個(gè)位點(diǎn)，2×8排列)上，在該表面上孵育20分鐘。平行地，將相同溶液施加于不銹鋼MALDI平臺(tái)(Bruker Daltonics貨號(hào)26755)上，以比較效果。由于不銹鋼表面的體積限制，不能施加全部10μL樣品。
在X3芯片上孵育后，去除大部分溶液，然后通過(guò)移液器用0.1％TFA(3x)洗滌這些位點(diǎn)。使第三次洗滌后表面上殘留的液體干燥，然后將2μL含有基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，Waters Corp.貨號(hào)186002331，0.25mg/mL的乙腈/乙醇/0.1％TFA84∶13∶3溶液)的溶液施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3.0mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。類似地，嘗試洗滌MALDI不銹鋼平板，施加基質(zhì)，為MALDI-TOF分析準(zhǔn)備平板。
在Axima CFR(Kratos Analytical by Shimadzu Biotech，Manchester，UK)上用脈沖式N2激光(337nm)、延遲抽提和加速電壓20kV以陽(yáng)離子模式進(jìn)行MALDI-TOF分析。用半自動(dòng)化方法以反射子(reflectron)模式操作該儀器，通常產(chǎn)生25-50光柵點(diǎn)/位點(diǎn)，20-50撞擊/光柵點(diǎn)。采集數(shù)據(jù)并儲(chǔ)存為所有光柵點(diǎn)的平均值，然后用MASCOT(http://www.matrixscience.com)以肽質(zhì)量指紋(PMF)進(jìn)行分析。MASCOT是搜索引擎，它采用在質(zhì)譜中觀察到的片段(峰)來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的一級(jí)序列。
在所有四種情況下，在不銹鋼上直接分析產(chǎn)生無(wú)效數(shù)據(jù)。各污染物引起干擾譜，不能將譜中的真實(shí)峰與干擾峰區(qū)別開(kāi)。將潔凈的(即不是有意污染的)消化物直接施加于不銹鋼表面導(dǎo)致可進(jìn)行PMF的譜。相反，X3表面提供的譜信噪比(S/N)高，峰多見(jiàn)。圖17a-17d說(shuō)明在所示污染物存在下在表面上純化后產(chǎn)生的譜。圖17a顯示了獲自被1M NaCl污染的樣品的結(jié)果，圖17b顯示了獲自被1M尿素污染的樣品的結(jié)果，圖17c顯示了獲自被1M TRIS污染的樣品的結(jié)果，而圖17d顯示了獲自被0.1％SDS污染的樣品的結(jié)果。X3表面的這些譜的MASCOT分析都鑒定了正確的消化蛋白質(zhì)，作為概率最高的答案。這些結(jié)果說(shuō)明X3表面在普通污染物的存在下無(wú)需額外純化步驟直接分析感興趣肽的能力。
實(shí)施例XX直接施加和分析凝膠中消化的蛋白質(zhì)在凝膠中用酶消化蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)組領(lǐng)域中所用的常見(jiàn)方法。1-D或2-D電泳和染色完成后，切下凝膠塊，脫色后消化，然后使游離的硫羥基還原并烷化。然后可溶解得到的肽，釋放到酸性溶液中。因?yàn)榇藭r(shí)該樣品常常是稀釋的并且含有污染物(如鹽、小分子等)，所以在MALDI-TOF分析之前進(jìn)行純化和濃縮方案可能是有益的。進(jìn)行純化的現(xiàn)有方法包括液相色譜或采用固相抽提筒。液相色譜是依賴于設(shè)備的方法，市售固相抽提產(chǎn)品(如ZipTip)可受限于尖頭-尖頭性能。這種要求可能使分析成為低通量過(guò)程。因此，可能需要至少能夠部分去除這些干擾污染物的樣品測(cè)定表面。這種樣品測(cè)定表面可提供可重復(fù)和高通量的平臺(tái)，用于分析物檢測(cè)和測(cè)定。
在一個(gè)具體應(yīng)用中，將來(lái)自兔肌肉的磷酸化酶b(Sigma貨號(hào)P6635，SwissProtP00489)溶解于18MΩ水中產(chǎn)生母液。然后，用該母液制備用于1-D凝膠電泳的蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)廠商方案制備Laemmli緩沖液(Bio-Rad貨號(hào)161-0737)，臨用前用此緩沖液稀釋蛋白質(zhì)母液。用預(yù)先澆鑄的4-15％SDS PAGE凝膠在Tris.HCl緩沖液(Bio-Rad產(chǎn)品號(hào)161-1176)中以70V恒壓進(jìn)行凝膠電泳。運(yùn)行完成后，用Gel Code Blue(Pierce產(chǎn)品號(hào)24590)染色凝膠過(guò)夜，然后用水洗滌。然后制備胰蛋白酶凝膠中消化所用的材料。采用市售的凝膠中胰蛋白酶消化試劑盒(Pierce產(chǎn)品號(hào)8987 IX)，按照廠商方案，但不對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜純化。消化的樣品母液的終濃度約為7.5pmol/μL，進(jìn)行稀釋以產(chǎn)生工作溶液濃度7.5fmol/μL的25％乙腈/0.1％TFA溶液。也按照廠商方案將一部分消化的樣品母液通過(guò)ZipTipμc18(Millipore貨號(hào)ZTC 18M)。然后將此樣品的濃度調(diào)整為7.5fmol/μL的25％乙腈/0.1％TFA溶液。然后，將此清潔的樣品用于T3表面，作比較之用。
將含有分析物的溶液(10μL，75fmol總分析物)施加于實(shí)施例XVIII所述X3型的液體保留區(qū)(LRZ)，在該表面上孵育20分鐘。孵育后，去除大部分溶液，然后通過(guò)移液器用10μL 0.1％TFA(3x)洗滌這些位點(diǎn)。使第三次洗滌后表面上殘留的液體干燥，然后將2μL含有基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，Waters Corp.貨號(hào)186002331，0.065mg/mL的乙腈/乙醇/0.1％TFA 84∶13∶3溶液)的溶液施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3.0mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
類似地，將清潔的消化物樣品(10μL，75fmol總分析物)施加于T3的液體保留區(qū)(LRZ)，集中并干燥。然后，將2μL含有基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，WatersCorp.貨號(hào)186002331，0.065mg/mL的乙腈/乙醇/0.1％TFA 84∶13∶3溶液(含有10mM檸檬酸銨))的溶液施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3.0mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
在Axima CFR(Kratos Analytical by Shimadzu Biotech，Manchester，UK)上用脈沖式N2激光(337nm)、延遲抽提和加速電壓20kV以陽(yáng)離子模式進(jìn)行MALDI-TOF分析。用半自動(dòng)化方法以反射子(reflectron)模式操作該儀器，通常產(chǎn)生25-50光柵點(diǎn)/位點(diǎn)，20-50撞擊/光柵點(diǎn)。采集數(shù)據(jù)并儲(chǔ)存為所有光柵點(diǎn)的平均值，然后用MASCOT(http://www.matrixscience.com)以肽質(zhì)量指紋(PMF)進(jìn)行分析。MASCOT是搜索引擎，它采用在質(zhì)譜中觀察到的片段(峰)來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的一級(jí)序列。
將樣品直接施加到不銹鋼表面上不能產(chǎn)生可分辨的譜圖。10pmol樣品的例子見(jiàn)圖18c。在不銹鋼上小于此濃度的所有濃度僅產(chǎn)生干擾譜。X3表面能夠純化肽，并將它們集中到分析區(qū)(AZ)中。如圖18a所示，該譜中有許多片段峰，尤其是在m/z值大于1300道爾頓時(shí)。ZipTip/T3法也產(chǎn)生多峰譜圖，但質(zhì)量范圍趨向于較低分子量(小于2000道爾頓)的物質(zhì)，如圖18b所示。
雖然X3方法或ZipTip/T3方法產(chǎn)生的譜圖的外形不同，但兩種方法都適用于這種類型的分析。采用T3表面時(shí)用ZipTip脫鹽產(chǎn)生的結(jié)果是37％的觀察峰與理論上推定的片段相匹配。匹配肽對(duì)應(yīng)于覆蓋了預(yù)計(jì)胰酶消化片段的37％序列。將凝膠中消化物直接施加于X3表面產(chǎn)生的譜圖中，44％的峰與理論上預(yù)計(jì)的片段相匹配，即39％序列覆蓋。這些值與在ZipTip上純化后轉(zhuǎn)移到MALDI樣品板上的方法獲得的值相當(dāng)，但無(wú)需額外的樣品制備步驟。
實(shí)施例XXIX3表面覆蓋的質(zhì)量范圍擴(kuò)展X3-乙腈-TFA方法將兔磷酸化酶B(Waters Corp.貨號(hào)186002326，SwissProt P00489)溶解于50％乙腈(ACN)/50％三氟乙酸的混合溶液中，將該酶的終濃度調(diào)整為1fmol/μL。將含有分析物的溶液(10μL，10fmol總分析物)施加于實(shí)施例XVIII所述X3型表面的液體保留區(qū)(LRZ)，在該表面上孵育20分鐘。孵育后，去除大部分溶液，然后通過(guò)移液器用10μL 0.1％TFA(2x)洗滌這些位點(diǎn)。使第三次洗滌后表面上殘留的液體干燥，然后將2μL含有基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB，Waters Corp.貨號(hào)186002333，0.65mg/mL的乙腈/0.1％TFA溶液(含有10mM檸檬酸銨)，4∶1)的溶液施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3.0mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
X3-乙腈-MOPS方法或者，將兔磷酸化酶B(Waters Corp.貨號(hào)186002326，SwissProt P00489)溶解于50％乙腈(ACN)/50％3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS，200mM，pH6.5)的混合溶液，將終濃度調(diào)整為1fmol/μL。將含有分析物的溶液(10μL，10fmol總分析物)施加于實(shí)施例XVIII所述X3型表面的液體保留區(qū)(LRZ)，在該表面上孵育20分鐘。孵育后，去除大部分溶液，然后通過(guò)移液器用10μL 20mM乙酸銨(2x)洗滌這些位點(diǎn)。使第三次洗滌后表面上殘留的液體干燥，然后將2μL含有基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB，Waters Corp.貨號(hào)186002333，0.65mg/mL的乙腈/0.1％TFA溶液(含有10mM檸檬酸銨)，4∶1)的溶液施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3.0mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品表面裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
T3-乙腈-TFA方法將兔磷酸化酶B(Waters Corp.貨號(hào)186002326，SwissProt P00489)溶解于50％乙腈(ACN)/50％三氟乙酸的混合溶液中，將終濃度調(diào)整為1fmol/μL。將含有分析物的溶液(10μL，10fmol總分析物)施加于實(shí)施例XVIII所述T3型表面的液體保留區(qū)(LRZ)，干燥并集中到分析區(qū)中。然后，將2μL含有基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB，Waters Corp.貨號(hào)186002333，0.65mg/mL的乙腈/0.1％TFA溶液(含有10mM檸檬酸銨)，4∶1)的溶液施加在各位點(diǎn)上。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的T3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將樣品表面裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
在Axima CFR(Kratos Analytical by Shimadzu Biotech，Manchester，UK)上用脈沖式N2激光(337nm)、延遲抽提和加速電壓20kV以陽(yáng)離子模式對(duì)上述樣品進(jìn)行MALDI-TOF分析。用半自動(dòng)化方法以反射子模式操作該儀器，通常產(chǎn)生25-50光柵點(diǎn)/位點(diǎn)，20-50撞擊/光柵點(diǎn)。采集數(shù)據(jù)并儲(chǔ)存為所有光柵點(diǎn)的平均值，然后用MASCOT以肽質(zhì)量指紋(PMF)進(jìn)行分析。
在X3型表面上的兩種方法都產(chǎn)生信噪比高的多峰譜圖，但序列沒(méi)有完全重疊。TFA方法產(chǎn)生44％序列覆蓋的譜圖，如圖19a所示。MOPS方法產(chǎn)生46％序列覆蓋的譜圖，但更重要的是，該方法揭示了關(guān)于樣品本身的新信息，如圖19b所示。當(dāng)組合各方法鑒定的片段時(shí)，序列覆蓋提高到胰酶消化磷酸化酶B的預(yù)計(jì)片段的57％。這與施加清潔的消化樣品后獲自T3型表面的結(jié)果非常一致，如圖19c所示。在這種情況下，序列覆蓋為58％，可代表樣品中容易檢測(cè)的感興趣片段。
用抗體作為捕獲機(jī)制的實(shí)施例特異性分離和檢測(cè)復(fù)雜溶液(如血清、混合的蛋白水解消化物、血漿等)中的分析物對(duì)各種生物、生化和化學(xué)分析方法來(lái)說(shuō)很重要?？贵w是可獲得的選擇性和靈敏度最高的工具，可容易地產(chǎn)生抗各種分析物的抗體?？贵w形成免疫試驗(yàn)的基礎(chǔ)，它們廣泛用于臨床化學(xué)、環(huán)境分析以及研究和開(kāi)發(fā)。用抗體純化的分析物一般需要一個(gè)或多個(gè)離線清潔步驟和濃縮步驟，然后施加于分析基片(如MALDI基片等)，這些步驟可能導(dǎo)致大量樣品損失。
能夠在一個(gè)基片上捕獲分析物和進(jìn)行濃縮步驟的裝置可最大程度降低樣品損失并提高檢測(cè)能力。能特異性捕獲分析物的抗體和其它配體可固定在樣品遞呈裝置的表面上，形成捕獲區(qū)。例如，可通過(guò)各種化學(xué)方法修飾X3表面，產(chǎn)生具有固定抗體的捕獲區(qū)。然后，可用X3芯片為在單個(gè)裝置上進(jìn)行MALDI-MS提供選擇性捕獲、濃縮和遞呈，這就不需要額外的加工步驟。
在一個(gè)實(shí)施例中，合成以下一系列化學(xué)物質(zhì)，產(chǎn)生用于制備具有錨定抗體的表面的樣品遞呈裝置的化學(xué)物質(zhì)。
2-[2-(2-{2-[2-(2-十一碳-10-烯氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙醇(13)。
將六乙二醇(26.9mL，0.1mol)加入100mL圓底燒瓶，向其中加入50％氫氧化鈉水溶液(1.72mL，22mmol)。將該溶液加熱到100℃并攪拌30分鐘。此時(shí)，逐滴加入11-溴十一碳-1-烯(4.7mL，21mmol)，繼續(xù)在100℃反應(yīng)18小時(shí)，直到TLC分析顯示出已消耗了原材料，然后冷卻到室溫。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物。對(duì)此殘余物進(jìn)行柱色譜(SiO2，40×200mm，20％甲醇/乙酸乙酯)，然后混合含有所需產(chǎn)物的組分，蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生2.0g(21％)淺黃色油狀13。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.78(m，1H)，4.94(m，2H)，3.69-3.54(m，24H)，3.42(t，J＝7.0Hz，2H)，2.38(bs，1H)，2.01(m，2H)，1.55(m，2H)3 1.33(m，2H)，1.23(bs，10H)。
{2-[2-(2-{2-[2-(2-十一碳-10-烯氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙酸叔丁酯(14)。
在無(wú)水條件下將13(2.0g，4.6mmol)加入50mL圓底燒瓶中。將其溶解于10mL無(wú)水二甲基甲酰胺，通過(guò)外部冷卻到0℃。將一份氫化鈉(60％的礦物油溶液，267mg，6.9mmol)加入此冰冷溶液中，在氬氣、0℃下攪拌該起泡混合物10分鐘。此時(shí)，逐滴加入溴代乙酸叔丁酯(1.02mL，6.9mmol)，將該反應(yīng)加熱到20℃8小時(shí)。TLC分析顯示此時(shí)該反應(yīng)不再繼續(xù)。通過(guò)緩慢加入10mL水終止該反應(yīng)，用50mL乙酸乙酯稀釋，用水萃取(2×50mL)。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，過(guò)濾，蒸發(fā)溶劑產(chǎn)生油狀殘余物。對(duì)此殘余物進(jìn)行柱色譜(SiO2，40×200mm，100％乙酸乙酯)，然后混合含有所需產(chǎn)物的組分，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生1.64g(65％)無(wú)色油狀14。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.79(m，1H)，4.94(m，2H)，4.00(s，2H)，3.71-3.54(m，24H)，3.42(t，J＝6.8Hz，2H)，2.01(m，2H)，1.54(m，2H)，1.45(s，9H)，1.34(m，2H)，1.24(bs，10H)。
(2-{2-[2-(2-{2-[2-(11-乙?；蛲榛檠趸?乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]-乙氧基}乙氧基)乙酸叔丁酯(15)。
在無(wú)水條件下將14(1.64g，3.0mmol)加入50mL圓底燒瓶中，將其溶解于20mL無(wú)水甲醇。向其中加入2，2′-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(81mg，0.3mmol)，然后加入硫羥乙酸(715μL，10mmol)。然后用鋁箔遮蔽該反應(yīng)，用低壓汞燈的光線處理。4小時(shí)后，TLC分析顯示出已消耗原材料。真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生油狀殘余物。然后對(duì)此殘余物進(jìn)行柱色譜(SiO2，40×200mm，100％乙酸乙酯)，然后混合含有所需產(chǎn)物的組分，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生1.48g(79％)無(wú)色油狀15。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.02(s，2H)，3.73-3.56(m，24H)5 3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，2.86(t，J＝7.2Hz，2H)，2.32(s，3H)5 1.56(m5 4H)，1.48(s，9H)，1.25(bs，14H)。
(2-{2-[2-(2-{2-[2-(11-巰基十二烷氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]-乙氧基}乙氧基)乙酸(16)。
將15(2.0g，3.2mmol)加入裝有特氟龍/硅隔板帽的20mL棕色瓶，將其溶解于3 N甲醇化氯化氫(5mL，15mmol)，加熱到50℃。將該溶液保持在50℃ 2小時(shí)。然后真空去除溶劑，然后將殘余物溶解于5mL 50％氫氧化鉀水溶液與甲基亞砜(1∶1)(在加入殘余物之前已脫氧)。在室溫下攪拌該混合物1小時(shí)，然后真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生1.6g(95％)澄清油狀16。該化合物不需要進(jìn)一步色譜純化。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.98(bs，1H)，4.14(s，2H)，3.74-3.57(m，24H)，3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，2.51(q，J＝7.2，2H)，1.57(m，4H)，1.32(t，J＝7.6Hz，1H)，1.26(bs，14H)。
實(shí)施例XXII制備圖案化的樣品遞呈裝置(X3方式，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)實(shí)施例)用基于抗體的捕獲區(qū)制造樣品遞呈裝置的過(guò)程中，可首先制備具有為接受和錨定抗體修飾的捕獲區(qū)的裝置。然后，可根據(jù)具體應(yīng)用，用特定抗體定制預(yù)制造的樣品遞呈裝置。預(yù)制造的樣品遞呈裝置可用于大量生產(chǎn)過(guò)程，以最大程度降低制造成本。例如，首先可產(chǎn)生大量預(yù)制造的樣品遞呈裝置，然后可用特定類型的抗體定制選擇的生產(chǎn)批次。在另一應(yīng)用中，可將預(yù)制造的樣品遞呈裝置提供給最終用戶。然后，最終用戶可通過(guò)將特定抗體錨定在該樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)中定制該預(yù)制造的樣品遞呈裝置。
下面描述了產(chǎn)生預(yù)制造的樣品遞呈裝置的方法實(shí)例。在此實(shí)例中，用NHS-酯基衍生樣品遞呈裝置上的捕獲區(qū)，使它們可用于錨定抗體。如實(shí)施例XIII所述制備24個(gè)表面修飾的基片，安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板(0.002英寸)，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。將該夾具放在裝有低壓汞燈光源(能量密度為120W/cm2)的空氣冷卻的紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩⒈┞兜幕湃牒?％16和95％6(總硫醇濃度為0.1mM)的乙醇混合溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。從組裝浴中取出圖案化的表面修飾的基片，用乙醇以2400rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩?br> 將圖案化的表面修飾的基片安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上第二個(gè)針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。將該夾具放在紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。將暴露的基片放?.1mM 9的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。最后，從組裝浴中取出圖案化兩次的表面修飾的基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩?br> 然后，在25mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0中孵育這些兩次圖案化的表面15分鐘。然后從緩沖溶液中取出這些兩次圖案化的表面，用含有1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC；0.4M)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS；0.1M)的水溶液在室溫下處理60分鐘。然后用UHP水洗滌該基片，然后用丙酮洗滌，用氮?dú)饬鞔蹈伞Ｈ肷溆嘟?grazing-angle)FTIR(～1742cm-1)證實(shí)存在NHS酯基，如圖20所示。
實(shí)施例XXIII從緩沖液和稀釋的血清樣品中固定抗體和檢測(cè)抗原以下描述了固定抗體以在樣品遞呈裝置上形成捕獲區(qū)并用它們特異性捕獲和檢測(cè)復(fù)雜混合物中的人類肽激素的例子。溶解抗人促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的C-末端(氨基酸18-39；Serotech，P/N MCA2000)或N-末端(氨基酸1-24；Biodesign P/NE54057M)部分的單克隆抗體以及非特異性小鼠免疫球蛋白(IgG；Chemicon，P/NPP100)制劑，使其在含有25mM磷酸鈉，pH8.0和0.1％吐溫-20的緩沖液中的終濃度為0.5mg/mL。
將10μL抗體溶液施加在實(shí)施例XXII所述X3芯片的液體保留區(qū)上，在相對(duì)濕度(RH)維持在100％的小室中孵育60分鐘。通過(guò)噴藥瓶用含有0.05％吐溫-20(TBS/吐溫)的過(guò)量Tris-緩沖鹽溶液洗掉芯片上的抗體溶液。通過(guò)溫和振蕩取出位點(diǎn)上過(guò)量的洗滌溶液，然后將10μL含有0.1％吐溫-20的50mM乙醇胺(Sigma P/N E9508)，pH9.0溶液施加于這些位點(diǎn)，在100％RH下孵育30分鐘(此過(guò)程能終止任何剩余的活化NHS基團(tuán)并防止它們共價(jià)結(jié)合于其它材料)。孵育后，通過(guò)噴藥瓶用TBS/吐溫洗掉乙醇胺溶液，如上所述。然后用5μL含有0.5％吐溫-20的1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma P/N A3059)溶液處理各位點(diǎn)，以封閉所有非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后加入分析物。讓BSA溶液在芯片上以100％RH孵育30分鐘，然后如上所述洗滌。
將5μL等份的ACTH肽(全長(zhǎng)、氨基酸1-39，Bachem P/N H-4998；或C末端，氨基酸18-39，Bachem P/N H-1215)在10％兔血清或TBS/吐溫中的稀釋液施加在各位點(diǎn)上，肽濃度為2nM-100nM。將這些肽在該芯片上以100％RH孵育30分鐘，然后用TBS/吐溫洗滌，再用UHP水洗滌，都采用噴藥瓶。然后在氮?dú)饬髦懈稍镌撔酒?。?μL含有基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB；Bruker Daltonics P/N 203074)，0.5mg/mL的乙腈/乙醇/0.1％TFA溶液(含有10mM二代檸檬酸銨)(84∶13∶3)施加在各位點(diǎn)上。該基質(zhì)溶液擴(kuò)散，充滿了該位點(diǎn)的3mm直徑。干燥后，將樣品和基質(zhì)濃縮到與其連接的X3位點(diǎn)的分析區(qū)(AZ)中。然后將該芯片裝在準(zhǔn)備用于MALDI-TOF分析的支架上。
在Axima CFR(Kratos Analytical by Shimadzu Biotech，Manchester，UK)上用脈沖式N2激光(337nm)、延遲抽提和加速電壓20kV以陽(yáng)離子模式進(jìn)行MALDI-TOF分析。用半自動(dòng)化方法以反射子模式操作該儀器，通常產(chǎn)生25-50光柵點(diǎn)/位點(diǎn)，20-50撞擊/光柵點(diǎn)。采集數(shù)據(jù)并儲(chǔ)存為所有光柵點(diǎn)的平均值。評(píng)價(jià)譜圖中預(yù)計(jì)m/Z處是否存在獨(dú)特的峰。
在固定了抗ACTH C末端的單克隆抗體(mAb)的位點(diǎn)上不難用MALDI-TOF分析檢測(cè)用10％兔血清稀釋到終濃度10nM的兩種ACTH肽。從位點(diǎn)的譜圖中可以看出，非特異性小鼠IgG沒(méi)有捕獲到任何ACTH肽。當(dāng)10％兔血清施加于不銹鋼平板時(shí)，無(wú)論其是否含有額外的ACTH肽，都不能獲得有用的MALDI-TOF譜。
各ACTH肽在TBS/吐溫緩沖液中的連續(xù)稀釋液的應(yīng)用進(jìn)一步說(shuō)明在這些X3芯片上進(jìn)行抗原捕獲和檢測(cè)的特異性和靈敏度。圖21顯示抗體/抗原配對(duì)可以檢測(cè)2nM濃度的肽，而不匹配對(duì)的譜顯示高濃度(100nM)溶液都沒(méi)有肽結(jié)合。采用抗ACTH C末端抗體捕獲區(qū)時(shí)，對(duì)于ACTH 18-39(C末端)和ACTH 1-39(全長(zhǎng))肽，低至2nM的抗原濃度就能產(chǎn)生陽(yáng)性檢測(cè)。采用抗ACTH N-末端抗體捕獲區(qū)時(shí)，當(dāng)與ACTH18-39(C-末端)肽抗原配對(duì)時(shí)，如期獲得陰性結(jié)果，即使肽濃度高達(dá)100nM。采用抗ACTH N-末端抗體捕獲區(qū)時(shí)，當(dāng)與ACTH 1-39(全長(zhǎng))肽抗原配對(duì)時(shí)，如期獲得陽(yáng)性結(jié)果，即使肽濃度低至2nM。在捕獲區(qū)上采用非特異性小鼠IgG抗體的對(duì)照組中，ACTH18-39(C末端)肽和ACTH 1-39(全長(zhǎng))肽都如期產(chǎn)生陰性檢測(cè)，即使?jié)舛雀哌_(dá)100nM。這些數(shù)據(jù)表明，該裝置高度靈敏，能夠檢測(cè)低濃度(如2nM)抗原。同時(shí)，該裝置對(duì)假陽(yáng)性結(jié)果具有高度耐受性，如即使抗原濃度非常高(如100nM)時(shí)的陰性檢測(cè)所示。
這些結(jié)果說(shuō)明此X3表面能夠固定抗體和利用這些抗體特異性和靈敏地檢測(cè)復(fù)雜混合物中的生物分子，而無(wú)需單獨(dú)的純化或濃縮步驟。
利用固定的金屬離子作為捕獲機(jī)制的實(shí)施例在另一變型中，可將金屬離子裝載到捕獲區(qū)上，提供用于捕獲特定分析物的選擇性結(jié)合界面。通過(guò)將合適金屬離子加載到捕獲區(qū)中，可以在捕獲區(qū)形成固定的金屬親和色譜(IMAC)表面。
在一種變型中，將鐵(即Fe(III))加載到捕獲區(qū)中。在另一變型中，將鎳(即Ni(II))加載到捕獲區(qū)中。加載金屬的捕獲區(qū)可用于捕獲選擇的分析物的各種應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施例中，用捕獲區(qū)上加載了Fe(III)的樣品遞呈裝置捕獲磷酸化肽。在另一實(shí)施例中，用捕獲區(qū)上加載了Ni(II)的樣品遞呈裝置捕獲His標(biāo)記的物質(zhì)。閱讀了本公開(kāi)內(nèi)容的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可將各種金屬選擇性加載到樣品遞呈裝置的捕獲區(qū)上，然后用這些離子捕獲相應(yīng)的生物物質(zhì)、生化物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)，以進(jìn)行分析和/或加工。
例如，具有加載了金屬的捕獲區(qū)的樣品遞呈裝置尤其可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。許多蛋白質(zhì)組學(xué)研究特別搜索參與疾病通路的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的差異。所述修飾之一是蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)磷酸化可用于打開(kāi)或關(guān)閉通路。分離磷酸肽和蛋白質(zhì)的常用方法是固定的金屬親和色譜(IMAC)。然而，IMAC方法一般是煩瑣和/或昂貴的，通常需要多個(gè)樣品液體轉(zhuǎn)移步驟。如果采用具有加載了金屬的捕獲表面的樣品遞呈裝置，用戶能夠最大程度減少樣品轉(zhuǎn)移和/或提高靶分子檢測(cè)能力。在一個(gè)實(shí)施例中，用含有金屬離子的X3表面螯合磷酸肽或蛋白質(zhì)，然后洗掉未結(jié)合的物質(zhì)。然后，可洗脫螯合的磷酸化樣品，與基材共結(jié)晶，以進(jìn)行MALDI-MS。這可減少全部樣品處理步驟，因此能最大程度降低樣品損失和污染的風(fēng)險(xiǎn)。
在另一變型中，構(gòu)建樣品遞呈裝置，使它的捕獲區(qū)中具有另一IMAC表面。在一個(gè)實(shí)施例中，將預(yù)制造的樣品遞呈裝置轉(zhuǎn)變?yōu)榧虞d了Ni(II)的表面。可用得到的樣品遞呈裝置捕獲樣品溶液中的His標(biāo)記物質(zhì)。常常將His標(biāo)記摻入重組蛋白以易于純化。廣泛洗滌所有未結(jié)合物質(zhì)后，用各種方法(如過(guò)量咪唑或在酸性條件下等)洗脫結(jié)合的蛋白并分離。因此，可用X3 IMAC表面捕獲His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，以排除沒(méi)有His標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)理解，本文所述方法可用于制備捕獲所選擇物質(zhì)(如磷酸化酪氨酸、His標(biāo)記的物質(zhì)等)的各種裝置的表面，以進(jìn)行進(jìn)一步加工或分析。此外，也考慮到，可將其它金屬(如Zn、Cu等)加載到捕獲區(qū)上，提供用于捕獲特定分析物的選擇性結(jié)合界面。
在一個(gè)實(shí)施例中，合成以下一系列化學(xué)物質(zhì)，產(chǎn)生用于制備具有為接受和錨定所選金屬離子構(gòu)建的捕獲區(qū)的預(yù)制造的樣品遞呈裝置的化學(xué)物質(zhì)。
1，2，3，4，5-五氟-6-十一碳-10-烯氧基甲基-苯(17)。
在氬氣下將10-十一碳烯醇(5.11g，30mmol)加入干燥的200mL圓底燒瓶，加入30mL無(wú)水四氫呋喃(THF)。將得到的溶液冷卻到0℃，逐滴加入叔丁氧鉀(14.67g，200mmol)在60mL THF中的溶液。在氬氣、0℃下攪拌該混合物90分鐘。向冷卻、攪拌過(guò)的溶液中逐滴加入2，3，4，5，6-五氟芐基溴(5.07mL，36mmol)，使該反應(yīng)在0℃繼續(xù)進(jìn)行90分鐘。通過(guò)緩慢加入30mL水終止該反應(yīng)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑將溶液的總體積減少到～30-40mL。然后用乙酸乙酯稀釋到200mL，然后用鹽水(1×200mL)和水(2×200mL)萃取。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，過(guò)濾，蒸發(fā)溶劑產(chǎn)生油狀17。該殘留物即可用于后續(xù)反應(yīng)。
硫代乙酸11-五氟苯基甲氧基-十一烷基酯(18)。
將17(10.52g，30mmol)和硫代乙酸(10.72mL，150mmol)加入干燥的夾套式250mL光反應(yīng)容器中。將它們?nèi)芙庥?50mL無(wú)水甲醇，然后加入2，2′-偶氮雙(2-甲基丙酰胺)二鹽酸鹽(814mg，3mmol)。打開(kāi)UV燈，在氬氣下照射該混合物4小時(shí)(同時(shí)恒定地?cái)嚢?。連續(xù)冷卻該反應(yīng)(水夾套)，在光反應(yīng)過(guò)程中將溫度維持在38℃以下。使該反應(yīng)容器冷卻到室溫，蒸發(fā)溶劑產(chǎn)生淺黃色油狀物。對(duì)該油狀物進(jìn)行硅膠色譜(41×300mm，1％乙酸乙酯/己烷，每?jī)蓚€(gè)柱體積后增加1％的乙酸乙酯濃度)，收集含有所需產(chǎn)物的組分，混合，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生3.74g(29％，兩步)無(wú)色油狀18。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ4.46(pt，2H)，3.46(t，2H)，4.16(t，J＝6.8Hz，2H)，2.85(t，J＝6.0Hz 2H)，2.31(s，3H)，1.72(m，2H)，1.56(m，2H)，1.24-1.36(寬m，14H)。
11-五氟苯基甲氧基-十一烷-1-硫醇(19)。
40mL棕色瓶裝有具有特氟龍線紋的硅隔板，向其中加入18(1.55g，3.6mmol)。溶解于10mL 4.9 N乙醇化氯化氫，將得到的溶液加熱到40℃ 2.5小時(shí)。然后，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生無(wú)色油狀殘余物。對(duì)該殘余物進(jìn)行硅膠色譜(41×450mm，5％乙酸乙酯/己烷)，收集并混合含有所需產(chǎn)物的組分。真空蒸發(fā)溶劑，得到144mg(10％)無(wú)色油狀19。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.46(pt，2H)，4.17(t，J＝6.4Hz，2H)，2.51(dd，J＝7.6，14.6Hz，2H)，1.74(m，2H)，1.58(m，2H)，1.34(t，1H)，1.21-1.30(寬m，14H)。
實(shí)施例XXIV制備圖案化的樣品遞呈裝置(X3，C15-CO2H實(shí)施例)如實(shí)施例XIII所述制備24個(gè)表面修飾的基片，安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板(0.002英寸)，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于液體保留區(qū)的特征。將該夾具放在裝有低壓汞燈光源(能量密度為120W/cm2)的空氣冷卻的紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。將暴露的基片放入含?％16-巰基十六酸和95％19(總硫醇濃度為0.1mM)的乙醇混合溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。從組裝浴中取出圖案化的表面修飾的基片，用乙醇以2400rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩?br> 將圖案化的表面修飾的基片安裝在定制的調(diào)準(zhǔn)夾具中，蓋上第二個(gè)針腳對(duì)齊的蝕刻不銹鋼蔭罩板，該蔭罩板具有大小和形狀對(duì)應(yīng)于分析區(qū)的特征。將該夾具放在紫外線固化系統(tǒng)的移動(dòng)帶上，在1小時(shí)中在該光源下通過(guò)45-75次。暴露于UV后，從夾具中取出基片，用乙醇1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍?。將暴露的基片放?.1mM 9的乙醇溶液中，室溫下孵育1-24小時(shí)。最后，從組裝浴中取出圖案化兩次的表面修飾的基片，用乙醇以1000rpm旋轉(zhuǎn)洗滌，在氮?dú)饬髦懈稍铩?br> 實(shí)施例XXV制備NHS芯片，然后連接于NTA(次氮基三乙酸)配體用10％氨溶液洗滌如實(shí)施例XXIV所述具有酸性基團(tuán)的X3表面5分鐘，然后用水沖洗。然后，用氮?dú)饬鞲稍镌摫砻妗Ｏ蚋骺字屑尤?0μL含有0.1％(v/v)辛基-β-葡糖苷(OBG，Pierce 28310)的25mM磷酸鈉(Sigma S9763)pH8，繼續(xù)孵育10分鐘。然后通過(guò)移液器用10μL 0.1％OBG(v/v)洗滌該表面兩次。然后通過(guò)加入10μL 50mMNHS(Pierce 24500)溶液和200mM EDC(Pierce 22981)在0.1％OBG中的溶液并孵育20分鐘使酸性基團(tuán)與NHS反應(yīng)。然后，通過(guò)移液器用10μL 0.1％OBG(v/v)洗滌該表面兩次。下一個(gè)步驟包括將表面上形成的NHS酯與螯合配體反應(yīng)。將10μL 20mMAB-NTA(Dojindo A296)在25mM磷酸鈉緩沖液(含有0.1％OBG)pH8中的溶液施加在該表面上并孵育30分鐘。然后，通過(guò)移液器用10μL 0.1％OBG(v/v)洗滌該表面兩次。
實(shí)施例XXVI將Fe(III)加載到NTA表面上，然后施加樣品下一步是引入其中會(huì)發(fā)生金屬螯合的緩沖液。因此，用10μL 100mM AcOH(乙酸)的0.1％OBG溶液洗滌該表面兩次。然后，通過(guò)施加10μL 1mM FeCl3(SigmaF-1513)在1mM AcOH～pH3(含有0.1％OBG)中的溶液并孵育10分鐘來(lái)加載該金屬。重要的是使FeCl3溶液保持新鮮，因?yàn)樗鼤?huì)隨時(shí)間氧化。加載金屬10分鐘后，用10μL 100mM AcOH的0.1％OBG溶液洗滌該表面2次，然后用10μL 100mM AcOH的0.1％OBG溶液(含有1M尿素)(Stratagene 300191)洗滌一次。然后將該樣品施加于同一溶液中，孵育20分鐘。然后用10μL樣品緩沖液洗滌該表面一次，然后用10μL100mM AcOH洗滌兩次。然后空氣干燥該表面。再通過(guò)將2μL 1∶1 ACN(乙腈)∶0.1％磷酸溶液加入各孔從X3表面上預(yù)洗脫樣品，并且干燥至中心。這使磷酸肽從Fe(III)-NTA表面上釋放到溶液中，后來(lái)將該溶液濃縮至中心。這些孔干燥后，將2μL基質(zhì)施加于各孔?；|(zhì)組成是0.5mg/mL DHB的90∶10 ACN∶檸檬酸銨(5mM)溶液。該組成導(dǎo)致在整個(gè)孔中形成均一的結(jié)晶墊。
下面描述了利用加載Fe(III)的樣品遞呈裝置從凝膠中胰酶消化物挑選出磷酸肽的示范性應(yīng)用。將牛奶的β-酪蛋白(Sigma貨號(hào)C6905，SwissProt P02666)溶解于18MΩ水中產(chǎn)生母液。然后，用此母液制備用于1-D凝膠電泳的蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)生產(chǎn)商方法制備Laemmli緩沖液(Bio-Rad貨號(hào)161-0737)，臨用前用該緩沖液稀釋蛋白質(zhì)母液。用預(yù)先澆鑄的4-15％SDS PAGE凝膠在Tris.HCl緩沖液(Bio-Rad產(chǎn)品號(hào)161-1176)中以110V恒壓進(jìn)行凝膠電泳。運(yùn)行完成后，用水徹底洗滌該凝膠，以去除大部分SDS。然后將凝膠放置在10％MeOH、7％AcOH溶液中20分鐘以固定凝膠。然后用Sypro Ruby(BioRad貨號(hào)170-3125)染色凝膠過(guò)夜，然后用10％MeOH、7％AcOH脫色。在暗室內(nèi)用透照儀觀察條帶，用去除每一凝膠部分(slice)后用乙醇清潔的刀片從凝膠中切下各條帶。按照已知方法(Rapid Comm.in Mass Spec.2001，75，1416-1421)在凝膠中進(jìn)行胰酶消化，然而，最后不用TFA混合物提取凝膠部分，從未用Speedvac蒸發(fā)器干燥凝膠或凝膠抽提物。因此，獲自凝膠中消化物的上清(20μL/部分)無(wú)需進(jìn)一步純化或濃縮即可使用。消化的樣品母液的終濃度約為25fmol/μL，無(wú)需進(jìn)一步稀釋即可使用。
如上述方法所述制備Fe(III)-NTA表面，直到與10μL 100mM AcOH的0.1％OBG(含有1M尿素)溶液一起孵育。此時(shí)，將5μL凝膠中的消化物上清加入各孔，使每孔的總體積為15μL。在表面上孵育20分鐘，其余方法如前所述。正如預(yù)計(jì)那樣，如果凝膠污染物結(jié)合于表面，集中溶液沒(méi)有問(wèn)題。
在Axima CFR(Kratos Analytical by Shimadzu Biotech，Manchester，UK)上用脈沖式N2激光(337nm)、延遲抽提和加速電壓20kV以陽(yáng)離子模式進(jìn)行MALDI-TOF分析。用半自動(dòng)化方法以反射子模式操作該儀器，通常產(chǎn)生25-50光柵點(diǎn)/位點(diǎn)，20-50撞擊/光柵點(diǎn)。采集數(shù)據(jù)并儲(chǔ)存為所有光柵點(diǎn)的平均值。
如圖22所示，主要峰(除880m/z處的基質(zhì)束)是預(yù)計(jì)來(lái)自β-酪蛋白消化的兩種磷酸肽(2064m/z和3124m/z)。不存在胰蛋白酶自身消化峰很引人注意。
在另一示范性應(yīng)用中，用加載Fe(III)的X3 IMAC表面從背景胰酶消化物中挑選出磷酸肽。用如前所述的相同方法將100fmol磷酸化酶B消化物(Waters Corp.貨號(hào)186002326，SwissProt P00489)和5fmol of β-酪蛋白消化物的混合物施加在X3 IMAC表面上。磷酸酶b不含磷酸化氨基酸，本文中用它作為樣品污染物。如圖23所示，當(dāng)將混合的蛋白質(zhì)消化樣品溶液放置在T3表面上時(shí)，背景噪音足夠高，以致于難以鑒定譜中磷酸肽的峰。T3表面不具有能捕獲磷酸肽并將該磷酸肽與不需要的物質(zhì)分離開(kāi)的結(jié)合表面。然而，當(dāng)在X3 IMAC表面上處理混合的蛋白質(zhì)消化樣品溶液時(shí)，顯著提高了信噪比。如圖24所示，X3 IMAC表面顯示出對(duì)磷酸肽的強(qiáng)烈結(jié)合(2064m/z和3124m/z)，而在T3上捕獲的譜中不能觀察到這種現(xiàn)象(圖23)。
測(cè)試加載Fe(III)的樣品遞呈裝置用于各種濃度的磷酸化酪氨酸肽的情況，以證實(shí)該裝置檢測(cè)低水平含磷酸化酪氨酸的化合物的能力。將不同量的磷酸化酪氨酸肽，pp60C-SRC羧基末端磷酸調(diào)節(jié)肽(Bachem，H-3258)加載到按照上述方法加載了Fe(III)的X3 IMAC上。用Axima CFR獲得了良好的靈敏度，如圖25所示。
實(shí)施例XXVII將Ni(II)加載到NTA表面上，然后施加樣品在此實(shí)施例中，在0.1％OBG中發(fā)生金屬螯合。通過(guò)施加10μL含有0.1％OBG的10mM NiSO4·6H2O(Sigma 227676)溶液并孵育10分鐘加載該金屬。加載金屬10分鐘后，用10μL 0.1％OBG洗滌該表面一次，然后用10μL 10mM HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸；Sigma H-4034)pH7.4、150mM NaCl(Calbiochem 567441)和0.1％OBG洗滌2次。然后將該樣品加入5μL相同溶液中，孵育20分鐘。再用10μL樣品緩沖液洗滌該表面3次，用10μL水洗滌兩次。然后空氣干燥該表面。然后通過(guò)向各孔加入2μL 1∶1 ACN∶0.1％磷酸溶液從Ni(II)-NTA表面上預(yù)洗脫樣品，干燥至中心。這些酸性條件使His標(biāo)記的蛋白質(zhì)從IMAC表面上釋放到溶液中，然后濃縮到中心。一旦這些孔干燥后，將2μL基質(zhì)加入各孔?；|(zhì)組成是0.5mg/mL DHB的90∶10ACN∶5mM檸檬酸銨溶液。該組成導(dǎo)致在整個(gè)孔中形成均一的結(jié)晶墊。
將來(lái)自牛紅細(xì)胞的泛素(Sigma U-6253)和泛素、His標(biāo)記重組物(Calbiochem662060)溶解于18MΩ水中，用上述HEPES緩沖液稀釋至20fmol/μL。在上述方法下，將100fmol泛素和His-標(biāo)記的重組變體加載到芯片上。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)泛素的結(jié)合(m/z～8500)，可見(jiàn)His標(biāo)記重組泛素的強(qiáng)烈信號(hào)(m/z～9500，圖26)。
其它遞呈裝置構(gòu)造的實(shí)施例如上所述，本文公開(kāi)的發(fā)明可應(yīng)用于在表面上四處移動(dòng)液體的各種圖案、形狀或構(gòu)造。此外，可構(gòu)造一個(gè)或多個(gè)表面，用于捕獲分析物和/或不需要的物質(zhì)。
之前討論的一個(gè)變型是有助于液體向中心區(qū)移動(dòng)的同心排列，結(jié)果是，濃縮了攜帶分析物的液體。在如圖1a所示的一種設(shè)計(jì)中，樣品遞呈裝置包括被邊界區(qū)限定邊界的兩個(gè)同心圓。
樣品遞呈裝置也可構(gòu)建有三個(gè)或多個(gè)同心圓，用于使液體向中心區(qū)移動(dòng)，以進(jìn)行分析或加工。例如，樣品遞呈裝置可包括三個(gè)同心圓，如圖27a所示。各區(qū)域具有潤(rùn)濕性值，相鄰區(qū)域的潤(rùn)濕性不同?？蓸?gòu)建同心環(huán)，使中心圓102的表面的接觸角(CA1)小于內(nèi)部同心環(huán)104的表面的接觸角(CA2)，CA2小于靠外的同心環(huán)106的接觸角(CA3)，CA3小于邊界區(qū)108的接觸角(CA4)(即CA1＜CA2＜CA3＜CA4)。
此外，可修飾表面區(qū)域102、104、106中的一個(gè)或多個(gè)，以用作結(jié)合區(qū)。可構(gòu)建各種結(jié)合區(qū)，用于捕獲所需分析物、不想要的物質(zhì)或其組合。例如，可構(gòu)建第一區(qū)以捕獲分析物A，可構(gòu)建第二區(qū)以捕獲分析物B，而可構(gòu)建第三區(qū)作為分析區(qū)。在另一實(shí)施例中，構(gòu)建第一區(qū)以捕獲不想要的物質(zhì)C，構(gòu)建第二區(qū)以捕獲不想要的物質(zhì)D，而構(gòu)建第三區(qū)作為分析區(qū)。在又一實(shí)施例中，構(gòu)建第一區(qū)以捕獲分析物，構(gòu)建第二區(qū)以捕獲不想要的物質(zhì)，而構(gòu)建第三區(qū)作為分析區(qū)。對(duì)于某些應(yīng)用，可能需要構(gòu)建具有基本不結(jié)合的表面的分析區(qū)。然而，在其它應(yīng)用中，可構(gòu)建具有結(jié)合表面的分析區(qū)。
在一個(gè)示范性應(yīng)用中，構(gòu)建具有能捕獲第一種抗原的第一抗體表面的第一區(qū)，構(gòu)建能捕獲第二種抗原的第二抗體表面的第二區(qū)。將含有第一種和第二種抗原的樣品液體加到樣品遞呈裝置上。孵育一段時(shí)間以使抗原結(jié)合于各自的抗體表面后，洗滌樣品遞呈裝置以去除任何殘留的樣品液體。然后，從第一抗體表面釋放第一種抗原，使其濃縮在分析區(qū)上。然后可對(duì)第一種抗原進(jìn)行進(jìn)一步加工和/或測(cè)定。分析了第一種抗原后，操作人員可洗掉第一種抗原并繼續(xù)加工第二種抗原。從第二抗體表面釋放第二種抗原，使其濃縮在分析區(qū)上。然后可對(duì)第二種抗原進(jìn)行化學(xué)加工和/或測(cè)定。
本文公開(kāi)的樣品遞呈裝置不限于上述同心表面區(qū)域。提供同心設(shè)計(jì)的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明的各種功能。也考慮到可構(gòu)建具有各種非圓形圖案/形狀的樣品遞呈裝置。
圖27b中顯示了一種變型，其中將″液滴區(qū)″112加到類似于圖1a所示的同心圓設(shè)計(jì)114中。在此結(jié)構(gòu)中，提供液滴區(qū)112是為了接收遞送到樣品遞呈裝置116上的液體。液滴區(qū)112的接觸角優(yōu)選小于邊界區(qū)118的接觸角并大于液體保留區(qū)120的接觸角。遞送給液滴區(qū)112的液滴可向液體保留區(qū)120流動(dòng)，最終在分析區(qū)122上濃縮。也可修飾液體保留區(qū)以用作捕獲區(qū)。在另一變型中，構(gòu)建液滴區(qū)以將樣品液體提供給多個(gè)液體保留區(qū)及其對(duì)應(yīng)的分析區(qū)。
在另一變型中，構(gòu)建具有兩個(gè)或多個(gè)液滴區(qū)134、136、138、140的樣品遞呈裝置132，以在不同位置接收多個(gè)液滴，在它們釋放到樣品遞呈裝置132的表面上后，引導(dǎo)這些液滴流向分析區(qū)。說(shuō)明四個(gè)液滴區(qū)結(jié)構(gòu)的實(shí)施例見(jiàn)圖27c。遞送到樣品遞呈裝置上的各種液滴可具有相同的化學(xué)組成或不同組成。而且，通過(guò)構(gòu)建，樣品遞呈裝置上的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域可具有結(jié)合表面。例如，可修飾液體保留區(qū)141以捕獲所需分析物。
圖27c顯示的裝置尤其可用于將多種液體引入一個(gè)區(qū)域。例如，通過(guò)將反應(yīng)物或催化劑依次加入液滴區(qū)，該裝置可用于進(jìn)行一系列化學(xué)反應(yīng)。在高通量應(yīng)用中，可通過(guò)用同一移液器將反應(yīng)物遞送到各分析區(qū)的專用液滴區(qū)上引入各反應(yīng)物。例如，樣品遞呈芯片可具有96個(gè)分析區(qū)，液體保留區(qū)圍繞著各分析區(qū)，各液體保留區(qū)可連接于各分析區(qū)專用的四個(gè)專用液滴區(qū)?？赏ㄟ^(guò)將96種先導(dǎo)化合物各自放在樣品遞呈裝置上自己的分析區(qū)中，在此芯片上同時(shí)測(cè)定96種不同的先導(dǎo)化合物?？赏瑫r(shí)引入四種不同反應(yīng)物中的一種或多種。由于可通過(guò)各分析區(qū)的專用液滴區(qū)將四種反應(yīng)物分別加到96個(gè)分析區(qū)上，可避免通過(guò)遞送移液器產(chǎn)生的交叉污染。而且，一旦反應(yīng)完成后，可在分析中直接進(jìn)行最終產(chǎn)物的分析(如通過(guò)質(zhì)譜等)。
在又一變型中，構(gòu)建如圖27d所示的樣品遞呈裝置，使其具有液體運(yùn)輸區(qū)，該運(yùn)輸區(qū)的接觸角梯度或轉(zhuǎn)變步驟能在樣品遞呈裝置的表面上將液體從一個(gè)區(qū)域運(yùn)輸?shù)搅硪粎^(qū)域。例如，該表面可包括六個(gè)區(qū)域(即區(qū)域1-6)142、144、146、148、150、152，相應(yīng)的接觸角為CA21、CA22、CA23、CA24、CA25和CA26。可構(gòu)造這些區(qū)域，使CA21＜CA22＜CA23＜CA24＜CA25＜CA26。優(yōu)選構(gòu)建各接觸區(qū)域，使其具有SAM。
在另一實(shí)施例中，構(gòu)建圖27e的樣品遞呈裝置，使其具有液滴區(qū)162、液體運(yùn)輸區(qū)163、液體保留區(qū)164和分析區(qū)166。雖然在此具體實(shí)施例中，液體運(yùn)輸區(qū)僅由潤(rùn)濕性不同的三個(gè)區(qū)域170、172、174組成，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，液體運(yùn)輸區(qū)也可由四種或多種潤(rùn)濕性不同的區(qū)域組成。例如，可構(gòu)建液體運(yùn)輸區(qū)，使其具有從一端到另一端的連續(xù)表面張力梯度，以致在液體運(yùn)輸區(qū)表面上液體接觸角能夠連續(xù)轉(zhuǎn)變。可用這些連續(xù)梯度或多步驟轉(zhuǎn)變梯度為各種目的在平表面上移動(dòng)液體試劑。例如，可將兩種或多種試劑從芯片上兩個(gè)不同位置移動(dòng)到一個(gè)位置，以便發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在另一變型中，可用表面張力梯度分離或過(guò)濾各種化學(xué)物質(zhì)或流體。例如，經(jīng)過(guò)構(gòu)建，一個(gè)或多個(gè)液體運(yùn)輸區(qū)可具有用于捕獲所需分析物和/或不需要的物質(zhì)的結(jié)合表面。在一種變型中，構(gòu)建具有用于捕獲不同抗原的抗體表面的各個(gè)部分的液體運(yùn)輸區(qū)。然后，可用樣品遞呈裝置過(guò)濾沉積在液滴區(qū)162上的樣品液體中不需要的抗原。在另一變型中，使液體運(yùn)輸區(qū)163適應(yīng)一種或多種色譜表面/區(qū)域(如離子交換表面、反相表面等)。
在一種變型中，樣品遞呈裝置包括多個(gè)不同大小的多個(gè)并列區(qū)域，各自具有特定目的(如樣品加載、樣品純化/捕獲、液體保留后濃縮到分析區(qū)和隨后的分析等)。如圖28a所示的一個(gè)實(shí)施例包括加工位點(diǎn)322、324、326、328、330、332的8×12陣列(圖28a中僅顯示了96個(gè)加工位點(diǎn)的一部分)。圖28b顯示了圖28a的樣品遞呈裝置300的單個(gè)加工位點(diǎn)322。樣品加載區(qū)302可以包含或不包含用于加工樣品的功能化學(xué)。將液體樣品從一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一區(qū)域的機(jī)制可以不同。可機(jī)械地移動(dòng)(如通過(guò)移液器操作等)加載到樣品加載區(qū)302中的樣品并放入下一區(qū)域中?？赏ㄟ^(guò)連接區(qū)342、344、346連接上述樣品遞呈裝置中所述的各種區(qū)域302、304、306、308，其潤(rùn)濕性可允許液體從一個(gè)區(qū)域流動(dòng)到另一區(qū)域。在一種變型中，構(gòu)建不同區(qū)域302、304、306、308、310、342、344、346，使其各自具有不同的表面張力，以促進(jìn)液體從一個(gè)區(qū)域流動(dòng)到另一區(qū)域。例如，可構(gòu)建各加工位點(diǎn)332，使其具有表面張力梯度，以促進(jìn)液體從加載區(qū)302流動(dòng)到分析區(qū)310。在另一變型中，連接區(qū)342、344、346各自的潤(rùn)濕性可因化學(xué)或物理刺激(如UV輻射)而改變，以致當(dāng)將加載區(qū)和下一區(qū)域之間的區(qū)域342暴露于UV輻射導(dǎo)致潤(rùn)濕性改變和隨后的液體流動(dòng)時(shí)，將施加于樣品加載區(qū)的樣品轉(zhuǎn)移到下一區(qū)域304(如離子交換區(qū))中。然后可用相似方法將樣品從離子交換區(qū)304轉(zhuǎn)移到反相區(qū)306中，最后轉(zhuǎn)移到液體保留區(qū)308中。此時(shí)，使加工的樣品濃縮到分析區(qū)310中?；蛘撸赏ㄟ^(guò)加入導(dǎo)致“溢出”到下一區(qū)域的溶劑使樣品在區(qū)域之間移動(dòng)?？芍貜?fù)此方法，直到純化的樣品在液體保留區(qū)308中。通過(guò)各種表面(具有不同潤(rùn)濕性和/或分析物結(jié)合特性)及其結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生具有多種純化、濃縮、分離和修飾能力(相對(duì)于一種或多種分析物)的樣品遞呈裝置。
離子交換是分離和純化蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多核苷酸和其它帶電的生物分子中最常用的色譜技術(shù)之一(“在合適的時(shí)間邁出正確的一步”(The right step at the righttime)Bio/Technology，4，954-958(1986)，Bonnerjera，J.，Oh，S.，Hoare，M.，Dunhill，P.)。因此，對(duì)于各種化學(xué)分析和/或合成應(yīng)用，在樣品遞呈裝置上提供具有離子交換能力的功能區(qū)可能是有優(yōu)點(diǎn)的?？稍跇悠愤f呈裝置上實(shí)施離子交換方法，它是在分析區(qū)分析樣品液體之前發(fā)生的唯一活性化學(xué)過(guò)程。在另一變型中，可實(shí)施離子交換，它是在樣品遞呈裝置上發(fā)生的一系列兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)加工步驟中的一個(gè)加工步驟。也可在具有一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)的樣品遞呈裝置上實(shí)施離子交換能力。
在離子交換色譜中分離依賴于帶電的溶質(zhì)分子可逆地吸附于帶相反電荷的固定的離子交換基團(tuán)。這些離子交換基團(tuán)可以是陽(yáng)離子或陰離子基團(tuán)，常常分為′弱′或′強(qiáng)′。因此，可構(gòu)建樣品遞呈裝置上的離子交換區(qū)，使其包括強(qiáng)陽(yáng)離子官能團(tuán)(如磺酸根基團(tuán))，弱陽(yáng)離子基團(tuán)(如羧酸根基團(tuán))，強(qiáng)陰離子基團(tuán)(如季胺)或弱陰離子基團(tuán)(如叔胺)。可通過(guò)組裝含有這些官能團(tuán)的各種SAM控制表面功能?？赏ㄟ^(guò)(例如)采用組裝過(guò)程中所用的1°、2°、3°或4°組成來(lái)控制表面潤(rùn)濕性。
如以上實(shí)施例所示，反相色譜是可用于樣品遞呈裝置上功能區(qū)中的另一種化學(xué)方法?？捎镁哂谐錾幕厥漳芰头直媛实姆聪嗌V分離具有一定程度的疏水特性的分子，如蛋白質(zhì)、肽和核酸。此外，在移動(dòng)相中使用離子配對(duì)修飾劑可以允許對(duì)帶電溶質(zhì)(如完全去保護(hù)的寡核苷酸和親水性肽)進(jìn)行反相色譜。在一種變型中，反相區(qū)會(huì)包含正烷基烴或芳香基，它們可通過(guò)疏水性相互作用而發(fā)生作用?？赏ㄟ^(guò)組裝含有這些官能團(tuán)的各種SAM控制表面功能?？赏ㄟ^(guò)(例如)采用組裝過(guò)程中所用的1°、2°、3°或4°組成來(lái)控制表面潤(rùn)濕性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容會(huì)理解，可在樣品遞呈裝置上應(yīng)用反相區(qū)，它是在分析分析區(qū)中樣品液體之前發(fā)生的唯一活性化學(xué)過(guò)程，或者它是在樣品遞呈裝置上發(fā)生的一系列過(guò)程之一。也可在具有一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)的樣品遞呈裝置上實(shí)施反相能力。
本文用離子交換區(qū)和反相區(qū)作為可能在樣品遞呈裝置上實(shí)施的功能區(qū)/區(qū)域的例子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容會(huì)理解，通過(guò)修飾功能區(qū)內(nèi)SAM表面上的表面化學(xué)，可對(duì)功能區(qū)進(jìn)行各種其它化學(xué)處理。
此外，可根據(jù)生物分子篩選協(xié)會(huì)(SBS)形式制備這些樣品遞呈裝置。因此，例如，可將這些位點(diǎn)放置在8×12陣列中，間隔9mm，產(chǎn)生96個(gè)單獨(dú)位點(diǎn)待用。在圖28a所示實(shí)施例中，在相對(duì)于分析區(qū)的正交位置呈45°角上產(chǎn)生這些位點(diǎn)，以提供間隔。也可產(chǎn)生與384-位點(diǎn)或1536-位點(diǎn)陣列相容的形式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)會(huì)理解，可構(gòu)建樣品遞呈裝置，使其具有樣品加工位點(diǎn)的各種陣列結(jié)構(gòu)。
可用具有一個(gè)或多個(gè)功能區(qū)(如離子交換區(qū)、反相區(qū)、捕獲區(qū)等)的樣品遞呈裝置加工各種生物、生化和/或化學(xué)樣品。例如，可用樣品遞呈裝置加工含有可干擾后續(xù)蛋白質(zhì)/肽分析的各種物質(zhì)的粗生物樣品(如血清、血漿等)。具體說(shuō)，樣品″清潔″最近已成為以去除粗樣品中不想要的、干擾性物質(zhì)為目的的主要研究領(lǐng)域。許多現(xiàn)有方法包括一系列離開(kāi)表面的色譜步驟，各步驟需要控制色譜的裝置和加工粗樣品的柱。具有一個(gè)或多個(gè)功能區(qū)以加工粗材料的樣品遞呈裝置可允許操作人員在表面上進(jìn)行色譜過(guò)程并且不需要額外儀器和工具。
額外遞呈裝置實(shí)施的實(shí)施例在另一變型中，遞呈裝置包括具有捕獲區(qū)和分析區(qū)的表面。也可任選地提供圍繞捕獲區(qū)和分析區(qū)的邊界區(qū)。構(gòu)建捕獲區(qū)，使其可被活化以捕獲抗原。例如，可通過(guò)將化學(xué)物質(zhì)或生化物質(zhì)(如核苷酸、肽、蛋白質(zhì)等)共價(jià)結(jié)合到表面上活化捕獲區(qū)。然后，可通過(guò)與樣品溶液(如生物液體等)中分析物的非共價(jià)相互作用用活化表面捕獲分析物。一旦所需分析物結(jié)合于捕獲區(qū)后，可去除遞呈裝置表面上樣品液體中的殘余物質(zhì)(如洗滌樣品遞呈裝置表面)。
一旦去除了殘余物質(zhì)后，可從捕獲區(qū)中釋放所需分析物，然后轉(zhuǎn)移到分析區(qū)中用于測(cè)定。在一種方法中，可通過(guò)化學(xué)方法(如引入化學(xué)試劑等)或物理方法(如UV輻射等)破壞分析物與活化表面的非共價(jià)鍵連接，因此，強(qiáng)迫活化表面釋放分析物。然后，引導(dǎo)釋放的分析物移動(dòng)到分析區(qū)中。例如，可由捕獲區(qū)和分析區(qū)的表面張力差異使釋放的分析物移動(dòng)到分析區(qū)中。在一個(gè)設(shè)計(jì)變型中，捕獲區(qū)的表面積大于分析區(qū)，以致分析物濃縮在分析區(qū)上。一旦分析物位于分析區(qū)中后，可實(shí)施各種化學(xué)分析技術(shù)以檢測(cè)/測(cè)定該分析物。在一種變型中，分析區(qū)包括基本不結(jié)合的表面。在另一變型中，分析區(qū)包括用于捕獲分析物用于分析的結(jié)合表面。在另一設(shè)計(jì)變型中，可在捕獲區(qū)捕獲分析物之后和捕獲區(qū)釋放分析物之前活化分析區(qū)的結(jié)合特征。
在另一變型中，通過(guò)切割捕獲區(qū)所含基團(tuán)內(nèi)的共價(jià)鍵使捕獲區(qū)釋放分析物。然后，可將連接于表面官能團(tuán)的切割端的釋放的分析物運(yùn)輸?shù)椒治鰠^(qū)中用于分析或進(jìn)一步加工。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容會(huì)理解，捕獲區(qū)的活化和捕獲區(qū)捕獲分析物不限于上述共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合。樣品遞呈裝置的變型可單獨(dú)或與共價(jià)/非共價(jià)結(jié)合相組合地利用離子和其它化學(xué)結(jié)合特征，以活化捕獲區(qū)和在捕獲區(qū)內(nèi)捕獲抗原。
在另一應(yīng)用中，將樣品遞呈裝置作為可定制裝置遞送和/或出售給第三方。構(gòu)建該可定制裝置，使其具有可修飾的捕獲區(qū)，以便第三方可選擇性修飾捕獲區(qū)以捕獲特定分析物用于分析。在一種變型中，使樣品遞呈裝置上的捕獲區(qū)適應(yīng)能夠共價(jià)結(jié)合抗體的表面。例如，可使捕獲區(qū)適應(yīng)包括NHS酯基的SAM表面。第三人可以是修飾樣品遞呈裝置、然后利用定制的樣品遞呈裝置分析和/或加工具體的感興趣分析物的最終用戶。在另一應(yīng)用中，第三方可為捕獲特定類型的分析物定制該樣品遞呈裝置，然后將此定制的樣品遞呈裝置提供或出售給其他方，其他方可能是最終用戶。在另一實(shí)施例中，可使捕獲區(qū)適應(yīng)包括NTA配體的SAM表面。然后，第三方可利用預(yù)先制造的NTA樣品遞呈裝置產(chǎn)生具有用于捕獲不同生化物質(zhì)的不同金屬離子的樣品遞呈裝置。
在又一變型中，在試劑盒中向用戶提供了可定制的樣品遞呈裝置，以及其它化學(xué)物質(zhì)/溶液，以允許用戶用特定的化學(xué)/生物物質(zhì)來(lái)活化捕獲區(qū)以捕獲所需抗原。在一種變型中，該試劑盒包括具有可經(jīng)活化以錨定抗體的捕獲區(qū)的樣品遞呈裝置，和可用于活化和錨定抗體的化學(xué)溶液。例如，該試劑盒可包括(1)芯片；(2)試劑；(3)緩沖液；(4)校準(zhǔn)物和(5)工具。在另一變型中，該試劑盒包括具有可被活化以捕獲磷酸肽的捕獲區(qū)的樣品遞呈裝置。例如，該試劑盒可包括(1)芯片；(2)試劑；(3)緩沖液；(4)校準(zhǔn)物和(5)工具。試劑盒中也可提供如何通過(guò)將合適的化學(xué)/生化物質(zhì)(如核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、單克隆抗體、鐵離子等)偶聯(lián)、加載和/或錨定到捕獲區(qū)上從而活化捕獲區(qū)的說(shuō)明書(shū)。在另一變型中，試劑盒中也可提供可偶聯(lián)、加載、錨定和/或連接于捕獲區(qū)的一種或多種活化試劑。例如，試劑盒中可提供三種類型的單克隆抗體，因此用戶可定制芯片以捕獲相應(yīng)抗原之一。
利用各種檢測(cè)/測(cè)定機(jī)制的示范性應(yīng)用如前所述，可利用樣品遞呈裝置與各種檢測(cè)或測(cè)定設(shè)備一起檢測(cè)和測(cè)定各種化學(xué)、生化和/或生物樣品。也可利用樣品遞呈裝置過(guò)濾和/或濃縮化學(xué)、生化和/或生物顆粒，用于進(jìn)一步加工和/或進(jìn)行其它化學(xué)反應(yīng)。
在一個(gè)變型中，將樣品遞呈裝置402與根據(jù)檢測(cè)反射光子進(jìn)行測(cè)定(如光譜學(xué)、熒光檢測(cè)等)的系統(tǒng)一起使用?？蓸?gòu)建該系統(tǒng)，使其具有光電發(fā)射器404(如UV、可見(jiàn)光或IR光源等)和光檢測(cè)器408(如光學(xué)傳感器等)，如圖29所示。
在另一變型中，將遞呈裝置與電離樣品遞呈裝置402上的分析物并將電離顆粒導(dǎo)向檢測(cè)器416的系統(tǒng)一起使用。例如，該系統(tǒng)可以是質(zhì)譜儀，如圖30所示?？衫梅瓷溏R412引導(dǎo)的激光410激發(fā)樣品遞呈裝置402表面上的分析物，通過(guò)加速電極414加速電離顆粒，使其飛向檢測(cè)器416。
在又一變型中，可構(gòu)建樣品遞呈裝置，以使光子可通過(guò)樣品遞呈裝置本身。例如，樣品遞呈裝置的基片402可包括一基于玻璃的層，該玻璃層上噴鍍有薄金層，金上沉積了SAM層。該薄金層可允許光子透過(guò)。在一個(gè)具體應(yīng)用中，樣品遞呈裝置402與光發(fā)射器418(如IR光源等)一起使用，該光發(fā)射器能使光透射通過(guò)遞呈裝置402的分析區(qū)420。光檢測(cè)器422(如IR光檢測(cè)器等)位于遞呈裝置402的另一面上，以測(cè)定通過(guò)遞呈裝置402的光量和分析區(qū)420中分析物的位置(如測(cè)定IR吸收譜)，如圖31所示。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容會(huì)理解，其它檢測(cè)和/或測(cè)定設(shè)備也可與本文所述樣品遞呈裝置一起使用。
描述了本發(fā)明，并描繪了本發(fā)明的具體實(shí)施例。雖然根據(jù)具體變型和說(shuō)明性附圖描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白，本發(fā)明不限于所述變型或附圖。具體說(shuō)，上述實(shí)施例并不限制分析區(qū)、液體保留區(qū)和邊界區(qū)的物理安排。此外，當(dāng)上述方法和步驟說(shuō)明某些事件以某種順序發(fā)生時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明白，可改變某些步驟的順序，這些改變是根據(jù)本發(fā)明變型進(jìn)行的。此外，可能時(shí)可在平行方法中同時(shí)進(jìn)行某些步驟，也可如上所述連續(xù)進(jìn)行某些步驟。因此，對(duì)于本發(fā)明的變型，它們?cè)诒竟_(kāi)的構(gòu)思范圍內(nèi)或等價(jià)于權(quán)利要求書(shū)中所述的本發(fā)明，本專利也應(yīng)覆蓋這些變型。最后，將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)以全文納入本文作為參考，就像各出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特別和單獨(dú)引入本文那樣。
權(quán)利要求
1.一種樣品遞呈裝置，其包括具有表面的基片，其中所述表面包括經(jīng)構(gòu)建以捕獲分析物的第一區(qū)和經(jīng)構(gòu)建用于分析所述分析物的第二區(qū)，構(gòu)建所述第一區(qū)和所述第二區(qū)，使其具有不同潤(rùn)濕性，以促進(jìn)液體從所述第一區(qū)流向所述第二區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述表面還包括第三區(qū)，構(gòu)建所述第三區(qū)，使其含有所述第一區(qū)中的液體。
3.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其包括多個(gè)所述第一區(qū)和多個(gè)所述第二區(qū)，其中多個(gè)所述第一區(qū)在所述表面上分布成陣列，所述第一區(qū)各自連接于多個(gè)所述第二區(qū)中對(duì)應(yīng)的區(qū)域，所述表面還包括適合分隔開(kāi)所述多個(gè)第一區(qū)的第三區(qū)。
4.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述基片包括自身組裝單層。
5.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，構(gòu)建所述第一區(qū)以進(jìn)行色譜。
7.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括固定的Fe(III)。
8.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括固定的Ni(II)。
9.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括固定的金屬親和色譜表面。
10.如權(quán)利要求1所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)適合捕獲蛋白質(zhì)、肽或核苷酸。
11.如權(quán)利要求4所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第二區(qū)基本不結(jié)合。
12.如權(quán)利要求11所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括用于捕獲分析物的抗體。
13.如權(quán)利要求11所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，構(gòu)建所述第一區(qū)以進(jìn)行色譜。
14.一種分析分析物的方法，所述方法包括將所述分析物遞呈到如權(quán)利要求9所述的樣品遞呈裝置上；和檢測(cè)所述分析物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)過(guò)程包括對(duì)所述分析物進(jìn)行激光解吸電離質(zhì)譜。
16.一種分析分析物的方法，所述方法包括將所述分析物遞呈到如權(quán)利要求11所述的樣品遞呈裝置上；和測(cè)定所述分析物的化學(xué)特征。
17.一種樣品遞呈裝置，其包括具有用于遞呈用于分析的分析物的表面的基片；捕獲所述分析物的部件；和集中所述分析物以進(jìn)行分析的部件。
18.如權(quán)利要求17所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述基片包括自身組裝單層。
19.如權(quán)利要求17所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述表面包括潤(rùn)濕性不同的多個(gè)區(qū)域。
20.如權(quán)利要求19所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述多個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)包括用于捕獲所述分析物的抗體。
21.如權(quán)利要求19所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述多個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)包括固定的金屬親和色譜表面。
22.如權(quán)利要求18所述的樣品遞呈裝置，其特征在于，所述表面適合將所述分析物集中到所述表面的基本不結(jié)合區(qū)域上。
23.一種經(jīng)構(gòu)建以檢測(cè)樣品中分析物的可定制樣品遞呈裝置，其包括具有表面的基片，其中所述表面包括第一區(qū)和第二區(qū)，第一區(qū)適合由用戶修飾以捕獲分析物，第二區(qū)經(jīng)構(gòu)建用于接受所述捕獲的分析物并遞呈所述捕獲的分析物以進(jìn)行分析。
24.如權(quán)利要求23所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，構(gòu)建所述第一區(qū)和所述第二區(qū)，使其具有不同潤(rùn)濕性，以促進(jìn)液體從第一區(qū)流向第二區(qū)。
25.如權(quán)利要求24所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第二區(qū)基本不結(jié)合。
26.如權(quán)利要求25所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述基片包括自身組裝單層。
27.如權(quán)利要求26所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)適合接受抗體。
28.如權(quán)利要求23所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括NHS酯基。
29.如權(quán)利要求23所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)適合螯合金屬離子。
30.如權(quán)利要求23所述的可定制樣品遞呈裝置，其特征在于，所述第一區(qū)包括NTA配體。
31.一種遞呈分析物的方法，所述方法包括將樣品液體加在表面上，其中所述樣品液體包含分析物和物質(zhì)(specie)；在所述表面的第一區(qū)上捕獲所述分析物；去除所述表面上的所述物質(zhì)；釋放所述分析物；和將所述分析物集中到所述表面的第二區(qū)上。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，還包括檢測(cè)所述分析物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，檢測(cè)所述分析物包括以下方法之一質(zhì)譜、表面等離振子共振、熒光、原子力顯微術(shù)、光譜法、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、X射線光電子光譜法、橢圓光度法、電化學(xué)檢測(cè)、磷光、紫外光譜、可見(jiàn)光譜和紅外光譜。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述捕獲過(guò)程還包括用抗體捕獲所述分析物。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述捕獲過(guò)程還包括用色譜表面捕獲所述分析物。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述集中過(guò)程還包括通過(guò)所述表面上表面張力的變化性集中所述分析物，其中所述表面包括自身組裝單層。
37.一種純化樣品液體的方法，所述方法包括將樣品液體加在表面上，所述樣品液體包含分析物；在所述表面的第一區(qū)中對(duì)所述樣品液體進(jìn)行色譜；將所述樣品液體轉(zhuǎn)移到所述表面的第二區(qū)上；和檢測(cè)所述表面的所述第二區(qū)中的所述分析物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，進(jìn)行色譜過(guò)程包括進(jìn)行離子交換色譜。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，進(jìn)行色譜過(guò)程包括進(jìn)行反相色譜。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述表面包括自身組裝單層。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于進(jìn)行分析測(cè)定的樣品遞呈裝置。這些裝置的結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)行各種液體處理，如保留、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、濃縮、定位和轉(zhuǎn)移。此外，這些裝置可增強(qiáng)對(duì)分析物的檢測(cè)和鑒定。本發(fā)明樣品遞呈裝置由具有潤(rùn)濕性不同的多個(gè)區(qū)域的一種或多種基材組成。本發(fā)明公開(kāi)了用本發(fā)明樣品遞呈裝置分析樣品的方法，以及制造樣品遞呈裝置的方法。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101014852SQ200580016450
公開(kāi)日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者C·M·貝利斯勒, J·A·沃克二世, S·M·尼古拉, D·P·德萊納, M·J·萊維, X·趙, I·Y·陳, M·L·斯托威茨, D·P·帕奎恩 申請(qǐng)人:恰根科學(xué)股份有限公司