專利名稱：用于診斷動脈硬化的多肽標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用來自受試者的樣品中一種或多種肽標記的存在或缺失診斷動脈硬化的用途以及一種診斷動脈硬化的方法，其中所述一種或多種肽標記的存在或缺失是存在動脈硬化的指征。
動脈硬化或動脈硬化癥、脈管或血管鈣化是最常見的病理性脈管變異。動脈硬化是多年以來血管形成的變化，并且起先保持未被認識的狀態(tài)。血脂和白血球在血管壁富集(噬斑形成)，血管鈣化，失去其彈性，并且血管直徑變得日益狹窄。形成動脈硬化癥的危險因素被認為包括高膽甾醇血、高血壓、吸煙、慢性糖尿病、肥胖、身體活動少和亞健康狀態(tài)，當然它也與其它因素緊密相關。另外的危險因素，諸如血甘油三酯過多、血液的脂蛋白水平增加、高半胱氨酸和特殊的炎性參數(shù)，諸如c-反應蛋白(CRP)或纖維蛋白原，以及慢性衣原體或幽門彎曲桿菌感染等正在論述當中。
動脈硬化癥不引起任何長時間的癥狀。只有當噬斑區(qū)內(nèi)形成的斑塊或血凝塊(血栓)造成血管直徑明顯減小時，癥狀才出現(xiàn)。最常見的動脈硬化性心臟和血管疾病是冠心病、腦血管疾病和外周動脈阻塞性疾?。凰鼈兊目膳碌牟l(fā)癥，即，心肌梗塞、中風或喪失下肢，較發(fā)展程度較低的國家而言，在德國特別頻繁的發(fā)生并造成非常高的公眾健康成本。
動脈硬化引起的心血管疾病在德國人的死因統(tǒng)計中占首位。因此，1999年，心血管疾病是最常見的死因，根據(jù)德國聯(lián)邦統(tǒng)計局的數(shù)字達到了48％，缺血性(冠狀動脈)心臟病占21％，而腦血管系統(tǒng)的疾病占10％。相比較而言，具有致命后果的癌癥比例是26％，呼吸道和消化道疾病分別是6％和5％。
盡管動脈硬化的變化通常在年輕時已發(fā)生，但患者大部分在中年和較大的年紀才呈現(xiàn)出臨床癥狀。
動脈硬化不能用藥物進行治療，而只可通過預防來避免。已存在的鈣化不能被破壞，且僵硬的血管壁也不能回復彈性。不過，可通過改變生活方式影響所述的危險因素使動脈硬化的進程明顯減緩，諸如戒煙等，或者用藥物(例如，乙酰水楊酸)。此外，對于嚴重的動脈鈣化而言，可使用外科手術方法，諸如氣囊血管成形術(PTA，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術)、旁路外科手術和插入支架。
既然如上所解釋的，動脈硬化變化不能被治療，而只能避免或減緩，早期識別動脈硬化的變化就尤其重要。
在正常的情形下，只有第二種疾病的診斷可以得到病人患動脈硬化的結論。目前，為此目的對血管收縮進行檢測，例如，通過造影劑或X-射線或超聲的方式。此外，所述的危險因素，諸如膽固醇水平增加或糖尿病等，也常常被檢查。不過，所有這些方法對于動脈硬化的早期可靠診斷而言都不是足夠的。特別需要有一種侵入性盡可能小并且快速便宜的早期識別動脈硬化的方法。
令人驚訝的是，目前已發(fā)現(xiàn)受試者樣品中的特殊肽標記可用于動脈硬化的診斷。
因此，本發(fā)明涉及利用來自受試者的樣品中至少一種肽標記的存在或缺失來診斷動脈硬化，其中所述多肽標記選自多肽標記No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9，以表1所述的分子量數(shù)值為特征表1用于動脈硬化診斷的多肽標記及它們的分子量
通過本發(fā)明，有可能在非常早的階段診斷動脈硬化。因此，可以在早期或其癥狀顯現(xiàn)之前用已知的治療方法治療所述疾病，由此可減輕它的進一步進程。此外，本發(fā)明使得能夠用部分非侵入或最小化侵入的方法便宜、快速并且可靠地診斷動脈硬化。
在本發(fā)明的某一具體實施方案中，多肽標記的特征不僅在于它的分子量，還在于它的遷移時間(見表2)表2用于動脈硬化診斷的多肽標記及它們的分子量和遷移時間
通過毛細管電泳(CE)測定遷移時間，例如，如實施例第2項中所提出的。因而，使用了長度90cm、內(nèi)徑(ID)75μm、外徑(OD)360μm的玻璃毛細管，操作電壓是30kV。使用以水配制的30％甲醇、0.5％甲酸作為樣品的溶劑。
已知CE遷移時間可以是不同的。不過，對于所應用的任一CE系統(tǒng)而言，其中多肽標記的洗脫次序通常是相同的。為了平衡遷移時間的差異，可以用遷移時間已知的標準品將系統(tǒng)標準化。這些標準品可以是，例如，實施例中所提及的多肽(參見實施例，第3項，“用于CE檢測的標準品”)。
表1至3中所示的多肽標記的特征通過毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)的方式進行鑒定，此方法在文獻中已有詳細的描述，例如，Neuhoff et al.(Rapid Communications in mass spectrometry，Vol.20149-156，2004)。個別測量法之間或不同質(zhì)譜儀之間的分子量變化相對較小，通常在±0.1％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在±0.05％的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的多肽標記是蛋白質(zhì)或肽或者蛋白質(zhì)或肽的降解產(chǎn)物。它們可以是被化學修飾的，例如，通過翻譯后修飾，諸如糖基化、磷酸化、烷基化或二硫橋等，或者通過其它的反應，例如，在降解的范圍內(nèi)。此外，所述的多肽標記還可被化學改造，例如，被氧化，在樣品純化范圍內(nèi)。
通過處理確定多肽標記的參數(shù)(分子量和遷移時間)，可以利用本領域已知的方法確定相應多肽的序列。
根據(jù)本發(fā)明的多肽(見表1或2)被用于診斷動脈硬化。“診斷”意指通過確定癥狀或現(xiàn)象獲得針對某一疾病或損傷的有關認識的過程。在本申請中，存在動脈硬化是從存在或缺失特殊的多肽標記推論而來的。因此，在來自受試者的樣品中測定根據(jù)本發(fā)明的多肽標記，其中它的存在或缺失使得我們可以斷定動脈硬化的存在?？赏ㄟ^本領域已知的任意方法檢測某一多肽標記的存在或缺失。這些可以是已知的方法在下文中有例證。
如果某一多肽標記的檢測值至少與它的閾值一樣高，那么它就被認為是存在的。如果檢測值低于閾值，那么該多肽標記被認為是不存在的。所述的閾值可通過檢測方法的靈敏度(檢測極限)或憑經(jīng)驗確定。
在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選若樣品某一特定分子量的檢測值至少是空白樣品(例如，只有緩沖液或溶劑)的該數(shù)值的兩倍，則認為所述閾值被超過了，更優(yōu)選檢測值至少高三倍的情況，還更優(yōu)選至少高4倍的情況，最優(yōu)選至少比空白樣品的該數(shù)值高5倍。
某個或某些多肽標記以檢測它/它們存在或缺失的方式被利用，其中的存在或缺失是動脈硬化的指征。因此，存在典型的出現(xiàn)于動脈硬化患者(ill)中但不出現(xiàn)于無動脈硬化的受試者(對照)中的多肽標記，諸如多肽標記No.1、No.7、No.8和No.9。此外，存在出現(xiàn)于無動脈硬化的受試者中(對照)但很少或根本不出現(xiàn)于動脈硬化受試者中的多肽標記。它們是，例如，多肽標記No.2、No.3、No.4、No.5和No.6。
表3用于診斷動脈硬化的多肽標記、它們的分子量和遷移時間，以及它們在動脈硬化患者和對照中的存在和缺失(樣品處理和檢測如實施例所述進行)
患病組 其中樣品中存在多肽標記的患動脈硬化的受試者的比例對照組 其中樣品中存在多肽標記的未患動脈硬化的受試者的比例Δ(患病組-對照組)的絕對值測定其中一種或多種多肽標記存在或缺失的樣品所來源的受試者可以是能患動脈硬化的任何受試者，例如，動物或人。優(yōu)選的，所述的受試者是哺乳動物，諸如狗、馬、貓等，最優(yōu)選是人。
在本發(fā)明的某一優(yōu)選實施方案中，不僅是一種多肽標記，而是多肽標記的某一組合被用于診斷動脈硬化，其中可從它們的存在或缺失推斷動脈硬化的存在與否。通過比較多個多肽標記，總結果中由于一些個體差異造成的患病或?qū)φ諅€體在典型存在概率上的偏差可以被降低或避免。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，表1或2中的兩種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合
-No.1和No.2、No.1和No.3、No.1和No.4、No.1和No.5、No.1和No.6、No.1和No.7、No.1和No.8、No.1和No.9、-No.2和No.3、No.2和No.4、No.2和No.5、No.2和No.6、No.2和No.7、No.2和No.8、No.2和No.9、-No.3和No.4、No.3和No.5、No.3和No.6、No.3和No.7、No.3和No.8、No.3和No.9、-No.4和No.5、No.4和No.6、No.4和No.7、No.4和No.8、No.4和No.9、-No.5和No.6、No.5和No.7、No.5和No.8、No.5和No.9、-No.6和No.7、No.6和No.8、No.6和No.9、-No.7和No.8、No.7和No.9，或-No.8和No.9。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的三種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1和No.2與肽標記No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.3與肽標記No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1和No.8與肽標記No.9的組合，-No.2和No.3與肽標記No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，
-No.2和No.8與No.9的組合，-No.3和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3和No.8與No.9的組合，-No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.4和No.8與No.9的組合，-No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.5和No.8與No.9的組合，-No.6和No.7與No.8或No.9的組合，-No.6和No.8與No.9的組合，或者-No.7和No.8與No.9的組合。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的四種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2和No.3與肽標記No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.8與No.9的組合，-No.1、No.3和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，
-No.1、No.3和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3和No.8與No.9的組合，-No.1、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4和No.8與No.9的組合，-No.1、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.5和No.8與No.9的組合，-No.1、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.6和No.8與No.9的組合，-No.1、No.7和No.8與No.9的組合，-No.2、No.3和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3和No.8與No.9的組合，-No.2、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4和No.8與No.9的組合，-No.2、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.5和No.8與No.9的組合，-No.2、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.6和No.8與No.9的組合，-No.2、No.7和No.8與No.9的組合，
-No.3、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4和No.8與No.9的組合，-No.3、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.5和No.8與No.9的組合，-No.3、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.6和No.8與No.9的組合，-No.3、No.7和No.8與No.9的組合，-No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.4、No.5和No.8與No.9的組合，-No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.4、No.6和No.8與No.9的組合，-No.4、No.7和No.8與No.9的組合，-No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.5、No.6和No.8與No.9的組合，-No.5、No.7和No.8與No.9的組合，或者-No.6、No.7和No.8與No.9的組合。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的五種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2、No.3和No.4與肽標記No.5、No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3和No.8與多肽標記No.9的組合，
-No.1、No.2、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2和No.5、No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2和No.6、No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，
-No.1、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，
-No.3、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，或者-No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的六種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2、No.3、No.4和No.5與肽標記No.6、No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，
-No.1、No.2、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，
-No.2、No.3、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.3、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.3、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，或者-No.4、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的七種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5和No.6與肽標記No.7、No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，
-No.1、No.2、No.3、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.3、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.2、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.3、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.1、No.4、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5、No.6和No.7與肽標記No.8或No.9之一的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5、No.6和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4、No.5、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.4、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.3、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，-No.2、No.4、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合，或-No.3、No.4、No.5、No.6、No.7和No.8與多肽標記No.9的組合。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的八種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7和No.8，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7和No.9，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.8和No.9，
-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.7、No.8和No.9，-No.1、No.2、No.3、No.4、No.6、No.7、No.8和No.9，-No.1、No.2、No.3、No.5、No.6、No.7、No.8和No.9，-No.1、No.2、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8和No.9，-No.1、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8和No.9，或-No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8和No.9。
在本發(fā)明的另一更優(yōu)選的實施方案中，表1或2中的九種多肽標記被用于診斷動脈硬化。具體而言，它們是以下多肽標記的組合-No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8和No.9。
除了以上提及的多肽標記之外，至少一種另外的多肽的存在或缺失可用作診斷動脈硬化的標記，只要所述多肽是動脈硬化或者無動脈硬化(對照，例如，健康狀態(tài))的指征即可。例如，被提及的多肽由至少10個通過肽鍵連接的氨基酸組成。優(yōu)選的，多肽由最多100個氨基酸組成。更優(yōu)選的，多肽的分子量大約為500至15,000Da，更優(yōu)選大約750至大約10,000Da，尤其是大約1000至大約7,500Da。所述標記可以被化學修飾，例如，通過翻譯后修飾，諸如糖基化、磷酸化、烷基化或二硫橋等，或者通過其它的反應，例如，在降解的范圍內(nèi)。此外，所述的多肽標記還可被化學改造，例如，被氧化，在樣品純化范圍內(nèi)。
其中檢測根據(jù)本發(fā)明的某種肽標記或多種肽標記存在或缺失的樣品可以是獲自受試者身體的任一樣品。所述樣品是具有適于提供受試者有關狀態(tài)信息(動脈硬化或健康，即，受試者沒有動脈硬化)的多肽組合物的樣品。例如，它可以是血液、尿、滑液、組織液、身體分泌物、汗、腦脊液、淋巴、腸液、胃液或胰液、膽汁、淚液、組織樣品、精液、陰道液或糞樣品。優(yōu)選液體樣品。
在優(yōu)選的實施方案中，所述樣品是尿樣或血樣，最優(yōu)選(血液)血清或(血液)血漿樣品。
尿樣在本領域中被認為是首選的。優(yōu)選的，將中流尿樣用作本發(fā)明上下文中所述尿樣。例如，還可如WO 01/74275中所述依靠排尿設備獲取尿樣。
血液樣品可用本領域已知的方法獲取，例如，從靜脈、動脈或毛細管中獲取。通常，血液樣品通過依靠注射器從例如受試者的手臂抽取靜脈血獲得。術語“血液樣品”包括通過進一步純化和分離方法獲自血液的樣品，諸如(血液)血漿或(血液)血清。
血漿是通過例如離心去除全部細胞成分而獲自血液的。可以在例如，諸如檸檬酸鈉等凝血抑制劑存在的條件下進行離心，因為血漿中仍然存在凝血因子。血清本質(zhì)上相當于例如通過血液凝結使凝血活性蛋白-主要是纖維蛋白原被去除的血漿。
用于制備血漿和血清的方法是本領域通常已知的。此外，WO 04/65958公布了從血漿中去除纖維蛋白原的方法。適于分離血清或血漿的組合物公布于，例如，WO 03/48764(也可參閱US 2004/129631)。從血液中收集血漿或血清樣品的裝置和方法在，例如，US 2004/31746中有描述。
樣品中多肽標記的存在或缺失可以用本領域已知適于檢測多肽標記的任一方法進行測定。這樣的方法是本領域技術人員所已知的。原則上，多肽標記的存在或缺失可以通過直接的方法測定，諸如質(zhì)譜，或者通過間接的方法測定，例如，依靠配體。
如果是必需的或期望的，則來自受試者的樣品，例如，尿或血液樣品，可通過任何合適的方式進行預處理，例如，在檢測多肽標記存在或缺失之前進行純化或分離。所述的處理可以包括，例如，純化、分離、稀釋或濃縮。所述的方法可以是，例如，離心、過濾、超濾、透析、沉淀或諸如親和分離或依靠離子交換層析進行分離等的層析方法；電泳分離，即，通過帶電顆粒在施加電場的溶液中不同的遷移行為進行分離。其中具體的例子是凝膠電泳、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、毛細管電泳、金屬親和層析、固定化金屬親和層析(IMAC)、基于凝集素的親和層析、液相層析、高效液相層析(HPLC)、正常的和反相HPLC、陽離子交換層析以及與表面的選擇性結合。所有這些方法都是本領域技術人員眾所周知的，技術人員能根據(jù)所應用樣品的功能選擇方法并選擇適于測定某個或某些多肽標記存在或缺失的方法。
在本發(fā)明的某一實施方案中，樣品在用毛細管電泳進行分離之前，先通過超離心進行分離純化并/或通過超濾分成含特定分子大小的多肽標記的級分。
優(yōu)選用質(zhì)譜方法測定多肽標記的存在或缺失，其中樣品的純化或分離可在使用該方法之前進行。與目前所應用的方法相比較而言，質(zhì)譜分析的優(yōu)勢在于通過單一的分析可測定樣品的許多(＞100)多肽的濃度。任何類型的質(zhì)譜儀都可應用。依靠質(zhì)譜，可以檢測10fmol的多肽標記，即，0.1ng的10kD蛋白質(zhì)，按常規(guī)檢測的準確性在復雜的混合物中是大約±0.01％。在質(zhì)譜儀中，形成離子的單元與適當?shù)姆治鲅b置耦聯(lián)。例如，電噴射離子化(ESI)界面通常用于檢測液體樣品中的離子，而MALDI最常用于從個別制備的樣品中制備離子。有各種分析裝置可利用，例如，離子阱分析裝置或TOF分析裝置。ESI和MALDI二者基本上都可與所有類型的質(zhì)譜儀聯(lián)合，盡管ESI通常與離子阱聯(lián)合，而MALDI與TOF聯(lián)合。
在電噴射離子化(ESI)中，在高電壓(例如，1-8kV)的影響下，溶液中存在的分子與其它物質(zhì)一起被霧化，首先形成帶電荷的小滴，然后通過溶劑蒸發(fā)變得更小。最后，在氣相中形成游離的離子。
在利用飛行時間(TOF)質(zhì)譜儀進行的質(zhì)譜測量中，施加了特定的加速電壓以使離子具有等量的動能。之后，各離子通過飛行管行進一段具體漂流距離所用的時間被非常精確的檢測到，因為具有等量的動能，離子的速率取決于它們的質(zhì)量。TOF質(zhì)譜儀具有非常高的掃描速度并因此達到了優(yōu)良的分辨率。
適于測定多肽標記存在和缺失的優(yōu)選方法包括氣相離子質(zhì)譜分析，諸如激光解析/離子化質(zhì)譜分析、SELDI-TOF MS(表面增強的激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜分析)、MALDI-TOF MS(矩陣輔助的激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜分析)、2D-PAGE/MS和毛細管電泳質(zhì)譜分析(CE-MS)。
2D-PAGE通常用于分離多肽并可與質(zhì)譜分析一起用于鑒定單獨的多肽(2D-PAGE/MS)。依靠2D-PAGE可辨別超過1000個的蛋白質(zhì)斑點。不過，每個單一的多肽斑點必須用質(zhì)譜分析方法分開進行鑒定。
在SELDI系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)芯片是最重要的組件。待分析樣品直接施加于陣列中存在的斑點上。存在不同的陣列，例如，代表疏水、親水、陽離子交換、陰離子交換和固定化金屬離子親和表面的層析陣列，以及用允許共價結合的化學基團預活化的陣列。優(yōu)選陽離子交換表面。在SELDI方法中，只有那些實際結合芯片表面的多肽被檢測到。在樣品多肽結合后，在各個斑點上施加能量-吸收矩陣。在所述矩陣晶化后，通常在適于分析的蛋白質(zhì)芯片閱讀器上評估所述的蛋白質(zhì)芯片陣列。
該閱讀器是TOF(飛行時間)質(zhì)譜儀，其中依靠激光將蛋白質(zhì)解析并離子化。因為晶化的蛋白質(zhì)平等地分布于斑點表面，離子化激光束通常擊中分析物內(nèi)代表性平均水平的分子，從而可以進行定量測定。離子化后，多肽在電場內(nèi)被加速，然后碰撞探測器。從激光照射陣列表面到分子撞擊探測器的飛行持續(xù)時間使得研究者可以準確的測定樣品中多肽的分子量(參見，例如，以下綜述Merchant，M.and Weinberger，S.R.，Electrophoresis，Vo1.2121164-1177，2000)。
特別優(yōu)選的方法是CE-MS，其中將毛細管電泳與質(zhì)譜分析聯(lián)合起來。此方法在文獻中有一些詳述，例如，德國專利申請DE 10021737、Kaiser等(J Chromatogr A，Vol.1013157-171，2003，和Electrophoresis，252044-2055，2004)以及Wittke等(Journal of Chromatography A，1013173-181，2003)。CE-MS技術使得研究者可以在短時間、小體積內(nèi)以高靈敏度同時測定幾百種多肽標記的存在。在含多肽的樣品已被檢測后，制作被檢測多肽標記的圖譜，此圖譜可與病人或健康人的圖譜進行比較。在多數(shù)情況下，這足以使用一種或有限數(shù)目的多肽標記診斷動脈硬化。具體而言，可以檢測來自表1或2的1、2、3、4、5、6、7、8或9種多肽標記，優(yōu)選用以上提及的多肽標記組合。更優(yōu)選包括與ESI-TOF分析裝置聯(lián)合(例如，在線的)毛細管電泳在內(nèi)的CE-MS方法。在此，將樣品加到電泳毛細管中，并且施加例如不超過50kV的電壓，尤其是不超過30kV。
對CE-MS而言，優(yōu)選使用揮發(fā)性溶劑，最好在基本上無鹽的條件下操作。所述溶劑的例子包括乙腈、異丙醇、甲醇等等。所述溶劑可與水或弱酸(例如，0.1％的甲酸)混合以使分析物質(zhì)子化。樣品中的多肽標記通過它們的大小和電荷被分離，它們的大小和電荷決定了在毛細管中的飛行時間。
依靠毛細管電泳，可以通過它們的電荷和大小將分子分開。中性顆粒將通過施加電流以電滲流的速度遷移，而陽離子則向陰極加速，陰離子則滯后。電泳中毛細管的優(yōu)勢在于有利的表面比體積比例，這能很好的分散電流流動過程中產(chǎn)生的焦耳熱。這就使得允許施加高電壓(通常高達30kV)以及由此而來的高效分離和分析時間較短。
在毛細管電泳中，通常使用硅玻璃毛細管。通過使用小內(nèi)徑的毛細管，避免了徑向擴散和傳遞。為了能將施加電壓的毛細管中電流所產(chǎn)生的熱充分消散到環(huán)境中，毛細管必須保持小的內(nèi)徑。通常使用內(nèi)徑50-75μm的毛細管。使用長度是，例如，30-100cm。用這樣尺寸的毛細管，常常保證了毛細管中釋放離子熱升高的溫度不會導致在毛細管中形成氣泡。此外，分離用毛細管通常是用涂布有塑料的硅玻璃制造的。毛細管既可以是未處理的，即，內(nèi)表面上暴露了它們的疏水基團，也可以是內(nèi)表面涂膜的。疏水涂層可用于提高分辨率。除了電壓之外，還可施加壓力，通常是在0至1psi的范圍內(nèi)。還可只在進行操作或變化期間施加壓力。
為了提高分辨率，在加樣期間可使用堆積方案在加樣之前，先加堿，然后再加樣，然后再加酸。分析物的離子因而被牽制在所述的酸和所述的堿之間。在施加電壓時，帶正電荷的分析物離子向所述的堿移動。在堿中，它們變成帶負電荷并且向相反方向移動，在那里它們變成帶正電荷。這一過程被重復多次直至酸堿中和。從而獲得濃縮的樣品。在加樣之前，可用適當?shù)木彌_液稀釋樣品。
為了檢測依靠毛細管電泳分離的多肽標記，毛細管電泳裝置優(yōu)選與質(zhì)譜儀聯(lián)合。質(zhì)譜分析使得研究者可以測定高真空狀態(tài)下游離離子的分子質(zhì)量。它包括通過它們的質(zhì)量電荷比例(m/z)將離子分開的質(zhì)量分析儀和探測器。
在另外的檢測樣品中多肽標記的優(yōu)選方法中，樣品中的多肽標記通過毛細管電泳分離，然后直接被離子化并通過界面即時轉移入聯(lián)合的用于探測的質(zhì)譜儀中。
本發(fā)明進一步涉及用于診斷動脈硬化的方法，通過以下步驟a)檢測來自受試者的樣品中至少一種多肽標記的存在或缺失，所述多肽標記如權利要求1或2中所定義；并且b)確定所述受試者中存在動脈硬化的可能性，其中i)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率高于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的存在是較高概率存在動脈硬化的指征；ii)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率低于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的缺失是較高概率存在動脈硬化的指征；iii)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率高于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的缺失是較高概率不存在動脈硬化的指征；或者iv)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率低于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的存在是較高概率不存在動脈硬化的指征。
在根據(jù)本發(fā)明方法的某一實施方案中，步驟b)中患動脈硬化的受試者(患病受試者)中或?qū)φ帐茉囌咧卸嚯臉擞浀拇嬖诟怕嗜缦?
在優(yōu)選的實施方案中，對照受試者是未患動脈硬化的受試者。在進一步優(yōu)選的實施方案中，是未患動脈硬化的人。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，有利的是使用數(shù)種適于診斷的多肽標記。具體而言，可使用表1或表2中的至少2、3、4、5、6、7、8或9種多肽標記。還更優(yōu)選的是，多肽標記的組合是如上文所提及的組合。
當使用了數(shù)種標記的時候，為了確定動脈硬化存在的概率，可使用本領域技術人員已知的統(tǒng)計方法。例如，通過使用諸如S-Plus等的計算機程序來利用Weissinger等所述的方法(Kidney Int.2004 Jim；65(6)2426-24；Random Forests method)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，樣品中多肽標記No.1、No.7、No.8和/或No.9的存在以及/或者樣品中多肽標記No.2、No.3、No.4、No.5和/或No.6的缺失是動脈硬化存在的指征。
為了測定存在或缺失，以上提及的純化、分離和檢測方法都可應用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。優(yōu)選用毛細管電泳、氣相離子光譜測定和/或質(zhì)譜分析檢測某一或某些多肽標記的存在或缺失。
在具體的優(yōu)選實施方案中，在檢測多肽標記的分子量之前，進行毛細管電泳并/或用質(zhì)譜測量法檢測某種或某些多肽標記的存在或缺失。
實施例1.樣品制備為了檢測動脈硬化的多肽標記，應用了血漿。從健康供體(對照)以及從依賴透析的動脈硬化患者中抽取血漿。為了從健康供體中抽取血漿，使用了帶肝素(Sarstedt，Nümbrecht，德國)的S-Monovettes，而來自透析患者的血漿則是直接抽取的，因為他們已經(jīng)服用了肝素。肝素用于避免血液凝結以及蛋白水解活動，并且因此還保護了血漿中所含有的蛋白質(zhì)和肽免于被酶降解。
為了后來的CE-MS檢測，血漿中含有的很高濃度的蛋白質(zhì)，諸如白蛋白和免疫球蛋白，必須通過超濾分離出去。因此，取出500μl血漿并與2ml過濾緩沖液(4mol/l尿素，0.1mol/l NaCl，0.01％氨水)混合。對這2.5ml樣品體積進行超濾(Centrisart 20 MWCO，Vivascience，Hannover，德國)。以3400rpm離心進行超濾直至獲得2ml的超濾液。
然后將所獲得的2ml濾液加到Pharmacia C-2柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上以去除尿素、鹽和其它干擾成分。然后用配制于水中的50％乙腈、0.5％甲酸將被結合的多肽從C-2柱子上洗脫下來，并凍干。為了進行CE-MS檢測，然后將所述多肽用20μl水(HPLC級，Merck，Darmstadt，德國)重懸。
2.CE-MS檢測用來自Beckman Coulter(P/ACE MDQ System；Beckman CoulterInc.，F(xiàn)ullerton，CA，USA)的毛細管電泳系統(tǒng)和來自Applied Biosystems(Mariner Biospectrometry Workstation；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)的ESI-TOF質(zhì)譜儀進行CE-MS檢測。
CE毛細管由Beckman Coulter(同上)供應并具有75/360μm的ID/OD和90cm的長度。適于CE分離的流動相由用水配制的30％甲醇和0.5％甲酸組成，利用同一種混合物以2μl/分鐘的流速使MS中的“管鞘通暢”。利用CE-ESI-MS Sprayer試劑盒(Agilent Technologies，Waldbronn，德國)實現(xiàn)CE和MS的聯(lián)合。
為了注射樣品，使用了1psi的壓力，注射的持續(xù)時間是20秒。利用這些參數(shù)，將大約10nl樣品注射入毛細管中，相當于毛細管體積的大約0.25％。用堆積技術濃縮毛細管中的樣品。因此，在注射樣品之前，先注射7秒(以1psi)的1mol/l NH3溶液，在注射樣品之后，注射5秒的2mol/l甲酸溶液。當施加分離電壓(30kV)時，分析物自動濃縮于這些溶液之間。
用增壓方法進行隨后的CE分離0psi 40分鐘，然后0.1psi 2分鐘，0.2psi 2分鐘，0.3psi 2分鐘，0.4psi 2分鐘，然后最后0.5psi 32分鐘。因此一輪分離的總持續(xù)時間是80分鐘。
為了在MS上獲得盡可能好的信號強度，關閉了噴霧器氣體。施加到噴霧針上用于產(chǎn)生電噴射的電壓是3200V，產(chǎn)生在整個毛細管上大約27kV的可利用的分離電壓。根據(jù)制造商的方法將Mariner質(zhì)譜儀上保留的設置針對肽探測而言最優(yōu)化。在m/z 400至m/z 2500的質(zhì)量范圍內(nèi)記錄光譜并且每3秒收集一次。
3.用于CE檢測的標準品為了核實和標準化CE檢測，應用了以所提及的CE遷移時間為特征的以下蛋白質(zhì)或多肽它們可用于使肽標記1至9以及被檢測樣品的CE時間標準化。
蛋白質(zhì)/多肽遷移時間抑酶肽(SIGMA，Taufkirchen，DE，Cat.#AI153) 9.2分鐘核糖核酸酶(SIGMA，Taufkirchen，DE，Cat.#R4875) 10.9分鐘溶菌酶(SIGMA，Taufkirchen，DE，Cat.#L7651) 8.9分鐘″REV″，序列REVQSKIGYGRQIIS 15.6分鐘″ELM″，序列ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.4分鐘″KINCON″，序列TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 20.0分鐘″GIVLY″序列GIVLYELMTGELPYSHIN 36.8分鐘所述蛋白質(zhì)/多肽應用濃度為各自配制于水中的10pmol/μL。
″REV″、″ELM、″KINCON″和″GIVLY″是合成肽。
所述肽的分子量和MS中可見的個別電荷狀態(tài)的質(zhì)量如下
權利要求
1. 利用來自受試者的樣品中至少一種肽標記的存在或缺失診斷動脈硬化的用途，其中所述多肽標記選自多肽標記No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9，它們以以下分子量值為特征
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中所述多肽標記選自多肽標記No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8或No.9，它們以以下分子量和遷移時間數(shù)值為特征
3.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少兩種多肽標記，尤其是多肽標記-No.1和No.2、No.1和No.3、No.1和No.4、No.1和No.5、No.1和No.6、No.1和No.7、No.1和No.8、No.1和No.9，-No.2和No.3、No.2和No.4、No.2和No.5、No.2和No.6、No.2和No.7、No.2和No.8、No.2和No.9，-No.3和No.4、No.3和No.5、No.3和No.6、No.3和No.7、No.3和No.8、No.3和No.9，-No.4和No.5、No.4和No.6、No.4和No.7、No.4和No.8、No.4和No.9，-No.5和No.6、No.5和No.7、No.5和No.8、No.5和No.9，-No.6和No.7、No.6和No.8、No.6和No.9，-No.7和No.8、No.7和No.9，或-No.8和No.9；所述多肽標記如權利要求1或2中所定義。
4.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少三種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
5.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少四種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
6.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少五種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
7.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少六種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
8.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少七種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
9.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了至少八種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
10.根據(jù)權利要求1或2的用途，其中使用了九種如權利要求1或2中所定義的多肽標記。
11.根據(jù)權利要求1至10中任一項的用途，其中至少一種另外的多肽被用作標記。
12.根據(jù)權利要求2至11中任一項的用途，其中所述遷移時間用毛細管電泳測定，電壓30kV，在30體積％甲醇、0.5體積％甲酸的水流動相中進行，毛細管長度為90cm。
13.根據(jù)權利要求1至12中任一項的用途，其中所述來自受試者的樣品是尿樣或血樣，尤其是血清或血漿樣品。
14.一種用于診斷動脈硬化的方法，包括以下步驟a)檢測來自受試者的樣品中至少一種多肽標記的存在或缺失，所述多肽標記如權利要求1或2中所定義；并且b)確定所述受試者中存在動脈硬化的可能性，其中i)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率高于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的存在是較高概率存在動脈硬化的指征；ii)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率低于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的缺失是較高概率存在動脈硬化的指征iii)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率高于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的缺失是較高概率不存在動脈硬化的指征或者iv)如果在患病受試者中所述多肽標記存在的概率低于對照受試者中同一多肽標記存在的概率，那么該多肽標記的存在是較高概率不存在動脈硬化的指征。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中步驟b)中的單獨概率如下
16.根據(jù)權利要求14或15的方法，其中使用了至少2、3、4、5、6、7、8或9種多肽標記。
17.根據(jù)權利要求14至16中任一項的方法，其中使用了如權利要求3中所定義的多肽標記的組合。
18.根據(jù)權利要求14至17中任一項的方法，其中多肽標記No.1、No.7、No.8和/或No.9的存在是動脈硬化存在的指征。
19.根據(jù)權利要求14至18中任一項的方法，其中多肽標記No.2、No.3、No.4、No.5和/或No.6的缺失是動脈硬化存在的指征。
20.根據(jù)權利要求14至19中任一項的方法，其中使用了毛細管電泳、氣相離子光譜測定法和/或質(zhì)譜測定法來檢測所述一種或多種多肽標記的存在或缺失。
21.根據(jù)權利要求14至20中任一項的方法，其中在測量所述多肽標記的分子量之前進行毛細管電泳。
22.根據(jù)權利要求14至21中任一項的方法，其中用質(zhì)譜測定法檢測所述一種或多種多肽標記的存在或缺失。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用受試者樣品中一種或多種肽標記的存在或缺失進行動脈硬化診斷的用途以及用于診斷動脈硬化的方法，其中所述肽標記的存在或缺失是存在動脈硬化的指征。
文檔編號G01N33/68GK101014863SQ200580029383
公開日2007年8月8日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權日2004年9月2日
發(fā)明者哈拉爾德·米沙克 申請人:馬賽奎斯診斷和治療有限公司