專利名稱：減小樣品中分析物品種的濃度范圍的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)的目的在于完成生物體全套蛋白質(zhì)組的同一性圖譜，并通過分析該信息從而鑒定可能的診斷性和治療性實體。目前用于分離蛋白質(zhì)混合物的方法包括兩維凝膠電泳和多維液相色譜法。所有這些方法均可以與質(zhì)譜法結(jié)合。該途徑的一個實例是酵母中1,484種蛋白質(zhì)的分離和鑒定(Washburn et al.，Nat.Biotechnol.19(3)242-2471(2001))。分離和鑒定蛋白質(zhì)的方法學(xué)另一實例是由Uetz等(Uetz etal.，Nature 403(6770)623-627(2000))和Ito等(Ito et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(8)4569-4574(2001))發(fā)展的酵母雙雜交篩選法的改良方法，該方法已在釀酒酵母中鑒定了超過4,000種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)分離和鑒定的定量方法是由Aebersold及其同事(Smolka et al.，Anal.Biochem.297(1)25-312(2001))發(fā)展的同位素編碼親和標(biāo)記(isotope coded affinity tag(ICAT))。ICAT包括采用普通或重同位素性試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行位點特異性的、共價的標(biāo)記從而定量蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。
復(fù)合蛋白質(zhì)混合物還可以在組合產(chǎn)生的配體文庫上分離。實體分子與組合文庫接觸后，該實體分子可與文庫中的配體結(jié)合。當(dāng)采用純化的、放射性標(biāo)記的初始實體時，可以實施對結(jié)合的實體的檢測(Mondorf et al.，J.Peptide Research 52526-536(1998))。其它方法包括通過針對實體的抗體進(jìn)行的檢測(Buettner et al.，InternationalJournal of peptide & Protein Research 4770-83(1996)；Furka et al.，International Journal Peptide Protein Research 37(6)487-493(1991)；和Lam et al.，(1991)如上)。采用固定在粘著物上的珠聯(lián)合使用刪減篩選法可以檢測多種實體的配體。這被稱為QuASAR法(國際(PCT)專利申請WO 01/40265)，其已被用于檢測結(jié)合病毒和朊病毒蛋白質(zhì)的配體。
FIoNA檢測技術(shù)(Hammond等國際(PCT)專利申請WO04/007757)和其他組合技術(shù)能夠鑒定配體實體相互作用。FIoNA檢測技術(shù)基于化學(xué)、物理、生物學(xué)，和/或生物化學(xué)功能從混合物中鑒定蛋白質(zhì)，而不僅僅是基于其與文庫中配體的結(jié)合能力。因此，F(xiàn)ioNA的目的在于采用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，鑒定結(jié)合所需物質(zhì)的配體-載體，然后在適宜的珠上解碼配體，以及合成適宜量的珠以便純化一種，或若干具有所需活性的蛋白質(zhì)。
各分析物之間濃度的巨大差異會妨礙對復(fù)合生物提取物中分析物的完全分析。在大多數(shù)生物混合物中，某些分析物的濃度很高，而其它分析物則僅為痕量水平。結(jié)果，分析物的濃度可能并不適應(yīng)給定分析方法的動態(tài)范圍。也就是說，由樣品中最大豐度和最小豐度分析物品種所產(chǎn)生的信號強度差異一般比分析方法檢測和精確測定的能力寬。例如，高度濃縮的蛋白質(zhì)可能會飽和檢測系統(tǒng)，而非常低的濃度可能會低于分析方法的靈敏度，人血清即是如此，人血清中最大豐度蛋白質(zhì)(白蛋白-數(shù)十mg/ml)與最小豐度(例如，IL-6-小于1pg/ml)之間的濃度差異可能會高達(dá)幾億倍。
目前存在兩種方式解決這一巨大差異第一種是設(shè)計適應(yīng)性更好的裝置而第二種是改變用于分析的樣品。
改變樣品的一種方法是減少樣品的較高豐度的品種，由此使得較低豐度的品種更易于檢測。例如，該方法包括使用接頭部分(linkermoieties)，諸如針對樣品中特定品種的抗體和特異性染料。例如，對于血漿而言，豐度高的蛋白質(zhì)包括白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原和α-1蛋白酶抑制劑。免疫親和柱非常昂貴，很少完全特異性地針對其靶物質(zhì)，而且會除去與靶蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)。而且，最大豐度的蛋白質(zhì)一旦被除去，另一組即成為最大豐度，其隨即需要建立另外的親和柱。此外，來自相同物種的不同組織和不同物種的組織的生物樣品可能具有的完全不同的最大豐度蛋白質(zhì)組。該方法還受到如下事實的影響，即除去某些分析物品種同樣會除去與它們發(fā)生相互作用的品種。因此，會除去某些可能的興趣品種。雖然除去高豐度的蛋白質(zhì)在某些情況下會有幫助，但該方法并不能檢測那些濃度始終低于檢測設(shè)備靈敏度的非常低豐度的蛋白質(zhì)。而且，若干種蛋白質(zhì)(在某些情況下甚至是數(shù)十種)表現(xiàn)為高豐度品種，因此不得不對大量特異性方法進(jìn)行設(shè)計以便尋找每一種不同的高豐度品種。因此，該方法基本上不能壓縮剩余分析物品種之間的濃度范圍。
另一方法是對樣品進(jìn)行分級分離(通常通過色譜法)。該方法根據(jù)相似的生物化學(xué)特性將分析物種類區(qū)分為不同的級分。例如，離子交換色譜法能夠根據(jù)電荷從而將蛋白質(zhì)區(qū)分為級分，而分子排阻色譜法根據(jù)分子大小來區(qū)分蛋白質(zhì)。因此，這些方法可以減小分析物的濃度范圍，但其代價是在每次區(qū)分中實質(zhì)上降低了分析物品種的群體多樣性。
發(fā)明概述[10]本發(fā)明提供了一種壓縮復(fù)合樣品中不同分析物品種間的濃度范圍同時基本上保持樣品中分析物品種的群體多樣性的方法。更具體地，相對于低豐度品種的濃度而言，所述方法基于物理-化學(xué)特性降低了高豐度品種的濃度，但基本上不會消除樣品分析物品種。
如上述，各種分析技術(shù)均具有檢測動態(tài)范圍。當(dāng)樣品中分析物的量高于動態(tài)范圍時，其信號將飽和檢測系統(tǒng)，故無法準(zhǔn)確測定其量。當(dāng)樣品中分析物的量低于檢測系統(tǒng)的靈敏度范圍時，該分析物也無法得以檢測，而且，即使低豐度分析物處于檢測動態(tài)范圍內(nèi)，來自高豐度分析物的信號也會干擾檢測低豐度分析物的能力。本發(fā)明的方法壓縮了樣品中分析物品種之間的濃度范圍。這可以為檢測器系統(tǒng)提供數(shù)量增加的分析物分子以便高于檢測的靈敏度閾值，而同時降低了進(jìn)行檢測的高豐度分析物的量因此由高豐度分析物導(dǎo)致的檢測系統(tǒng)的飽和度顯著降低，因此降低了對檢測高于靈敏度閾值的低豐度品種的能力的干擾。其結(jié)果是具有了檢測樣品中更多分析物品種的能力。采用該方法，可以檢測的品種數(shù)量至少是通過質(zhì)譜法從血清中檢測的品種數(shù)量的1.5倍。通常，該數(shù)量介于可檢測的品種數(shù)量的2-4倍。
本發(fā)明的方法與檢測樣品的其它處理方法相反。例如，除去經(jīng)選擇的高豐度品種并不能顯著降低樣品中大量品種的濃度范圍。分級分離降低了分析物的濃度范圍，但其代價在于實質(zhì)上降低了分級物種群中的品種多樣性。
本發(fā)明通過將復(fù)合樣品與經(jīng)選擇量的文庫相接觸而實現(xiàn)該結(jié)果，所述文庫中包含多種不同的結(jié)合部分?？蓪λ凶兞?文庫組分的多樣性和所用文庫的量)進(jìn)行操作以便有益于本發(fā)明。通過操作樣品所接觸的不同結(jié)合部分的多樣性，有可能結(jié)合遍及所有濃度范圍的品種，亦即，無論是高豐度的品種還是稀少的品種。而且，使用的不同結(jié)合部分的量越大，樣品群體中能夠俘獲的品種量就越大。
文庫的量同樣必須進(jìn)行選擇以便使得結(jié)合部分被至少樣品中的高豐度品種飽和。通過這種方式，樣品中所俘獲的高豐度品種和稀少品種的相對量將非常接近于原始樣品中它們的相對濃度。這導(dǎo)致濃度范圍的壓縮，使得在檢測期間由高豐度品種和稀少品種所產(chǎn)生的處于經(jīng)選擇檢測系統(tǒng)的動態(tài)范圍之內(nèi)的信號量增大。
本發(fā)明的目的在于顯著增加樣品中可檢測的品種的量，亦即尤其是，發(fā)現(xiàn)樣品中的新品種。優(yōu)選特定種類的結(jié)合部分的文庫來實現(xiàn)該目的。尤其，最好通過使用大量不同結(jié)合部分的文庫來實現(xiàn)該目的，所述結(jié)合部分預(yù)先未對其結(jié)合樣品中特定分析物的能力進(jìn)行選擇。在本文中將所述文庫稱為“非選擇性”文庫。(在使用文庫后會明確地顯示出所述文庫中某些結(jié)合部分的結(jié)合特異性這一事實并不會導(dǎo)致相同文庫具有“選擇性”)使用所述文庫增加了無差別地俘獲完整種群的品種的可能性。例如，因此，抗體文庫(其中各抗體針對已知結(jié)合位點)僅能選擇各抗體所針對的品種，相反地，相同規(guī)模的生殖系抗體文庫并不包含與預(yù)先選擇的分析物相結(jié)合的抗體。所述文庫更有可能選擇出樣品中存在的未知品種。通過實施組合化學(xué)或通過隨機組裝化學(xué)部分可以創(chuàng)建非選擇性文庫。此外，通過增加文庫(選擇性或非選擇性)的規(guī)模，可以增加樣品中所俘獲的和所檢測的不同分析物品種的數(shù)量。結(jié)合部分的非選擇性文庫的實例包括生殖系抗體文庫、重組結(jié)合蛋白質(zhì)的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結(jié)合特異性為非預(yù)先選擇的、多種類型的組合文庫及其部分。
還應(yīng)當(dāng)注意到，濃度壓縮的量依賴于結(jié)合部分和樣品中分析物的相對量。一種極端情況是，結(jié)合部分相對分析物的相對量可能非常大以至于結(jié)合部分能夠俘獲樣品中所有分析物。在這種情況下，分析物濃度范圍不會出現(xiàn)壓縮。其它極端情況是，結(jié)合部分相對分析物的相對量可能非常小，以至于每一種分析物品種均能飽和結(jié)合部分的結(jié)合能力。在這種情況下，理論上，所俘獲的各個分析物品種的量是相同的，分析物濃度范圍被壓縮至相等。該極端情況在目的是盡可能多地檢測品種時尤為有用。在這兩種極端情況之間是如下情況，該情況中高豐度品種飽和了結(jié)合部分，而低豐度品種不能飽和結(jié)合部分。在這種情況下，高豐度分析物濃度范圍之間的差異非常小，而低豐度分析物的濃度差異則得以保留。該結(jié)果在用于比較兩種不同樣品種類之間分析物品種的相對濃度時尤為有用。例如，在探索生物標(biāo)記時，對取自具有兩種不同表型狀態(tài)(例如癌對比非癌)的生物體的樣品進(jìn)行比較以便鑒定兩種狀態(tài)之間存在不同的分析物品種。通過保留稀少品種之間的濃度差異，本發(fā)明的方法能夠用于發(fā)現(xiàn)這些稀少品種中的生物標(biāo)記。在一個實施方式中，結(jié)合部分與樣品中分析物品種的比值最大為1∶500，更優(yōu)選地，最大為1∶50或最大為1∶5。
本發(fā)明提供了一種縮小復(fù)合樣品中不同分析物品種之間的濃度范圍同時基本上保持樣品中分析物品種的群體多樣性的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，提供了一種方法，其包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中；(b)將所述第一樣品與包含至少100種不同的結(jié)合部分的一定量文庫接觸；(c)以不同的結(jié)合部分從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物品種以及除去未結(jié)合的分析物品種；和(d)從所述結(jié)合部分上分離所述俘獲的分析物品種從而產(chǎn)生第二樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第二濃度范圍存在于所述第二樣品中。其中所述文庫的量經(jīng)過選擇以便俘獲一定量的不同的分析物品種從而所述第二濃度范圍低于所述第一濃度范圍。
所述第一樣品包含至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的分析物品種。在某些實施方式中，所述文庫包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的結(jié)合部分。
優(yōu)選地，所述結(jié)合部分包括生物有機聚合物。優(yōu)選地，所述生物有機聚合物選自肽、寡核苷酸和寡糖。在本發(fā)明的其它實施方式中，所述結(jié)合部分選自抗體和核酸適體(aptamer)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述結(jié)合部分與固體載體或多個固體載體(a solid support or supports)結(jié)合。優(yōu)選地，所述固體載體或多個固體載體是珠或顆粒的集合。各個珠或顆?？蛇B結(jié)于基本上不同的結(jié)合部分。而且，多個不同的結(jié)合部分可連結(jié)于相同的珠或顆粒。優(yōu)選地，所述珠或顆粒的直徑小于1μm?？刹捎眠x自粉碎、磨碎和聲波破碎的方法將所述珠或顆粒制成磨碎的微?；椤Ｔ谠摲椒ǖ膬?yōu)選實施方式中，所述顆粒與第二固體載體連結(jié)從而形成陣列或試紙條(dipstick)。優(yōu)選的微粒化珠是由天然或合成聚合物形成的聚合物基質(zhì)。
在本發(fā)明其它優(yōu)選實施方式中，所述固體載體或多個固體載體選自纖維、整體柱(monolith)、膜和塑料條帶。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，與第一樣品接觸的所述文庫是非選擇性文庫。可以采用多種非選擇性文庫實施本發(fā)明的方法。優(yōu)選的非選擇性文庫可選自生殖系抗體文庫、重組結(jié)合蛋白質(zhì)的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結(jié)合特異性為非預(yù)先選擇的、組合文庫及其部分。
優(yōu)選地，所述不同的結(jié)合部分包含在完全或不完全的組合文庫中。優(yōu)選的組合文庫是六肽文庫。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述第二樣品所具有的分析物品種多樣性基本上與所述第一樣品的相同。
可以采用多種樣品實施本發(fā)明的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述樣品選自羊水、血、腦脊液、關(guān)節(jié)內(nèi)液、眼內(nèi)液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿液、條件培養(yǎng)液、發(fā)酵液、組織勻漿液及其衍生物。
在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括檢測所述第二個樣品中分析物品種的步驟。優(yōu)選地，通過采用選自比色、光度、磁共振、橢偏光、質(zhì)譜、電泳、色譜、酶性和序列分析的方法對所述分析物進(jìn)行檢測。
任選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括基于物理或化學(xué)特性分級分離所述第二樣品中所述分析物的步驟或鑒定至少一種所分離的分析物的步驟。優(yōu)選地，對所述分析物的分級分離包括采用選自色譜法、電泳、毛細(xì)電泳、過濾和沉淀的方法分離所述分析物。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括將生物特異性結(jié)合部分與所述第二樣品接觸以及測定所述生物特異性結(jié)合部分是否從所述第二樣品中俘獲了分析物品種的步驟。
未結(jié)合的分析物的除去可包括采用洗滌緩沖液洗滌所述俘獲的分析物。
可采用不同的分析物實施本發(fā)明的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述分析物選自多肽、核酸、復(fù)合糖、復(fù)合脂質(zhì)、合成無機化合物和合成有機化合物。
本發(fā)明還提供了鑒定診斷性生物標(biāo)記的方法。在優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括以下步驟(a)提供來自具有第一表型的第一組生物體的第一組生物樣品；(b)提供來自具有第二表型的第二組生物體的第二組生物樣品；(c)對各個所述的生物樣品實施如本文(權(quán)利要求1)所述的減小樣品中不同分析物品種的濃度范圍的方法，由此分別產(chǎn)生第三和第四組生物樣品；(d)在所述第三和第四組生物樣品的各個樣品中檢測分析物品種；和(e)鑒定在所述第三和第四組樣品中存在不同的至少一種分析物品種，由此所述最少一種分析物品種為用于區(qū)分所述第一表型和第二表型的生物標(biāo)記。在優(yōu)選的實施方式中，該方法的步驟(e)包括鑒定生物標(biāo)記圖譜以便提供較所述圖譜中任一生物標(biāo)記單獨所具有的預(yù)測力更佳的預(yù)測力。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于減小樣品中分析物相對量的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品包含第一的多種不同的分析物，所述分析物具有第一量方差(a first variance in amounts)；(b)將所述第一樣品與多種不同的結(jié)合部分接觸，各結(jié)合部分的存在量均為已確定的；(c)以所述不同的結(jié)合部分從所述第一樣品中俘獲一部分所述第一的不同的分析物以及除去未俘獲的分析物；和(d)從所述結(jié)合部分上分離所述俘獲的分析物從而產(chǎn)生第二樣品，該樣品中包含第二的多種不同的分析物，所述分析物具有第二量方差(a second variance in amounts)。多種不同結(jié)合部分的各結(jié)合部分的所述已確定的量經(jīng)過選擇以便俘獲一定量的所述不同的分析物由此所述第二量方差小于所述第一量方差。
本發(fā)明還提供了用于檢測樣品中多種分析物的試劑盒。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，試劑盒包括含有至少100種不同的結(jié)合部分的文庫的容器和使用所述文庫實施本發(fā)明方法的說明書。優(yōu)選地，所述結(jié)合部分與固體載體或多個固體載體連結(jié)。所述文庫可包括六肽組合文庫或其部分，其中所述六肽與顆粒連結(jié)。
任選地，本發(fā)明的試劑盒包括用于以所述結(jié)合部分俘獲分析物的結(jié)合緩沖液或用于從所述結(jié)合部分上洗脫俘獲的分析物的洗脫緩沖液。本發(fā)明的其它試劑盒實施方式包括能夠允許本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本文所述任何方法變型的任選的功能性組分。
本發(fā)明還提供了包含結(jié)合部分的文庫。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，文庫包含至少100種不同的結(jié)合部分，其中多種不同的結(jié)合部分與相同的固體載體或多個固體載體連結(jié)。優(yōu)選地，所述結(jié)合部分包括組合六肽文庫或其部分。
附圖簡介[36]
圖1顯示了展示本發(fā)明的組合配體文庫與血漿孵育結(jié)果的分析。根據(jù)實施例2中所述方法將所述文庫與血漿孵育。
圖2是在與文庫孵育之前除去或不除去IgG的血漿的比較。按照實施例3中所述實施該試驗。
圖3顯示了本發(fā)明的組合配體文庫與血漿孵育的結(jié)果。按照實施例4實施該試驗。
圖4是Protein G柱留存物的PAGE分析。左欄是考馬斯藍(lán)染色；右欄是用Silver Quest染色的相同凝膠。
圖5是對血液級分的圖解說明(基于質(zhì)量)，其中著重顯示了大量低豐度蛋白質(zhì)的痕量特性。
圖6是用均一化珠處理之前和之后的樣品的質(zhì)譜比較。質(zhì)量范圍是2.5kDa-10kDa。根據(jù)實施例1實施該試驗。
圖7是用均一化珠處理之前和之后的樣品比較。質(zhì)量范圍是2kDa-30kDa。根據(jù)實施例1實施該試驗。
圖8是用均一化珠處理之前和之后的樣品比較。質(zhì)量范圍是30kDa-180kDa。根據(jù)實施例1實施該試驗。
圖9是對本發(fā)明均一化珠概念的一個實施方式的圖解說明。
定義[45]除非另有定義，此處所用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的意義。下列參考文件為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的多個術(shù)語的一般定義Singleton etal.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.，1988)；The Glossary of Genetics，5th Ed.，R.Rieger et al.(eds.)，SpringerVerlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionay ofBiology(1991)。如此處所使用的，除非另有定義否則下列術(shù)語具有所描述的意義。
“分析物”是指能夠與本發(fā)明的結(jié)合部分相結(jié)合的任何分子部分，其結(jié)合的方式是不會通過與本文所述洗滌液的接觸而完全被斷裂的方式。“俘獲的分析物”是在接觸洗滌液后由本發(fā)明的結(jié)合部分所結(jié)合的任何分析物。
“吸附劑”是指能夠結(jié)合分析物(例如靶多肽)的任何物質(zhì)。“色譜吸附劑”是指通常用于色譜法中的物質(zhì)。例如，色譜吸附劑包括離子交換物質(zhì)、金屬螯合劑、疏水作用吸附劑、親水作用吸附劑、染料和復(fù)合型吸附劑(例如，疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。“生物特異性吸附劑”是指包含生物分子，例如核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、單糖、多糖、脂肪酸、脂質(zhì)、類固醇或其結(jié)合物(例如糖蛋白、脂蛋白、糖脂)的吸附劑。在特定情況下，生物特異性吸附劑可以是大分子結(jié)構(gòu)諸如多蛋白質(zhì)復(fù)合體、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例是結(jié)合了抗體、受體蛋白質(zhì)、凝集素和核酸的固體載體。生物特異性吸附劑針對靶分析物的特異性通常高于色譜吸附劑。SELDI中使用的吸附劑的其它實例可見于美國專利6,225,047(Hutchens and Yip，″Use of retentate chromatography to generate difference maps，″May 1，2001)。
結(jié)合部分可在適于形成分子相互作用的任何物理狀態(tài)(包括氣體、水性和有機懸浮物和乳狀物，最優(yōu)選地是液態(tài))中存在并與可采用本發(fā)明進(jìn)行檢測的分析物發(fā)生相互作用。
“固體載體”是指包括顆粒(例如珠)、纖維、整體柱、膜、濾器、塑料條帶等等的任何不溶性物質(zhì)。
“蛋白質(zhì)生物芯片”是指適于俘獲多肽的生物芯片。在現(xiàn)有技術(shù)中記載了多種蛋白質(zhì)芯片。其包括，例如，由賽弗吉生物系統(tǒng)公司(Ciphergen Biosystems)(Fremont，CA)、Packard BioScience公司(Meriden CT)、Zyomyx公司(Hayward，CA)以及Phylos公司(Lexington，MA)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)生物芯片。所述蛋白質(zhì)芯片的實例可見于下列專利或?qū)＠暾堉忻绹鴮＠?,225,047(Hutchens and Yip，″Use of retentatechromatography to generate difference maps，″May 1，2001)；國際公開WO 99/51773(Kuimelis and Wagner，″Addressable protein arrays，″October 14，1999)；國際公開WO 00/04389(Wagner et al.，″Arrays ofprotein-capture agents and methods of use thereof，″July 27，2000)以及國際公開WO 00/56934(Englert et al.，″Continuous porous matrix arrays，″September 28，2000)。
“表面增強凈解吸(Surface-Enhanced Neat Desorption)”或“SEND”是SELDI的變型，其包括使用包含能量吸收分子層的探針(“SEND探針”)，所述能量吸收分子結(jié)合在探針表面。例如，可以通過共價或非共價化學(xué)鍵進(jìn)行結(jié)合。與傳統(tǒng)的MALDI不同的是，SEND中的分析物不需要在用于解吸/電離的能量吸收分子的晶體基質(zhì)中俘獲?！澳芰课辗肿?Energy absorbing molecules)”(“EAM”)是指能夠吸收來自激光解吸/電離源的能量并隨后將與其接觸的分析物分子解吸和電離的分子。該用語包括MALDI中使用的分子(通常稱為“基質(zhì)”)，且明確地包括肉桂酸(cinnamic acid)衍生物、芥子酸(sinapinic acid)(“SPA”)、氰基-羥基-肉桂酸(“CHCA”)和二羥基苯甲酸、阿魏酸、羥基苯乙酮衍生物，以及其它。其還包括SELDI中所使用的EAM。在特定實施方式中，能量吸收分子組成線形或交聯(lián)的聚合物，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，構(gòu)成可以是α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一實施方式中，構(gòu)成是α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三-甲氧基)硅基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一實施方式中，構(gòu)成是包含α-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和甲基丙烯酸十八烷基酯(octadecyl methacrylate)(“C18 SEND”)的共聚物。SEND可進(jìn)一步見于美國專利5,719,060和WO 03/64594(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having EnergyAbsorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes″，August 7，2003)。
SEAC/SEND是SELDI的變型，其中結(jié)合部分和能量吸收分子均結(jié)合于樣品呈遞表面。因此，SEAC/SEND探針能夠通過親和性俘獲和解吸而無需提供外部基質(zhì)即可俘獲分析物。C18 SEND生物芯片是SEAC/SEND的變型，其包括C18部分，該部分的功能在于作為結(jié)合部分，而CHCA部分的功能在于作為能量吸收部分。
由賽弗吉生物系統(tǒng)公司制造的蛋白質(zhì)生物芯片包含具有色譜性或生物特異性吸附劑的表面，所述色譜性或生物特異性吸附劑連結(jié)于所述表面的可尋址位置。賽弗吉ProteinChip陣列包括NP20、H4、H50、SAX-2、Q10、WCX-2、CM-10、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、IMAC-40、PS-10以及PS-20。這些蛋白質(zhì)芯片包含條帶形鋁基質(zhì)。該條帶的表面上涂覆二氧化硅。
對于NP-20生物芯片，氧化硅的功能在于作為親水性吸附劑俘獲親水性蛋白質(zhì)。
H4、H50、SAX-2、WCX-2、IMAC-3、PS-10以及PS-20生物芯片進(jìn)一步包含水凝膠形式的官能化、交聯(lián)聚合物，該聚合物以物理方式連結(jié)于生物芯片表面，或通過硅烷以共價方式連結(jié)于生物芯片表面。H4生物芯片具有用于疏水性結(jié)合的異丙基官能基。H50生物芯片具有用于疏水性結(jié)合的壬基苯氧基-多(乙二醇)甲基丙烯酸酯。SAX-2生物芯片具有用于陰離子交換的四級銨官能基。WCX-2生物芯片具有用于陽離子交換的羧酸鹽官能基。IMAC-3生物芯片具有通過胺乙酸(nitriloacetic acid)或IDA固定的用于配位共價結(jié)合的銅離子。PS-10生物芯片具有酰基-咪唑(acyl-imidizole)官能團，其能與蛋白質(zhì)上用于共價結(jié)合的基團進(jìn)行反應(yīng)。PS-20生物芯片具有用于與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的環(huán)氧官能團。PS系列生物芯片用于將生物特異性吸附劑，如抗體、受體、凝集素、肝素、蛋白質(zhì)A、生物素/抗生蛋白鏈菌素等，結(jié)合至可發(fā)揮其特異性俘獲樣本中分析物功能的芯片表面。LSAX-30(陰離子交換)、LWCX-30(陽離子交換)及IMAC-40(金屬螯合物)生物芯片在其表面具有功能性乳膠珠(latex bead)。所述生物芯片可進(jìn)一步見于WO00/66265(Rich et al.(″Probes for a Gas Phase Ion Spectrometer，″November 9，2000)；WO 00/67293(Beecher et al.，″Sample Holder withHydrophobic Coating for Gas Phase Mass Spectrometer，″November 9，2000)；美國專利申請09/908,518(Pohl et al.，″Latex Based AdsorbentChip，″July 16，2002)以及美國專利申請60/350,110 (Um etal.，″Hydrophobic Surface Chip，″November 8，2001)。
“氣相離子光譜儀”是指檢測氣相離子的裝置。氣相離子光譜儀包括提供氣相離子的離子源。例如，氣相離子光譜儀包括質(zhì)譜儀、離子移動光譜儀及總離子流測定裝置?！皻庀嚯x子光譜法”是指使用氣相離子光譜儀檢測氣相離子。
“質(zhì)譜儀”是指檢測可被轉(zhuǎn)化成氣相離子質(zhì)荷比的參數(shù)的氣相離子光譜儀。質(zhì)譜儀一般包括離子源和質(zhì)量分析儀。質(zhì)譜儀的實例是飛行時間(time-of-flight)式、扇形磁場(magnetic sector)式、四極子濾過(quadrapole filter)式、離子阱(ion trap)式、離子回旋共振(ion cyclotronresonance)式、靜電扇形分析器，以及這些形式的組合?！百|(zhì)譜法”是指使用質(zhì)譜儀檢測氣相離子。
本發(fā)明文中的“探針”或“質(zhì)譜儀探針”是指可用于將來自分析物的離子導(dǎo)入氣相離子光譜儀(諸如質(zhì)譜儀)的裝置?！疤结槨币话惆ê袠悠烦蔬f表面的固體基質(zhì)(撓性的或剛性的)，分析物在所述樣品呈遞表面上被呈遞至電離能量源?！癝ELDI探針”是指包含結(jié)合于表面的吸附劑(又稱“結(jié)合部分”)的探針?！拔絼┍砻妗笔侵肝絼┧Y(jié)合的表面?！盎瘜W(xué)選擇性表面”是指吸附劑或者能夠例如通過反應(yīng)形成共價或配合共價鍵的方式與結(jié)合部分相結(jié)合的反應(yīng)部分所結(jié)合的表面。
“SELDI MS探針”是指包含結(jié)合于表面的吸附劑的探針。
本發(fā)明文中的“方差”是指在試驗樣品中分析物濃度的數(shù)學(xué)方差。方差減少是指具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＞0.05)的情況。用最簡單的術(shù)語表示，方差是通過至少一種檢測方法所檢測的試驗樣品中所有分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)差的平方。優(yōu)選的檢測方法是質(zhì)譜法，其中可檢測分析物的量是由檢測器所鑒定的質(zhì)峰下方的區(qū)域面積。
“洗滌緩沖液”是指可用于洗滌并從吸附劑表面除去未結(jié)合物質(zhì)的溶液。洗滌緩沖液通常包括鹽(可以將其或者也可以不將其pH緩沖至特定的范圍內(nèi))，去污劑并且任選地可包括可用于從表面或復(fù)合物上除去偶發(fā)結(jié)合物質(zhì)的其它成份。
“洗脫緩沖液”是指能夠?qū)⒔Y(jié)合部分和所結(jié)合的分析物解離的溶液。在某些情況下，當(dāng)亞基在復(fù)合物中相結(jié)合時，洗脫緩沖液能夠斷裂亞基間的相互作用。如同洗滌緩沖液，洗脫緩沖液可包括單獨使用或作為混合物使用的去污劑、鹽、有機溶劑等。通常，后面這些試劑在洗脫緩沖液中的濃度要高于在洗滌緩沖液中的濃度，以便使洗脫緩沖液更易于斷裂分子的相互作用。斷裂分子的相互作用的這種能力稱為“嚴(yán)緊性”，而洗脫緩沖液的嚴(yán)緊性高于洗滌緩沖液的嚴(yán)緊性。
發(fā)明詳述[63]本發(fā)明提供了試劑盒和方法，該試劑盒和方法能使本領(lǐng)域技術(shù)人員減小在復(fù)合混合物中發(fā)現(xiàn)的興趣分析物的濃度范圍。比較采用分析物特異性試劑的現(xiàn)有技術(shù)方法而言，此處所述的方法尤為有益，因為這些方法能夠減小樣品中分析物的濃度范圍，所述樣品含有未知組分并且是復(fù)合物，該復(fù)合物中不僅存在大量不同的分析物(大于103種)，而且存在濃度的動態(tài)范圍(數(shù)量級大于103)。結(jié)果，采用所主張的發(fā)明能夠同時分析“深蛋白質(zhì)組(Deep Proteome)”，其包括來自生物來源(包括血、血漿和血清)的多種液體中所存在的大量低豐度蛋白質(zhì)。(參見圖5)。由此本發(fā)明具有用于分子復(fù)合混合物，諸如生物樣品的分析性制備的用途。
分析物濃度范圍或濃度方差的減小是通過使用結(jié)合部分文庫實現(xiàn)的，所述文庫具有確定的規(guī)模和多樣性，所述文庫優(yōu)選在惰性載體上合成或被結(jié)合于惰性載體上。當(dāng)導(dǎo)入包含分析物多樣性的溶液中時，所主張的發(fā)明的結(jié)合部分將結(jié)合溶液中的分析物。高豐度分析物的存在量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于飽和其各自結(jié)合部分的能力所需要的量；因此，這些高豐度分析物總量的高百分比將保持未結(jié)合。相反地，痕量分析物的量較低意味著這些分子無法飽和所有適于它們的結(jié)合部分；因此，與高豐度分析物相比，痕量分析物起始量的較高百分比將保持與其各自的結(jié)合部分相結(jié)合。未結(jié)合的分析物可通過洗滌而被除去。當(dāng)從結(jié)合部分上洗脫結(jié)合的分析物時，相對起始物質(zhì)而言，洗脫物質(zhì)中高豐度分析物的相對量降低。相反，相對起始物質(zhì)而言，洗脫物質(zhì)中痕量分析物的量增加。分析物相對濃度的這種同時發(fā)生的改變會導(dǎo)致在單一分析，或者比采用起始物質(zhì)時數(shù)目更少的分析中檢測洗脫物質(zhì)中眾多(既便不是全部)存在于溶液中的分析物。以血清為例，白蛋白是高豐度的，多種補體相關(guān)蛋白、激素結(jié)合蛋白具有中間濃度，而旁分泌因子和細(xì)胞標(biāo)記物可能具有微小的濃度。使用本發(fā)明，血清中所檢測到的分析物豐度范圍可被降低，這能夠使眾多(既便不是大多數(shù)或甚至全部)興趣分析物得以分析。
采用所主張的發(fā)明制備樣品是簡單易行的。在吸附了興趣分析物之后，任選地洗滌該分析物從而除去未結(jié)合的分析物。隨后采用例如通過施以洗脫緩沖液的方式從結(jié)合部分上洗脫吸附的分析物。所得溶液包含全部興趣分析物，而不包含結(jié)合部分；但是，與初始復(fù)合混合物不同的是，由于相對于初始復(fù)合混合物而言高豐度分析物的濃度降低而低豐度分析物的濃度增加，故所得溶液中存在的分析物濃度范圍相對較小。分析物的濃度范圍或分析物之間的濃度范圍所發(fā)生的這種改變能夠在無須重新校準(zhǔn)檢測裝置的情況下使得所得溶液中分析物的較大百分比得以檢測，而對含有非常不同濃度組分的復(fù)合混合物直接分析時則必需進(jìn)行所述重新校準(zhǔn)。
在本發(fā)明某些實施方式中，可以將與結(jié)合部分結(jié)合的分析物直接洗脫至適用于質(zhì)譜儀的探針或蛋白質(zhì)芯片上。為有助于分析，在這些實施方式中使用的洗脫緩沖液可包括適用于質(zhì)譜儀的基質(zhì)物質(zhì)?？蛇x地，可在分析物沉積于探針或芯片之后，將該基質(zhì)物質(zhì)導(dǎo)入分析物。在這種情況的優(yōu)選實施方式中，使用SEND或SEAC/SEND生物芯片，該生物芯片上包含基質(zhì)物質(zhì)。這些優(yōu)選實施方式緩解了對在洗脫緩沖液包含基質(zhì)物質(zhì)或在沉積于生物芯片之上后的某些時間點將基質(zhì)物質(zhì)導(dǎo)入分析物的需求。
通過提供多種結(jié)合部分(每種結(jié)合部分識別復(fù)合混合物中存在的單一或較小百分比的興趣分析物)，本發(fā)明可以在最低限度地或無須重新校準(zhǔn)檢測裝置的情況下使復(fù)合混合物的組成得以檢測。這包括對那些除此以外將無法得到檢測的品種(其由于被高豐度分析物掩蔽，或者存在的濃度非常低以至于無法通過分析法得到檢測)的檢測。這為高通量分析技術(shù)提供了非常大的益處，否則由于眾多復(fù)合混合物中存在大濃度范圍分析物而不得不需要多次重新校準(zhǔn)、和/或多個通道、和/或多個檢測步驟或昂貴且浪費的分級分離技術(shù)，故此高通量分析技術(shù)將在檢測步驟上受到上述需要的限制。此外，通過增加低豐度分析物的相對濃度，本發(fā)明能夠檢測樣品中僅以痕量存在的分析物。以血清為例，未濃縮血清中僅存在痕量的特定分析物諸如某些激素。其它分析物，諸如白蛋白是高豐度的，存在量為微摩爾至毫摩爾。相對于高豐度分析物而言，本發(fā)明能夠濃縮低豐度分析物。因此，采用本發(fā)明制備示例性血清樣品時，相對于白蛋白和其它高豐度分析物的濃度而言，激素濃度增加。通過將血清中低和高豐度分析物的濃度相靠近，就可僅采用檢測分析物的分析裝置的一項或若干項靈敏度設(shè)定而定性且定量地檢測分析物組成。
通過相同的方法，本發(fā)明能夠測定生物樣品中存在的痕量蛋白質(zhì)，諸如純化的治療性蛋白質(zhì)，其中對蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量的容許量非常有限。例如來自細(xì)胞培養(yǎng)物上清的純化抗體可包含痕量的不同蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)來自用于表達(dá)抗體的細(xì)胞。后者這些蛋白質(zhì)是不應(yīng)該存在的，通?？捎锰禺愋訣LISA檢測法進(jìn)行檢測。但是，當(dāng)雜質(zhì)的濃度非常低時，免疫化學(xué)試驗是無效的。如果首先根據(jù)本發(fā)明對要分析的樣品進(jìn)行處理，痕量蛋白質(zhì)雜質(zhì)則可被顯著地濃縮，由此可通過常規(guī)化學(xué)或免疫化學(xué)方法進(jìn)行檢測。
1.減小樣品中的相對分析物濃度A.適宜的試驗樣品[69]本發(fā)明的試驗樣品可以是能使該試驗樣品中的分析物與本發(fā)明的結(jié)合部分相接觸(如本文所述)的任何形式。適宜的試驗樣品包括氣體、粉末、液體、懸液、乳液、可透過的或粉末化的固體，等等。優(yōu)選地，試驗溶液是液體。試驗樣品可直接取自來源并用于本發(fā)明的方法中，而無須任何預(yù)先操作。例如，水樣品可直接取自含水層并采用本文所述方法直接進(jìn)行處理。
可選地，初始樣品可用多種方法進(jìn)行制備以便增強其對檢測的適應(yīng)性。所述樣品制備包括除去特定分析物、濃縮、磨碎、提取、滲濾等。例如，固體樣品可被粉末化成為粉末，然后采用水或有機溶劑進(jìn)行提取。然后對來自粉末的提取物實施本發(fā)明的方法。在對液體實施本發(fā)明的方法之前，可將氣體樣品通過溶液進(jìn)行發(fā)泡或滲濾以便將該氣體的組分在液體中溶解和/或濃縮。
試驗樣品優(yōu)選包含至少四種興趣分析物，更優(yōu)選地至少8、15、20、50、100,1000、100,000、1,000,000、10,000,000或更多種興趣分析物。在某些情況下，適于采用本發(fā)明的方法進(jìn)行操作的試驗樣品可包含數(shù)百種或數(shù)千種興趣分析物。優(yōu)選地，試驗樣品中的分析物濃度至少跨越數(shù)量級，更優(yōu)選地，至少兩個、三個、四個或更多個數(shù)量級。本發(fā)明的方法一經(jīng)實施，可通過至少一種檢測法進(jìn)行檢測的分析物的該濃度范圍將減小至少兩倍、更優(yōu)選地，10、20、50、100、1000或更多倍。
可以采用任何適宜的方法收集試驗樣品。例如，可以采用浸漬、挖取、舀取、吸取或捕集來收集環(huán)境樣品?？梢圆捎贸槿?、刮取、手術(shù)切除或用皮下針等來收集生物樣品。各種情況中的收集方法高度依賴于樣品來源和狀態(tài)，而多種可選的適宜收集技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
1.生物試驗樣品[73]試驗樣品可以取自潛在地包含興趣分析物任何來源，包括環(huán)境樣品，諸如空氣、水、土、提取物等。本發(fā)明優(yōu)選的試驗樣品是生物樣品，優(yōu)選是生物液體。可采用本發(fā)明的方法操作的生物樣品包括羊水、血、腦脊液、關(guān)節(jié)內(nèi)液、眼內(nèi)液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿液、條件培養(yǎng)液、發(fā)酵液、組織勻漿液及其衍生物。生物樣品中的興趣分析物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和多糖。更具體地，興趣分析物是動物中通常存在的，或是與疾病或感染狀態(tài)諸如癌癥、病毒感染、寄生蟲感染、細(xì)菌感染等相關(guān)的細(xì)胞代謝產(chǎn)物。特別地，興趣分析物是針對細(xì)胞應(yīng)激的標(biāo)記物。顯示動物處于應(yīng)激中的分析物是多種疾病狀態(tài)(包括特定心理疾病、心肌梗死和感染)的早期指示物。
興趣分析物還包括那些對動物異源的，但在動物組織中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。特別地，在此意義下的興趣分析物包括治療性藥物(包括抗生素)，其中的很多種以可由感染性生物體產(chǎn)生的，或來源于環(huán)境隱匿于動物內(nèi)的不同對映體和毒素存在。例如，實例可以是蛋白(eggwhite)或E.Coli提取物。
2.環(huán)境試驗樣品[75]環(huán)境樣品是用于本發(fā)明的另一類優(yōu)選試驗樣品。優(yōu)選的環(huán)境樣品包括土、塵、皮屑、天然和合成纖維、水、植物材料、動物糞便等。環(huán)境樣品中優(yōu)選的分析物包括天然和合成毒素、肥料、除草劑和殺蟲劑，以及用于細(xì)菌和病毒劑的標(biāo)記，諸如所述興趣劑的結(jié)構(gòu)蛋白特征。特別地，在環(huán)境試驗樣品中尋找的優(yōu)選分析物是毒素，特別是諸如肉毒素、蓖麻毒素、炭疽毒素等的毒素。環(huán)境試驗樣品中存在的疾病相關(guān)的興趣分析物包括完整病毒體以及肉毒桿菌、埃博拉病毒(ebola)、HIV、SARS、炭疽、鼠疫、瘧疾、天花、牛海綿樣腦病相關(guān)的蛋白酶傳染因子、綿羊搔癢癥、變異體CJD等的特征性蛋白質(zhì)和核酸。
示例性環(huán)境樣品可獲自多種來源，包括自然環(huán)境，諸如天然存在的水體。天然存在的水體例如可以是洋、湖泊、海、河流、沼澤、水塘、三角洲或灣。可選地，環(huán)境提取物可以是來自水處理中心的提取物。
可選地，環(huán)境樣品可取自人造環(huán)境，諸如建筑物。該建筑物可以是任何人造建筑物。優(yōu)選地，所述建筑物已受到一種或多種生物病原體諸如天花、炭疽，或一種或多種毒劑，諸如沙林、梭曼、神經(jīng)毒劑、爆炸性化學(xué)劑、殺蟲劑、VX和糜爛性毒劑的污染。獲取該環(huán)境樣品的方法包括采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜溶劑從建筑物表面上干燥抹取，或從建筑物表面上潮濕抹取。
B.適宜的結(jié)合部分[78]本發(fā)明適宜的結(jié)合部分包括小有機分子，諸如染料和三嗪，以及生物聚合物諸如肽、蛋白質(zhì)、多核苷酸、寡糖或脂質(zhì)。本發(fā)明的結(jié)合部分可以是分子量為100KDa或更高的分子，諸如抗體，但優(yōu)選是分子量在10KDa范圍內(nèi)的較小的分子，更優(yōu)選是1KDa左右，期望是小于1KDa，例如小于750、500或250Da。理想上，本發(fā)明的結(jié)合部分與不溶性顆粒化物質(zhì)結(jié)合。各個不溶性顆粒優(yōu)選攜帶有若干拷貝的相同結(jié)合部分，而各個顆粒類型結(jié)合不同的結(jié)合部分。
本發(fā)明的結(jié)合部分可以是在溶液、懸液，或在能使所述結(jié)合部分與分析物(包括置于固體載體上的)相接觸的任何其它狀態(tài)中。
結(jié)合部分可以是“噬菌體展示文庫”(其中肽作為噬菌體外膜的部分而呈遞)的一部分。(例如參見，Tang，Xiao-Bo，et al.；J.Biochem；1997；pp.686-690；vol.122，No.4)。在噬菌體顆粒的表面上呈遞肽能夠?qū)崿F(xiàn)小肽的組合文庫快通量篩選，該方法還有益于篩選組合抗體文庫。噬菌體展示文庫由噬菌體制成，所述噬菌體已經(jīng)通過重組操作從而將結(jié)合部分作為噬菌體蛋白外膜的部分進(jìn)行表達(dá)。采用噬菌體展示，可以方便地構(gòu)建結(jié)合部分的文庫。
結(jié)合部分還可以是可溶性組合分子。可溶性組合分子優(yōu)選包括俘獲部分，該部分能使所述結(jié)合部分與互補固體載體相連結(jié)?？扇苄越Y(jié)合部分實施方式通常是在通過將該結(jié)合部分結(jié)合至或連結(jié)至固體載體從而分離所得復(fù)合物之前與樣品接觸并與興趣分析物結(jié)合。組合文庫可以由構(gòu)建塊組成，所述構(gòu)建塊包含手性原子諸如19種天然存在的氨基酸。
本發(fā)明的結(jié)合部分可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)進(jìn)行制備。例如，結(jié)合部分可以通過化學(xué)合成、從天然來源中收集(在此情況下結(jié)合部分是生物有機聚合物)、采用重組技術(shù)制備。對于該后者情況，具有不多于15、10、8、6或4個氨基酸的肽尤為有益，因為它們易于采用重組或固相化學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。此外，化學(xué)合成文庫可見于，例如Fodor et al.，Science 251767-773(1991)和Houghten etal.，Nature 35484-86(1991)。在裂解-連結(jié)-重組固相組合合成(Lamet al.，Nature 354，82-84(1991))中，結(jié)合部分的補體的多樣性是不同氨基酸的數(shù)目與結(jié)合部分的長度(在單個結(jié)合部分中氨基酸的數(shù)目)相乘的結(jié)果。
核酸是另一種優(yōu)選的生物有機聚合物結(jié)合部分。與肽相同，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的合成或重組技術(shù)制備核酸。本發(fā)明優(yōu)選的核酸結(jié)合部分的長度為至少4個，更優(yōu)選6、8、10、15或20個核苷酸。核酸結(jié)合部分包括能夠與特異性分子靶(諸如蛋白質(zhì)或代謝物)結(jié)合的單鏈或雙鏈DNA或RNA分子(例如，核酸適體)。
本發(fā)明還包括寡糖結(jié)合部分。寡糖結(jié)合部分的長度優(yōu)選是至少5個單糖單位，更優(yōu)選是8、10、15、20、25或更多個單糖單位。
生物聚合物結(jié)合部分可以是脂質(zhì)。如此處所使用的，術(shù)語“脂質(zhì)”是指疏水性或兩親性部分。由此，結(jié)合部分的脂質(zhì)文庫同樣可用于本發(fā)明的方法和試劑盒中。適宜的脂質(zhì)包括C14至C50脂肪族、芳基、芳烷基、芳稀基或芳炔基部分，其可包括至少一種雜原子，該雜原子選自氮、硫、氧和磷。其它適宜的脂質(zhì)包括磷酸甘油酯、糖基甘油脂、鞘脂、固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丙醇胺。結(jié)合部分的脂質(zhì)文庫的長度優(yōu)選是至少5個單位，更優(yōu)選至少8、10、15、20、25、50或更多個單位。
本發(fā)明也可以使用小有機分子作為結(jié)合部分。通常，所述分子具有能使其與分析物發(fā)生離子性、疏水性或親和相互作用的特性。小有機結(jié)合部分包括通常用于色譜方法中的化學(xué)基團，諸如單-、二-和三-甲基氨基乙烷基基團，單-、二-和三-乙烷基氨基乙烷基基團，磺酰基，磷酰基，苯基，羧甲基基團等。例如，文庫使用苯二氮卓(例如參見，Bunin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712(1994))和類肽(例如Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367-9371(1992))。在其它實施方式中，結(jié)合部分使染料或三嗪衍生物。該列表并非是窮舉的，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地識別數(shù)以千計的化學(xué)官能團，這些基團具有離子性、疏水性或親和特性，適宜用作本發(fā)明的結(jié)合部分。以下將更詳細(xì)地描述組合結(jié)合部分文庫的制備和使用。
結(jié)合部分可以是購買的預(yù)先連結(jié)于載體的、在載體上合成的，或者可以是采用標(biāo)準(zhǔn)方法直接連結(jié)于或直接固定在載體上的(例如參見，Harlow and Lane，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1988)；Biancala et al.，Letters in PeptideScience 7(291)297(2000)；MacBeath et al.，Science 2891760-1763(2000)；Cass et al.，ed.，Proceedings of the Thirteenth AmericanPeptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美國專利5,576,220；Cook et al.，Tetrahedron Letters 356777-6780(1994)；和Fodor et al.，Science 251(4995)767-773(1991))。
組合文庫[88]在本發(fā)明的一個實施方式中，結(jié)合部分的文庫是組合文庫或其部分。組合化學(xué)文庫是通過將多個化學(xué)“構(gòu)建塊”組合成所有可能的組合方式，以化學(xué)合成或生物合成方式形成的化合物的集合。例如，完全線形組合化學(xué)文庫，諸如多肽文庫，是通過將一組化學(xué)構(gòu)建塊(氨基酸)以每一種可能的方式組合成給定的化合物長度(即，多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)從而形成的。舉例來說，如果構(gòu)建塊的數(shù)目是5且構(gòu)建體由五個成員組成，則可能的線形組合的數(shù)目是55或3,125個成員。在該情況下，構(gòu)建塊(A、B、C、D和E)是線形組合的，諸如A-A-A-A-A；A-A-A-A-B；A-A-A-A-C；A-A-A-B-A；A-A-A-B-B；A-A-A-B-C；.....；A-A-B-A-A；A-A-B-A-B；A-A-B-A-C；.....；E-E-E-E-C；E-E-E-E-D；E-E-E-E-E。
組合文庫的另一種形式是以支架為基礎(chǔ)的。該構(gòu)建體的基礎(chǔ)是單個中心分子或核心，其中包含可被構(gòu)建塊取代的位置。三氯-三嗪(三個可取代位點)即為一種實例，其上可結(jié)合若干取代基。如果取代基的數(shù)目是三，則可能的組合數(shù)目即為10。還可以考慮各取代基的相對定位，在這種情況下組合的數(shù)目會更大。
[90]作為第三水平，可以將線性組合文庫與以支架為基礎(chǔ)的文庫進(jìn)行組合，其中后者文庫的取代基是組合的線性序列。
可以通過化學(xué)構(gòu)建塊所述組合性混合從而合成數(shù)百萬種化學(xué)化合物。對于肽結(jié)合部分而言，所述長度優(yōu)選限于15、10、8、6或4個氨基酸。本發(fā)明核酸結(jié)合部分的優(yōu)選長度是至少4個，更優(yōu)選6、8、10、15，或至少20個核苷酸。寡糖長度優(yōu)選為至少5個單糖單位，更優(yōu)選8、10、15、20、25或更多個單糖單位。
組合文庫可以是完全的或不完全的。生物聚合物的完全組合文庫是這樣一些文庫，該文庫中包含具有給定聚合物長度和組合的每一種可能的單體排列方式的代表方式。不完全文庫是這樣一些文庫，該文庫中缺少具有給定聚合物長度的一種或多種可能的單體排列方式。
肽結(jié)合部分是所主張的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。生成適用于所主張的本發(fā)明的肽結(jié)合部分的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如“裂解、結(jié)合和重組”方法(例如參見，F(xiàn)urka et al.，Int.J.PeptideProtein Res.，37487-493(1991)；Houghton et al.，Nature 35484-88(1991)；Lam et al.，Nature，35482-84(1991)；國際專利申請WO92/00091；和美國專利5,010,175、5,133,866和5,498,538)和本領(lǐng)域中已知的其它方法。肽文庫的表達(dá)還可見于Devlin et al.，Science，249404-406(1990)。
本領(lǐng)域眾所周知的組合和合成化學(xué)技術(shù)可以生成包含數(shù)百萬種成員的文庫(Lam et al.，Nature 35482-84(1991)和國際專利申請(PCT)WO 92/00091)，各文庫具有獨有的結(jié)構(gòu)。例如，由18種天然氨基酸制備的線性六聚物配體文庫包含34×106種不同的結(jié)構(gòu)。當(dāng)還包括氨基酸類似物和異構(gòu)體時，可能的結(jié)構(gòu)數(shù)目事實上是無限的。此外，所述文庫的每一成員均有可能具有結(jié)合不同分子的能力。組合文庫的成員可在固體載體上合成或與固體載體連結(jié)，所述固體載體諸如珠，其中各珠的表面上基本上含有文庫成員的數(shù)百萬個拷貝。由于可將不同的珠與不同的文庫成員結(jié)合以及用于結(jié)合文庫成員的珠的總數(shù)目非常大，故能夠與珠所結(jié)合的文庫成員相結(jié)合的不同分子的可能數(shù)目非常巨大。
Hammond等，US 2003/0212253(2003年11月13日)公開了組合文庫，如下所述。肽結(jié)合部分文庫可以由氨基酸合成，所述氨基酸能夠提供相對于天然氨基酸而言增加的穩(wěn)定性。例如，半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸可從文庫中省略而包括非天然氨基酸諸如2-萘丙氨酸和正亮氨酸。N-端氨基酸可以是D-異構(gòu)體或可以被乙?；栽诖嬖诎被拿笗r提供更好的生物化學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)合部分的密度必須足以提供對靶分子充分的結(jié)合力，但又不能太高以防止結(jié)合部分與其自身相互反應(yīng)而不與靶分子相互反應(yīng)。結(jié)合部分的所需密度是0.1μmole-500μmole/g載體干重，更優(yōu)選地，結(jié)合部分的所需密度是10μmole-100μmole/g載體。六聚肽文庫在Toyopearl-AF Amino 650M樹脂(Tosohaas，Montgomeryville，Pa)上合成。樹脂珠的大小為60-130mm/珠。通過與Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH的混合物(1∶3.8摩爾比)相結(jié)合從而完成起始樹脂的初始置換。結(jié)合后，完全凈TFA除去Boc保護基團。然后對所得去保護的氨基進(jìn)行乙酰化。然后通過樹脂珠上殘留的Fmoc-Ala-OH位點組裝肽鏈。采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc合成策略。在典型試驗的一種實施方式中，采用20％哌啶/DMF將六克Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl Resin去保護(2×20分鐘)，然后用DMF洗滌(8次)，然后等分為18個獨立反應(yīng)管。在各獨立管中，單個Fmoc-氨基酸與樹脂(BOP/NMM，過量5-10倍)結(jié)合4-7小時。然后洗滌各樹脂并采用“裂解/混合”文庫技術(shù)(Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；國際專利申請WO 92/00091(1992)；美國專利號5,010,175；美國專利號5,133,866；和美國專利號5,498,538)進(jìn)行組合。重復(fù)去保護和結(jié)合的循環(huán)直至完成氨基酸序列(六聚物文庫需六個循環(huán))。在最后的結(jié)合循環(huán)中，在獨立的反應(yīng)管中采用20％哌啶/DMF從肽中除去最終Fmoc。采用TFA處理(TFA∶H.sub.20∶Phenol，90∶5∶5)2小時以除去側(cè)鏈保護基團。充分洗滌樹脂然后真空干燥。所得的肽密度通常為0.06-0.12mmol/g樹脂。所述氨基酸可以是L或D-立體異構(gòu)體或外消旋混合物。
測序并證實肽配體-樹脂珠復(fù)合物的肽組成，通過Commonwealth Biotechnologies，Inc.，Richmond，Va進(jìn)行定量氨基酸分析從而計算樹脂的置換度。通過采用Hewlett PackardG1005A的Edman降解于Protein Technologies Laboratories，Texas A&M University進(jìn)行測序。
用于制備組合文庫的裝置是商業(yè)上可獲得的(例如參見，357MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，9050Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，多種組合文庫本身即可從商業(yè)上獲得(例如參見，ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Colnmbia，MD，等)。
在某些肽文庫實施方式中，肽在重組噬菌體的表面上表達(dá)從而產(chǎn)生大規(guī)模、易于篩選的文庫。采用“噬菌體”方法(Scott and Smith，Science 249386-390，1990；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，876378-6382，1990；Devlin et al.，Science，49404-406，1990)，可以構(gòu)建非常大規(guī)模的文庫(106-108種化學(xué)實體)。第二種方法主要使用化學(xué)方法，其實例是Geysen法(Geysen al.，Molecular Immunology 23709-715，1986；Geysen et al.J.Immunologic Method 102259-274，1987；和Fodor等的方法(Science 251767-773，1991)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry，Volume#5，Abstract FR013，1988；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.37487-493，1991)，Houghton(美國專利號4,631,211,1986年12月公布)和Rutter等(美國專利號5,010,175，1991年4月23日公布)公開了用于制備作為激動劑或拮抗劑而得以檢測的肽混合物的方法。
還可以使用其它用于生成化學(xué)多樣性文庫的化學(xué)物質(zhì)。所述化學(xué)物質(zhì)包括，但不限于肽(例如，PCT申請?zhí)朩O 91/19735)，編碼的肽(例如，PCT申請?zhí)朩O 93/20242)，隨機生物寡聚物(例如，PCT申請?zhí)朩O 92/00091)，苯二氮卓類(例如，美國專利號5,288,514)，diversomer諸如乙內(nèi)酰脲、苯二氮卓類和二肽(Hobbs etal.，Proc.Nczt.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))，插烯酰多肽(vinylopgous polypeptide)(Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽性肽模擬物(Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文庫的類似有機合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡碳胺酯(oligocarbamates)(Cho et aL.，Science 2611303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell et al.，J.Org.Chem.59658(1994))，核酸文庫(參見Ausubel，Berger and Sambrook，均如上述)，肽核酸文庫(例如參見，美國專利5,539,083)，抗體文庫(例如參見，Vaughnet al.，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文庫(例如參見，Liang et al.，Science，2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)，小有機分子文庫(例如參見，苯二氮卓類，Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；類異戊二烯，美國專利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和間噻嗪烷酮(metathiazanones)，美國專利5,549,974；吡咯烷，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯二氮卓類，5,288,514，等等)。
接頭部分[100]本發(fā)明的結(jié)合部分任選地包括接頭部分，該部分使結(jié)合部分靶向地和/或可逆地連結(jié)至固體載體。示例性接頭部分包括表位和his-標(biāo)簽，其可以與所要俘獲的生物分子連結(jié)從而形成融合蛋白。在這些情況下，可剪切的接頭序列，諸如特異性針對Factor XA或腸激酶的那些序列(Invitrogen，San Diego，Calif.)可任選地被包含在生物分子和俘獲部分之間以便于融合分子組分的分離和/或分開。特異性識別設(shè)計配體的蛋白域也可被用作接頭部分(例如參見，Deisenhofer，J.，Biochemistry 20(1981)2361-2370)。本領(lǐng)域中已知多種其它等效的接頭部分。例如參見，Hochuli，Chemisclze Irzdustrie，1269-70(1989)；Hochuli，Genetic Engineering，Principle and Methods，1287-98(1990)，Plenum Press，N.Y.；and Crowe，et al.(1992)OIAexpressTHe HighLevel Expression & Protein Purgfication System，QIAGEN，Inc.Chatsworth，Calif.；上述文件引入此處作為參考。需要吸附的生物分子的抗原決定簇以及其它特征也可用作俘獲部分標(biāo)簽。示例性接頭部分包括聚-組氨酸(聚-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)標(biāo)簽；flu HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標(biāo)簽及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan et al.，Molecular and CeLlular Biology，53610-3616(1985))；和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborsky et al.，ProteinEngineering，3(6)547-553(1990))。其它標(biāo)簽多肽包括Flag-肽(Hopp et a1.，BioTechnology，61204-1210(1988))；KT3表位肽(Martinet al.，Science，255192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner etal.，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991))；和T7基因10種蛋白質(zhì)肽標(biāo)簽(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990))。
C.采用結(jié)合部分從試驗樣品中俘獲分析物[101]通過在能使各結(jié)合部分與其對應(yīng)分析物相結(jié)合的條件下將試驗樣品與結(jié)合部分接觸可以俘獲試驗樣品中存在的分析物。如上所述，結(jié)合部分可以與試驗樣品直接接觸，或者結(jié)合部分可以首先與固體載體，諸如試紙條、SELDI探針和不溶性聚合珠、膜或粉末相連結(jié)。
在結(jié)合部分是珠文庫的一部分的情況中，珠體積與復(fù)合樣品諸如血清的樣品體積的比率可以是介于例如，1∶150和1∶1之間。珠與樣品的比率越小，增加低豐度或稀少分析物品種的相對濃度的能力即越強。在恒定珠∶樣品體積為1∶10時，血清所使用的珠體積可以是至少介于0.0005ml和15mL的珠之間(包括0.020ml)。
在一個實施方式中，在與試驗樣品接觸之前，將結(jié)合部分與固體載體結(jié)合。在該可選的實施方式中，將固體載體僅與試驗樣品接觸一段時間，該時間足以使結(jié)合部分與分析物結(jié)合，然后將固體載體撤離試驗樣品，而分析物通過在分析物和結(jié)合部分之間形成復(fù)合體而被結(jié)合在固體載體上。
在一個實施方式中，結(jié)合部分包含接頭部分。在該實施方式中，以能使試驗樣品中存在的分析物與結(jié)合部分結(jié)合的方式將結(jié)合部分與試驗樣品直接接觸。經(jīng)過足夠的時間之后，包含針對結(jié)合部分的俘獲部分的互補俘獲部分的固體載體與試驗樣品接觸。這使得結(jié)合部分通過俘獲部分與固體載體結(jié)合，而保留了結(jié)合的分析物。
將結(jié)合部分與試驗樣品接觸可通過如下步驟實施，將二者混合，將試驗樣品拭抹在結(jié)合部分上，使試驗樣品流經(jīng)其上結(jié)合了結(jié)合部分的固體載體，以及對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的其它方法。將結(jié)合部分與分析物持續(xù)接觸一段時間，所述時間足以使得結(jié)合部分達(dá)到與樣品的結(jié)合平衡。在一般實驗室條件下，該時間至少是10分鐘。
固體載體[106]用于本發(fā)明的可接受的載體的種類非常廣泛。載體可以是可透過性的或不可透過性的。其可以是連續(xù)性的或非連續(xù)性的，撓性的或非撓性的。載體可以由多種材料制成，所述材料包括陶瓷、玻璃、金屬、有機高分子材料，或其組合。
優(yōu)選的載體包括有機聚合物載體，諸如顆粒化或珠化載體、編織網(wǎng)和非編織網(wǎng)(諸如纖維網(wǎng))、微孔纖維、微孔膜、空心纖維或空心管。還可以使用聚丙烯酰胺和礦物質(zhì)載體諸如硅酸鹽和碳酸鹽(例如，羥基磷灰石)。編織網(wǎng)和非編織網(wǎng)可以具有規(guī)則或不規(guī)則的表面物理構(gòu)型。尤為優(yōu)選的實施方式包括球形的載體或不規(guī)則形狀的珠或顆粒。
可以使用多孔材料，因為其能夠提供大的表面積。多孔載體可以是合成的或天然的、有機的或無機的。具有多孔結(jié)構(gòu)的適宜固體的孔徑是至少大約1.0納米(nm)而其孔體積是至少大約0.1立方厘米/克(cm3/g)。優(yōu)選地，孔徑是至少大約30nm，因為較大的孔對擴散的限制較小。優(yōu)選地，孔體積是至少大約0.5cm3/g，因為孔周圍較大的表面積會產(chǎn)生較大可能容量。優(yōu)選的多孔載體包括顆粒載體或珠載體，諸如瓊脂糖、親水性聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、礦物質(zhì)氧化物和Sepharose，包括球形和不規(guī)則形狀的珠和顆粒。
為獲得顯著的優(yōu)點，結(jié)合部分的載體優(yōu)選是親水性的。優(yōu)選地，親水聚合物是可水膨脹的以便使分析物得以更好的滲透。所述載體的實例包括天然多糖諸如纖維素、變性纖維素、瓊脂糖、交聯(lián)的葡聚糖、氨基變性的交聯(lián)葡聚糖、瓜爾膠、變性瓜爾膠、黃胞膠、豆角膠和水凝膠。其它實例包括交聯(lián)的合成親水聚合物諸如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)和修飾的聚乙二醇。
可以通過多種機制實施結(jié)合部分與固體載體的連結(jié)。可以通過將預(yù)先制備的結(jié)合部分與固體載體連結(jié)從而用完全制備的結(jié)合部分衍生固體載體。可選地，可以通過將前體分子與固體載體連結(jié)以及隨后在生長鏈(其通過第一前體分子與固體載體連結(jié))中加入另外的前體分子，從而在固體載體上形成結(jié)合部分。當(dāng)結(jié)合部分是聚合物，尤其是生物聚合物諸如多肽、多核苷酸或多糖分子時，這種將吸附劑構(gòu)建在固體載體上的機制尤為有用?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，通過連續(xù)地將單體組分(例如，氨基酸、核苷酸或單糖)添加至與固體載體相連的第一單體組分，從而得到生物聚合物吸附劑。例如參見，美國專利號5,445,934(Fodor et al.)。
例如，在特定實施方式中，組合文庫，各固體載體，例如各個珠，可僅具有一種結(jié)合部分與其連結(jié)(受組合化學(xué)的限制)。
但是，在另一實施方式中，各固體載體可結(jié)合多種不同的結(jié)合部分。例如，可以采用裂解-和-合并的方法制備肽組合文庫?？梢詫⑦@些肽從其結(jié)合的珠上剪切下來，混合，然后與新的珠組結(jié)合，而不通過珠對肽進(jìn)行任何分選。以這種方法，各個珠可結(jié)合多種不同的結(jié)合部分。由此，本發(fā)明提供了結(jié)合部分的組合文庫，其中組合文庫的多種不同成員與相同的固體載體相結(jié)合。少至一種而多至10、100、1000、10,000、1,000,000、1,000,000,000或更多種不同的結(jié)合部分可與單個固體載體相結(jié)合。在特定的實施方式中，固體載體的形式是珠，而單個的、不同類型的結(jié)合部分與各個珠相結(jié)合。例如，在肽結(jié)合部分文庫中，代表一種可能的氨基酸排列的肽與一個珠結(jié)合，而代表另一種可能的氨基酸排列的肽與另一個珠結(jié)合，等等。
可采用可逆性或不可逆性相互作用將結(jié)合分子與固體載體連結(jié)。例如，可以采用下述載體來實現(xiàn)不可逆的相互作用，所述載體包括與結(jié)合部分化學(xué)連結(jié)的(任選地通過間隔基團)至少一個反應(yīng)官能團，諸如羥基、羧基、巰基或氨基。適宜的官能團包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、磺酰酯、碘代乙?；⑷?、環(huán)氧、咪唑基氨基甲酸酯和溴化氰以及其它鹵素活性載體?？梢酝ㄟ^多種已知技術(shù)將所述官能團裝備至載體。例如，可通過已知的方式采用氨基丙基三乙烯乙醚衍生玻璃表面。在某些實施方式中，結(jié)合部分在合成期間與固體載體結(jié)合，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的(例如，固相肽和核酸合成)。
可選地，可以采用與固體載體和/或結(jié)合部分相連結(jié)的接頭部分，來實現(xiàn)固體載體與結(jié)合部分之間的可逆性相互作用。適用于本發(fā)明的多種接頭部分均是已知的，其中某些在上面已經(jīng)描述過。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，接頭部分用于連結(jié)不同的試劑的用途是眾所周知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用該公知技術(shù)僅通過常規(guī)試驗即可制備適用于本發(fā)明的固體載體/結(jié)合部分結(jié)合物。
微?；腆w載體[115]本發(fā)明優(yōu)選的實施方式采用小型、珠化、微?；腆w載體，其直徑小于1000μm，優(yōu)選小于100、10、1或0.1μm。所述載體通常通過機械碾磨或其它將較大珠減小為粉末一致性的方式制得。微粒化固體載體是合乎需要的，因為相對于較大的珠而言，微?；腆w載體的表面積和體積的比率增大。微?；腆w載體還減小了包含本發(fā)明的組合文庫時所需要的載體體積，由此可以使用更為復(fù)雜和有效的文庫。然而采用現(xiàn)有的設(shè)備，由于受到所用濾器系統(tǒng)的原料大小的限制，故難以在非常小(＜10μm)的珠上合成組合文庫。為了克服這一問題，可以在珠上大批量合成組合文庫，然后通過機械碾磨、粉碎或聲粉碎將其碎裂化，從而形成粉末或微粒的集合。
使用這些技術(shù)，可以制備與不同結(jié)合部分相連結(jié)的微粒化固體載體。這又可以廣泛地進(jìn)行混合從而形成相對于混合更大或多種大小的不同珠而言，更為均一的組成。
微粒化固體載體可與活性表面共價連結(jié)，通過環(huán)氧基團、N-羥基琥珀酰亞胺、二甲基3，3′-二硫代丙亞氨酸酯(dithiopropionimidate)或戊二醛以形成與組合文庫的配體形成化學(xué)鍵或與聚合物(配體在其上合成)的基礎(chǔ)基質(zhì)形成化學(xué)鍵，從而制成“試紙條“或芯片。這可以通過與肽文庫的N-端氨基交聯(lián)而得以實現(xiàn)。
在表面上的非反應(yīng)的交聯(lián)基團可與小化學(xué)物質(zhì)諸如巰基乙醇進(jìn)行反應(yīng)從而防止進(jìn)一步的反應(yīng)性。此外，還可對表面作進(jìn)一步處理從而防止蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。
與微?；腆w載體所連結(jié)的結(jié)合部分相結(jié)合的靶分子可采用一種或多種方法進(jìn)行洗滌，所述方法例如采用具有不同鹽濃度和pH的緩沖液而結(jié)合的蛋白質(zhì)被洗脫至具有低pH、低或高離子強度的溶液、強離液劑、乙腈/甲酸等中。
可以采用多種方法根據(jù)分子量針對洗脫的靶分子分析蛋白質(zhì)組成，所述方法例如包括，但不限于質(zhì)譜法、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳，或通過等電聚焦進(jìn)行pI。
可選地，可以通過電泳洗脫靶分子。在該實施方式中，可用適宜的溶液諸如Laemmli緩沖液浸泡包含結(jié)合的靶分子的微粒化固體載體，并用SDS-PAGE分析確定蛋白質(zhì)。可選的緩沖液可以包含脲，而蛋白質(zhì)可通過在等電聚焦凝膠中的電泳進(jìn)行分離。
可選地，微?；腆w載體可與填充劑混合并被壓制成片劑形式。以這種形式，可以將其直接加入樣品溶液或可替換地首先將其在緩沖液中懸浮。
可將微粒化固體載體置于溶液諸如瓊脂糖或丙烯酰胺中，并通過纖維上的交聯(lián)劑的聚合反應(yīng)而與凝膠自身交聯(lián)或彼此交聯(lián)從而形成整體柱物質(zhì)。
可選地微粒化固體載體可固定在粘合劑薄膜上。
另一方法是將微粒化固體載體包埋在多孔基質(zhì)中。所述基質(zhì)可包括能夠使顆粒在融解充氣階段整合至其中的非編織纖維或網(wǎng)。
可根據(jù)需要將微顆粒整合至單張膜或?qū)盈B膜之中以便獲得適宜的所需結(jié)合能力；其中微粒化固體載體通過壓延或水纏繞(hydroentanglement)而被包埋在層之間。
膜組成可以選自天然或合成來源，包括聚酯聚丙烯纖維網(wǎng)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本節(jié)所描述的多種技術(shù)通常可用于本發(fā)明的其它實施方式。
1.除去未結(jié)合的分析物[128]本發(fā)明的一個特征是根據(jù)本文所述方法的分析物的處理優(yōu)選除減小分析物濃度之間的差異之外濃縮并部分純化了結(jié)合的分析物。該特征的完全實現(xiàn)包括任選地將未結(jié)合的分析物與固體載體上的結(jié)合部分所結(jié)合的分析物洗滌分離。
優(yōu)選通過將結(jié)合部分所結(jié)合的分析物與溫和洗滌溶液相接觸來實施洗去未結(jié)合的分析物。溫和洗滌溶液意在除去通常見于初始包含分析物的試驗樣品中的污染物和未結(jié)合分析物。通常，洗滌溶液具有生理pH和離子強度而且在環(huán)境溫度和壓力條件下實施洗滌。
本領(lǐng)域技術(shù)人員無須過度試驗即可實施適用于本發(fā)明的洗滌溶液的制備。除去污染物的方法，包括低嚴(yán)緊性洗滌方法，已有報道，例如見于Scopes，ProteinPurificationPrinciples and Practice(1982)；Ausubel，et al.(1987和定期增刊)；Current Protocols in MolecularBiology；Deutscher(1990)″Guide to ProteinPurification″in Methods inEnzymology vol.182，以及該系列中的其它卷。
D.從結(jié)合部分分離俘獲的分析物[131]可以采用多種方法，優(yōu)選采用能夠破壞結(jié)合部分和分析物之間相互作用的水洗脫緩沖液從結(jié)合部分洗脫結(jié)合的分析物并進(jìn)行分離。任何適宜的洗脫緩沖液均可用于此目的，包括變性劑諸如離液劑和有機溶劑。示例性洗脫緩沖液包括具有非常低或高離子強度的鹽水溶液、去污劑溶液和有機溶劑。競爭性結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合部分的試劑的溶液和懸液也可用于洗脫緩沖液，只要所述競爭性結(jié)合試劑不妨礙隨后興趣分析物的收集或分析。所選擇的洗脫緩沖液具有高度的應(yīng)用特異性，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員通過公眾領(lǐng)域中一般可獲得的材料或通過常規(guī)試驗即可很容易地對其進(jìn)行鑒別(例如參見，ProteinPurificationPrinciplesand Practice(1982)；和Deutscher(1990)″Guideto Protein Purification″in Methods in Enzymology vol.182，以及該系列中的其它卷)。
典型的順序包括用氯化鈉洗滌(以便通過優(yōu)勢離子交換作用收集蛋白質(zhì))，然后使用乙二醇(主要通過疏水締合針對蛋白質(zhì)相互作用的洗脫液)，然后將pH降低至2.5(變性緩沖液)而最后使用鹽酸胍。
適宜的洗脫緩沖液的實例包括修飾分析物和/或結(jié)合部分的表面電荷的那些緩沖液，諸如pH緩沖溶液。用于通過修飾酸度而破壞表面電荷的PH緩沖溶液優(yōu)選是強緩沖液，足以將溶液的pH保持在酸性范圍，即，pH小于7，優(yōu)選小于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或3.0；或保持在堿性范圍內(nèi)pH大于7，優(yōu)選大于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、9.3、10.0或11.0。在特定實施方式中，洗脫緩沖液可包含9M脲pH為3、9M脲pH為11或6.66％MeCN/13.33％IPA/79.2％H20/0.8％TFA的混合物。一種方法對比另一種方法的選擇要依賴于用于均衡樣品的分析方法。
可選地，可以使用高鹽濃度溶液，該溶液具有充分的離子強度以便遮蔽分析物和/或結(jié)合部分的電荷特性。此時，尤為優(yōu)選的是具有多價離子的鹽，例如堿土金屬或過渡金屬平衡離子的硫酸鹽和磷酸鹽，雖然解離為一個或多個單價的鹽也適用于本發(fā)明，假若所得溶液的離子強度為至少0.1，優(yōu)選0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.75、1.0mol1-1或更高。舉例來說，多種蛋白質(zhì)分析物/結(jié)合部分相互作用對其環(huán)境的離子強度改變敏感。因此，可通過結(jié)合的分析物與鹽溶液(優(yōu)選無機鹽溶液諸如氯化鈉)接觸而將分析物與結(jié)合部分分離。這可以采用多種方法來完成，所述方法包括在洗脫緩沖液中水浴、浸透或浸漬固體載體，該載體上結(jié)合了分析物，或通過用洗脫緩沖液對固體載體沖洗、噴霧或洗滌。所述處理能夠從與固體載體結(jié)合的結(jié)合部分上釋放分析物。然后可以從洗脫緩沖液中回收所述分析物。
離液劑，諸如胍和脲，破壞圍繞結(jié)合部分和所結(jié)合分析物的水封結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致分析物和結(jié)合部分之間的復(fù)合解離。適于用作本發(fā)明的洗脫緩沖液的離液鹽溶液是應(yīng)用特異性的且本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)實驗進(jìn)行制備。例如，適宜的離液洗脫緩沖液可包含濃度范圍為0.1-9M的脲或胍。
基于去污劑的洗脫緩沖液從表面張力以及分子復(fù)合結(jié)構(gòu)的方面修飾親和性分子的選擇性。適宜用作洗脫緩沖液的去污劑包括離子型和非離子型去污劑。非離子型去污劑通過修飾溶液的介電常數(shù)而破壞分子間的疏水性相互作用，而離子型去污劑通常以傳遞均一電荷的方式遮蔽感受性分子，這導(dǎo)致被遮蔽的分子排斥相似地被遮蔽的分子。例如，離子型去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)以傳遞均一負(fù)電荷的方式遮蔽蛋白質(zhì)。非離子型去污劑的實例包括Triton X-100、TWEEN、NP-40和辛基-糖苷。兩性離子去污劑的實例包括CHAPS。
另一類通過修飾溶液的介電常數(shù)而破壞疏水性相互作用的去污劑類化合物包括乙二醇、丙二醇和有機溶劑諸如乙醇、丙醇、乙腈和甘油。
本發(fā)明優(yōu)選的洗脫緩沖液包括適用于質(zhì)譜儀的基質(zhì)物質(zhì)。基質(zhì)物質(zhì)可包括洗脫緩沖液中。本發(fā)明的某些實施方式可任選地包括將分析物從結(jié)合部分上直接洗脫至質(zhì)譜儀探針，諸如蛋白質(zhì)或生物芯片。在本發(fā)明其它實施方式中，所述基質(zhì)可與從結(jié)合部分上洗脫之后的分析物混合。而其它實施方式包括將分析物直接洗脫至SEND或SEAC/SEND蛋白質(zhì)芯片，該芯片包括預(yù)先置于蛋白質(zhì)芯片上的能量吸收基質(zhì)。在后者這些實施方式中，洗脫緩沖液中即無須存在其它基質(zhì)物質(zhì)。
適用于本發(fā)明的其它洗脫緩沖液包括上述緩沖液組分的組合。由兩種或多種上述洗脫緩沖液組分所制成的洗脫緩沖液能夠基于多種洗脫特性而修飾復(fù)合物亞單位之間分子相互作用的選擇性。
采用本發(fā)明分離的分析物所具有的分析物濃度范圍或分析物之間的濃度方差低于試驗樣品中初始存在的分析物濃度范圍或濃度方差。例如，相對于針對試驗樣品實施本文所述的任何方法之前試驗樣品中所存在的相同分析物之間的濃度方差而言，在采用本發(fā)明的方法進(jìn)行操作后，分離的分析物所具有的分析物濃度范圍或與其它分離的分析物的濃度方差降低至少兩倍，更優(yōu)選地降低10、20、25、50、100、1000或更多倍。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法以最小限量的洗脫緩沖液進(jìn)行實施，以確保洗脫緩沖液中分離的分析物的濃度最大化。更優(yōu)選地，洗脫緩沖液中至少一種分離的分析物的濃度大于先前在試驗樣品中的濃度。
在分離俘獲的分析物之后，可對該分析物進(jìn)一步進(jìn)行基于某些化學(xué)或物理特性諸如分子量、等電點或?qū)瘜W(xué)或生物化學(xué)配體的親和力的濃縮或分級分離處理。用于核酸、蛋白質(zhì)和多糖的分級分離方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如可見于Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；Sambrook et al.，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，(Sambrook)(1989)；以及CurrentProtocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel et al.，eds.，CurrentProtocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1994 Supplement)(Ausubel)。
E.檢測分離的分析物[142]在已將分析物洗脫并分離以使其不含結(jié)合部分之后，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何技術(shù)對分析物進(jìn)行檢測、定量或其它特征分析。將本發(fā)明的分析技術(shù)施用于復(fù)合試驗樣品的特征是相對于在初始試驗樣品中所檢測的大范圍的分析物濃度而言，所分離的分析物的濃度范圍發(fā)生動態(tài)性方差減小。分析物濃度范圍的這種減小能使，比較使用初始試驗樣品自身的分析物檢測可用的百分比而言，初始試驗樣品中所檢測的分析物大得多的百分比得以檢測和特征分析，而不需要重新校準(zhǔn)設(shè)備。實現(xiàn)分析物濃度范圍的實際減小需要依賴多種因素，所述因素包括包括初始試驗樣品的性質(zhì)和所用結(jié)合部分的性質(zhì)和多樣性。一般地，采用本文所述技術(shù)對分析物濃度方差的減小足以使至少25％，更優(yōu)選至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％分離的分析物得以檢測，而不需要重新校準(zhǔn)設(shè)備。理想上，本發(fā)明能使至少90％、95％、98％或更多分離的分析物得以檢測，而不需要重新校準(zhǔn)設(shè)備。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜方法實施對采用本文所述技術(shù)分離的分析物的檢測。例如，使用染料的比色測定的適用范圍非常廣泛?？蛇x地，可通過光譜法實施檢測。光譜檢測儀依靠的是反射率、紫外線和/或可見光吸收，或用適宜波長激發(fā)后的熒光中的變化來檢測反應(yīng)組分。示例性檢測方法包括熒光分析法，吸光度、反射率和透光度光譜法。雙折射、反射率或衍射中的變化還可用于監(jiān)測復(fù)合物形成或反應(yīng)進(jìn)程。檢測分子相互作用尤為有用的技術(shù)包括表面等離子共振、橢率檢測法、共振鏡技術(shù)、光柵偶聯(lián)波導(dǎo)技術(shù)和多極共振光譜法。這些技術(shù)以及其它技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，而且在無須過度試驗的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地將其應(yīng)用于本發(fā)明。例如，這些技術(shù)以及其它技術(shù)的多種方式可見于″Spectrochemical Analysis″Ingle，J.D.和Crouch，S.R.，Prentice HallPubl.(1988)以及″Analytical Chemistry″Vol.72，No.17。
優(yōu)選的檢測方法是質(zhì)譜分析法。質(zhì)譜分析技術(shù)包括(但不限于)離子化(I)技術(shù)諸如基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)，連續(xù)或脈沖電噴霧(ESI)和相關(guān)方法(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)，或大集束撞擊(massive cluster impact(MCI))；這些離子源可與檢測形式相匹配，所述檢測形式包括線形或非非線形反射飛行時間(TOF)、單個或多個四極子、單個或多個扇形磁場、傅立葉變換離子回旋共振(FTICR)、離子阱，及其組合(例如，離子阱/飛行時間)?？梢詫嵤┒喾N基質(zhì)/波長組合(MALDI)或溶劑組合(ESI)以便用于離子化。例如，采用ESI(Valaskovic，G.A.et al.，(1996)Science 2731199-1202)或MALDI(Li，L.et al.，(1996)J.Am.Chem.Soc.1181662-1663)質(zhì)譜法檢測分析物的Subattomole水平。ES質(zhì)譜法已經(jīng)由Fenn等(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申請?zhí)朩O 90/14148)提出而且在當(dāng)前綜述文章(R.D.Smith et al.，Anal.Chem.62，882-89(1990)以及B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry，SpectroscopyEurope，4，10-18(1992))中已經(jīng)總結(jié)了目前的用途。Hillenkamp等已經(jīng)提出了MALDI-TOF質(zhì)譜法(″Matrix Assisted UV-LaserDesorption/IonizationA New Approach to Mass Spectrometry of LargeBiomolecules，″Biological Mass Spectrometry(Burlingame andMcCloskey，editors)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，pp.49-60，1990)。采用ESI，由于存在可用于質(zhì)量計算的多個離子峰，故可以在飛克分子量的樣品中非常精確地測定分子量。本發(fā)明優(yōu)選的分析法使用表面增強凈解吸激光解吸/離子化(SELDI)，例如參照美國專利號6,020,208中所述。質(zhì)譜法是本發(fā)明的實施方式中尤其優(yōu)選的檢測方法，其中分析物的洗脫物直接置于質(zhì)譜儀的探針或生物芯片上，或其中洗脫緩沖液包含基質(zhì)物質(zhì)或在從結(jié)合部分上洗脫分析物之后與基質(zhì)物質(zhì)結(jié)合。
另一種廣泛使用的檢測方法是基于興趣分析物的一種或多種物理特性的電泳分離。分析多肽和蛋白質(zhì)分析物的特別優(yōu)選的實施方式是二-維電泳。優(yōu)選的應(yīng)用是通過在第一維中的等電點，以及通過第二維中的大小來分離分析物。用于分析物電泳分析的方法隨所研究的分析物而廣泛地變化，但用于鑒定適用于給定分析物的特定電泳方法的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
II.鑒定生物標(biāo)記[146]本發(fā)明的其它實施方式是采用上述珠化的結(jié)合部分來鑒定用于診斷疾病、感染或污染的生物標(biāo)記。生物標(biāo)記可以在上述任何樣品中鑒定，但優(yōu)選是從取自活體(最優(yōu)選是人)的諸如血、尿、腦脊液等的樣品中鑒定?？梢圆捎枚喾N方法來鑒定生物標(biāo)記。
“生物標(biāo)記”事實上可以是在生物樣品中存在的且可被分離的或可在生物樣品中檢測的任何生物化合物，諸如蛋白質(zhì)及其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂質(zhì)、核酸、有機或無機化合物、天然結(jié)合物和小分子。此外，生物標(biāo)記可以是整個的完整分子，或者其可以是完整分子的一部分，該部分可具有部分功能或例如可被抗體或其它特異性結(jié)合蛋白質(zhì)所識別。生物標(biāo)記可以是表位特異性抗體。如果生物標(biāo)記的可檢測方面與給定表型(諸如生命體中的特定疾病狀態(tài)，或水體中的污染水平)相關(guān)，則生物標(biāo)記即被視為有益的。例如，所述可檢測方面可以包括來自個體的生物樣品中生物標(biāo)記的存在、缺失或濃度，和/或其作為生物標(biāo)記圖譜一部分的呈現(xiàn)。生物標(biāo)記的所述可檢測方面在本文中稱為“特征”。例如，特征還可以是生物標(biāo)記的兩個或多個可檢測方面的比率，所述生物標(biāo)記可以具有或可以不具有已知的識別性?！吧飿?biāo)記圖譜”包括至少兩種所述特征，其中所述特征可與生物標(biāo)記(諸如核酸和糖)的相同或不同分類相對應(yīng)。生物標(biāo)記圖譜還可包括至少3、4、5、10、20、30或更多種特征。在一個實施方式中，生物標(biāo)記圖譜包括數(shù)百種，或甚至數(shù)千種特征。在其它實施方式中，生物標(biāo)記圖譜包括至少一種內(nèi)標(biāo)的至少一種可檢測的方面。
“表型”是生物體的可觀測的物理和生物化學(xué)特性，其由遺傳構(gòu)成和環(huán)境影響二者所決定?？蛇x地，在本發(fā)明的文中，表型還可以與自然的無生命方面相關(guān)聯(lián)，例如水體的表型包括水體可(物理地或化學(xué)地)檢測的那些方面。例如，湖泊的表型包括水溫、酸度、礦物質(zhì)含量、氧含量，無論其是否能夠維持生命以及何種生命形式。
“表型改變”是一種可以檢測的與給定表型相關(guān)的參數(shù)的改變。例如，表型改變可包括體液中生物標(biāo)記的增加或減少，，其中所述變化與疾病狀態(tài)相關(guān)。表型改變可進(jìn)一步包括患者的給定狀態(tài)的可檢測方面的改變，所述患者在生物標(biāo)記的可檢測方面無改變。例如，表型的改變可包括體溫、呼吸率、脈搏、血壓或其它生理學(xué)參數(shù)的可檢測改變。所述改變可借助臨床觀察和檢測采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行測定。如本文所使用的，“常規(guī)技術(shù)”是指可根據(jù)表型改變對個體進(jìn)行分類但不會獲得根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)記圖譜的那些技術(shù)。
采用所主張的發(fā)明來鑒定物種或組織中的診斷性生物標(biāo)記需要至少兩種生物樣品的可用性。所提供的生物樣品可以是如下形式對照組和試驗組、對照組和試驗個體，在不同的時間取自相同的個體或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的任何其它排列形式。
按照本文所述用珠化的結(jié)合部分文庫處理所得到的各個樣品。以這種方式，能夠檢測更多的推定生物標(biāo)記，如下面實施例部分所述。其發(fā)生的原因是因為所述結(jié)合部分縮窄了樣品中存在的分析物濃度范圍的方差，由此使低豐度和高豐度分析物均能得以檢測。
在用本發(fā)明的結(jié)合部分文庫處理之后，對于各個生物樣品，分別針對與所述結(jié)合部分相結(jié)合的分析物進(jìn)行洗脫和合并。然后分析合并的樣品以確定樣品中的任何共同分析物是否表現(xiàn)出差異表達(dá)(一種樣品中的表達(dá)增強比對其它樣品)，或者在一種樣品中表達(dá)而在其它樣品中無表達(dá)。表現(xiàn)出所述差異表達(dá)的分析物即可被視為針對在各生物樣品源之間觀察到的表型改變或差異的推定生物標(biāo)記。然后可以實施進(jìn)一步的統(tǒng)計學(xué)和分析檢測以便以所需確定度將該生物標(biāo)記與表型改變相關(guān)聯(lián)。
用于鑒定生物標(biāo)記的優(yōu)選分析性分析法是與上述用于一般鑒定分析物的那些方法相同的方法，所述分析物與本發(fā)明的結(jié)合部分相結(jié)合。
III.試劑盒[154]本發(fā)明還包括試劑盒，其含有能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本文所述技術(shù)的組分。為此目的，試劑盒最基本的要素是提供多種結(jié)合部分，每一種結(jié)合部分具有經(jīng)選擇的量以便俘獲預(yù)先確定量的不同分析物。在本發(fā)明的某些試劑盒實施方式中，提供了與固體載體，優(yōu)選不溶性珠結(jié)合的結(jié)合部分。在其它實施方式中，分別提供固體載體和結(jié)合部分。當(dāng)分別提供時，結(jié)合部分和/或固體載體包括俘獲部分，該部分能夠使本發(fā)明的操作者在實施本文所述發(fā)明期間將結(jié)合部分結(jié)合于固體載體。分別提供結(jié)合部分和固體載體的試劑盒可任選地提供實施結(jié)合部分與固體載體的結(jié)合反應(yīng)所需的其它試劑。
本發(fā)明的試劑盒還包括多種容器，該容器中含有用于樣品制備和分析物分離的組分。具有該特性的示例性組分包括一種或多種洗滌溶液，該溶液足以從特異性結(jié)合分析物的結(jié)合部分上除去未結(jié)合物質(zhì)，和至少一種洗脫溶液，該溶液足以釋放與結(jié)合部分特異性結(jié)合的分析物。
試劑盒實施方式可任選地包含在本發(fā)明的方法中使用結(jié)合部分的文庫的說明書。
雖然為了清楚和便于理解而通過例證和實施例的方式對上述發(fā)明給出了某些詳細(xì)的描述，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在本發(fā)明的教導(dǎo)下，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，作出等同物的特定變型、改變、修飾和替換是顯而易見的。故此，本文所描述的實施方式涉及的是多種修飾、改變等等，而本發(fā)明的范圍單獨地參照所附權(quán)利要求而確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地識別多種能夠變化、改變或修飾而產(chǎn)生基本上相似的結(jié)果的非關(guān)鍵參數(shù)。
雖然本文所描述的本發(fā)明的各個元素包含多個實施方式，但是應(yīng)當(dāng)理解的是(除非另有描述)，所給出的本發(fā)明的元素的各個實施方式能夠與本發(fā)明的其它元素的各個實施方式一同使用，所述各個使用方式的目的在于構(gòu)成本發(fā)明獨特的實施方式。
根據(jù)上述內(nèi)容可以理解，本發(fā)明的應(yīng)用非常廣泛的。通過以下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實施例僅為描述性的，并不意在以任何方式對本發(fā)明的定義和范圍進(jìn)行限制。
實施例實施例1人血清蛋白濃度范圍的減小[160]本實施例舉例說明了上述本發(fā)明的一種實施方式如何施用于復(fù)合生物樣品(在此例中是人血清)。在本實施例中，通過選擇性地將血清蛋白吸附至與不溶性珠結(jié)合的六肽來實現(xiàn)血清蛋白濃度方差的減小。在本例的結(jié)合部分群體(其形式為分拆、重組和合并的珠組合文庫)中，可以呈遞超過1×106種可能的六肽排列方式。以這種形式，高豐度血清分析物(諸如白蛋白)與六肽結(jié)合部分相結(jié)合，但其僅能達(dá)到與特定結(jié)合部分的飽和度相等的水平。相反，由于識別低豐度分析物的結(jié)合部分的量是非限制性的，故低豐度血清分析物幾乎全部被結(jié)合。該選擇性結(jié)合的結(jié)果導(dǎo)致由所用結(jié)合部分所識別的蛋白質(zhì)的分析物濃度范圍減小，而不會出現(xiàn)在意在選擇性地除去高豐度分析物的方法中，丟失固有的低豐度分析物的風(fēng)險。因此，使用所述方法分離的血清分析物的大部分可以在一種批量分析中進(jìn)行檢測，而無需重新校對檢測裝置。這與下述情況相反，即當(dāng)必須反復(fù)重新校準(zhǔn)檢測裝置以便檢測未處理的血清中相同分析物，從而在血清試驗樣品中檢測相同分析物時所出現(xiàn)的情況。在本實施例中，以4℃，14,000rpm離心30mL血清15分鐘，然后從上層小心地除去全部脂質(zhì)物質(zhì)。將所余血清通過0.8μm濾器過濾，然后通過0.45μm濾器過濾。保留500μl該過濾的血清作為非均一化對照樣品。將大約1mL六肽文庫(在20％甲醇中溶脹過夜，然后以含有140mM氯化鈉的20mM檸檬酸鈉緩沖液pH7過夜，然后洗滌3次以除去細(xì)小顆粒物質(zhì))等分加入三個重力流動柱的各個柱中。六肽文庫的各個等份與7.6mL等份的過濾血清于室溫下溫和攪動孵育2小時。孵育后，排干柱，收集的體積代表流通液(flow-through)。保留1mL的流通液用于分析。然后立即用20mL檸檬酸鹽緩沖液(20mM檸檬酸鈉，140mM氯化鈉，pH＝7)洗柱。另外收集第一個1mL的洗出液用于分析。洗滌后，從三個柱重復(fù)份的每個中除去若干個200uL等份的樹脂，然后按下述進(jìn)行處理。針對來自各個重復(fù)份的第一個200μL等份的樹脂，用200uL 2×LDS緩沖液+DTT還原劑(通過混合500uL 4×LDS，200uL 10×DTT，和300uLdH20制備)于90℃加熱該樣品10分鐘。該樣品冷卻后，將其以2,000rpm離心1分鐘。收集上清液，然后保存于-20℃以備1D-凝膠分析。針對來自各個重復(fù)份的第二個200μL等份的樹脂，用400uL 6M尿素以批量形式孵育該樣品1小時，伴以溫和攪動。然后2,000rpm離心該樣品1分鐘以形成片狀六聚物配體珠文庫，然后收集上清液用SELDI-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。針對來自各個重復(fù)份的第三個200μL等份的樹脂，用400uL 6M GuHCl以批量形式孵育樣品1小時，伴以溫和攪動。然后2,000rpm離心該樣品1分鐘以形成片狀六聚物配體珠文庫，然后收集上清液用SELDI-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
隨后在IMAC-Cu ProteinChip Arrays上對為了SELDI-質(zhì)譜儀分析而保留的全部樣品進(jìn)行處理。首先使用50uL 100mM CuSO4孵育5分鐘以便用Cu使表面帶電來制備IMAC陣列。在室溫下持續(xù)搖動從而完成孵育。孵育階段過后，用蒸餾水沖洗陣列以便除去過剩的CuSO4。然后用pH4.0 100mM醋酸鈉于室溫下持續(xù)搖動中和帶電的IMAC-Cu陣列5分鐘。孵育期過后，除去醋酸鈉并用蒸餾水沖洗IMAC-Cu陣列。然后對IMAC-Cu陣列預(yù)處理兩次，采用150ul結(jié)合緩沖液(0.1M NaPO4，0.5M NaCl，pH7)于室溫下持續(xù)搖動5分鐘。預(yù)處理后，除去這種緩沖液然后加入新的90ul等份的結(jié)合緩沖液，隨后加入10ul的來自均一化試驗的樣品(總孵育體積為100ul)。然后在IMAC-Cu陣列上持續(xù)搖動孵育樣品30分鐘。孵育后，除去過剩的樣品體積，然后用150uL結(jié)合緩沖液洗滌陣列三次；每次洗滌5分鐘并持續(xù)搖動。最終洗滌之后，用150uL蒸餾水沖洗IMAC-Cu陣列兩次，然后干燥。作為最終步驟，將1uL 50％飽和SPA(在50％乙腈，0.5％三氟乙酸中)加至各點，干燥，然后用額外的1ul 50％SPA重復(fù)添加基質(zhì)。該陣列隨后即可用于SELDI-質(zhì)譜儀的分析。
圖6-8中描述了均一化前后過濾血清的SELDI-質(zhì)譜的對比。樣品的質(zhì)譜分析顯示出，由于高豐度分子的減少還降低了能夠隱匿初始樣品中的峰的離子抑制作用，故此峰高度平緩增加而且可見峰的數(shù)目增加。預(yù)期這種方法將增加復(fù)合溶液(諸如血清)中可檢測分析物的數(shù)量，該增加的數(shù)量超過使用原始復(fù)合溶液(未施以本發(fā)明方法)的可檢測分析物數(shù)量至少0.5，更為可能的是1、2、3或更大的數(shù)量級。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有700,000種不同成員的六肽文庫對血清所產(chǎn)生的結(jié)果與具有6400萬種成員或300萬種成員的文庫所產(chǎn)生的結(jié)果相似。
表1蛋白的峰檢測，所述蛋白(S/N比＞3)來自未經(jīng)均一化珠處理的血清。所檢測的全部峰＝191M/z質(zhì)量 TOF 強度 MZ面積TOF面積 S/N2015.662014.6517.1776.4172127.900.542949.022036.482035.4717.2655.3084143.630.603840.642088.132087.1217.4822.244348.87 0.203317.282158.142157.1417.7711.12938.45 0.03468.762236.712235.7118.0901.459619.01 0.076511.412274.252273.2418.2402.647659.30 0.236720.782297.372296.3618.3321.759325.74 0.102113.842348.052347.0518.5321.194016.12 0.06329.442387.062386.0618.6851.054910.47 0.04088.382433.772432.7618.8651.12219.13 0.03528.952510.492509.4819.1591.170113.0S 0.04979.412548.372547.3619.3021.487917.14 0.064512.012588.132557.1319.4511.125324.23 0.09039.122645.662644.6519.6650.80166.61 0.02446.532672.542671.5319.7640.71007.81 0.02875.802701.932700.9219.8720.60591.89 0.00694.962714.042713.0319.9160.79675.25 0.01926.532744.232743.2220.0261.575315.67 0.056912.962765.832764.8220.1051.993335.32 0.127716.432798.602797.6020.2231.811417.06 0.061414.982822.572821.5620.3092.250528.31 0.101318.662841.992840.9820.3781.051513.66 0.04878.732874.682873.6820.4941.350116.29 0.057811.252882.132881.1220.5211.08527.18 0.02549.052986.192985.1920.8861.621816.72 0.058213.663008.503007.5020.9640.71472.51 0.00876.033035.733034.7221.0580.65884.37 0.01515.583051.053050.0421.1110.39481.66 0.00573.353069.953068.9521.1760.47391.33 0.00464.023092.473091.4721.2531.191816.40 0.056110.143114.573113.5621.3280.49971.64 0.00564.263151.053150.0521.4520.65135.28 0.01795.573164.533163.5221.4980.979311.19 0.03788.393232.233231.2221.7251.581318.92 0.063313.633243.483242.4721.7630.77216.38 0.02136.663298.213297.2121.9453.465436.61 0.121230.073313.893312.8821.9975.113576.84 0.253744.433333.833332.8222.0632.543237.75 0.124222.143384.923383.9122.2302.143265.06 0.212918.753407.633406.6322.3041.082412.54 0.04089.493429.513428.5122.3750.60493.05 0.00995.313452.913451.9022.4510.82047.29 0.02367.223476.393475.3822.5270.53344.42 0.01424.713503.263502.2522.6140.55242.93 0.00944.893511.643510.6322.6410.47322.83 0.00914.193528.973527.9622.6960.46205.10 0.01634.103546.063545.0622.7510.59736.70 0.02145.303568.263567.2522.8211.00349.59 0.03058.933590.143589.1422.8911.035632.09 0.10189.233623.823622.8122.9980.43373.89 0.01233.883637.243636.2323.0400.45136.62 0.02084.043694.923693.9123.2210.56095.95 0.01865.053729.433728.4223.3290.46382.79 0.00874.193764.533763.5223.4380.41741.51 0.00473.783805.093804.0923.5630.845910.90 0.03367.693823.323B22.3123.6191.705228.82 0.088615.543848.083847.0723.6951.086914.13 0.04339.933855.693854.6923.7190.84248.51 0.02607.703898.883897.8723.8502.373228.05 0.085421.773921.253920.2523.9191.157612.73 0.038710.643942.173941.1623.9820.56286.01 0.01825.183966.533965.5224.0560.55957.51 0.02275.163980.763979.7624.0990.49523.90 0.01184.58
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6740.826739.8131.2883.080358.810.137062.446763.086762.0731.3392.613947.310.110053.076832.176831.1731.50029.3327 769.05 1.7805598.616852.896851.8831.54812.8114 225.11 0.5200261.856873.746872.7331.5966.7676115.78 0.2670138.536895.966894.9531.6474.0495126.91 0.292083.036968.156967.1431.8132.646248.810.111954.546987.836986.8231.8589.1160179.49 0.4107188.177007.187006.1831.9023.506448.010.109772.487035.747034.7331.9672.817955.450.126558.377054.797053.7832.0112.611869.350.157854.187219.977218.9732.3856.0098205.68 0.4631126.187323.597322.5932.6171.450243.840.098030.687354.387353.3732.6860.841814.960.033417.857426.457425.4432.8470.25308.63 0.01925.397632.917631.9033.30225.1248 922.09 2.0212543.777697.487696.4733.4432.344094.170.205350.977781.997780.9833.6274.0191140.62 0.305287.957839.407838.3933.7522.065082.170.177645.387929.487928.4733.9460.406511.970.02578.998003.128002.1234.1040.617720.190.043213.748070.028069.0134.2470.740121.610.046116.548141.708140.6934.3992.318068.480.145452.098158.618157.60- 34.4351.667529.110.061737.528251.988250.9734.6330.32829.23 0.01957.438294.078293.0634.7211.229237.020.077927.938372.448371.4334.8860.574127.100.056813.128484.998483.9935.1210.37548.50 0.01778.658589.518588.5035.3382.4703105.46 0.218057.398651.758650.7535.4661.859159.080.121743.398713.508712.4935.5935.5491204.46 0.4198130.118756.818755.8035.6821.726552.130.106740.618833.418832.4035.8382.4403133.47 0.272457.738939.058938.0436.05322.2153 1128.34 2.2880529.759019.229018.2136.2162.398492.320.186257.549091.979090.9636.3622.3245113.49 0.228256.079144.699143.6836.4682.3181121.61 0.243756.149309.129308.1236.7963.6153148.49 0.295288.659374.689373.6836.9262.4549109.39 0.216760.499437.969436.9537.0512.7925165.50 0.326769.149516.919515.9037.2071.8864104.50 0.205546.999581.859580.8437.3341.305170.920.139032.679637.199636.1937.4431.011554.070.105625.439724.009722.9937.6120.375416.300.03179.509785.719784.7037.7320.28529.89 0.01927.259939.689938.6838.0290.747135.290.067919.2210063.40 10062.39 38.5674.5744203.31 0.3889118.8110144.76 10143.75 38.4220.569031.570.060114.8710273.13 10272.12 38.6660.763138.760.073420.1510497.57 10496.57 39.0890.278213.210.02477.4710561.30 10560.29 39.2080.408221.740.040611.0210635.46 10634.45 39.3460.593035.520.066116.1010718.48 10717.47 39.5000.904061.400.113924.7110802.36 10801.36 39.6560.859966.950.123623.6610921.46 10920.45 39.8750.437823.170.042612.1611046.41 11045.40 40.1040.13105.23 0.00963.6811147.95 11146.94 40.2890.15177.75 0.01414.2911431.94 1143.093 40.8021.560185.670.154245.1311515.49 11514.48 40.9523.4607316.45 0.5666100.7911667.57 11666.56 41.2235.1984534.22 0.9496153.2911874.61 11873.61 41.5900.899992.250.162626.9912135.29 12134.28 42.0470.347220.900.036510.6412213.21 12212.20 42.1830.192712.500.02175.9412421.55 12420.55 42.5430.417625.400.043813.1112553.09 12552.08 42.7700.392126.020.044612.4412837.97 12836.97 43.2550.705153.270.090422.9213035.41 13034.40 43.5890.225719.660.03317.4613517.28 13516.27 44.3931.7454207.59 0.343660.2013664.19 13663.19 44.6351.0656136.20 0.223937.2413826.26 13825.25 44.9010.933996.110.157233.1114005.24 14004.23 45.1934.3241437.10 0.7106155.8014103.83 14102.82 45.3532.4578213.14 0.345089.3614335.82 14334.81 45.7278.76321030.75 1.6560325.4714534.46 14533.45 46.0452.5813335.53 0.535197.6614717.09 14716.08 46.3350.8605197.18 0.311833.12
15187.2415186.2447.0750.443775.600.117717.8715657.4115656.4047.8030.08978.45 0.01303.7815820.3915819.3848.0530.08659.75 0.01493.7116443.6516442.6448.9970.119011.730.01765.4517066.0817065.0749.9231.3076165.52 0.244464.0517175.0817174.0750.0832.5670301.87 0.4434127.3017296.4817295.4750.2612.7701417.80 0.6109139.2817482.1017481.0950.5321.0341142.54 0.207253.1117766.5417765.5350.9440.6228131.11 0.189433.0817945.0217944.0151.2010.6698282.23 0.402636.3321092.5621091.5555.5430.1325101.64 0.134111.2623718.0523717.0458.9240.088365.370.081213.4125789.6225788.6261.4620.050934.020.040710.8327804.4627803.4563.8352.94971524.96 1.7606669.0328548.7628547.7564.6890.8053668.67 0.7571187.1231256.5731255.5667.7090.026014.770.01616.6132717.1732716.1769.2840.01807.30 0.00784.8134145.2534144.2470.7910.102484.340.087928.8334918.3834917.3771.5930.051138.330.039414.7837428.1637427.1674.1390.039467.810.067712.5539114.9339113.9275.8020.049357.700.056016.8041845.5441844.5478.4210.1089116.05 0.109740.1742589.2642588.2679.1200.090494.910.088333.6944703.9444702.9381.0730.054686.720.078820.9850260.9550259.9485.9960.019429.770.02558.0655322.5255321.5190.2500.1770349.83 0.285979.5265162.7065161.6997.9960.023772.940.055111.6469555.7069554.69101.264 0.020680.680.058410.4682925.1282924.12110.623 0.024673.370.049013.9389416.6589415.64114.894 0.006023.190.01483.4397397.9597396.94119.939 0.006312.810.00793.57110339.51 110338.50 127.698 0.005746.500.02633.26實施例2.文庫與未分級分離的、未稀釋的人混合血漿的孵育[164]為有助于分析復(fù)合樣品，本方法可用于減小濃度差異。人血漿是一種最復(fù)雜和難以分析的物質(zhì)蛋白質(zhì)存在的濃度范圍大于1010(Anderson和Anderson)；減小該范圍將有助于分析痕量蛋白質(zhì)。在該方法的條件下，與未經(jīng)處理的起始物質(zhì)相比，血漿與配體文庫的孵育將增加可檢測的并隨后可分析的蛋白質(zhì)的數(shù)量。
A.樣品制備[165]冷凍的、混合的人貧血小板血漿(PPP)于37℃下解凍，然后經(jīng)0.8和0.45μm濾器過濾。位于具有EA CA-Ala間隔子的Toyopearl650M氨基樹脂(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)上的，四個重復(fù)份的大約1ml六聚體肽配體文庫各自與9ml血漿于室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1小時。樹脂排干，然后用1ml檸檬酸鹽緩沖液(20mM檸檬酸鹽，140mM NaCl，pH 7.0)洗滌。保留該洗滌溶液，以及上樣血漿和起始流通的樣品。隨后用20個柱體積的檸檬酸鹽洗滌珠文庫。
100μl來自樣品2和4的樹脂與等體積(100μl)的2×LDS緩沖液+DTT(Invitrogen，Carlsbad，CA)在90℃下孵育10分鐘，然后離心。收集并保存上清液以備分析。
200μl來自重復(fù)份1-4的樹脂與400μl 6M GuHCl或400μl6M脲以批量形式孵育1小時。樹脂排干，然后收集流通液以備分析。在G-25柱上將洗脫液中GuHCl和脲的濃度減低至1M脲，步驟如下用200μl 1M脲5分鐘平衡G-25柱兩次，然后2000rpm離心3分鐘。在試管中加入20μl脲和GuHCl樣品，然后在相同的條件下再次離心。收集流通液。
B.LDS-PAGE分析[168]起始PPP、流通液和洗滌液用檸檬酸鹽緩沖液按1∶25稀釋，然后用2×樣品緩沖液按1∶2稀釋。14μl處理的GuHCl和脲上清液在5μl 4×LDS緩沖液+2μl DTT還原劑中于90℃加熱10分鐘。用大約10μl來自樣品2和4的珠上樣兩個孔。在MOPS緩沖液中，23μl的各個保留的樣品在4-12％Bis-Tris凝膠(NuPage，Invitrogen)上于200V進(jìn)行電泳。凝膠用Simply Blue(Invitrogen)按照廠商說明書進(jìn)行染色。結(jié)果顯示于圖1和圖4中。
經(jīng)過處理的樣品中存在若干條帶，這些條帶未能見于初始血漿中，而初始血漿中存在的非常明顯的白蛋白條帶(～64kD)基本上被減小了。這些結(jié)果表明，所述方法確實減少了蛋白質(zhì)的濃度范圍，如該方法所檢測到的，因此與初始物質(zhì)的分析相比，所述方法增加了可檢測和可分析的蛋白質(zhì)的數(shù)量。
實施例3.除去IgG后濃度方差的減小[170]在多種蛋白質(zhì)組應(yīng)用中，樣品制備的首要步驟之一是除去白蛋白和IgG，因為這些高豐度蛋白質(zhì)掩蔽了低豐度品種的檢測。然而除去這些蛋白，也常常除去了與它們相關(guān)的痕量品種，而且還會有樣品的損失。在分析前不需要除去IgG的樣品制備方法將會是有益的。本實施例表明，使在完整血漿中不能檢測的蛋白質(zhì)品種可視化并不需要除去IgG。在除去或未除去IgG的血漿中，比較了在LDS-PAGE中檢測到的蛋白質(zhì)圖譜。
A.樣品制備[171]冷凍的、混合的人貧血小板血漿(PPP)于37℃下解凍，然后經(jīng)0.8和0.45μm過濾器過濾。按照如下步驟除去血漿中的IgG在Bio-Rad柱中填充5ml Protein G Sepharose Fast-flow樹脂(Amersham，T&S)，以10cm/h流速(通過振動泵控制)加入10ml過濾的PPP，然后收集流通液。
位于具有EA CA-Ala間隔子的Toyopearl 650 M氨基樹脂(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)上的，大約1ml六聚體肽配體文庫與9ml流通液(如上)孵育1小時/室溫/旋轉(zhuǎn)。用手除去孵育期間形成的凝塊。樹脂排干，然后用1ml檸檬酸鹽緩沖液(20mM檸檬酸鹽，140mMNaCl，pH 7.0)洗滌，接著用10ml T-檸檬酸鹽(檸檬酸鹽緩沖液+0.05％Tween-20)和10ml檸檬酸鹽緩沖液洗滌。收集流通液和最初1ml的洗滌液以備分析。將樹脂大約分為3等份，每等份200μl。
一個樹脂等份與等體積(200μl)2×LDS緩沖液+DTT(Invitrogen，Carlsbad，CA)于90℃加熱10分鐘，然后離心。收集并保存上清液以備分析。剩余的樹脂等份與500μl 6M GuHCl或500μl 6M脲以批量形式孵育1小時。樹脂排干，然后收集流通液已備分析。
洗脫液中的GuHCl和脲濃度從6M減少至1M濃度，而一半的初始體積(2×濃縮的)在G-25柱上通過緩沖液交換。
B.LDS-PAGE分析[175]初始的PPP、除去IgG的PPP、流通液和洗滌液，以及GuHCl和脲上清液的樣品在LDS緩沖液+DTT還原劑中于90℃加熱10分鐘。LDS緩沖液、GuHCl和脲洗脫液的最終稀釋度分別為0.25x、lx和lx。PPP、除去IgG的血漿、流通液和洗滌液被稀釋為50X。ProteinG LDS和Glycine洗脫液與2×LDS緩沖液+DTT孵育。23μl各樣品在4-12％Bis-Tris凝膠上電泳，MOPS緩沖液，200V。根據(jù)上述方法先前所制備的血漿樣品(從中除去IgG)同樣進(jìn)行電泳。隨后通過SilverQuest按照廠商說明書使用Simply Blue對凝膠染色。數(shù)據(jù)顯示于圖2中。
雖然開始時，流通液和洗滌液樣品的MW 50和25 KDa的蛋白質(zhì)(減少的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的大小)有明顯的減少，但如凝膠所示，來自包含和不包含IgG的血漿的LDS-PAGE洗脫液中均沒有顯著性差異。由于樣品處理的問題，來自脲和GuHCl樣品的信號是不明顯的。這些數(shù)據(jù)表明除去IgG的影響不明顯。優(yōu)選除去和保留IgG可能是為了其它的原因，或許是為了獨立分析；但是，對于通過該方法分析痕量蛋白而言，并不需要除去IgG。
實施例4.人血清中蛋白質(zhì)濃度范圍的減小[177]前面的實施例已表明所述方法可用于未稀釋和未分級分離的人血漿的用途。在臨床診斷中起始樣品通常是血清，而非血漿。下面的實施例表明使用所述方法制備血清用于分析的可行性。
A.血清制備[178]5個7ml裝有人血的試管在4℃過夜使其凝固成血塊。凝固的血塊在Sorvall離心機RT7中4,000rpm離心5分鐘，收集血清，然后經(jīng)0.8和0.45μm濾器過濾。
B.樣品制備1.基于TentaGel的文庫孵育[179]將250μl TentaGel文庫[含有Gly間隔子的TentaGel MNH210μm(Rapp Polymer)文庫(Peptides International，Louisville，KY)平均直徑10μm，～5.6×108珠/ml]置于15ml錐形管中與2.25ml(1∶9v/v)血清在室溫(RT)下孵育1小時。4000rpm離心樹脂2分鐘，然后保存上清液以備分析(FT Tenta)。用1.25ml檸檬酸鹽緩沖液搖動洗珠，然后在2ml Eppendorf管中4,000rpm離心2分鐘。保留洗滌液用于分析(W Tenta)。再加入4×1.25ml檸檬酸鹽緩沖液洗珠。將珠分成3等份，每等份大約75μl。
一個樹脂等份與75μl 2×LDS/DTT于90℃孵育10分鐘。離心珠，然后將上清液保存于-20℃。其它等份與200μl 6M脲或6MGuHCl于RT下孵育1.5小時。初始及未結(jié)合的血清部分用檸檬酸鹽按1∶25稀釋，然后用2×LDS/DTT按1∶2稀釋。樣品于90℃加熱10分鐘，然后冷凍于-20℃。
2.基于Toyopearl的文庫孵育[181]將大約1ml Toyopearl文庫(平均直徑65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)與9ml血清孵育1小時/RT/旋轉(zhuǎn)。200μl樹脂在200μl 2×(LDS緩沖液+DTT還原劑)中于90℃加熱10分鐘。收集上清液并保存于-20℃以備分析。200μl樹脂與400μl(v/v)6M脲以批量形式孵育1小時。收集流通液以備分析并保存于室溫下。200μl樹脂與400μl 6M GuHCl以批量形式孵育1小時。收集流通液以備分析并保存于室溫下。初始及未結(jié)合的血清部分用檸檬酸鹽按1∶25稀釋，然后用2×LDS/DTT按1∶2稀釋。樣品于90℃加熱10分鐘，然后冷凍于-20℃。200μl血清和200μl各未結(jié)合部分交付于Analytical Chemistry分析。
C.LDS-PAGE分新[182]14μl的1M脲和GuHCl樣品用5μl 4×LDS緩沖液和2μl10×DTT于90℃加熱10分鐘。冷凍的LDS樣品于90℃再加熱10分鐘。在4-12％Bis Tris凝膠中每孔上樣各樣品20μ1。凝膠用MOPS電泳緩沖液于200V進(jìn)行電泳，直至染料前端到達(dá)凝膠底部。根據(jù)廠商說明書用Simply Blue蛋白質(zhì)染色劑染色凝膠，然后用H2O脫色。凝膠顯示于圖3中。
用文庫孵育后，血清中可見條帶的數(shù)目有實質(zhì)性增加(泳道2與3和8相比)。條帶的圖譜與使用血漿孵育文庫所得圖譜非常相似(泳道3，圖3與泳道7，圖1相比)。這些結(jié)果表明用本發(fā)明的方法制備的血清樣品增加了可用LDS-PAGE分析的條帶的數(shù)目，而且與初始血清相比，洗脫液中大部分高豐度蛋白質(zhì)的濃度減小。
雖然為了清楚和理解而通過例舉說明和實施例的方式已經(jīng)對上述發(fā)明作出了某些細(xì)節(jié)描述，但對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，在本發(fā)明的教導(dǎo)下在不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍的情況下可對其作出特定的變化和修改。
正如具體地而且獨立地將各個獨立出版物或?qū)＠暾堃胱鳛閰⒖家粯?，本說明書中所引用的全部出版物和專利申請均被引入此處作為參考。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第一濃度范圍存在于所述第一樣品中；(b)將所述第一樣品與包含至少100種不同的結(jié)合部分的一定量文庫接觸；(c)以所述不同的結(jié)合部分從所述第一樣品中俘獲一定量的不同分析物品種以及除去未結(jié)合的分析物品種；和(d)從所述結(jié)合部分上分離所俘獲的分析物品種從而產(chǎn)生第二樣品，該樣品中包含多個不同的分析物品種，所述分析物品種以第二濃度范圍存在于所述第二樣品中；其中所述文庫的量經(jīng)過選擇以便俘獲一定量的不同的分析物品種從而所述第二濃度范圍低于所述第一濃度范圍。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一樣品包含至少100、至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的分析物品種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述文庫包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000種不同的結(jié)合部分。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合部分包括生物有機聚合物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合部分與固體載體或多個固體載體結(jié)合。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述文庫是非選擇性文庫。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述不同的結(jié)合部分包含在完全或不完全的組合文庫中。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二樣品所具有的分析物品種多樣性基本上與所述第一樣品的相同。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品選自羊水、血、腦脊液、關(guān)節(jié)內(nèi)液、眼內(nèi)液、淋巴液、乳液、汗液、唾液精液、精漿、血清、痰液、滑液、淚液、臍帶液、尿液、活檢組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿液、條件培養(yǎng)液、發(fā)酵液、組織勻漿液及其衍生物。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括檢測所述第二樣品中的分析物品種。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中未結(jié)合的分析物的除去包括采用洗滌緩沖液洗滌所述俘獲的分析物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物選自多肽、核酸、復(fù)合糖、復(fù)合脂質(zhì)、合成無機化合物和合成有機化合物。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括基于物理或化學(xué)特性分級分離所述第二樣品中的分析物。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括鑒定至少一種所述分離的分析物。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將生物特異性結(jié)合部分與所述第二樣品接觸以及測定所述生物特異性結(jié)合部分是否從所述第二樣品中俘獲了分析物品種。
16.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述生物有機聚合物選自肽、寡核苷酸和寡糖。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合部分選自抗體和核酸適體。
18.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述固體載體或多個固體載體是珠或顆粒的集合。
19.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述固體載體或多個固體載體選自纖維、整體柱、膜和塑料條帶。
20.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述非選擇性文庫選自生殖系抗體文庫、重組結(jié)合蛋白質(zhì)的噬菌體展示文庫、染料文庫或非組合性文庫，其中成員的結(jié)合特異性為非預(yù)先選擇的、組合文庫及其部分。
21.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組合文庫是六肽文庫。
22.如權(quán)利要求10所述的方法，其中采用選自比色、光度、磁共振、橢偏光、質(zhì)譜、電泳、色譜、酶性和序列分析的方法對所述分析物進(jìn)行檢測。
23.如權(quán)利要求13所述的方法，其中分級分離包括采用選自色譜法、電泳、毛細(xì)電泳、過濾和沉淀的方法分離所述分析物。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其中各個珠或顆粒連結(jié)于基本上不同的結(jié)合部分。
25.如權(quán)利要求18所述的方法，其中多個不同的結(jié)合部分連結(jié)于相同的珠或顆粒。
26.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述珠或顆粒的直徑小于1μm。
27.如權(quán)利要求18所述的方法，其中采用選自粉碎、磨碎和聲波破碎的方法將所述珠或顆粒制成磨碎的微?；?。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述微?；槭怯商烊换蚝铣删酆衔镄纬傻木酆衔锘|(zhì)。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述顆粒與第二固體載體連結(jié)從而形成陣列或試紙條。
30.一種用于檢測樣品中多種分析物的試劑盒，包括(i)含有至少100種不同結(jié)合部分的文庫的容器；和(ii)使用所述文庫實施權(quán)利要求1所述方法的說明書。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述結(jié)合部分與固體載體或多個固體載體連結(jié)。
32.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述文庫包括六肽組合文庫或其部分，其中所述六肽與顆粒連結(jié)。
33.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于以所述結(jié)合部分俘獲分析物的結(jié)合緩沖液。
34.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于從結(jié)合部分上洗脫所述俘獲的分析物的洗脫緩沖液。
35.一種包含至少100種不同的結(jié)合部分的文庫，其中多種不同的結(jié)合部分與相同的固體載體或多個固體載體連結(jié)。
36.如權(quán)利要求35所述的文庫，其中所述結(jié)合部分包括組合六肽文庫或其部分。
37.一種鑒定診斷性生物標(biāo)記的方法，該方法包括以下步驟(a)提供來自具有第一表型的第一組生物體的第一組生物樣品；(b)提供來自具有第二表型的第二組生物體的第二組生物樣品；(c)對各個所述的生物樣品實施權(quán)利要求1所述的方法，由此分別產(chǎn)生第三和第四組生物樣品；(d)在第三和第四組生物樣品的各個樣品中檢測分析物品種；(e)鑒定在第三和第四組生物樣品中存在不同的至少一種分析物品種，由此該至少一種分析物品種為用于區(qū)分第一表型和第二表型的生物標(biāo)記。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中步驟(e)包括鑒定生物標(biāo)記圖譜以便提供較所述圖譜中任一生物標(biāo)記單獨所具有的預(yù)測力更佳的預(yù)測力。
39.一種減小樣品中分析物的相對量的方法，包括以下步驟(a)提供第一樣品，該樣品包含第一的多種不同的分析物，所述分析物具有第一量方差；(b)將所述第一樣品與多種不同的結(jié)合部分接觸，各結(jié)合部分的存在量均為已確定的；(c)以所述不同的結(jié)合部分從第一樣品中俘獲一部分第一的不同的分析物以及除去未俘獲的分析物；和(d)從所述結(jié)合部分上分離所述俘獲的分析物從而產(chǎn)生第二樣品，該樣品中包含第二的多種不同的分析物，所述分析物具有第二量方差其中多種不同結(jié)合部分的各結(jié)合部分的所述已確定的量經(jīng)過選擇以便俘獲一定量的所述不同的分析物由此所述第二量方差小于第一量方差。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、組合化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明描述了用于在動力學(xué)上降低取自復(fù)合混合物的分析物之間方差的方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1997284SQ200580016558
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月23日
發(fā)明者E·博斯徹蒂, D·哈蒙德 申請人:賽弗吉生物系統(tǒng)有限公司, 美國國家紅十字會