專(zhuān)利名稱(chēng)：酶檢測(cè)技術(shù)的制作方法
背景技術(shù)：
常常需要確定試驗(yàn)樣品內(nèi)特定的酶的存在或數(shù)量。在一些情況中，僅僅是酶的存在就可以，例如，指示組織或器官損傷的存在。同樣地，異常的酶濃度也可指示其它病癥，如細(xì)菌或病毒的感染。舉例來(lái)說(shuō)，認(rèn)為蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶)和金屬肽酶會(huì)增加白色念珠菌的致病性，白色念珠菌是可以引起念珠菌性陰道炎(“酵母菌感染”)的微生物。試驗(yàn)樣品中酶的存在或濃度還可以作為一些類(lèi)型的癌癥和其它病癥的診斷標(biāo)志。舉例來(lái)說(shuō)，前列腺-特異性的抗原(PSA)是一種公知的前列腺癌的標(biāo)志。其它診斷標(biāo)志的例子包括組織蛋白酶B(癌癥)、組織蛋白酶G(肺氣腫、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥)、纖溶酶原激活物(血栓形成、慢性炎癥、癌癥)和尿激酶(癌癥)。
一種用于檢測(cè)酶的存在的常規(guī)方法描述于Braach-Maksvvtis等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,348,319。Braach-Maksvvtis等人通過(guò)檢測(cè)由酶消化的底物而發(fā)揮作用。例如，Braach-Maksvvtis等人的

圖1說(shuō)明了包括第一區(qū)域11和第二區(qū)域12的裝置10。第一區(qū)域11具有聚合物珠粒13(載體)，它經(jīng)由肽接頭15與鏈霉抗生物素蛋白14(報(bào)道分子)相連，該肽接頭15可被蛋白酶16裂解。當(dāng)加入蛋白酶16時(shí)，鏈霉抗生物素蛋白14被釋放出來(lái)并傳到第二區(qū)域12，第二區(qū)域12包括生物傳感器膜17，它通過(guò)膜阻抗的變化來(lái)檢測(cè)鏈霉抗生物素蛋白的存在(第5欄，II.25-30)?？墒?，不幸地，由Braach-Maksvvtis等人描述的技術(shù)極其復(fù)雜并且對(duì)于一些類(lèi)型的應(yīng)用成本過(guò)高，例如需要通過(guò)患者(自診斷或借助于醫(yī)務(wù)人員)的相對(duì)快速的診斷。
因而，目前需要存在一種簡(jiǎn)單和便宜的技術(shù)來(lái)精確地檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的存在。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)的酶或其抑制劑的診斷試劑盒。所述試劑盒包含許多種反應(yīng)性復(fù)合物，每種反應(yīng)性復(fù)合物包含與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物。所述底物可被酶(例如，水解酶)裂解。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，所述報(bào)道分子包括用可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的顆粒。該試劑盒還包含層析介質(zhì)(例如，多孔膜)，它能被置于與試驗(yàn)樣品連通中。層析介質(zhì)限定第一檢測(cè)區(qū)域，在該第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠俘獲所述的特異性結(jié)合構(gòu)件。能夠在第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生第一檢測(cè)信號(hào)，例如通過(guò)固定在其中的報(bào)道分子來(lái)產(chǎn)生第一檢測(cè)信號(hào)。所述第一檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度可以與試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的數(shù)量成反比，并且也可以與試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的數(shù)量成正比。
在某些實(shí)施方案中，層析介質(zhì)還可以包含第二檢測(cè)區(qū)域，在該第二檢測(cè)區(qū)域能夠俘獲報(bào)道分子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在對(duì)報(bào)道分子具有親和性的第二檢測(cè)區(qū)域內(nèi)接收材料。能夠在第二檢測(cè)區(qū)域內(nèi)第二檢測(cè)信號(hào)，例如通過(guò)固定在其中的報(bào)道分子來(lái)產(chǎn)生。第二檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度可以與試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的數(shù)量成正比，并且也可以與試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的數(shù)量成反比。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，公開(kāi)了一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)的酶或其抑制劑的方法。所述方法包括試驗(yàn)樣品與許多種反應(yīng)性復(fù)合物接觸以形成培養(yǎng)混合物，每種反應(yīng)性復(fù)合物包含與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物。所述底物可被酶裂解以釋放所述報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件，所述報(bào)道分子能夠直接或間接地產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。所述方法還包括向?qū)游鼋橘|(zhì)施加培養(yǎng)混合物，該層析介質(zhì)限定第一檢測(cè)區(qū)域，在該第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠俘獲特異性結(jié)合構(gòu)件。確定在第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)檢測(cè)信號(hào)的存在或強(qiáng)度。以下更詳細(xì)地論述本發(fā)明的其它特征和方面。
附圖簡(jiǎn)述在本說(shuō)明書(shū)的剩余部分中引用以下附圖，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更具體地闡述本發(fā)明的全部和能夠公開(kāi)的內(nèi)容，包括其最佳方式圖1是一個(gè)可用于本發(fā)明的診斷試驗(yàn)試劑盒的測(cè)定裝置的實(shí)施方案的透視圖；圖2是一個(gè)對(duì)于報(bào)道分子共價(jià)鍵合到底物上的實(shí)施方案的圖解說(shuō)明；和圖3是一種可用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案來(lái)檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的存在或數(shù)量的測(cè)定技術(shù)的簡(jiǎn)圖。
在本說(shuō)明書(shū)和附圖中引用符號(hào)的重復(fù)使用意在表示本發(fā)明的相同或相似的特征或元件。
代表性實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明定義如在此使用，術(shù)語(yǔ)“試驗(yàn)樣品”泛指懷疑包含酶和/或酶抑制劑的材料。例如，所述試驗(yàn)樣品可以得到或來(lái)源于生物來(lái)源，例如生理性液體，包括血液、組織液、唾液、眼睛晶狀體、腦脊液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、陰道液、羊水，等等。除生理性液體之外，還可以使用其它液體樣品(例如，水、食品、等等)用于環(huán)境或食品生產(chǎn)的測(cè)定。此外，固體材料可用作試驗(yàn)樣品。所述試驗(yàn)樣品可以以從來(lái)源獲得的方式直接使用或在修飾樣品特性的預(yù)處理之后使用。例如，此類(lèi)預(yù)處理可包括從血液制備的血漿、稀釋的粘性流體，等等。預(yù)處理的方法還可包括過(guò)濾、沉淀、稀釋、蒸餾、混合、濃縮、干擾組分的失活、試劑的加入，等等。而且，還可以有益地修飾固體試驗(yàn)樣品以形成液體介質(zhì)、釋放酶和/或酶抑制劑，等等。
詳細(xì)說(shuō)明現(xiàn)在將詳細(xì)地參照本發(fā)明的多種實(shí)施方案，在下文中闡述其中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例。提供各個(gè)實(shí)施例作為本發(fā)明的說(shuō)明，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。事實(shí)上，顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作出不脫離本發(fā)明的范圍或精神的各種修飾和改變。舉例來(lái)說(shuō)，說(shuō)明或描述為一個(gè)實(shí)施方案的一部分的特征可以用在另一實(shí)施方案中以產(chǎn)生更進(jìn)一步的實(shí)施方案。因此，本發(fā)明意在包括這樣的改進(jìn)和變更，并將它們歸入所附的權(quán)利要求和它們的同等物的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明通常涉及用于檢測(cè)酶或酶抑制劑的存在或數(shù)量的診斷試驗(yàn)試劑盒。所述診斷試劑盒利用反應(yīng)性復(fù)合物來(lái)方便酶或酶抑制劑的檢測(cè)。所述反應(yīng)性復(fù)合物包括與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接(例如，共價(jià)鍵合、物理吸附，等等)的底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白底物與報(bào)道分子(例如，染色膠乳顆粒)和特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，生物素化的化合物)連接起來(lái)。在此實(shí)施方案中，底物為蛋白水解酶提供裂解目標(biāo)。具體地，在與反應(yīng)性復(fù)合物接觸時(shí)，蛋白水解酶裂解底物并釋放報(bào)道分子和/或特異性結(jié)合構(gòu)件。然后可以將由釋放的報(bào)道分子直接或間接地產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)顯示試驗(yàn)樣品內(nèi)酶或酶抑制劑的存在或數(shù)量。
可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)各種類(lèi)型的酶。例如，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶，等等。在一些實(shí)施方案中，研究的酶是“水解酶”或“水解作用酶”，其是指促進(jìn)水解反應(yīng)的酶。此類(lèi)水解酶的例子包括，但不限于蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或雜-低聚糖酶、同-或雜-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經(jīng)氨酸苷酶和酯酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，可以檢測(cè)肽酶?！半拿浮笔橇呀獯嬖谟诙屉闹械碾逆I的水解酶。肽酶的例子包括，但不限于金屬肽酶、二肽基肽酶I、II或IV；等等。在另一實(shí)施方案中，可以檢測(cè)蛋白酶。“蛋白酶”是裂解比較長(zhǎng)的肽和蛋白質(zhì)中的肽鍵的水解酶?？筛鶕?jù)本發(fā)明檢測(cè)的蛋白酶的例子包括，但不限于絲氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、PSA，等等)、天冬氨酸蛋白酶(例如，胃蛋白酶)、巰基蛋白酶(例如，促激素巰基蛋白酶)、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶。還有其它的酶描述于Bronstein等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,243,980和Yue等人的2004/0081971，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
同樣地，也可以根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)任何各種已知的酶抑制劑。例如，已知的水解酶抑制劑包括，但不限于蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或雜-低聚糖酶、同-或雜-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經(jīng)氨酸苷酶和酯酶的抑制劑。蛋白酶抑制劑可以包括，例如，天冬氨酸蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑，酸性或堿性蛋白酶抑制劑，等等。一些具體的蛋白酶抑制劑的例子包括benzamideine、吲哚、胃蛋白酶抑制劑、卵巨球蛋白、氟哌啶醇、過(guò)渡態(tài)模擬物，等等。
如上所述，將反應(yīng)性復(fù)合物用于本發(fā)明來(lái)檢測(cè)酶或酶抑制劑的存在或數(shù)量。所述反應(yīng)性復(fù)合物包括與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物。術(shù)語(yǔ)“底物”泛指通過(guò)酶在其上的化學(xué)作用以形成產(chǎn)物的物質(zhì)。所述底物可以是天然存在或是合成的。一些合適的水解酶的底物包括，例如，酯、酰胺、肽、醚或其它具有可被酶水解的鍵的化合物。酶催化水解反應(yīng)可以，例如，產(chǎn)生作為主產(chǎn)物的羥基或胺化合物和作為副產(chǎn)物的游離磷酸鹽、乙酸鹽，等等。具體的底物類(lèi)型可以包括，例如，蛋白質(zhì)或糖蛋白、肽、核酸(例如，DNA和RNA)、碳水化合物、脂類(lèi)、酯、其衍生物，等等。舉例來(lái)說(shuō)，一些合適的肽酶和/或蛋白酶的底物可以包括肽、蛋白質(zhì)和/或糖蛋白，例如酪蛋白(例如，β-酪蛋白、偶氮酪蛋白，等等)、白蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA))、血紅蛋白、肌紅蛋白、角蛋白、明膠、胰島素、蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白，等等。還有其它合適的底物描述于Simonsson等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,748,116；Diamond等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,786.137；Rao等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,197,537；和Henderson等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,235,464；Nemori等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,485,926，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
特異性結(jié)合構(gòu)件通常可以是任何特異性的結(jié)合對(duì)的單元，即兩個(gè)不同的分子，其中一個(gè)分子化學(xué)和/或物理地與第二個(gè)分子結(jié)合起來(lái)。舉例來(lái)說(shuō)，免疫活性的特異性結(jié)合構(gòu)件可以包括抗原、半抗原、抗體(初級(jí)或次級(jí))及其復(fù)合物，包括由重組DNA方法或肽合成形成的抗原、半抗原、抗體(初級(jí)或次級(jí))及其復(fù)合物?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白質(zhì)或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結(jié)合單元的混合物。此類(lèi)抗體的制備方法和它們用作特異性結(jié)合構(gòu)件的適合性的詳細(xì)情況是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。其它常見(jiàn)的特異性結(jié)合構(gòu)件包括，但不限于生物素和抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、captavidin、或抗生物素抗體；蛋白A和G；碳水化合物和植物凝血素、互補(bǔ)的核苷酸序列(包括用于檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的DNA雜交試驗(yàn)的探針和俘獲的核苷酸序列)；互補(bǔ)的肽序列包括由重組方法形成的肽序列；效應(yīng)物和受體分子；激素和激素結(jié)合蛋白；酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶；其衍生物，等等。此外，特異性的結(jié)合對(duì)可以包括所述原始的特異性結(jié)合構(gòu)件的類(lèi)似物、衍生物和/或片段。
除了被連接到特異性結(jié)合構(gòu)件外，如上面描述，底物還連接到報(bào)道分子以形成所述的反應(yīng)性復(fù)合物。所述報(bào)道分子可包含任何能直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。合適的可檢測(cè)的物質(zhì)可包括，例如，色原；發(fā)光的化合物(例如，熒光，磷光，等等)；放射性化合物；可見(jiàn)的化合物(例如，膠乳或金屬的顆粒，如金)；脂質(zhì)體或其它含有產(chǎn)生信號(hào)的物質(zhì)的囊泡；酶和/或底物，等等。例如，一些適于用作可檢測(cè)的物質(zhì)的酶描述于Litman等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,275,149，在此以其全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。酶/底物體系的一個(gè)例子是酶是堿性磷酸酯酶并且底物是硝基藍(lán)四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯或其衍生物或類(lèi)似物，或底物是4-甲基傘形花基(umbelliferyl)-磷酸酯。其它合適的報(bào)道分子描述于Jou等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
在一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子可含有產(chǎn)生光學(xué)上可檢測(cè)信號(hào)的發(fā)光化合物。所述發(fā)光化合物可以是分子、聚合物、樹(shù)枝狀物、顆粒，等等。例如，合適的熒光分子可包括，但不限于熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白、若丹明和它們的衍生物和類(lèi)似物。其它合適的熒光化合物是通常被稱(chēng)為“量子點(diǎn)”的半導(dǎo)體納米晶體。例如，此類(lèi)納米晶體可含有通式CdX的核，其中X是Se、Te、S，等。所述納米晶體還可以用通式Y(jié)Z的覆蓋殼鈍化，其中Y是Cd或Zn，和Z是S或Se。其它合適的半導(dǎo)體納米晶體的例子還描述于Barbera-Guillem等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,261,779和Dapprich等人的No.6,585,939，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
此外，合適的發(fā)磷光的化合物可包括一種或多種金屬的金屬?gòu)?fù)合物，所述一種或多種金屬為例如釕、鋨、錸、銥、銠，鉑、銦、鈀、鉬、锝、銅、鐵、鉻、鎢、鋅，等等。特別優(yōu)選的是釕、錸、鋨、鉑和鈀。所述金屬配合物可含有一個(gè)或多個(gè)促進(jìn)復(fù)合物在水溶液或非水環(huán)境中的溶解度的配體。例如，一些合適的配體的例子包括，但不限于吡啶；吡嗪；異煙酰胺；咪唑；聯(lián)吡啶；三聯(lián)吡啶；菲咯啉；聯(lián)吡啶并吩嗪；卟啉、卟吩，及其衍生物。此類(lèi)配體可以，例如，被烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、羧酸酯、醛、羧酰胺、氰基、氨基、羥基、亞氨基、羥羰基、氨羰基、脒、胍鹽、酰脲、含硫基團(tuán)、含磷基團(tuán)，和N-羥基-琥珀酰亞胺的羧酸酯所取代。
卟啉和卟吩金屬?gòu)?fù)合物含有與亞甲橋偶聯(lián)在一起的吡咯基團(tuán)以形成帶有金屬螯合內(nèi)腔的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些分子中有許多分子都在室溫下在合適的溶劑中(例如，水)和無(wú)氧環(huán)境下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的磷光性質(zhì)。一些合適的能顯示出磷光性質(zhì)的卟啉復(fù)合物包括，但不限于鉑(II)糞卟啉-I和III、鈀(II)糞卟啉、釕糞卟啉、鋅(II)-糞卟啉-I，其衍生物，等等。類(lèi)似地，一些合適的能顯示出磷光性質(zhì)的卟吩復(fù)合物包括，但不限于鉑(II)四-內(nèi)消旋-氟苯基卟吩和鈀(II)四-內(nèi)消旋-氟苯基卟吩。還有其它合適的卟啉和/或卟吩復(fù)合物描述于Schmidt等人的美國(guó)專(zhuān)利No.4,614,723；Hendrix的No.5,464,741；Soini的No.5,518,883；Ewart等人的No.5,922,537；Saqner等人的No.6,004,530；和Ponomarev等人的No.6,582,930，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
聯(lián)吡啶金屬?gòu)?fù)合物也可被用作發(fā)磷光的化合物。一些合適的聯(lián)吡啶復(fù)合物的例子包括，但不限于二[(4，4′-甲氧甲酰)-2，2′-聯(lián)吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4-基)丙基]-1，3-二氧戊環(huán)釕(II)；雙(2，2′-聯(lián)吡啶)[4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶]釕(II)；二(2，2′-聯(lián)吡啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶]-4′-基)-丁酸]釕(II)；三(2，2′-聯(lián)吡啶)釕(II)；(2，2′-聯(lián)吡啶)[二-二(1，2-二苯基膦基)亞乙基]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4′-基)丙基]-1，3-二氧戊環(huán)鋨(II)；二(2，2′-聯(lián)吡啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶)-丁胺]釕(II)；二(2，2′-聯(lián)吡啶)[1-溴-4(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4-基)丁烷]釕(II)；二(2，2′-聯(lián)吡啶)馬來(lái)酰亞胺己酸，4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4′-丁酰胺釕(II)，等等。還有其它合適的可以顯示出磷光性質(zhì)的金屬?gòu)?fù)合物描述于Richter等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,613,583；Massev等人的No.6,468,741；Meade等人的No.6,444,423；Massev等人的No.6,362,011；Bard等人的No.5,731,147；和Massev等人的No.5,591,581，以它們的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
在一些情況中，利用“時(shí)間-分辨的”發(fā)光檢測(cè)技術(shù)。時(shí)間-分辨的檢測(cè)包括用一個(gè)或多個(gè)光的短脈沖激發(fā)發(fā)光化合物，然后在測(cè)量剩余發(fā)光信號(hào)前的激發(fā)之后通常等待一定的時(shí)間(例如，大約1-100微秒之間)。用這樣的方式除去任何短暫的磷光或熒光本底信號(hào)以及分散的激發(fā)輻射。這種除去許多種本底信號(hào)的能力可導(dǎo)致敏感性比常規(guī)的熒光或磷光大2-4個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，通過(guò)利用某些發(fā)光材料的特征，將時(shí)間-分辨的檢測(cè)用來(lái)減少來(lái)自發(fā)射源或散射作用(由激發(fā)輻射的散射所產(chǎn)生)的本底信號(hào)。
為了有效地作用，時(shí)間-分辨的技術(shù)通常需要相對(duì)長(zhǎng)的發(fā)射持續(xù)時(shí)間用于發(fā)光化合物。這就期望所述化合物在任何短暫的本底信號(hào)消散以后發(fā)射它的信號(hào)。此外，長(zhǎng)的熒光持續(xù)時(shí)間使采用廉價(jià)的電路用于時(shí)間門(mén)測(cè)定成為可能。例如，所述可檢測(cè)的化合物可以有大于大約1微秒的熒光持續(xù)時(shí)間，在一些實(shí)施方案中大于大約10微秒，在一些實(shí)施方案中大于大約50微秒，以及在一些實(shí)施方案中從大約100微秒到大約1000微秒。此外，所述化合物還可以具有相對(duì)大的“斯托克斯頻移”。術(shù)語(yǔ)“斯托克斯頻移”通常被定義為與激發(fā)線或帶相比，發(fā)光輻射到比較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)的譜線或帶的位移。相對(duì)大的斯托克斯頻移讓發(fā)光化合物的激發(fā)波長(zhǎng)與它的發(fā)射波長(zhǎng)保持很遠(yuǎn)并且是合乎需要的，因?yàn)榧ぐl(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的巨大差異使除去來(lái)自發(fā)射信號(hào)的反射激發(fā)輻射變得容易。此外，巨大的斯托克斯頻移還能最小化來(lái)自樣品中的發(fā)光分子和/或由于蛋白質(zhì)或膠體的光散射的干擾，所述蛋白質(zhì)或膠體與一些體液(例如，血液)一起存在。另外，巨大的斯托克斯頻移還能將對(duì)于為除去本底干擾的昂貴、高精度的過(guò)濾器的需求最小化。例如，在一些實(shí)施方案中，所述發(fā)光化合物具有大于大約50納米的斯托克斯頻移，在一些實(shí)施方案中大于大約100納米，以及在一些實(shí)施方案中從大約100到大約350納米。
例如，一種合適的用于時(shí)間-分辨的檢測(cè)技術(shù)的熒光化合物類(lèi)型包括釤(Sm(III))、鏑(Dy(III))、銪(Eu(III))和鋱(Tb(III))的鑭系元素螯合物。在所述螯合物在基本上較短的波長(zhǎng)的激發(fā)之后，此類(lèi)螯合物可以顯示出強(qiáng)烈地紅外移動(dòng)、窄帶、長(zhǎng)期的發(fā)射。通常，由于位于分子中鑭系元素附近的發(fā)色團(tuán)，所述螯合物具有強(qiáng)烈的紫外激發(fā)帶。在通過(guò)所述發(fā)色團(tuán)的激發(fā)之后，激發(fā)能量可以從激發(fā)的發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)到鑭系元素。這遵循鑭系元素?zé)晒獍l(fā)射特性。例如，與熒光素的僅僅大約28納米相比，銪螯合物具有大約250到大約350納米的特別大的斯托克斯頻移。并且，與其它熒光化合物的大約1到大約100毫微秒相比，銪螯合物的熒光是長(zhǎng)期的，具有大約100大約1000微秒的持續(xù)時(shí)間。此外，這些螯合物具有窄的發(fā)射光譜，通常在大約50％發(fā)射時(shí)具有小于大約10納米的帶寬。一種合適的銪螯合物是N-(對(duì)-異硫氰酰芐基)-二亞乙基三胺四乙酸-Eu+3。
另外，還可將在水溶液或懸浮液中惰性、穩(wěn)定和固有地?zé)晒獾蔫|系元素螯合物用于本發(fā)明以取消對(duì)分子團(tuán)-形成試劑的需要，分子團(tuán)-形成試劑常常用于保護(hù)具有有限溶解度和在水溶液或懸浮液中有猝滅問(wèn)題的螯合物。一個(gè)此類(lèi)螯合物的例子是4-[2-(4-異硫氰酰苯基)乙炔基]-2，6-二{[N，N-二(羧甲基)氨基]甲基}-吡啶[參考Lovgren，T.等人，Clin.Chem.42，1196-1201(1996)]。一些鑭系元素螯合物還顯示出特別高的信噪比。例如，一種此類(lèi)螯合物是四配位基的β-二酮酯-銪螯合物[參考Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596-601(1998)]。除了上面描述的熒光化合物之外，其它適用于本發(fā)明的化合物描述于Mullinax等人的美國(guó)專(zhuān)利No.6,030,840；Davidson的No.5,585,279；Singer等人的No.5,573,909；Wieder等人的No.6,242,268；和Hemmila等人的No.5,637,509，在此以它們的全部?jī)?nèi)容引入作為參考用于所有目的。
按照規(guī)定，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中報(bào)道分子可間接地產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。在這種情況中，報(bào)道分子可以不必特異性地含有可檢測(cè)的物質(zhì)，而是反而能對(duì)可檢測(cè)的物質(zhì)有影響以產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。例如，在一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子可以是特異性的結(jié)合對(duì)的一個(gè)單元，例如上面描述的。例如，可以將作為特異性結(jié)合對(duì)的一個(gè)單元的報(bào)道分子放入并與探針接觸，所述探針與特異性結(jié)合對(duì)的另一個(gè)單元共軛。因此，釋放的報(bào)道分子將與共軛的探針結(jié)合起來(lái)，然后使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)容易地檢測(cè)(直接或間接地)。在下文將更詳細(xì)解釋?zhuān)?dāng)報(bào)道分子含有特異性結(jié)合構(gòu)件時(shí)，通常期望特異性結(jié)合構(gòu)件不同于連接到底物的另一個(gè)特異性結(jié)合構(gòu)件并且對(duì)另一個(gè)特異性結(jié)合構(gòu)件沒(méi)有特定的結(jié)合親和性。
不管報(bào)道分子是直接或是間接地產(chǎn)生信號(hào)，它可能含有顆粒(有時(shí)稱(chēng)為“珠”或“微珠”。尤其是，顆粒提高了報(bào)道分子穿過(guò)層析介質(zhì)并且固定在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的能力，例如如下所述。例如，可以使用天然存在的顆粒，如核、支原體、質(zhì)粒、質(zhì)體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞影)、單細(xì)胞的微生物(例如，細(xì)菌)、多糖(例如，瓊脂糖)，等等。此外，也可以利用合成的顆粒。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用熒光或有色染料標(biāo)記的膠乳粒子。雖然可以使用任何的膠乳顆粒，但是膠乳粒子通常是由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、聚乙酸乙烯基酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚對(duì)苯二甲酸亞丁基酯、丙烯腈、乙烯氯丙烯酸酯等，或其醛、羧基、氨基、羥基或酰肼衍生物形成的。其它合適的顆粒描述于Jou等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459。市場(chǎng)上可買(mǎi)到的合適的熒光顆粒的例子包括由Molecular Probes，Inc.以商品名“FluoSphere”(Red 580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)出售的熒光羧化物微球，以及也是由Eugene，Oregon.的MolecularProbes，Inc.出售的“Texas Red”和5-和6-羧四甲基若丹明。另外，市場(chǎng)上可買(mǎi)到的合適的染色膠乳微粒的例子包括由Fishers，Indiana的Bangs Laboratories，Inc.出售的羧基膠乳珠。
使用時(shí)，所述顆粒的形狀常常可以變化。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，顆粒是球形的。但是，應(yīng)當(dāng)清楚其它形狀也是本發(fā)明所考慮的，如板、棒、圓片、條、管、不規(guī)則的形狀，等等。此外，所述顆粒的尺寸也可以變化。例如，所述顆粒的平均尺寸(例如，直徑)可以從大約0.1納米到大約1,000微米，在一些實(shí)施方案中，從大約0.1納米到大約100微米，以及在一些實(shí)施方案中，從大約1納米到大約10微米。例如，“微米級(jí)”的顆粒是通常所期望的。使用時(shí)，此類(lèi)“微米級(jí)”的顆?？删哂写蠹s索梅微米到大約1,000微米的平均尺寸，在一些實(shí)施方案中，從大約1微米到大約100微米，以及在一些實(shí)施方案中，從大約1微米到大約10微米。同樣地，也可以使用“納米級(jí)”的顆粒。此類(lèi)“納米級(jí)”的顆?？删哂写蠹s0.1納米到大約10納米的平均尺寸，在一些實(shí)施方案中，從大約0.1納米到大約5納米，以及在一些實(shí)施方案中，從大約1納米到大約5納米。
使用任何各種公知的技術(shù)，通常將所述的特異性結(jié)合構(gòu)件與報(bào)道分子連接于所述底物。例如，可以使用羧基、氨基、醛、溴乙?；⒌庖阴；€基、環(huán)氧和其它活性官能團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合構(gòu)件和/或報(bào)道分子到底物的共價(jià)連接，以及通過(guò)殘余的游離基和自由基的偶合反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)。表面官能團(tuán)也可以作為官能化的共同單體被引入，因?yàn)樗鰣?bào)道分子的表面可含有比較高的極性基團(tuán)表面濃度。在某些情況下，所述特異性結(jié)合構(gòu)件和/或報(bào)道分子能直接共價(jià)鍵合到底物，而不需要進(jìn)一步的修飾。同樣應(yīng)該理解，除了共價(jià)鍵合以外，其它的連接技術(shù)(如物理吸附)也可以用于本發(fā)明。還有其它的非共價(jià)鍵合技術(shù)可使用抗體和/或抗原，如次級(jí)抗體(例如，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和/或生物素)。
現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述一種具體的用于將報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件共價(jià)鍵合到底物的技術(shù)。在這個(gè)具體實(shí)施方案中，底物是β-酪蛋白，報(bào)道分子是染色顆粒，而特異性結(jié)合構(gòu)件是生物素衍生物。例如，報(bào)道分子可以是從Molecular Probes，Inc.中獲得的名為“FiuoSphere”的紅色羧基膠乳顆粒。同樣地，特異性結(jié)合構(gòu)件可以是磺酸基琥珀酰亞胺基-6-(生物素-酰胺基)己酸酯，其是從Rockford，Illinois的Pierce Biotechnology，Inc.得到的，名為EZ-Link磺酸基-NHS-LC-生物素。認(rèn)為用于制備此類(lèi)NHS-活化的生物素的技術(shù)描述于Bremmer等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,872,261，以其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
對(duì)于與β-酪蛋白共價(jià)結(jié)合的染色顆粒，用碳化二亞胺(例如，乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC))首次活化顆粒表面上的羧基，如圖2所示。因?yàn)榈鞍缀吞堑鞍椎孜?例如，β-酪蛋白)通常具有伯胺基團(tuán)(NH2)，例如在賴(lài)氨酸(K)殘余物的側(cè)鏈和/或各個(gè)多肽的N-末端，然后所述活化的羧基可與底物的伯胺(-NH2)基團(tuán)反應(yīng)以形成酰胺鍵。這個(gè)反應(yīng)可以在緩沖液，如磷酸緩沖鹽水(PBS)(例如，pH值7.2)、2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)或硼酸鹽緩沖液(例如，pH值8.5)中發(fā)生。如果需要，然后可將產(chǎn)生的反應(yīng)性復(fù)合物用乙醇胺保護(hù)，例如，來(lái)保護(hù)任何其余的活性部位。
在有些相似的方法中，基于生物素的特異性結(jié)合構(gòu)件也可以被共價(jià)鍵合到β-酪蛋白。例如，NHS-活化的生物素可以與底物上存在的伯胺基團(tuán)(任選地在緩沖液的存在下)形成共價(jià)酰胺鍵。將一個(gè)此類(lèi)反應(yīng)的例子顯示在下面
一旦形成，使用者可以讓試驗(yàn)樣品與反應(yīng)性復(fù)合物一起培養(yǎng)一段時(shí)間。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員依靠所研究的酶的活性能容易地確定出用于酶-催化反應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間，其依次部分地取決于溫度、pH值、底物濃度、抑制劑(競(jìng)爭(zhēng)性的(與酶結(jié)合)、無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性的(與酶-底物復(fù)合物結(jié)合)或非競(jìng)爭(zhēng)性的(與酶和/或酶-底物復(fù)合物結(jié)合))的存在?？筛鶕?jù)需要有選擇地控制這些因素以增加或減少培養(yǎng)時(shí)間。例如，培養(yǎng)時(shí)間可以大于大約1分鐘，在一些實(shí)施方案中從大約5分鐘到大約50分鐘，在一些實(shí)施方案中從大約10分鐘到大約25分鐘。同樣地，可以有選擇地控制pH值以促進(jìn)酶的活性。例如，試驗(yàn)樣品內(nèi)堿性物質(zhì)的高水平會(huì)導(dǎo)致pH值對(duì)于一些酶的最佳活性而言過(guò)高，例如大于8。具體地，酶可在pH值從大約3到大約8的水平具有最佳活性，以及在一些實(shí)施方案中，pH值從大約4到大約7。因此，如果需要，可以使用緩沖液或其它的改變pH值的化合物來(lái)保持所需要的pH值。
在培養(yǎng)之后，試驗(yàn)樣品內(nèi)存在的任何酶通常將裂解至少一部分反應(yīng)性復(fù)合物的底物。結(jié)果，可以形成各種物種，包括釋放的報(bào)道分子、釋放的特異性結(jié)合構(gòu)件、部分裂解的復(fù)合物(例如，酶-報(bào)道分子-底物-特異性結(jié)合構(gòu)件)，以及未反應(yīng)的復(fù)合物(例如，報(bào)道分子-底物-特異性結(jié)合構(gòu)件)。較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間和較大的酶濃度可導(dǎo)致得到的培養(yǎng)混合物中釋放的報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件的濃度更大。此外，應(yīng)當(dāng)清楚，根據(jù)底物和酶的性質(zhì)，“釋放的”報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件可以含有或可不必含有復(fù)合物的片段。例如，當(dāng)使用較長(zhǎng)鏈的底物(例如，蛋白質(zhì))時(shí)，釋放的報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件可含有來(lái)自蛋白質(zhì)底物的肽片段。相反，當(dāng)使用較短鏈的底物(例如，肽)時(shí)，釋放的報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件相對(duì)地不含這樣的片段。
根據(jù)本發(fā)明，診斷試驗(yàn)試劑盒還包含用于指示報(bào)道分子的存在或缺少的測(cè)定裝置。所述測(cè)定裝置使用層析介質(zhì)用于從培養(yǎng)混合物內(nèi)存在的其它物種中化學(xué)分離釋放的報(bào)道分子。與其它分離技術(shù)(如，離心)對(duì)比，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)層析介質(zhì)可簡(jiǎn)化并降低產(chǎn)生的眾多消費(fèi)者應(yīng)用的診斷試驗(yàn)試劑盒的成本，所述診斷試驗(yàn)試劑盒包括所需的一次性試劑盒。
參照?qǐng)D1，例如，現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定裝置20的一個(gè)實(shí)施方案，測(cè)定裝置20可以用來(lái)指示酶的存在或數(shù)量。如圖所示，測(cè)定裝置20包含任選地由載體21支持的層析介質(zhì)23。層析介質(zhì)23可由任何種類(lèi)的液體能夠通過(guò)的材料制成，例如流體性的通道、多孔膜，等等。例如，層析介質(zhì)23可以是由以下材料形成的多孔膜，所述材料例如是，但不限于天然的、合成的或合成修飾的天然存在材料，例如多糖(例如，纖維素材料(如，紙)和纖維素衍生物(如，醋酸纖維素和硝化纖維素))；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；硅石；無(wú)機(jī)材料，例如減活礬土、硅藻土、MgSO4或其它的與聚合物(如，氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯基酯共聚物)一起均勻地分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無(wú)機(jī)的精細(xì)粉碎的材料；布、天然存在的(例如，棉花)和合成的(例如，尼龍或人造絲)；多孔的凝膠，如硅膠、瓊脂糖、葡聚糖和明膠；聚合膜，如聚丙烯酰胺；等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，層析介質(zhì)由硝化纖維素和/或聚醚砜材料形成。應(yīng)該理解術(shù)語(yǔ)“硝化纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝化纖維素，或硝酸和其它酸的混合酯，其它酸例如是具有1-7個(gè)碳原子的脂肪族羧酸。
所述載體21可以由任何能夠支持層析介質(zhì)23的材料形成。雖然不要求，但載體21可以是透明的，以便光能容易地從中穿過(guò)。另外，通常期望載體21是液體-不能滲透的，以便流過(guò)介質(zhì)的液體不會(huì)滲漏過(guò)載體21。用于載體的合適的材料的例子包括，但不限于玻璃；聚合材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如，Mylar膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、環(huán)氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺；等等。如本領(lǐng)域所熟知的，可將層析介質(zhì)23澆鑄到載體21上，將其中產(chǎn)生的薄片模切成所需的大小和形狀?；蛘撸蓪游鼋橘|(zhì)23簡(jiǎn)單地用例如粘合劑層壓到載體21上。在一些實(shí)施方案中，將硝化纖維素或尼龍多孔膜粘附到Mylar膜上。粘合劑用于將多孔膜粘合到Mylar膜上，例如是壓敏粘合劑。認(rèn)為這種類(lèi)型的片狀結(jié)構(gòu)是可以從Millipore Corp.(Bedford，Massachusetts)購(gòu)買(mǎi)到的。其它合適的片狀結(jié)構(gòu)的例子描述于Durlev，III等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,075,077，以它的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
測(cè)定裝置20還可以利用吸收性材料28。吸收性材料28常常接收從整個(gè)層析介質(zhì)23流過(guò)的液體。如本領(lǐng)域所熟知的，吸收性材料28可以幫助促進(jìn)毛細(xì)管作用和液體流過(guò)介質(zhì)23。
以上描述的培養(yǎng)方法可在試驗(yàn)樣品施加到層析介質(zhì)23之前進(jìn)行，或作為測(cè)定步驟的一部分引入(即，在施加試驗(yàn)樣品之后進(jìn)行培養(yǎng)，例如將試驗(yàn)樣品施加到培養(yǎng)孔內(nèi))。例如，可將培養(yǎng)混合物直接施加到部分層析介質(zhì)上，培養(yǎng)混合物可沿著圖1中箭頭“L”說(shuō)明的方向通過(guò)層析介質(zhì)23?；蛘?，可將混合物首先施加到樣品襯墊22或其它與層析介質(zhì)23液體連通的材料上。一些合適的可以用于形成樣品襯墊22的材料包括，但不限于硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯襯墊和玻璃纖維過(guò)濾紙。如果需要，樣品襯墊22還可以包含一種或多種擴(kuò)散或非擴(kuò)散地附在其上的測(cè)定預(yù)處理試劑。
無(wú)論如何，層析介質(zhì)23限定第一檢測(cè)區(qū)域31，在第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)能夠俘獲和檢測(cè)(例如，間接地)特異性結(jié)合構(gòu)件。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一接收材料固定在第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)，作為用于釋放特異性結(jié)合構(gòu)件的固定結(jié)合位點(diǎn)，特異性結(jié)合構(gòu)件存在于未反應(yīng)的復(fù)合物上，或特異性結(jié)合構(gòu)件存在于部分裂解的復(fù)合物上。例如，在一些實(shí)施方案中，第一接收材料可以是生物接收材料。此類(lèi)生物接收材料是本領(lǐng)域所熟知的并且可以包括，但不限于抗體、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效應(yīng)物和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶以及其衍生物。當(dāng)試驗(yàn)樣品中酶的濃度開(kāi)始增加時(shí)，釋放出更多的報(bào)道分子，所述報(bào)道分子對(duì)在第一檢測(cè)區(qū)域31的接收材料很少或沒(méi)有特定的結(jié)合親和性。減少的第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)報(bào)道分子的數(shù)量導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度下降。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的減少，可以容易地確定酶的存在或濃度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，酶的數(shù)量與第一檢測(cè)區(qū)域31的信號(hào)強(qiáng)度I1成反比。如果需要，可以將信號(hào)強(qiáng)度I1對(duì)已知的酶濃度范圍的酶濃度繪圖，以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。根據(jù)該強(qiáng)度曲線可將信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)槊傅臐舛?，以確定未知試驗(yàn)樣品中酶的數(shù)量。
第一檢測(cè)區(qū)域31通常提供許多不同的檢測(cè)區(qū)域以便使用者能更好地確定試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的濃度。每個(gè)區(qū)域可包含相同或不同的接收材料。例如，檢測(cè)區(qū)域31可以包括兩個(gè)或多個(gè)不同的檢測(cè)區(qū)域(例如，線、點(diǎn)，等等)。使用兩個(gè)或多個(gè)不同的檢測(cè)區(qū)域可以提供一些好處，例如便于半定量和/或抑制由于反應(yīng)性復(fù)合物或其它材料的超限造成的潛在的假陽(yáng)性。所述檢測(cè)區(qū)域可以以基本上垂直于試驗(yàn)樣品流經(jīng)層析介質(zhì)23的方向線性排列。同樣地，在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)區(qū)域可以以基本上平行于試驗(yàn)樣品流經(jīng)層析介質(zhì)23的方向線性排列。應(yīng)該理解第一檢測(cè)區(qū)域31的一個(gè)或多個(gè)不同的區(qū)域可以顯示出上述信號(hào)強(qiáng)度和酶濃度之間的關(guān)系；但是，每個(gè)不同的區(qū)域不必都顯示出這樣的關(guān)系。例如，在一些實(shí)施方案中，多個(gè)不同的區(qū)域中僅有一個(gè)區(qū)域顯示出信號(hào)強(qiáng)度與酶的濃度成反比。其它不同區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度，例如那些用于減少假陽(yáng)性的區(qū)域，則保持恒定，或顯示出信號(hào)強(qiáng)度的增加和/或減少。只要檢測(cè)區(qū)域31的至少一個(gè)不同的區(qū)域滿(mǎn)足所述的反比關(guān)系，就認(rèn)為由第一檢測(cè)區(qū)域31顯示的信號(hào)強(qiáng)度與酶的濃度成反比。
根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)需要的應(yīng)用有選擇地控制對(duì)于所研究酶的檢測(cè)靈敏度水平。一種具體的用于控制所述檢測(cè)靈敏度的技術(shù)包括控制用于第一檢測(cè)區(qū)域31的第一接收材料的數(shù)量。例如，當(dāng)分析懷疑含有很大濃度的酶的試樣時(shí)，第一接收材料的數(shù)量可以等于或大于需要俘獲所用的全部反應(yīng)性復(fù)合物的最小量。因此，如果沒(méi)有酶存在于試驗(yàn)樣品中，則所有反應(yīng)性復(fù)合物將固定在檢測(cè)區(qū)域31和所有報(bào)道分子將存在在第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)。俘獲所有反應(yīng)性復(fù)合物需要的最小數(shù)量可以用實(shí)驗(yàn)方法來(lái)確定，并且通常取決于使用的反應(yīng)性復(fù)合物的數(shù)量以及第一接收材料和特異性結(jié)合構(gòu)件之間的結(jié)合親和性。
在需要提高的檢測(cè)靈敏度的應(yīng)用(例如，低的懷疑的酶濃度或短的培養(yǎng)時(shí)間)中，第一接收材料的數(shù)量可以小于俘獲所需要使用的全部反應(yīng)性復(fù)合物的最小量。使用這樣有限數(shù)量的第一接收材料可以提供許多好處，包括降低任何部分裂解的復(fù)合物在第一檢測(cè)區(qū)域31被俘獲的可能性，否則會(huì)導(dǎo)致測(cè)定的酶濃度略低于實(shí)際的濃度。也就是說(shuō)，當(dāng)酶濃度增加時(shí)，從反應(yīng)性復(fù)合物釋放出更多的特異性結(jié)合構(gòu)件。由于它們的分子尺寸較小，這些釋放的特異性結(jié)合構(gòu)件通常比部分裂解的復(fù)合物和未反應(yīng)的復(fù)合物更快地到達(dá)第一檢測(cè)區(qū)域31，并且因此具有更高的有效結(jié)合位點(diǎn)的占據(jù)概率。此外，部分裂解的復(fù)合物通常還比完全未反應(yīng)的復(fù)合物含有較少的特異性結(jié)合構(gòu)件。這種特異性結(jié)合構(gòu)件數(shù)量的減少在統(tǒng)計(jì)上減少了部分裂解的復(fù)合物與第一檢測(cè)區(qū)域31結(jié)合的可能性。
正如以上的討論，酶濃度和信號(hào)強(qiáng)度之間的反比關(guān)系可以與試驗(yàn)樣品中的實(shí)際的酶濃度相關(guān)聯(lián)。但是，因?yàn)椴⒉豢偸切枰褂妹笣舛取霸黾印迸c信號(hào)強(qiáng)度“減少”相互關(guān)聯(lián)的測(cè)定形式(例如，消費(fèi)者應(yīng)用)，所以本發(fā)明還提供酶濃度“增加”與信號(hào)強(qiáng)度“增加”直接相關(guān)聯(lián)的實(shí)施方案。在此類(lèi)情況下，可以利用另外的檢測(cè)區(qū)域。例如，再次參照?qǐng)D1，層析介質(zhì)23還可限定位于第一檢測(cè)區(qū)域31下游的第二檢測(cè)區(qū)域35。第二檢測(cè)區(qū)域35可以提供一個(gè)或多個(gè)不同的區(qū)域(例如，線、點(diǎn)，等等)，并且可以位于任何相對(duì)于試驗(yàn)樣品流動(dòng)的方向。
在第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)，可以俘獲和檢測(cè)任何在檢測(cè)區(qū)域31沒(méi)有與第一接收材料結(jié)合的釋放的報(bào)道分子、部分裂解的復(fù)合物或未反應(yīng)的復(fù)合物。俘獲釋放的報(bào)道分子的方法可取決于所用報(bào)道分子的性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，可將第二接收材料固定在用于俘獲報(bào)道分子的第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)。例如，第二接收材料可以是生物接收材料，例如，但不限于抗體、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效應(yīng)物和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶，以及其衍生物。因?yàn)槠谕诙邮詹牧咸囟ǖ亟Y(jié)合到報(bào)道分子，所以第二接收材料通常不同于第一接收材料。
例如，釋放的報(bào)道分子可以與選擇的對(duì)第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)的第二接收材料有親和性的特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合?？梢允褂萌魏喂募夹g(shù)將特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合到報(bào)道分子，例如通過(guò)如上所述的共價(jià)鍵合和/或物理吸附。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將所述報(bào)道分子的羧基活化并與抗體的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。在這種情況下，釋放的報(bào)道分子可通過(guò)抗體和接收材料之間的結(jié)合而被固定在第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)，以便檢測(cè)由可檢測(cè)的物質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)。例如，第一接收材料可以是次級(jí)抗體(如抗生物素抗體，例如山羊抗小鼠IgG抗體)、抗生物素蛋白(高陽(yáng)離子的66,000道爾頓糖蛋白)、鏈霉抗生物素蛋白(非糖基化的52,800道爾頓蛋白質(zhì))、中性抗生物素蛋白(去糖基的抗生物素蛋白衍生物)或captavidin(硝化的抗生物素蛋白衍生物)。在這個(gè)實(shí)施方案中，第一接收材料可以與生物素(小鼠IgG抗體)的特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合起來(lái)。例如，所述報(bào)道分子可以是與C反應(yīng)蛋白結(jié)合的熒光染色顆粒，其可以與單克隆抗體第二接收材料(例如，抗C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體)結(jié)合起來(lái)。
當(dāng)然，也可以使用任何其它的用于俘獲和檢測(cè)釋放的報(bào)道分子的適用技術(shù)。例如，在一些實(shí)施方案中，可將非生物接收材料固定在用于俘獲釋放的報(bào)道分子的第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)。此類(lèi)非生物接收材料在俘獲，例如包含標(biāo)記顆粒的釋放的報(bào)道分子中是特別有用的。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接收材料是聚電解質(zhì)。聚電解質(zhì)可以有正或負(fù)電荷，以及通常為中性的凈電荷。一些合適的具有凈正電荷的聚電解質(zhì)的例子包括，但不限于聚賴(lài)氨酸(可從Sigma-Aldrich ChemicalCo.Inc.(St.Louis，Missouri)購(gòu)買(mǎi)到)、聚乙烯亞胺；環(huán)氧氯丙烷-官能化的聚胺和/或聚酰氨基胺，如(二甲胺-環(huán)氧氯丙烷)共聚物；聚二烯丙基二甲基-氯化銨；陽(yáng)離子纖維素衍生物，如纖維素共聚物或用季銨水溶性單體接枝的纖維素衍生物；等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以利用CelQuatSC-230M或H-100(可從National Starch& Chemical，Inc.獲得)，它們是含有季銨水溶性單體的纖維素衍生物。此外，一些合適的具有凈負(fù)電荷的聚電解質(zhì)的例子包括，但不限于聚丙烯酸，如(乙烯-甲基丙烯酸鈉鹽)共聚物，等等。同樣應(yīng)該理解其它聚電解質(zhì)也可以用于本發(fā)明，如兩親的聚電解質(zhì)即，具有極性和非極性的部分)。例如，一些合適的兩親的聚電解質(zhì)的例子包括，但不限于聚(苯乙烯基-嵌段-N-甲基2-乙烯基吡啶碘化物)和聚(苯乙烯基-嵌段-丙烯酸)，二者都可從Polymer Souree，Inc.(Dorval，Canada)獲得。其它的聚電解質(zhì)的例子更詳細(xì)地描述于Song等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布No.2003/0124739，以它全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
雖然通?？梢岳萌魏尉垭娊赓|(zhì)，但是選擇用于具體應(yīng)用的聚電解質(zhì)可以取決于釋放的報(bào)道分子的性質(zhì)而變化。特別地，聚電解質(zhì)分布電荷讓其結(jié)合到具有相反電荷的物質(zhì)上。因此，例如，具有凈正電荷的聚電解質(zhì)常常會(huì)較好地與帶陰電荷的釋放的報(bào)道分子(例如，染色顆粒)結(jié)合，而具有凈負(fù)電荷的聚電解質(zhì)常常會(huì)較好地結(jié)合到帶陽(yáng)電荷的釋放的報(bào)道分子。因此，在這種情況中，這些分子間的離子相互作用讓所需要的結(jié)合發(fā)生在第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)。然而，雖然主要是利用離子相互作用來(lái)達(dá)到所需要的結(jié)合，但是也發(fā)現(xiàn)聚電解質(zhì)可以與具有相似電荷的報(bào)道分子結(jié)合。
除了使用接收材料之外，還可以利用其它的俘獲技術(shù)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道分子可以含有能夠被磁性裝置俘獲的磁性物質(zhì)。通常，如果材料受施加磁場(chǎng)的影響，例如，如果一種材料被吸引或排斥或者具有可檢測(cè)的磁化率或感應(yīng)，則認(rèn)為該材料是“磁性的”或“有磁力感應(yīng)的”。例如，一些合適的可以用來(lái)給予磁性的有磁力感應(yīng)的物質(zhì)的例子包括但不限于順磁性物質(zhì)、超順磁性物質(zhì)、鐵磁體物質(zhì)、亞鐵磁性材料和變磁性材料。具體的例子是金屬，例如鐵、鎳、鈷、鉻和錳；鑭系元素，例如釹、鉺；合金，例如鋁、鎳、鈷或銅的磁性合金；氧化物，例如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)，氧化鎳(NiO2)或氧化錳(Mn2O3)；復(fù)合材料，例如鐵酸鹽；以及固態(tài)溶液，例如帶有氧化鐵的磁鐵礦。在一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子含有用如上所述的可檢測(cè)的物質(zhì)染色的磁性顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，磁性裝置靠近(例如，在下面)由層析介質(zhì)23限定的第二檢測(cè)區(qū)域35。用這樣的方式，磁性裝置可以將釋放的報(bào)道分子，以及任何部分裂解的或未反應(yīng)的復(fù)合物固定在第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)。任何磁性裝置可以用于本發(fā)明。例如，磁場(chǎng)發(fā)生器可以用來(lái)產(chǎn)生引起磁性物質(zhì)反應(yīng)的磁場(chǎng)。合適的磁場(chǎng)發(fā)生器包括，但不限于永磁體和電磁體。一些市場(chǎng)上可買(mǎi)到的合適的磁性分離裝置的例子包括由Dynal，Inc.(Lake Success，New York)生產(chǎn)的Dynal M PC系列的分離器，其使用位于容納試驗(yàn)介質(zhì)的容器外部的永磁體。其它的磁性設(shè)備描述于Liberti等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,200,084；Tuunanen等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,647,994；Wang等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,795,470；以及Siddiqi的美國(guó)專(zhuān)利No.6,033,574，以它們的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
當(dāng)報(bào)道分子含有直接可檢測(cè)的物質(zhì)時(shí)，由于釋放的報(bào)道分子和/或部分裂解的復(fù)合物的存在，酶濃度的增加導(dǎo)致第二檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度I2增加。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度的增加，可以容易地確定酶的存在或濃度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，酶的數(shù)量與第二檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度I2成正比，如果需要，可將信號(hào)強(qiáng)度I2對(duì)已知酶濃度范圍的酶濃度繪圖以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。根據(jù)該強(qiáng)度曲線可將信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)槊傅臐舛?，以確定未知試驗(yàn)樣品中酶的數(shù)量。應(yīng)該理解，正如以上對(duì)于第一檢測(cè)區(qū)域31的討論，只要第二檢測(cè)區(qū)域35的至少一個(gè)不同的區(qū)域滿(mǎn)足所述正比關(guān)系，就認(rèn)為由第二檢測(cè)區(qū)域35顯示的信號(hào)強(qiáng)度與酶的濃度成正比。
并且，在第一檢測(cè)區(qū)域31的信號(hào)強(qiáng)度(I1)和第二檢測(cè)區(qū)域35(I2)之間也可存在反比關(guān)系。例如，因?yàn)榇嬖陬A(yù)定量的報(bào)道分子，所以在第二檢測(cè)區(qū)域35俘獲的數(shù)量與在第一檢測(cè)區(qū)域31俘獲的數(shù)量成反比。這種反比關(guān)系的結(jié)果是在一些情況中通過(guò)比較兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度可以在擴(kuò)大范圍更有效地測(cè)定酶的濃度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，酶的數(shù)量正比于信號(hào)強(qiáng)度“I2”與信號(hào)強(qiáng)度“I1”的比值。基于該比值落入的范圍，可以確定出酶的一般濃度范圍。如果需要，可以將I2與I1的比值對(duì)已知范圍酶濃度的酶濃度繪圖，以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。根據(jù)該強(qiáng)度曲線可將信號(hào)強(qiáng)度比值轉(zhuǎn)變?yōu)槊傅臐舛龋源_定未知試驗(yàn)樣品中酶的數(shù)量。應(yīng)該注意到可將I1和I2之間的另一種數(shù)學(xué)關(guān)系對(duì)酶濃度繪圖以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將I2/(I2+I1)的值對(duì)酶濃度繪圖以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。
如上所述，本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以利用不可直接檢測(cè)的報(bào)道分子。因此，在釋放時(shí)，通常期望報(bào)道分子與用于隨后的檢測(cè)的物質(zhì)以一些方式相互作用。例如，可以使用能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的探針，將探針裝配起來(lái)與釋放的報(bào)道分子結(jié)合。例如，探針可以含有用可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記或以別的方式施加的顆粒。在一些情況下，希望以一些方式來(lái)修飾探針。例如，可以用特異性結(jié)合構(gòu)件來(lái)修飾探針以形成對(duì)釋放的報(bào)道分子有特異性親和性的結(jié)合的探針。通?？梢允褂萌魏喂募夹g(shù)將特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合到探針，例如通過(guò)如上所述的共價(jià)鍵合和/或物理吸附。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將在探針表面的羧基活化并與特異性結(jié)合構(gòu)件的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。在利用時(shí)，通常期望用于探針和報(bào)道分子的特異性結(jié)合對(duì)不同于用于第一接收材料和另一個(gè)連接到底物的特異性結(jié)合構(gòu)件的特異性結(jié)合對(duì)。這有助于保證探針和報(bào)道分子基本上與上面描述的結(jié)合機(jī)理不抵觸。
所述探針可以在酶探測(cè)過(guò)程的任何階段與釋放的報(bào)道分子接觸。例如，在一些實(shí)施方案中，可將探針施加到位于期望檢測(cè)的區(qū)域上游位置的測(cè)定裝置20。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將探針施加到結(jié)合襯墊(未顯示)，所述襯墊位于檢測(cè)區(qū)域31和35的上游，但在樣品襯墊22的下游。
在此類(lèi)實(shí)施方案中，各種測(cè)定形式可以用來(lái)檢測(cè)所釋放的報(bào)道分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，利用“三明治”測(cè)定形式，選擇其中釋放的報(bào)道分子來(lái)吸引結(jié)合探針的特異性結(jié)合構(gòu)件。所述釋放的報(bào)道分子(例如抗體、抗原，等等)通常具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(例如，抗原表位)。通過(guò)結(jié)合探針的特異性結(jié)合構(gòu)件來(lái)占據(jù)這些結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。但是，釋放的報(bào)道分子的游離結(jié)合位點(diǎn)隨后可以與固定在第二檢測(cè)區(qū)域35內(nèi)的接收材料結(jié)合以形成新的三重的三明治復(fù)合物?；蛘?，可以使用直接或間接的“競(jìng)爭(zhēng)性的”測(cè)定形式來(lái)檢測(cè)釋放的報(bào)道分子。在這種情況中，結(jié)合探針的特異性結(jié)合構(gòu)件可以與釋放的報(bào)道分子相同或是釋放的報(bào)道分子的類(lèi)似物。因此，在到達(dá)第二檢測(cè)區(qū)域35時(shí)，結(jié)合的檢測(cè)探針和釋放的報(bào)道分子競(jìng)爭(zhēng)固定接收材料的有效結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)然，任何其它的測(cè)定形式也適用于本發(fā)明。
對(duì)于上面描述的實(shí)施方案，其中的報(bào)道分子是可間接地檢測(cè)的，在試驗(yàn)樣品內(nèi)酶濃度的增加會(huì)導(dǎo)致釋放出更許多種報(bào)道分子。因此，如果使用三明治測(cè)定形式，更多釋放的報(bào)道分子與結(jié)合探針結(jié)合起來(lái)以使酶的數(shù)量與第二檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度成正比。另一方面，如果使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定形式，酶的數(shù)量與第二檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度成反比。在任何情況下，可以將信號(hào)強(qiáng)度對(duì)已知酶濃度范圍的酶濃度繪圖，以產(chǎn)生強(qiáng)度曲線。根據(jù)該強(qiáng)度曲線可將信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)槊傅臐舛?，以確定未知試驗(yàn)樣品中酶的數(shù)量。
參照?qǐng)D3，現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述使用熒光來(lái)檢測(cè)蛋白酶存在的方法的一種具體實(shí)施方案。最初，將含有蛋白酶P的試驗(yàn)樣品與反應(yīng)性復(fù)合物41混合，每個(gè)反應(yīng)性復(fù)合物41包括連接到底物47(例如，蛋白質(zhì)或糖蛋白)的熒光顆粒43和特異性結(jié)合構(gòu)件45(例如，生物素化物質(zhì))。讓所述復(fù)合物41培養(yǎng)足夠的時(shí)間以形成培養(yǎng)混合物(在圖3中標(biāo)明為數(shù)字65)，所述培養(yǎng)混合物包括釋放的熒光顆粒43和特異性結(jié)合構(gòu)件45以及未反應(yīng)的復(fù)合物41、部分裂解的復(fù)合物49、蛋白酶P和由酶-催化反應(yīng)產(chǎn)生的任何產(chǎn)品(未顯示)。將培養(yǎng)混合物65施加在樣品襯墊22上，如圖示的指向箭頭所示，然后移動(dòng)到第一檢測(cè)區(qū)域31。由于它們的尺寸較小，釋放的特異性結(jié)合構(gòu)件45流動(dòng)更快并且具有更高的被第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)第一接收材料90俘獲的概率。第一檢測(cè)區(qū)域31內(nèi)的有效結(jié)合位點(diǎn)也可以被一些未反應(yīng)的復(fù)合物41和部分裂解的復(fù)合物49占據(jù)。但是，沒(méi)有被第一檢測(cè)區(qū)域31俘獲的任何未反應(yīng)的復(fù)合物41和部分裂解的復(fù)合物49移動(dòng)到第二檢測(cè)區(qū)域35并與含在其中的第二接收材料(未顯示)結(jié)合起來(lái)。因?yàn)獒尫诺臒晒忸w粒43對(duì)于第一接收材料90沒(méi)有親和性，所以它們也移動(dòng)到第二檢測(cè)區(qū)域35并與第二接收材料結(jié)合起來(lái)。
一旦被俘獲，可以在第一檢測(cè)區(qū)域31和/或第二檢測(cè)區(qū)域35測(cè)量所述熒光顆粒43的信號(hào)強(qiáng)度。熒光檢測(cè)通常利用波長(zhǎng)過(guò)濾器以從激發(fā)光子中分離發(fā)射光子和利用檢測(cè)器來(lái)記錄發(fā)射光子并產(chǎn)生可記錄的輸出，通常以電信號(hào)或攝影圖象的方式。一種合適的用于本發(fā)明的熒光檢測(cè)器是由SPEX Industries，Inc.(Edison，New Jersey)出售的FluoroLog III分光熒光計(jì)。合適的熒光檢測(cè)器的另一個(gè)例子描述于Song等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布No.2004/0043502，以它的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。雖然在這個(gè)具體的實(shí)施方案中利用熒光，但是應(yīng)該理解任何其它已知的檢測(cè)技術(shù)也可以用在本發(fā)明中。例如，其它合適的光檢測(cè)技術(shù)可以包括但不限于磷光、衍射、反射率、透光度，等等。光讀出器能夠發(fā)射光并且還能記錄檢測(cè)信號(hào)(例如，傳送或反射的光、發(fā)射的熒光或磷光，等等)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以利用反射分光光度計(jì)或讀出器來(lái)檢測(cè)報(bào)道分子的存在，所述報(bào)道分子顯示可見(jiàn)的顏色(例如染色膠乳微粒)。一種合適的反射率讀數(shù)器描述于Kaylor等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布No.2003/0119202，以它的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考用于所有目的。
與用于測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度的技術(shù)無(wú)關(guān)，蛋白酶P的絕對(duì)量可以通過(guò)比較第一檢測(cè)區(qū)域31的信號(hào)強(qiáng)度與第二檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定。例如，如上所述，蛋白酶P的數(shù)量可以通過(guò)I2/I1的比值并使用先前確定的強(qiáng)度曲線將這個(gè)比值轉(zhuǎn)化成酶濃度來(lái)確定。或者，也可以獨(dú)立地使用信號(hào)強(qiáng)度I1或I2以標(biāo)明酶的存在或濃度。當(dāng)然，本發(fā)明還預(yù)期定性的實(shí)施方案，在定性的實(shí)施方案中僅僅通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度確認(rèn)酶的存在，沒(méi)有具體的相互關(guān)系來(lái)確定實(shí)際的酶濃度。
在酶的上下文中具體地描述了上述檢測(cè)技術(shù)。但是，正如所描述的，本發(fā)明同樣地適于檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的存在或數(shù)量。為了檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的存在，可以將預(yù)定量的相應(yīng)的酶與所述試驗(yàn)樣品混合并培養(yǎng)。在一定量的酶抑制劑存在下，酶-催化反應(yīng)不能以可檢測(cè)的速度進(jìn)行。因此，酶抑制劑濃度和信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系將與酶濃度和信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系相反。作為例證，酶-催化反應(yīng)不會(huì)在一定量抑制劑的存在下發(fā)生。因此，所有的反應(yīng)性復(fù)合物會(huì)在檢測(cè)區(qū)域31被俘獲，產(chǎn)生它的最大信號(hào)強(qiáng)度。另一方面，當(dāng)酶抑制劑的數(shù)量減少時(shí)，酶會(huì)引起報(bào)道分子從如上所述的反應(yīng)性復(fù)合物釋放。由于存在的釋放的報(bào)道分子相應(yīng)的減少，因此在檢測(cè)區(qū)域31產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度開(kāi)始減少。同樣地，在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)區(qū)域35產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)由于存在的釋放的報(bào)道分子的相應(yīng)增多而開(kāi)始增加。因此，在這個(gè)具體實(shí)施方案中，試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的數(shù)量與檢測(cè)區(qū)域31的信號(hào)強(qiáng)度成反比以及與檢測(cè)區(qū)域35的信號(hào)強(qiáng)度成正比。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的診斷試驗(yàn)試劑盒提供了相對(duì)簡(jiǎn)單和有成本效益的方法以快速地進(jìn)行酶或它們的抑制劑的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。所述試驗(yàn)試劑盒提供可見(jiàn)的試驗(yàn)結(jié)果，以便由進(jìn)行所述試驗(yàn)的人能以迅速的方式容易地觀察，以及在試驗(yàn)條件下有助于導(dǎo)出高度可靠和一致的試驗(yàn)結(jié)果。所述診斷試驗(yàn)試劑盒還是一次性的，以便如果需要，可以在所述試驗(yàn)結(jié)束時(shí)廢棄。
參考以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1最初將β-酪蛋白軛合到熒光顆粒上。具體地，將2毫升紅色羧化FluoroSphere顆粒(粒徑為0.5微米，2％固體含量，Molecular Probes，Inc.(Eugene Oregon))用磷酸緩沖鹽水(PBS)(Polysciences，Inc.(Warrington，Pennsylvania))洗滌一次，然后懸浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亞胺(Polysciences，Inc.)并將所得混合物搖動(dòng)30分鐘。將所述顆粒用硼酸鹽緩沖液(Polysciences，Inc.)洗滌兩次，然后懸浮在1毫升硼酸鹽緩沖液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.(St.Louis，Missouri))并將混合物在室溫下?lián)u動(dòng)過(guò)夜。將所述顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌一次，然后再懸浮在500微升硼酸鹽緩沖液中。將1毫升乙醇胺溶液(0.1摩爾，Polysciences Inc.)加入到顆粒中并搖動(dòng)30分鐘。然后將所述顆粒用水洗滌四次并懸浮在2毫升硼酸鹽緩沖液中。
在形成后，將軛合的顆粒(以下稱(chēng)“FCM-酪蛋白”)生物素化。具體地，將在200微升硼酸鹽緩沖液中的4毫克FCM-酪蛋白顆粒與200微升硼酸鹽緩沖液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois))混合。將混合物搖動(dòng)過(guò)夜，然后用水洗滌五次。將洗滌的顆粒懸浮在1毫升三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中(pH值7.2，20毫摩爾)。將生物素化的軛合顆粒以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“FCM-酪蛋白-B”。
實(shí)施例2最初將β-酪蛋白軛合到染色顆粒上。具體地，將2毫升藍(lán)色羧化的顆粒(粒徑為0.3微米，Bangs Laboratories Inc.(Fisher，Indiana))用磷酸緩沖鹽水(PBS，來(lái)自Polysciences，Inc.(Warrington，Pennsylvania))洗滌一次，然后懸浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亞胺(Polysciences，Inc.)并將混合物搖動(dòng)30分鐘。所述顆粒用硼酸鹽緩沖液(Polysciences，Inc.)洗滌兩次，然后懸浮在1毫升硼酸鹽緩沖液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma AldrichChemical Co.，Inc.(St.Louis，Missouri))并將混合物在室溫下?lián)u動(dòng)過(guò)夜。將所述顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌一次，然后再懸浮在500微升硼酸鹽緩沖液中。將1毫升乙醇胺溶液(0.1摩爾，Polysciences Inc.)加入到所述顆粒中并搖動(dòng)30分鐘。然后將所述顆粒用水洗滌四次并懸浮在2毫升硼酸鹽緩沖液中。
在形成后，將軛合的顆粒(以下稱(chēng)“BP-酪蛋白”)生物素化。具體地，將在200微升硼酸鹽緩沖液中的4毫克BP-酪蛋白顆粒與200微升硼酸鹽緩沖液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois))混合。將混合物搖動(dòng)過(guò)夜，然后用水洗滌五次。將洗滌的顆粒懸浮在1毫升三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液中(pH值7.2，20毫摩爾)。將生物素化的軛合顆粒以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“BP-酪蛋白-B”。
實(shí)施例3證明根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(來(lái)自Millipore，Inc.(Bedford，Massachusetts)的HF12002)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來(lái)。將鏈霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測(cè)區(qū)域。將層狀卡片在37℃干燥1小時(shí)，然后切成4毫米寬的測(cè)定裝置。
向微孔板上的兩個(gè)孔中各加入25微升實(shí)施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)和75微升三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(pH值7.4)(一個(gè)樣品孔和一個(gè)對(duì)照孔)。將5微升來(lái)自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)、可從Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.獲得的金屬酶加入樣品孔。另外，將5微升減活的蛋白酶加入到對(duì)照孔。所述減活的蛋白酶是通過(guò)將活性蛋白酶煮沸5分鐘而得到的。讓每個(gè)孔中的混合物反應(yīng)20分鐘。然后將20微升各混合物轉(zhuǎn)入含有20微升吐溫20(2％，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然后將測(cè)定裝置樣品插入各自的孔中以開(kāi)始所述試驗(yàn)。測(cè)定進(jìn)行10分鐘之后，觀察各檢測(cè)區(qū)域的顏色強(qiáng)度。具體地，在插入對(duì)照孔中的測(cè)定裝置的檢測(cè)區(qū)域觀察到紅線，而在插入樣品孔中的測(cè)定裝置上沒(méi)有觀察到紅線。因此，通過(guò)檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶存在時(shí)下降了。
實(shí)施例4證明根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來(lái)。將鏈霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)使GoldlineTM膜(可從British Biocell International獲得的聚賴(lài)氨酸溶液)成條狀來(lái)形成第二檢測(cè)區(qū)域。將層狀卡片在37℃干燥1小時(shí)，然后切成4毫米寬的測(cè)定裝置。
然后提供六個(gè)含有25微升實(shí)施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)樣品(指定為樣品1-6)。將每個(gè)樣品用不同數(shù)量的來(lái)自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養(yǎng)15分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數(shù)量分別為0.0、0.2、1.0、2.0、10.0和20.0微克。對(duì)于樣品1(對(duì)照樣品)，還加入20微克減活的蛋白酶(通過(guò)煮沸30分鐘得到的)。在培養(yǎng)之后，然后將2微升各混合物轉(zhuǎn)入含有40微升吐溫20(1％，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然后將測(cè)定裝置樣品插入各自的孔中以開(kāi)始所述試驗(yàn)。在測(cè)定進(jìn)行10分鐘之后，觀察各檢測(cè)區(qū)域的顏色強(qiáng)度。定性結(jié)果在下面的表1中顯示。
表1檢測(cè)區(qū)域的定性顏色強(qiáng)度
如所顯示的，由第一檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下減小了，而由第二檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下增大了。
實(shí)施例5證明根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來(lái)。將鏈霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)使GoldlineTM膜(可從British Biocell International獲得的聚賴(lài)氨酸溶液)成條狀來(lái)形成第二檢測(cè)區(qū)域。將層狀卡片在37℃干燥1小時(shí)，然后切成4毫米寬的測(cè)定裝置。
然后提供六個(gè)含有50微克實(shí)施例2中形成的“BP-酪蛋白-B”的樣品(指定為樣品1-6)。將每個(gè)樣品用不同數(shù)量的來(lái)自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養(yǎng)10分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數(shù)量分別為0、5、10、20、40和200納克。對(duì)于樣品1(對(duì)照樣品)，還加入20微克減活蛋白酶(通過(guò)煮沸30分鐘得到的)。培養(yǎng)之后，然后將2微升各混合物轉(zhuǎn)入含有40微升吐溫20(1，Sigma-AldrichChemical Co.，Inc.)的孔中。
然后將測(cè)定裝置樣品插入各自的孔中以開(kāi)始所述試驗(yàn)。在測(cè)定進(jìn)行10分鐘之后，使用反射率讀數(shù)器測(cè)定各檢測(cè)區(qū)域的反射率強(qiáng)度。定量結(jié)果在下面的表2中顯示。
表2檢測(cè)區(qū)域的定量顏色強(qiáng)度
如所顯示的，由第一檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下減小了，而由第二檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下增大了。并且，I2/I1的比值在酶的存在下增加了。
實(shí)施例6
證明根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF 12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來(lái)。將兩個(gè)不同的鏈霉抗生物素蛋白線條(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)使GoldlineTM膜(可從BritishBiocell International獲得的聚賴(lài)氨酸溶液)成條狀來(lái)形成第二檢測(cè)區(qū)域。將層狀卡片在37℃干燥1小時(shí)，然后切成4毫米寬的測(cè)定裝置。
然后提供六個(gè)含有5微升實(shí)施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)的樣品(指定為樣品1-6)。將每個(gè)樣品用不同數(shù)量的來(lái)自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養(yǎng)10分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數(shù)量分別為0.0、0.1、0.2、1.0、2.0和10.0微克。對(duì)于樣品1(對(duì)照樣品)，還加入20微克減活蛋白酶(通過(guò)煮沸30分鐘得到的)。在培養(yǎng)之后，然后將2微升各混合物轉(zhuǎn)入含有40微升吐溫20(1，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然后將測(cè)定裝置樣品插入各自的孔中以開(kāi)始所述試驗(yàn)。在測(cè)定進(jìn)行10分鐘之后，觀察各檢測(cè)區(qū)域的顏色強(qiáng)度。定性結(jié)果在下面的表3中顯示。
表3檢測(cè)區(qū)域的定性顏色強(qiáng)度
如所顯示的，由第一檢測(cè)區(qū)域的第一條線顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下減小了，而由第二檢測(cè)區(qū)域顯示的信號(hào)強(qiáng)度在酶的存在下增大了。雖然由第一檢測(cè)區(qū)域的第二條線顯示的信號(hào)強(qiáng)度在開(kāi)始時(shí)增大了，但隨后在酶的存在下減小了。
雖然已經(jīng)參照具體的實(shí)施方案詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)對(duì)上文的理解，可以容易地想到這些實(shí)施方案的變更、變化和同等的實(shí)施方案。因此，應(yīng)將本發(fā)明的范圍確定為所附的權(quán)利要求和其任何同等物。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)的酶或其抑制劑的診斷試劑盒，所述試劑盒包括許多種反應(yīng)性復(fù)合物，每種反應(yīng)性復(fù)合物包括與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物，所述底物可被酶裂解；以及限定第一檢測(cè)區(qū)域的層析介質(zhì)，在該第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠俘獲所述的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中能夠在所述的第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生第一檢測(cè)信號(hào)，其中從所述的第一檢測(cè)信號(hào)可確定酶或其抑制劑的存在或數(shù)量。
2.一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品內(nèi)的酶或其抑制劑的方法，所述方法包括將試驗(yàn)樣品與許多種反應(yīng)性復(fù)合物接觸以形成培養(yǎng)混合物，所述的反應(yīng)性復(fù)合物各自包括與報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物，其中所述的底物可被酶裂解以釋放出所述報(bào)道分子和所述特異性結(jié)合構(gòu)件，所述報(bào)道分子能夠直接或間接地產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；將所述培養(yǎng)混合物施加在層析介質(zhì)上，所述的層析介質(zhì)限定第一檢測(cè)區(qū)域，在該第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠俘獲所述的特異性結(jié)合構(gòu)件；以及確定在所述第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的檢測(cè)信號(hào)的存在或強(qiáng)度。
3.權(quán)利要求1或2的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的酶是水解酶。
4.權(quán)利要求3的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的水解酶是蛋白酶或肽酶。
5.權(quán)利要求4的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的水解酶是絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶或堿性蛋白酶。
6.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的底物是蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、酯或其衍生物。
7.權(quán)利要求6的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的底物是酪蛋白、白蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白、角蛋白、明膠、胰島素、蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白或其衍生物。
8.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的報(bào)道分子包括能夠直接產(chǎn)生所述第一檢測(cè)信號(hào)的可檢測(cè)物質(zhì)。
9.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的報(bào)道分子包括特異性結(jié)合構(gòu)件。
10.權(quán)利要求9的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，進(jìn)一步地包括與特異性結(jié)合構(gòu)件軛合的探針，所述探針還包括能夠直接產(chǎn)生所述的檢測(cè)信號(hào)的可檢測(cè)物質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述探針的所述特異性結(jié)合構(gòu)件對(duì)所述報(bào)道分子的所述特異性結(jié)合構(gòu)件具有特異性的結(jié)合親和性。
12.權(quán)利要求10的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述探針的所述特異性結(jié)合構(gòu)件與所述報(bào)道分子的所述特異性結(jié)合構(gòu)件相同或是所述報(bào)道分子的所述特異性結(jié)合構(gòu)件的類(lèi)似物。
13.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中在所述的第一檢測(cè)區(qū)域內(nèi)固定接收材料，所述第一檢測(cè)區(qū)域?qū)λ龅奶禺愋越Y(jié)合構(gòu)件具有親和性。
14.權(quán)利要求13的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述接收材料的總數(shù)小于結(jié)合到所述反應(yīng)性復(fù)合物的總數(shù)上所需要的數(shù)量。
15.權(quán)利要求13的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述接收材料的總數(shù)等于或大于結(jié)合到所述反應(yīng)性復(fù)合物的總數(shù)上所需要的數(shù)量。
16.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中所述的層析介質(zhì)進(jìn)一步地包括第二檢測(cè)區(qū)域，在該第二檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠俘獲所述報(bào)道分子以產(chǎn)生第二檢測(cè)信號(hào)。
17.權(quán)利要求16的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中在所述的第二檢測(cè)區(qū)域內(nèi)固定第二接收材料，所述的第二接收材料對(duì)所述報(bào)道分子或其復(fù)合物具有親和性。
18.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中在試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的數(shù)量與所述第二檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度成正比。
19.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中在試驗(yàn)樣品內(nèi)酶的數(shù)量與所述第一檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度成反比。
20.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的診斷試驗(yàn)試劑盒或方法，其中在試驗(yàn)樣品內(nèi)酶抑制劑的數(shù)量與所述第一檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度成正比。
全文摘要
提供一種用于檢測(cè)酶或酶抑制劑的存在或數(shù)量的診斷試驗(yàn)試劑盒。所述診斷試劑盒利用反應(yīng)性復(fù)合物來(lái)方便酶或酶抑制劑的檢測(cè)。所述反應(yīng)性復(fù)合物包括與(例如，共價(jià)鍵合、物理吸附，等等)報(bào)道分子和特異性結(jié)合構(gòu)件連接的底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，將肽、蛋白或糖蛋白底物連接到報(bào)道分子(例如染色的膠乳顆粒)和特異性結(jié)合構(gòu)件(例如，生物素化的化合物)上。在這個(gè)實(shí)施方案中，底物為蛋白水解酶提供裂解目標(biāo)。具體地，接觸反應(yīng)性復(fù)合物時(shí)，蛋白水解酶裂解底物并釋放出報(bào)道分子和/或特異性結(jié)合構(gòu)件。由釋放的報(bào)道分子所顯示的信號(hào)可用來(lái)指示試驗(yàn)樣品內(nèi)酶或酶抑制劑的存在或數(shù)量。
文檔編號(hào)G01N33/558GK1977167SQ200580022099
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者宋旭東 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司