專利名稱：低密度脂蛋白中膽固醇的多重定量方法
技術領域：
本發(fā)明涉及同時測量生物樣品中作為被分析物的低密度脂蛋白中膽固醇和總膽固醇的方法，特別涉及可以穩(wěn)定用于測量的液體試劑的方法。
背景技術：
低密度脂蛋白(以下稱作“LDL”)在血液膽固醇運輸中起主要作用，特別是，在動脈粥樣硬化病例中血管壁上沉積的絕大部分膽固醇來自LDL。LDL膽固醇的增加是動脈粥樣硬化疾病的主要危險因素，因此在臨床上對其選擇性定量是很有用的?？偰懝檀紲y量包括測量所有的脂蛋白，例如乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、LDL以及高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇，總膽固醇測量仍然是脂類檢驗的主要項目。
定量LDL膽固醇的常規(guī)方法包括一種包含分級分離和膽固醇定量兩個操作的方法以及基于總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯值依照Friedewald方程通過計算的定量方法。
對于分級分離，包括了諸如超速離心、沉淀和免疫學技術的方法。這些方法需要通過離心或過濾處理樣品，考慮到便利和經(jīng)濟的原因，很難在實驗室檢驗部門推廣應用?；贔riedwald方程的計算方法因不考慮個體變異，所以在精確度上有問題，限制了其使用。
近來，業(yè)已報道了不需要分級分離的定量LDL膽固醇的方法(特開平11-318496號公報)，其在檢驗作為臨床檢驗用試劑時適用。該方法包括第一步，選擇性除去樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇(“除去”意思是降解酯型膽固醇，并使降解產(chǎn)物在第二步中不被檢測到)，以及第二步定量LDL膽固醇。
盡管上述用于LDL膽固醇測量的試劑在臨床上很有用，但是該試劑并沒有得到廣泛使用，這是因為一直廣泛地進行總膽固醇的常規(guī)測量，并且可以通過Friedewald方程等測定LDL膽固醇水平。然而，如上所述，通過Friedewald方程測定的LDL膽固醇水平存在問題，并且，LDL膽固醇水平的精確測量具有臨床意義。因此，期望進一步改進該試劑，由此推廣使用臨床意義高的測量LDL膽固醇的試劑。
另一方面，下述文獻中披露了僅用一次測定連續(xù)測量HDL中膽固醇和總膽固醇以及LDL中膽固醇和總膽固醇的方法(特表2003-501630號公報)。在該方法中，將樣品放入試管中，使樣品中非HDL膽固醇和抗apoB抗體之間形成復合物，并測量未參與形成復合物的脂蛋白，即HDL。接著，用表面活性劑解離復合物，并通過酶測定剩余的非HDL膽固醇?？赏ㄟ^將兩次測量獲得的值加起來得到總膽固醇水平。就LDL膽固醇來說，使用了類似的反應方法，其中在復合物形成時使用的是抗apoA-I或抗apoA-II抗體而非抗apoB抗體。常規(guī)測量HDL膽固醇、LDL膽固醇和總膽固醇在醫(yī)學檢查等領域中廣泛應用，因此，同時測量HDL膽固醇、LDL膽固醇和總膽固醇很有意義。
專利文件1特開平11-318496號公報專利文件2特表2003-501630號公報發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種抑制下述試劑自發(fā)顯色的穩(wěn)定化方法，所述試劑用于通過一次測定同時定量LDL膽固醇和總膽固醇。該方法作為一種多重定量方法，其中僅用一次測量就可獲得多個項目的定量值。
鑒于最近引起注意的LDL膽固醇的精確測量的重要性，以及通常已知的總膽固醇測量的重要性，本發(fā)明人堅持不懈地研究以建立同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的系統(tǒng)。
本發(fā)明人已開發(fā)了一種能同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的方法(特愿2002-362970，PCT/JP03/15995)。該方法包括在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑存在下，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于脂蛋白，通過將所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料來測量除LDL外的脂蛋白中膽固醇，隨后添加至少作用于LDL的表面活性劑，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于殘留的LDL，并通過將所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料來測量LDL膽固醇，在此可通過對上述兩次測量值求和計算總膽固醇值。該方法是一種有效的多重定量方法，其中僅用一次測量就可獲得多個項目的定量值。但是，在該方法中，存在于第一試劑中的、產(chǎn)生醌染料的成分以液體試劑的形式使用，因此該試劑被空氣氧化，帶來了自發(fā)顯色和液體試劑缺乏穩(wěn)定性的問題。
因此，本發(fā)明人堅持不懈地針對用于僅用一次測量就能同時定量LDL膽固醇和總膽固醇的試劑的穩(wěn)定性進行研究，終于找到了一種通過抑制在同時測量LDL膽固醇和總膽固醇的方法中所用試劑自發(fā)顯色來穩(wěn)定地測量LDL膽固醇和總膽固醇的可靠方法。
在先前的定量方法中，對樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇進行酶促反應以檢測膽固醇的步驟在第一步進行。但是，在本發(fā)明的定量方法中，該步驟得到改進以便能檢測除LDL外的脂蛋白中膽固醇的酶促反應，其在第一步、第二步的早期進行并在隨后檢測LDL膽固醇的酶促反應。


圖1顯示了本發(fā)明的原理。如圖1所示，本發(fā)明的方法包括兩個步驟。在第一步中，基于樣品中除LDL外的脂蛋白中膽固醇的反應產(chǎn)生了過氧化氫。在第二步中，由第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫引起發(fā)生反應溶液吸光度的改變，隨后發(fā)生了基于LDL中膽固醇的反應，并測量由于上述反應的反應溶液吸光度的改變。第二步中吸光度的改變總量相應于總膽固醇量，而關相對于第二步中所產(chǎn)生的過氧化氫量的吸光度的改變量則相應于LDL膽固醇量。通過改變在測量這種吸光度改變時自動分析儀的分析條件，可僅用一次測量就可同時進行多項的測量。
在常用的多重定量方法中，大多數(shù)與醌染料形成相關的試劑組合物整合到測量第一步所使用的第一試劑中。另一方面，在本發(fā)明方法中，因為醌染料僅在第二步形成，所以大多數(shù)與醌染料形成相關的試劑組合物能與第一步所使用的第一試劑和第二步所使用的第二試劑分開，故抑制了由于試劑空氣氧化所致的自發(fā)顯色。因為抑制試劑自發(fā)顯色變得可能，所以試劑能得到穩(wěn)定，因此能可靠地測量膽固醇。
當使用自動分析儀在各種可以設定的測量條件下執(zhí)行本發(fā)明方法時，可在多項分析中設定分析儀的測量條件，即根據(jù)第二步中吸光度總的改變來定量總膽固醇。另一種測量條件是在第二步中添加第二試劑后，根據(jù)兩點間(在添加第二試劑后吸光度剛快速改變后的點和反應終點之間)吸光度的差值定量LDL膽固醇。
即，本發(fā)明如下。
一種僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，包括處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步；和轉化第一步中所獲得的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以及轉化所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料的第二步，其中所述醌染料并不在第一步形成，并僅用一次測量根據(jù)第二步中形成的醌染料的量定量低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇；[2][1]的方法，其中與醌染料形成相關的試劑組合物包括4-氨基安替比林、酚類和苯胺類氫供體化合物以及過氧化物酶；在第一步中添加4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)、酚類(phenolic)和苯胺類氫供體化合物(anilinic hydrogen donor compound)中的任何一種；在第一步中沒有添加的試劑組合物在第二步中添加；[3][1]或[2]的方法，其中在第一步中，在作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑存在下，使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫；并在第二步中，在至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑存在下使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫；[4][1]-[3]任一的方法，其中在第二步中，第一步獲得的過氧化氫被轉化為醌染料；將至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑添加到測量系統(tǒng)中；使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于測量系統(tǒng)中殘留的低密度脂蛋白；并通過轉化為醌染料測量所產(chǎn)生的過氧化氫；[5][1]-[4]任一的方法，其中基于下述的兩個值同時測量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的量，所述的兩個值為作為反映存在的總膽固醇量的測量值的第二步中吸光度的改變總量，以及作為反映低密度脂蛋白中存在的膽固醇量的測量值的相對于第二步中所產(chǎn)生的過氧化氫量的吸光度改變量。
[1]-[5]任一的方法，其中第二步中吸光度的改變顯示了兩階段的增加，其中在添加第二試劑后的快速增加和隨后的緩速增加；根據(jù)后面吸光度的緩速改變量定量低密度脂蛋白中膽固醇；[7][1]-[6]任一的方法，其中根據(jù)第二步中總的吸光度的改變量定量總膽固醇； [1]-[7]任一的方法，其中在不同的測量條件下，使用供臨床化學檢驗用的自動分析儀僅用一次測量來進行分析；[9]一種穩(wěn)定僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇方法中的液體試劑的方法，所述定量方法包括添加第一試劑以處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步，和添加第二試劑以轉化第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫以及轉化為醌染料的第二步，其中在第一步中添加的第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物中的任意一種；和在第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物；[10]一種穩(wěn)定[1]-[8]任一的方法中的液體試劑的方法，其中在第一步中添加的第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物中的任意一種；和在第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物；[11][9]或[10]的方法，其中在第一試劑中還含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶；在第二試劑中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑；[12]一種用于僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇方法的試劑盒，所述定量方法包括添加第一試劑以處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步，和添加第二試劑以轉化第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫以及轉化為醌染料的第二步，其中第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物中的任意一種；和第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物；[13][12]的試劑盒，其中在第一試劑中還含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶；在第二試劑中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑。
通過本發(fā)明的方法，在僅用一次測量同時定量LDL膽固醇和總膽固醇的方法中使用的試劑能穩(wěn)定地保持為液體狀態(tài)，使得由于空氣氧化所致的自發(fā)著色無法發(fā)生。此外，僅用一次測量就能可靠地測量LDL膽固醇和總膽固醇。
本說明書包含了描述于本申請優(yōu)先權所基于的JP專利申請?zhí)?004-106006說明書或附圖或兩者中的內(nèi)容。
附圖簡述圖1顯示的是本發(fā)明多重定量方法的原理；圖2顯示的是用本發(fā)明多重定量方法測量的LDL中膽固醇水平和獨立測量的LDL中膽固醇水平之間的相關性；以及圖3顯示的是用本發(fā)明多重定量方法測量的總膽固醇水平和獨立測量的總膽固醇水平之間的相關性。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明是一種同時測量生物樣品中的LDL中膽固醇和總膽固醇的方法，其中僅用一次測量定量生物樣品中所含的LDL中膽固醇和總膽固醇，利用了通過處理脂蛋白形成的作為指示劑的染料的吸光度。此外，本發(fā)明是通過阻止空氣氧化所致的試劑自發(fā)顯色以增強試劑或試劑組合物穩(wěn)定性且甚至當試劑放置一段長時間時仍能獲得可靠結果的方法。在本發(fā)明的方法中，通過處理生物樣品中的脂蛋白產(chǎn)生過氧化氫，接著將過氧化氫轉化為醌染料，并測量醌染料的吸光度，由此測量生物樣品中脂蛋白所含有的膽固醇。本發(fā)明的方法包括其中處理生物樣品中除LDL外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步和其中轉化第一步獲得的過氧化氫為醌染料并處理殘留的LDL以產(chǎn)生過氧化氫以及將過氧化氫轉化為醌染料的第二步。也就是說，在本發(fā)明的方法中，在不同的步驟中分別處理除LDL外的脂蛋白和LDL，并在一個步驟中將處理產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料并檢測所形成的醌染料。在此，處理脂蛋白指用表面活性劑和酶處理脂蛋白。當用表面活性劑處理脂蛋白時，釋放了脂蛋白中的膽固醇。當用酶(膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶)處理脂蛋白時，產(chǎn)生了過氧化氫。也就是說，處理脂蛋白包括一系列的處理，其中釋放了脂蛋白中的膽固醇，且還從膽固醇產(chǎn)生了過氧化氫。此外，處理膽固醇還指通過用酶處理所釋放的膽固醇產(chǎn)生過氧化氫。隨后用過氧化物酶將所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料。在本發(fā)明中，“試劑”指含有試劑組合物的產(chǎn)品，以及“試劑組合物”指組成所述試劑的物質(zhì)，例如表面活性劑和酶。
在第一步中，用表面活性劑和酶處理生物樣品中除LDL外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫。因為在第一步中使用的第一試劑中并不包含與醌染料的產(chǎn)生相關的一組試劑組合物，所以產(chǎn)生的過氧化氫并不轉化為醌染料。在第二步中，用表面活性劑和酶處理LDL，通過該反應才產(chǎn)生過氧化氫。當?shù)诙街惺褂玫牡诙噭┨砑拥綔y量系統(tǒng)時，在該測量系統(tǒng)中就含有了與醌染料的產(chǎn)生相關的該組試劑組合物，由此處理了LDL中的脂蛋白，同時發(fā)生了轉化測量系統(tǒng)中所存在的過氧化氫為醌染料的反應。當?shù)诙介_始時，第一步中已形成的產(chǎn)生自除LDL外的脂蛋白中的膽固醇的過氧化氫存在于測量系統(tǒng)中，在第二步開始的同時所述過氧化氫轉化為醌染料。另一方面，隨著上述醌染料的產(chǎn)生，第二步中通過處理LDL產(chǎn)生的過氧化氫平行轉化為醌染料。隨著用酶處理膽固醇時間的延續(xù)，第二步中通過處理LDL產(chǎn)生的過氧化氫增加了。因為第二步中通過處理LDL產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料，所以醌染料隨時間的延續(xù)也得以增加了。第二步剛開始后由于醌染料的吸光度改變反映了第一步中產(chǎn)生的過氧化氫量，即除LDL外的脂蛋白中存在的膽固醇量。當?shù)诙浇Y束時由于醌染料的吸光度改變則反映了第一步中產(chǎn)生的過氧化氫量和附加的第二步中產(chǎn)生的過氧化氫量，即LDL中的膽固醇量。換句話說，第二步中吸光度的總改變作為反映生物樣品中存在的總膽固醇量的測量值，第二步中產(chǎn)生的過氧化氫量的吸光度改變則作為反映LDL中存在的膽固醇量的測量值?；谶@兩種吸光度改變，即第二步中吸光度總改變和關于第二步中產(chǎn)生的過氧化氫量的吸光度改變，可以同時測量生物樣品中所含的LDL中的膽固醇和總膽固醇。在本發(fā)明的方法中，在第一步和第二步中使用了不同的試劑。通過詳細描述這兩種試劑的成分分組，可得到與醌染料形成、試劑自身穩(wěn)定相關的主要試劑組合物，且在膽固醇測量方法中亦可獲得可靠結果。試劑組合物指進行化學反應所必需的試劑組合物的成分，例如于特定化學反應或緩沖液或兩者相關的試劑。在本發(fā)明方法中，可獲得以液體提供的穩(wěn)定的液體試劑。在過氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚類或苯胺類氫供體化合物存在下，通過處理膽固醇產(chǎn)生的過氧化氫形成為一種有色醌(醌染料)。當過氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚類或苯胺類氫供體化合物以混合的液體狀態(tài)存在于試劑中時，由于空氣氧化作用隨時間的延續(xù)形成了醌染料，甚至當不存在過氧化氫時，試劑也發(fā)生自發(fā)著色。因此，無法保持用于測量膽固醇的試劑或試劑組合物的穩(wěn)定性，也就無法保證能進行可靠的膽固醇測量了。在本發(fā)明中，所有的過氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚類或苯胺類氫供體化合物不允許同時存在于這兩種試劑的任何一種中。只有在這兩種試劑最終都添加到測量系統(tǒng)后，所有的過氧化物酶、4-氨基安替比林、和酚類或苯胺類氫供體化合物才被允許添加到系統(tǒng)中。
脂蛋白中含有的膽固醇，即本發(fā)明方法的測量對象包括酯型膽固醇(膽固醇酯)和游離膽固醇。當在本說明書中提及“膽固醇”時，該術語包括這兩種類型。
本發(fā)明的方法所檢驗的生物樣品是可能含有脂蛋白，如HDL、LDL、VLDL、或CM的樣品，且包括但不限于例如，體液，如血液、血清、和血漿，及其稀釋液?！俺齃DL外的脂蛋白”指HDL、VLDL、CM等。
“反映存在的總膽固醇量的測量值”和“反映LDL中存在的膽固醇量的測量值”指當測定生物樣品脂蛋白中所存在的膽固醇的濃度或絕對量時，獲得的測量值。該測量方法沒有特別限制，并當該值相應于生物樣品脂蛋白中所存在的膽固醇的濃度或絕對量時，例如，通過組合多種測量最終獲得成正比或反比的值，該值稱為測量值。例如，測量值的一個實例是通過用特定的試劑對脂蛋白中的膽固醇進行一系列處理所形成的化合物的吸光度。在這種情況下，測量值包括絕對值和變化值。
例如，圖1所示的第二步中吸光度的改變是由通過第二步處理所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料產(chǎn)生的吸光度加上由通過第一步處理所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料產(chǎn)生的吸光度測量值。在圖1中，由步驟2中測量2獲得的吸光度的吸光度改變量(測量2和測量1獲得的吸光度之間的差值)獲得了反映LDL中存在的膽固醇量的吸光度，該吸光度是“反映LDL中存在的膽固醇量的測量值”。第二步中測量2獲得的總吸光度是相應于LDL中存在的膽固醇量的吸光度加上反映除LDL外的脂蛋白中存在的膽固醇量的吸光度的值，該吸光度是“反映存在的總膽固醇量的測量值”。但是，為了在實踐中獲得精確的測量值，基于通過將測量2獲得的吸光度減去在添加第二試劑前的吸光度所獲得的值計算膽固醇量。
在僅用一次測量就獲得兩類測量值情況下，“一次測量”包括在測量生物樣品后以獲得許多必需測量值之前的一系列連續(xù)處理。在一次測量過程中，包括了許多次添加試劑和獲得測量值，但不包括離心分離操作等和通過形成復合物來進行的分離操作。更適宜地，在用于測量的一個試管或孔中一次完成測量。
“基于這兩個測量值同時獲得的生物樣品中所含的LDL膽固醇和總膽固醇的量”指基于這兩個值通過計算獲得LDL中的膽固醇和總膽固醇的濃度或絕對值。例如，根據(jù)圖1中測量2獲得的測量值量的改變可以知道LDL中存在的膽固醇量，即測量1和2測量值之間的差值，通過測量2獲得的測量值可以知道存在的總膽固醇量。
在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑存在下，通過酶促反應降解膽固醇進行第一步處理。該處理產(chǎn)生的過氧化氫一直保留到第二步中而不被除去或檢測。表面活性劑作用指通過表面活性劑降解脂蛋白以釋放脂蛋白中的膽固醇。
一種選擇性地與除LDL外的脂蛋白即HDL、VLDL、CM等中含有的膽固醇反應的特定方法如下。
也就是說，在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑存在下使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫。
第一步反應溶液中的膽固醇酯酶濃度優(yōu)選為0.2-2.0IU/mL，且優(yōu)選假單胞菌屬細菌原生的膽固醇酯酶。此外，膽固醇氧化酶濃度優(yōu)選為0.1-0.7IU/mL，優(yōu)選使用來自細菌或酵母的膽固醇氧化酶。
第一步中使用的作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑的優(yōu)選實例包括具有HLB值為13以上至15以下，優(yōu)選13以上至小于等于4的聚環(huán)氧烷衍生物。該衍生物的實例可包括高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸酰胺縮合物、高級烷基胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物、烷基酚縮合物等。應當指出的是表面活性劑HLB值的計算方法是眾所周知的，且描述于例如“Shin Kaimenkasseizai(日文)(NewSurfactants)”，Hiroshi Horiuchi，1986，Sankyou Publishing Co.LTD中。
具有HLB值為13以上至15以下的聚環(huán)氧烷衍生物的特別優(yōu)選的實例可包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯芐基苯基醚等具有HLB值為13以上至15以下的化合物。但是，聚環(huán)氧烷衍生物并不限于這些。
作為第一步中使用的表面活性劑，如可以是具有13.2的HLB值的聚氧乙烯衍生物Emulgen B66(Kao Corporation產(chǎn)品)。
第一步中使用的表面活性劑的濃度優(yōu)選為約0.1-10g/L，更優(yōu)選為約0.5-5g/L。
第一步優(yōu)選在pH 5-9的緩沖液中進行，含有胺的緩沖液是優(yōu)選的，例如Tris緩沖液、三乙醇胺緩沖液或Good氏緩沖液。特別是，作為Good氏緩沖液的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO是優(yōu)選的，緩沖液的濃度優(yōu)選為10-500mM。
第一步的反應溫度為約30-40℃，最優(yōu)選為37℃。反應時間(從添加第一試劑到添加第二試劑的時間)為約2-10分鐘，優(yōu)選5分鐘。
在本發(fā)明方法中，期望在白蛋白存在下進行第一步。白蛋白沒有特殊限制，只要是白蛋白即可。可優(yōu)選使用商品化的白蛋白，如血清白蛋白，特別優(yōu)選無脂肪酸的白蛋白。白蛋白的來源沒有特殊限制，可以是任何動物，如人、牛、豬和馬，特別優(yōu)選使用廣泛使用的牛血清白蛋白。在第一步的反應液中上述白蛋白的濃度優(yōu)選0.1到5.0g/dL，更優(yōu)選0.3到3.0g/dL。
如上所述，第一步中使用的第一試劑包括至少一種表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。該試劑還可包含合適的緩沖液和白蛋白。第一步中使用的試劑不含有所有與醌染料形成相關的試劑組合物，但含有4-氨基安替比林或酚類或苯胺類氫供體化合物。此外，第一步中使用的第一試劑不含有過氧化物酶。
在第一步中，產(chǎn)生的過氧化氫相應于生物樣品中存在的LDL外的脂蛋白中的膽固醇量，及該過氧化氫被轉移入第二步中而不被除去或檢測。
在隨后的第二步中，定量第一步中已被處理的除LDL外的脂蛋白中膽固醇所產(chǎn)生的過氧化氫，處理并定量第一步結束時殘留的LDL中的膽固醇。
通過用至少作用于LDL的表面活性劑處理LDL，進行LDL中的膽固醇的處理。通過與表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的作用，LDL中的膽固醇產(chǎn)生了過氧化氫。在此，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶包含在第一步使用的第一試劑中，且可以使用在第一步中被添加到測量系統(tǒng)中的那些。此外，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶也可包含在第二步使用的第二試劑中。至少作用于LDL的表面活性劑可以是僅選擇作用于LDL的表面活性劑或作用于所有脂蛋白的表面活性劑。
因為根據(jù)添加第二試劑后吸光度的改變量來計算LDL的測量值，測量值的精確度取決于反應速率，即所使用的表面活性劑的反應強度。因此，優(yōu)先選擇具有合適的反應強度的表面活性劑。
僅選擇作用于LDL或作用于所有脂蛋白的表面活性劑的優(yōu)選的實例可包括在第一試劑中不使用的聚環(huán)氧烷衍生物。所述衍生物的實例可包括高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸酰胺縮合物、高級烷基胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物和烷基酚縮合物。
聚環(huán)氧烷衍生物特別優(yōu)選的實例可包括聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯芐基苯基醚等在第一試劑中不使用的化合物。作為第二步中使用的表面活性劑，是具有13.3的HLB值的聚氧乙烯月桂基醇Polidocanol(Thesit)(Roche DiagnosticCorporation產(chǎn)品)。
第二步中使用的表面活性劑的濃度優(yōu)選為約0.1-100g/L，更優(yōu)選為約1-50g/L。
第二步中其他優(yōu)選的反應條件與第一步中優(yōu)選的反應條件相同。但是，在本發(fā)明方法的第二步中，測量系統(tǒng)中含有的來自除LDL外的脂蛋白中的膽固醇的過氧化氫在第二步一開始后就被轉化為醌染料，而在第二步進行中LDL中的膽固醇則產(chǎn)生了過氧化氫，且該過氧化氫被轉化為醌染料。由于通過處理除LDL外的脂蛋白形成的醌染料的吸光度增加與第二試劑的添加同時開始，快速進行且在短時間內(nèi)就結束。另一方面，因為在添加第二試劑后LDL被處理以產(chǎn)生過氧化氫，且接著形成醌染料，故反映存在的LDL量的吸光度在添加第二試劑后的隨時間開始緩速增加，增加的速率并不太高。換句話說，第二步中吸光度的增加顯示出由第二步一開始后快速增加和緩速增加組成的兩階段增加。開始的快速增加是反映存在的除LDL外的脂蛋白量的增加，以及隨后的緩速增加是反映存在的LDL量的增加。
因此，期望在添加第二試劑后大于等于30秒至小于等于5分鐘內(nèi)終止來自LDL中膽固醇的醌染料的形成，以便來自除LDL外的脂蛋白中的膽固醇的醌染料和來自LDL中膽固醇的醌染料能被獨立測量，使得能精確定量LDL中存在的膽固醇的量。
在第一步中通過測定膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用所產(chǎn)生的過氧化氫，可以定量除LDL外的脂蛋白中的膽固醇。在第二步中通過添加至少作用于LDL的表面活性劑并測定表面活性劑和已在第一步中添加的膽固醇酯酶以及膽固醇氧化酶作用產(chǎn)生的過氧化氫，可以定量LDL中的膽固醇?？赏ㄟ^其中在過氧化物酶存在下，通過在4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體化合物之間引起的氧化縮合將所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為有色醌并在400-700nm波長下測量的方法進行過氧化氫的檢測。這時，當添加第二步中使用的第二試劑到測量系統(tǒng)時，所有與醌染料形成相關的試劑組合物，即過氧化物酶、4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體化合物開始包含在測量系統(tǒng)中。也就是說，第二步中使用的第二試劑含有至少一種作用于LDL的表面活性劑，還含有第一步中使用的第一試劑中所不含有的過氧化物酶、4-氨基安替比林和氫供體化合物(酚類或苯胺類)中的試劑組合物。此外，第二步中使用的第二試劑可含有任何一種緩沖液、白蛋白、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
在第二步反應中形成的醌染料的吸光度測量值是由第二步中產(chǎn)生的過氧化氫所產(chǎn)生的吸光度加上通過第一步中反應產(chǎn)生的過氧化氫所產(chǎn)生的吸光度的測量值，并表示為生物樣品中所有脂蛋白中存在的膽固醇量。通過將總吸光度減去由于第一步產(chǎn)生的過氧化氫的吸光度所獲得的吸光度，即第二步中產(chǎn)生的過氧化氫的測定表示為LDL中存在的膽固醇量。
在氫供體化合物中，苯胺類氫供體化合物的實例包括N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-磺丙基苯胺(HALPS)等。
當在第二步的反應溶液中過氧化氫轉化為醌染料時，過氧化物酶的濃度優(yōu)選為0.3-3.0mmol/L，以及酚類或苯胺類氫供體化合物的濃度優(yōu)選為0.5-2.0mmol/L。
當在第二步中添加第二試劑時，因為所有與醌染料形成相關的試劑組合物開始包含在系統(tǒng)中，第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫在第二步早期就轉化為醌染料。與此同時，用第二試劑中含有的并作用于LDL的表面活性劑和包含在測量系統(tǒng)中的膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶處理LDL中的膽固醇以產(chǎn)生過氧化氫。因為在其形成的同時，通過測量系統(tǒng)中所含有的與醌染料形成相關的試劑組合物的作用，由LDL中膽固醇所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料，隨時間的延續(xù)醌染料量增加了。因此，在第二步中，在第二步開始的同時吸光度快速增加并隨時間的延續(xù)而持續(xù)增加，如圖1所示。在第一次測量中，測量快速增加的吸光度。在第二次測量中，測量隨時間的延續(xù)增加的吸光度。第二次測量的測量值反映了存在的總膽固醇量，第二次測量的測量值和第一次測量的測量值之間的差值反映了LDL中存在的膽固醇量。
添加第二試劑后和第一次測量前的時間，即第一步中產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料所需的時間是0-60秒，優(yōu)選在30秒內(nèi)。此外，進行第二次測量前的時間，即在第二步中通過酶促反應使LDL中存在的所有膽固醇產(chǎn)生過氧化氫并將所產(chǎn)生的過氧化氫轉化為醌染料所需的時間是1-5分鐘。當在第一次測量和第二次測量的兩點進行測量并獲得兩個測量值時，根據(jù)計算處理這兩個測量值，可通過計算定量總膽固醇和LDL中的膽固醇量。
計算公式如下所示。
總膽固醇ΔATsample-ΔATBLKΔATSTD-ΔATBLK×CTSTD]]>LDL膽固醇ΔALsample-ΔALBLKΔALSTD-ΔALBLK×CLSTD]]>ΔAT樣品通過將樣品的測量2所獲得的吸光度減去僅由樣品和第一試劑獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；ΔATSTD通過將標準樣品的測量2所獲得的吸光度減去僅由標準樣品和第一試劑獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；ΔATBLK當鹽水或純水用作為樣品時，通過將測量2所獲得的吸光度減去僅由樣品和第一試劑獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；CTSTD標準樣品的總膽固醇值；ΔAL樣品通過將樣品的測量2所獲得的吸光度減去樣品的測量1所獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；ΔALSTD通過將標準樣品的測量2所獲得的吸光度減去標準樣品的測量1所獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；ΔALBLK當鹽水或純水用作為樣品時，通過將測量2所獲得的吸光度減去測量1所獲得的吸光度測定的吸光度的改變量；CLSTD標準樣品的LDL膽固醇值。
在本發(fā)明的方法中，每種脂蛋白被處理形成醌染料的路線概述如下。應當指出的是以下概述了形成醌染料的過程(處理)，但沒有顯示試劑組合物。
除LDL的脂蛋白的處理 LDL的處理
在每個箭頭下的試劑組合物是每種處理(反應)所需的試劑組合物，在此C酯酶表示膽固醇酯酶，C氧化酶表示膽固醇氧化酶。
在上述處理中，在本發(fā)明方法的第一步中進行處理1A，以及在第二步中進行處理1B、處理2A和處理2B。在第二步中，處理1B在第二步的早期完成，而處理2A和處理2B則在整個第二步中進行。
更適宜地，在一個反應容器中連續(xù)進行第一步和第二步，自動分析儀自動測量第二步中吸光度的改變量和第二步完成時吸光度量。
本發(fā)明方法中使用的分析儀是一種自動分析儀，具有執(zhí)行多項同時分析方法的功能，其中多項可同時測量。所述自動分析儀包括TBA-30R(Toshiba Corporation)，BM1250、1650和2250(JEOL Ltd.)等。
考慮到分析儀執(zhí)行多項同時分析方法的功能，可添加第一試劑至第四試劑到反應容器中并可設定反應時間為3-20分鐘。此外，因為光度測量在反應的大多數(shù)時間中進行，可以設定不同的測量時間，由此比色法和速率分析以及比色法和速率方法的組合可具有不同的時間設定。更進一步，也可在不同波長下執(zhí)行同時測量。可通過適當?shù)卦O定這些分析用的測量條件完成本發(fā)明多項的同時測量。
對于具有執(zhí)行多項同時分析方法功能的自動分析儀而言，可使用市場上可買到的分析儀。
本發(fā)明還包括一種同時測量生物樣品中的LDL中的膽固醇和總膽固醇的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括第一試劑和第二試劑。第一試劑含有至少作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。第一試劑還可含有與醌染料形成相關的試劑組合物，所述試劑組合物包括過氧化物酶、4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體化合物，但所有的過氧化物酶、4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體化合物不能同時含有。更進一步地，含4-氨基安替比林或酚類或苯胺類氫供體化合物的任何一種，不含過氧化物酶。此外，第一試劑可含合適的緩沖液、白蛋白等。第二試劑含有至少作用于LDL的表面活性劑和在第一試劑使用的包括過氧化物酶、4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體化合物的與醌染料形成相關的試劑組合物之中不含有的附加的試劑組合物。第二試劑還可含合適的緩沖液、白蛋白等?？梢詼y量通過試劑組合物反應形成的有色醌的吸光度。本發(fā)明的試劑盒還含有具有已知濃度的標準脂蛋白溶液、緩沖液等。
實施例在下文中，基于實施例本發(fā)明得到更具體的解釋。但是，本發(fā)明不限于下述實施例。
制備第一步和第二步中使用的試劑組合物(分別為第一試劑組合物和第二試劑組合物)，使得分別產(chǎn)生如下組合物。分別制備相應于兩種測量系統(tǒng)的試劑組合物，所述試劑組合物對于第一試劑和第二試劑而言具有不同組分。
測量系統(tǒng)1第一試劑組合物PIPES緩沖液，pH 7.050mmol/L4-氨基安替比林 1.4mmol/L膽固醇酯酶 0.6IU/mL膽固醇氧化酶 0.5IU/mL表面活性劑，Emulgen B66(Kao Corp) 0.27％第二試劑組合物PIPES緩沖液，pH 7.050mmol/L表面活性劑，Polidocanol(Thesit)1％(Roche Diagnostic Crop)TOOS6mmol/LPDO(過氧化物酶) 6.5IU/mL測量系統(tǒng)2第一試劑組合物PIPES緩沖液，pH 7.0 50mmol/LTOOS2mmol/L膽固醇酯酶 0.6IU/mL
膽固醇氧化酶 0.5IU/mL表面活性劑，Emulgen B66(Kao Corp)0.27％第二試劑組合物PIPES緩沖液，pH 7.0 50mmol/L表面活性劑，Polidocanol(Thesit) 1％(Roche Diagnostic Crop)4-氨基安替比林 4mmol/LPOD 6.5IU/mL作為用于評估的對照產(chǎn)品，使用市場上可買到用于自動分析的試劑LDL-EX N(Denka Seiken Co.，Ltd.產(chǎn)品)和用于自動分析的試劑T-CHO(S)N(Denka Seiken Co.，Ltd.產(chǎn)品)。(樣品)制備58份人血清樣品。
作為自動分析儀，使用TBA-30R(Toshiba Corporation產(chǎn)品)。(用于同時分析LDL-C和T-CHO的試劑(多重試劑))測量條件多項自動分析將37℃下預熱的300μL第一試劑與各4μL樣品混合并在37℃下反應5分鐘后，添加100μL的第二試劑并繼續(xù)反應5分鐘。在添加第二試劑后，在30秒和5分鐘后測量600nm處吸光度。根據(jù)添加第二試劑后30秒和5分鐘之間的吸光度的改變量計算LDL膽固醇(LDL-C)水平，并根據(jù)添加第二試劑后吸光度的改變量計算總膽固醇(T-CHO)水平。這時，預先測量由鹽水(在下文中，稱為空白)引起的吸光度的改變量和當使用已知濃度樣品作為標準樣品時吸光度的改變量，并根據(jù)LDL-C和T-CHO這兩個值的差值計算“每mg/dL的吸光度的改變量”。然后，測量樣品，通過將測量的吸光度的改變量減去空白獲得吸光度的改變量，并與“每mg/dL的吸光度的改變量”比較以分別計算LDL-C和T-CHO的濃度。
通過用于評估的對照產(chǎn)品LDL-EX N測量的LDL中膽固醇的測量值和通過本發(fā)明方法測量的測量值之間的相關性如圖2所示。通過用于評估的對照產(chǎn)品T-CHO(S)測量的總膽固醇的測量值和通過本發(fā)明方法測量的測量值之間的相關性如圖3所示。如圖2和3所示，根據(jù)本發(fā)明方法同時的定量，獲得了與當LDL-C和T-CHO分別測量時獲得的值相似的測量結果。
在本說明書中引用的所有出版物、專利、以及專利申請其全文引入本說明書中作為參考。
權利要求
1.一種僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，包括處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步；和轉化第一步中所獲得的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以及轉化所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料的第二步，其中所述醌染料并不在第一步形成，并僅用一次測量根據(jù)第二步中形成的醌染料的量由此定量低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中與醌染料形成相關的試劑組合物包括4-氨基安替比林、酚類和苯胺類氫供體化合物以及過氧化物酶；在第一步中添加4-氨基安替比林、酚類和苯胺類氫供體化合物中的任何一種；在第一步中沒有添加的試劑組合物在第二步中添加。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中在第一步中，在作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑存在下使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫；并在第二步中，在至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑存在下使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于生物樣品中所含的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫。
4.根據(jù)權利要求1-3任一的方法，其中在第二步中，第一步獲得的過氧化氫被轉化為醌染料；將至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑添加到測量系統(tǒng)中；使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用于測量系統(tǒng)中殘留的低密度脂蛋白；并通過轉化為醌染料測量所產(chǎn)生的過氧化氫。
5.根據(jù)權利要求1-4任一的方法，其中基于下述的兩個值同時測量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的量，所述的兩個值為作為反映存在的總膽固醇量的測量值的第二步中吸光度總的改變量，以及作為反映低密度脂蛋白中存在的膽固醇量的測量值的相對于第二步中所產(chǎn)生的過氧化氫量的吸光度改變量。
6.根據(jù)權利要求1-5任一的方法，其中第二步中吸光度的改變顯示了兩階段的增加，其中在添加第二試劑后的快速增加和隨后的緩速增加；根據(jù)后面吸光度的緩速改變量定量低密度脂蛋白中膽固醇。
7.根據(jù)權利要求1-6任一的方法，其中根據(jù)第二步中吸光度總的改變量定量總膽固醇。
8.根據(jù)權利要求1-7任一的方法，其中在不同的測量條件下，使用供臨床化學檢驗用的自動分析儀僅用一次測量來進行分析。
9.一種穩(wěn)定僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇方法中所用的液體試劑的方法，所述定量方法包括添加第一試劑以處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步，和添加第二試劑以轉化第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫以及轉化為醌染料的第二步，其中在第一步中添加的第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物中的任意一種；和在第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物。
10.一種穩(wěn)定根據(jù)權利要求1-8任一的方法中所用液體試劑的方法，其中在第一步中添加的第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物的任意一種；和在第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物。
11.根據(jù)權利要求9或10的方法，其中在第一試劑中還含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶；以及在第二試劑中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑。
12.一種用于僅用一次測量定量生物樣品中的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇方法的試劑盒，所述定量方法包括添加第一試劑以處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步，和添加第二試劑以轉化第一步中所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫以及轉化為醌染料的第二步，其中其中第一試劑中包含作為與醌染料形成相關的試劑組合物的4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物中的任意一種；和第二試劑中含有4-氨基安替比林、酚類或苯胺類氫供體化合物以及過氧化酶之中未包含在第一試劑中的試劑組合物。
13.根據(jù)權利要求12的試劑盒，其中在第一試劑中還含有作用于除低密度脂蛋白外的脂蛋白的表面活性劑、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶；在第二試劑中含有至少作用于低密度脂蛋白的表面活性劑。
全文摘要
提供了一種通過抑制其自發(fā)顯色而穩(wěn)定試劑的方法，使得僅用一次測量就能同時定量LDL膽固醇和總膽固醇。一種僅用一次測量定量生物樣品中所含的低密度脂蛋白中的膽固醇和總膽固醇的方法，包括處理生物樣品中除低密度脂蛋白外的脂蛋白以產(chǎn)生過氧化氫的第一步，和轉化第一步中獲得的過氧化氫為醌染料并處理殘留的低密度脂蛋白以及轉化所產(chǎn)生的過氧化氫為醌染料的第二步，這里在第一步中不形成醌染料，以及僅用一次測量根據(jù)第二步中產(chǎn)生的醌染料的量定量低密度脂蛋白中膽固醇和總膽固醇。
文檔編號G01N33/92GK1961079SQ200580017679
公開日2007年5月9日 申請日期2005年3月30日 優(yōu)先權日2004年3月31日
發(fā)明者松本京子, 松井寬史 申請人:電化生研株式會社