專利名稱：改變微球表面特性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及改變微球表面特性的方法。某些實(shí)施方式包括將烯醇酸偶聯(lián)到微球上，對(duì)微球表面特性進(jìn)行改性，這樣就能通過(guò)烯醇酸將一種試劑偶聯(lián)到微球上。
相關(guān)技術(shù)介紹以下描述和實(shí)施例并不因?yàn)榘ㄔ诒静糠种?，而被看作是現(xiàn)有技術(shù)。
分光光譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于化學(xué)體系和生物體系分析中。多數(shù)情況下，這些技術(shù)涉及對(duì)目標(biāo)物吸收或發(fā)射電磁輻射的測(cè)定。一種這樣的應(yīng)用是用于微陣列領(lǐng)域，它是一種被許多學(xué)科采用的技術(shù)，包括組合化學(xué)和生物檢測(cè)行業(yè)。美國(guó)德克薩斯州，Austin的Luminex公司開(kāi)發(fā)出一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在各種著色的熒光微球表面上進(jìn)行生物檢測(cè)。這種系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例見(jiàn)述于Chandler等的美國(guó)專利第5981180號(hào)，該專利全文參考結(jié)合于本文。在這樣的流體流動(dòng)器件中，利用激光激發(fā)微球，當(dāng)各單獨(dú)的微球以較高速度通過(guò)檢測(cè)區(qū)時(shí)，對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)。這種系統(tǒng)生成的測(cè)量數(shù)據(jù)可以很容易地傳送到數(shù)據(jù)庫(kù)中，用于進(jìn)一步分析。
一些研究小組和個(gè)人也報(bào)道了對(duì)熒光微球進(jìn)行多元分析的檢測(cè)工作，見(jiàn)述于Fulton等，Clin.Chem.，1997，43，1749-1756；Kettman等，Cytometry，1998，33，234-243；McDade等，Med.Dev.Diag.Indust.，1997，19(4)，75-82；McHugh，Methods Cell Biol.，1994，42，575-595；Nikiforov等，NucleicAcid Res.，1994，22，4167-4175；Fulton的美國(guó)專利5736330，Chandler的美國(guó)專利6046807；Fulton的美國(guó)專利6057107；Chandler的美國(guó)專利6139800；Chandler等的美國(guó)專利6268222；Chandler的美國(guó)專利6366354；Chandler的美國(guó)專利6411904；Chandler等的美國(guó)專利6449562，這些文獻(xiàn)都全文參考結(jié)合于本文中。
在上述系統(tǒng)中，熒光染料被吸收到微球中和/或結(jié)合到微球的表面。染料根據(jù)其在該系統(tǒng)選定的檢測(cè)窗的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)光能力進(jìn)行選擇。另外，各檢測(cè)窗相隔一定的波長(zhǎng)，選擇的染料要盡可能減少染料熒光信號(hào)在相鄰檢測(cè)窗內(nèi)的重疊。采用兩個(gè)檢測(cè)窗和兩種染料，每種染料有10個(gè)不同的濃度，那么將有100種可通過(guò)熒光區(qū)分的微球搭配。
過(guò)去30年中，由于親合色譜、固相合成和生物大分子(如蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸等)固定的領(lǐng)域的進(jìn)步，它們已經(jīng)進(jìn)入基于微球的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，可將一個(gè)或多個(gè)生物分子連接到微球表面上。所述一個(gè)或多個(gè)生物分子根據(jù)要進(jìn)行的具體檢測(cè)形式進(jìn)行選擇。例如，一個(gè)微球群可包括不同子群的微球，每個(gè)子群與不同的抗原偶聯(lián)。子群可與樣品結(jié)合，然后可以通過(guò)檢測(cè)來(lái)確定樣品中存在哪些抗原。與微球相結(jié)合的生物分子可包括本領(lǐng)域已知的任何生物分子。
通過(guò)偶聯(lián)可以達(dá)到生物分子或其他任何此類實(shí)體的固定，偶聯(lián)方式包括微球表面上的活性/穩(wěn)定反應(yīng)基團(tuán)與待固定實(shí)體上的特定官能團(tuán)之間發(fā)生的以下作用(1)離子相互作用；(2)吸附；(3)絡(luò)合(例如“金屬配位”的偶聯(lián))；(4)共價(jià)鍵。例如，微粒[例如微米球和納米球；納米管；金屬微粒，包括一種或多種具有任何尺寸、形狀或組成的金屬；半導(dǎo)體微粒；分子印跡聚合物(MIPS)；磁性微粒；以及其他染色物質(zhì)]和微滴定板是許多固定系統(tǒng)中常用的固體基質(zhì)。為確保能固定生物材料以進(jìn)行足夠靈敏的化驗(yàn)，制備并維持固體的官能化活性表面是很重要的。在固體表面上固定生物分子的現(xiàn)有方法通常涉及固體表面上的活化羧基、氨基、羥基或硫羥基與生物分子的反應(yīng)。這些基團(tuán)活化之后或引入官能化間隔基之后，活化的基團(tuán)在固體表面上提供了直接連接生物分子的位置。
但是，當(dāng)前用來(lái)提供直接連接位的基團(tuán)有許多缺陷。例如，這些官能團(tuán)中大多數(shù)官能團(tuán)[如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、異硫氰酸酯等]在水性環(huán)境中容易發(fā)生水解，在不到1小時(shí)的時(shí)間就失去反應(yīng)活性(即不具有化學(xué)活性)。因此，如果用這些官能團(tuán)將生物分子連接到固體表面，它們可能在數(shù)量、可重復(fù)性和均勻性方面隨著時(shí)間出現(xiàn)不利的變化。
活性微球或官能化微球一般通過(guò)對(duì)已經(jīng)適當(dāng)官能化的單體進(jìn)行共聚或通過(guò)對(duì)預(yù)形成的微球進(jìn)行化學(xué)改性來(lái)產(chǎn)生。后官能化是制備活性微粒的流行方法，如Upson早期在J.Polym.Sci.Polym.Symp.(1985，72，45)上所述，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
幾個(gè)研究小組報(bào)道了制備和評(píng)價(jià)各種通過(guò)改性制得的微粒的近期工作，包括Margel等J.Polym.Sci.1991，A-29，347-355；Anal.Biochem.，1981，128，342-350)、Ugelstad等(Makromol.Chem.，1979，180，737-744；Adv.ColloidInterface Sci.，1980，13，102-140)和Rembaum等(Br.Polym.J.，1978，10，275-280；J. Macromol.Sci.Chem.，1979，A-13，603-632)，它們?nèi)膮⒖冀Y(jié)合于本文。R.Arshady在Biomaterials，1993，14，5-15中的一篇綜述介紹了經(jīng)過(guò)標(biāo)記的活性微球的合成與物理化學(xué)性質(zhì)，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
Fray等，Bioconjugate Chem.，1999，10，562-571報(bào)道了用耐水解的醛官能團(tuán)預(yù)活化微粒的策略，但觀察到這些微球的反應(yīng)產(chǎn)率小于8％，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。Milton的美國(guó)專利6146833介紹了酰基氟活化的聚合物表面與氨基衍生的生物分子在室溫的反應(yīng)。Clerc等在國(guó)際公開(kāi)專利WO 99/67228中介紹了氟苯基樹(shù)脂在固相合成酰胺、肽、羥氨酸、胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、磺酰胺和α取代羰基化合物中的應(yīng)用，這些文獻(xiàn)全文參考于本文。
Medvedkin等，Bioorg.Khirn.，1995，21(9)，684-690介紹了在肽的合成中使用經(jīng)磺基-四氟苯基活化的酯，并證實(shí)了它們的反應(yīng)活性和在水性存放條件下良好的穩(wěn)定性，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。顯然，用這種試劑預(yù)活化聚苯乙烯表面還沒(méi)有見(jiàn)諸報(bào)道。
1950年，Hoechst在Heyna等人的德國(guó)專利第DE 960534中提出用乙烯基砜(VS)改性的活性染料對(duì)纖維素和羊毛纖維染色，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。Siegel在一篇綜述中完整描述了基于VS及其受保護(hù)的2-硫酸根合乙基砜和2-硫代硫酸根合乙基砜的活性染料[E.Siegel，The Chemistry of Synthesis Dyes，第VI卷(Ed.K.Venkataraman)；2-108，Academic Press，1972，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文]。Snow等人的美國(guó)專利第5414135號(hào)描述了用PEG負(fù)載的VS對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
將生物分子(如寡聚核苷酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物)固定到熒光微球上的最常用方法是活化存在于微球表面的羧基。該活化需要過(guò)量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)以及4-6的偶聯(lián)pH值。碳二亞胺與羧基官能團(tuán)之間的反應(yīng)形成了活化的O-酰基脲衍生物反應(yīng)中間體。然后，該反應(yīng)中間體受到與微球相連的生物分子上的氨基中的伯氮的親核進(jìn)攻，釋放出取代的脲，并產(chǎn)生在反應(yīng)中間體與生物分子之間的酰胺連接。
但是，這樣活化羧基具有許多缺點(diǎn)。例如，反應(yīng)中間體的半衰期極短，快速發(fā)生水解或重排產(chǎn)生N-?；寮雍衔?。此外，形成O-酰基脲的最佳pH是4-5。不過(guò)，核苷酸上的伯氨基主要在約4-5的pH值下發(fā)生質(zhì)子化，因此很不活潑。反應(yīng)中間體的這些限制嚴(yán)重妨礙了生物分子與微球的偶聯(lián)產(chǎn)率。此外，在低pH值下，生物分子中的核酸堿基可能發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)子化。這種質(zhì)子化引起DNA解鏈，暴露出螺旋上的疏水核，促使螺旋與微球的固體基質(zhì)發(fā)生非特異性的疏水反應(yīng)。
盡管有這些缺陷，EDC介導(dǎo)的偶聯(lián)目前仍是將生物分子共價(jià)固定在固體表面的主要模式，見(jiàn)述于Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，NY，1996；Frey，A.等，Bioconjugate Chem.，1999，10，562-571；Gilles，M.A.等，Anal.Biochem.，1990，184，244-248；Chan V.W.F.等，Biochem.Biophys.Res.Communications，1998，151(2)，709-716；Valuev，I.L.等，Biomaterials，1998，19，41-43，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
對(duì)于組合庫(kù)，諸如馬來(lái)酸、二羥基苯甲酸、羥基苯基乙酸、六茜素羧酸、溴代二羥基苯甲酸、3-氧-1-茚滿羧酸、3-硝基苯基乙酸和3，4-二氟苯甲酸這樣的構(gòu)建基元已經(jīng)見(jiàn)諸報(bào)道，如Lin，R.等，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，7678-7680，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此引為參考。
可引入聚合物以改進(jìn)聚合物表面特性的一些分子已經(jīng)見(jiàn)諸報(bào)道并示于下面。
用聚合物負(fù)載的催化劑、試劑或底物進(jìn)行的有機(jī)反應(yīng)為已知的，如Hodge，P.在“Synthesis and separations using functional polymers”(Sherrington，D.C.和Hodge，P.主編，1988，John Wiley，44-113)中所述，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
聚合物負(fù)載的酚類化合物是已知的。例如，聚合物負(fù)載的四氟苯酚現(xiàn)在用作化學(xué)庫(kù)合成中的活化樹(shù)脂，如Salvino，J.M.等，J. Comb.Chem.，2000，2，691-699所述，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
在糖類與其他具有1，2和1，3二醇官能團(tuán)的客體的絡(luò)合反應(yīng)中，硼酸常被引入到合成受體，如Czarnik，A.W.等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，5874；Shinkai，S.J.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1994，477和Geert-Jan Boons等，Tetrahedron Lett.，200，41，6965所述，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。硼酸也可引入化學(xué)親合體系，用于純化蛋白質(zhì)，如Bergseid，M.等在Biotechniques，2000，29，1126中所述，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。用各種硼酸將兩個(gè)實(shí)體連接在一起的情況見(jiàn)述于Stolowitz的美國(guó)專利6008406，Stolowitz等的美國(guó)專利6075126，Stolowitz等的美國(guó)專利6124471，Stolowitz等的美國(guó)專利6462179和Stolowitz等的美國(guó)專利6630577，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
酸性官能團(tuán)也可加到玻璃表面上，如Geiger，F(xiàn).M.等，J.Am.Chem.Soc.，2004，126，11754所述，該文獻(xiàn)的全文參考結(jié)合于本文。
因此，需要開(kāi)發(fā)一種方法，在將生物分子連接到微球表面的過(guò)程中改變微球表面特性，但不存在上述的一種或多種缺點(diǎn)，如由于用來(lái)連接生物分子的官能團(tuán)發(fā)生水解而隨時(shí)間產(chǎn)生的各種變化。
發(fā)明概述以下對(duì)各種方法、微球和試劑盒(kit)實(shí)施方式的描述并不對(duì)所附權(quán)利要求的主旨構(gòu)成任何限制。
一種實(shí)施方式涉及一種改變微球表面特性的方法。所述方法包括將一種烯醇酸與微球偶聯(lián)，對(duì)微球的表面特性進(jìn)行改性。烯醇酸可包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸。可通過(guò)烯醇酸將試劑與微球偶聯(lián)。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能團(tuán)代替。在另一些實(shí)施方式中，烯醇酸可以概括地表示為能與一種化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化的極性基團(tuán)。所述化學(xué)基團(tuán)可以包括砜基或羰基等。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸包含至少一個(gè)親水基團(tuán)。在另一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括三角酸(deltic acid)、方形酸(squaric acid)、鄰二羥環(huán)戊烯三酮酸(croconic acid)或玫棕酸，或者其他同系物。在一個(gè)不同的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在另外的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括經(jīng)改性后包含親水基團(tuán)的二甲氧基三嗪甲基嗎啉。在又一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括混和官能團(tuán)。所述混和官能團(tuán)可包括硼酸或硼酸衍生物。在一些實(shí)施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一種實(shí)施方式中，將烯醇酸與微球偶聯(lián)包括使包含乙烯基和烯醇酸的單體與不同的單體發(fā)生共聚反應(yīng)，形成具有改性的表面特性的微球。在一個(gè)不同的實(shí)施方式中，將烯醇酸與微球偶聯(lián)可包括將烯醇酸連接到微球表面。
經(jīng)改性的表面特性可提高試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。經(jīng)改性的表面特性還可以提高用這些微球進(jìn)行化驗(yàn)的效果。舉例來(lái)說(shuō)，試劑可包括生物分子。
表面特性可包括電荷密度。此外的或另外的表面特性可包括pKa。上述方法的每個(gè)實(shí)施方式可包括在此描述的任何其他步驟。此外，所述方法顯然可包括同時(shí)(即在相同步驟中)改變上述多個(gè)微球的表面特性。
另一種實(shí)施方式涉及包含烯醇酸的微球，所述烯醇酸偶聯(lián)到微球的聚合物核上，使烯醇酸能對(duì)微球的表面特性進(jìn)行改性。烯醇酸可包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸分子。可通過(guò)烯醇酸將一種試劑與微球偶聯(lián)。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能團(tuán)代替。在更多的實(shí)施方式中，烯醇酸可以概括地表示為與一種化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化的極性基團(tuán)。所述化學(xué)基團(tuán)可以包括砜基或羰基。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸至少包含一個(gè)親水基團(tuán)。在另一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括三角酸、方形酸、鄰二羥環(huán)戊烯三酮酸或玫棕酸，或者其他同系物。在一種不同的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在另外的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括經(jīng)改性后包含親水基團(tuán)的二甲氧基三嗪甲基嗎啉。在又一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括混和官能團(tuán)。所述混和官能團(tuán)可包括硼酸或硼酸衍生物。在一些實(shí)施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸可通過(guò)包含乙烯基和烯醇酸的單體與另一種不同的單體發(fā)生共聚反應(yīng)來(lái)偶聯(lián)到聚合物核上。在一種不同的實(shí)施方式中，烯醇酸可通過(guò)將烯醇酸連接到聚合物核表面上來(lái)與聚合物核偶聯(lián)。
經(jīng)改性的表面特性可提高試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。經(jīng)改性的表面特性還可提高用這些微球進(jìn)行化驗(yàn)的效果。所述試劑可以是生物分子。所述表面特性可包括電荷密度。此外，表面特性可包括pKa。微球的每種實(shí)施方式可根據(jù)本發(fā)明所述進(jìn)一步調(diào)整配置、組成和/或形成方式。
另一種實(shí)施方式涉及試劑盒。該試劑盒包括微球。該試劑盒還包括含烯醇酸的活化試劑。此外，試劑盒包含一種或多種化學(xué)品，一種或多種器件，或它們的一些組合，可用來(lái)將烯醇酸偶聯(lián)到微球的聚合物核上，使烯醇酸能對(duì)微球的表面特性進(jìn)行改性?？赏ㄟ^(guò)烯醇酸將一種或多種試劑與微球偶聯(lián)。
試劑盒和試劑盒的這些組件可如本發(fā)明所述進(jìn)一步配置。例如，在一些實(shí)施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能團(tuán)代替。在另一些實(shí)施方式中，烯醇酸可以概括地表示為與一種化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化的極性基團(tuán)。所述化學(xué)基團(tuán)可以包括砜基或羰基。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)參照附圖閱讀以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)顯而易見(jiàn)，圖中

圖1所示是測(cè)量系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例的流程簡(jiǎn)圖，該系統(tǒng)可利用本發(fā)明所述的微球的實(shí)施方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
在附圖和下文中顯示了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和替代。應(yīng)當(dāng)理解，附圖及其詳細(xì)描述無(wú)意將本發(fā)明限制于所介紹的特定形式，相反，本發(fā)明覆蓋所有改進(jìn)、等價(jià)和替代形式，只要它們落在附屬權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)。
優(yōu)選實(shí)施方式詳述術(shù)語(yǔ)“微球”、“微?！焙汀爸樽印痹谶@里可互換使用，指本領(lǐng)域已知的具有任何合適尺寸和形狀的離散固體物質(zhì)，其表面可與在此所述的一種或多種表面改性劑偶聯(lián)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“表面改性劑”一般指可與微球表面偶聯(lián)或以其他方式位于微球表面上和可改變微球表面的特性的一種或多種分子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“試劑”一般指偶聯(lián)到微球上的分子，該試劑在用微球進(jìn)行的化驗(yàn)或其他實(shí)驗(yàn)中可與被分析物反應(yīng)。合適的試劑的例子包括但不限于生物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸、寡聚核苷酸、酶、抗原、抗體或任何其他涉及或關(guān)乎人、動(dòng)物、植物等的生物功能的分子，以及候選藥物和染料。
本文一般性地描述了具有異常酸性的表面(例如聚苯乙烯表面)的微球的形成方法。例如，本文描述了在微球上偶聯(lián)一種或多種諸如烯醇酸衍生物的表面改性劑的方法。在一種實(shí)施方式中，改變微球表面特性的方法包括將烯醇酸偶聯(lián)到微球上，以改性微球的表面特性。可以通過(guò)烯醇酸將一種試劑偶聯(lián)到微球上。雖然在此參照一個(gè)微球描述了這種方法的實(shí)施方式，但應(yīng)當(dāng)理解，烯醇酸可以同時(shí)(即在所述方法的同一步驟或相同幾個(gè)步驟中)偶聯(lián)到多個(gè)微球上。
聚合物微球的表面性質(zhì)在許多涉及廣譜生物化驗(yàn)的應(yīng)用中扮演著重要角色。例如，微球的表面特性決定著是否有試劑以及哪些試劑能夠連接到微球上。此外，微球的表面特性可以決定試劑偶聯(lián)到微球上的量、可預(yù)測(cè)性、可重復(fù)性、均勻性等。在大多數(shù)市售微球中，端基為COOH或SO3H的功能單體被用來(lái)形成微球聚合物核的活化(或官能化)表面。酸性微球表面目前用諸如羧基、亞砜、氫氧化物、硼酸和硅酸這樣的基團(tuán)產(chǎn)生。
但是，在此所述方法包括用表面改性劑對(duì)微球表面進(jìn)行改性，所述表面改性劑如與砜或羰基之類的化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)。例如，在此所述的微球表面上可以加載一些官能團(tuán)(或用進(jìn)行官能化)，它們包括但不限于位于相鄰碳原子上并共軛的羰基和OH，被雙鍵或另一共軛鍵分隔的羰基和OH，共軛的砜和OH，羰基和COOH，砜和COOH，硼酸和OH，以及硅酸和COOH。相反，目前用作表面改性劑的酸包括位于碳、硼、硫或硅原子上的可離子化基團(tuán)。
烯醇酸包含位于不同原子上的氧基和羥基，它們被一個(gè)或多個(gè)雙鍵所分隔。根據(jù)處理微球的溶液的pH，位于微球表面的烯醇酸基團(tuán)可發(fā)生離子化，并可影響微球的表面電荷(例如電荷密度)和界面電荷(即水溶液與微球表面之間的界面上的電荷)。換句話說(shuō)，烯醇酸與微球發(fā)生偶聯(lián)，以改性表面特性，如微球的表面電荷和界面電荷。表面電荷和界面電荷的這些變化反過(guò)來(lái)會(huì)控制微球表面上的化學(xué)連接(或偶聯(lián))，特別是諸如生物分子這樣的試劑與固體表面之間的偶聯(lián)。所述試劑也可通過(guò)烯醇酸偶聯(lián)到微球上。
在此所述方法可采用如下烯醇酸、烯醇酸衍生物和混和官能團(tuán)來(lái)實(shí)施。例如，在此所述的方法可用諸如方形酸、氰尿酸和硼酸，以及7元化羥基環(huán)庚三烯酚酮(seven membered hydroxyl-tropolone)和三烷基甲硅烷基化合物這樣的烯醇酸。
Lugade等的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2004/0039201號(hào)介紹用方形酸氟化物作為預(yù)活化的烯醇酸氟化物，用于共價(jià)偶聯(lián)生物分子的氨基；該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。在此所述的方法采用若干烯醇酸及其衍生物來(lái)開(kāi)發(fā)其他可用于一批生物醫(yī)藥應(yīng)用的試劑。
在一種實(shí)施方式中，本文所述的方法可用諸如方形酸或其衍生物的烯醇酸來(lái)實(shí)施。方形酸是相當(dāng)強(qiáng)的二元酸，其pKa在約2-3.5的范圍內(nèi)。通過(guò)轉(zhuǎn)移兩個(gè)質(zhì)子，方形酸可產(chǎn)生二價(jià)方形酸根陰離子，它是相對(duì)剛性的離域平面芳族二價(jià)陰離子，能夠作為氫鍵的有效受體。該酸的其他同系物如三角酸、克酮酸和玫棕酸可用于在此所述方法的實(shí)施方式。附有方形酸酯的表面(由含胺表面制得)用來(lái)與含胺分子共軛。與方形酸相關(guān)的方法的例子見(jiàn)述于Blixt，O.等“Enymaticglycosoylation of reducing oligosaccharides linked to a solid phase or a lipid via acleavable squarate linker”，Carbohydrate Research，1999，319，80-91，以及Glusenkamp等的美國(guó)專利第6602692號(hào)和Aberg等的美國(guó)專利第6656876號(hào)，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。但是，在此所述的方法中，用方形酸來(lái)改變微球表面的特性，如表面pKa和表面電荷。
在另一種實(shí)施方式中，在此所述的方法可用oxocarbon acid來(lái)實(shí)施。Cole，R.J.等(Science，1973，179，1324)和Schmidt，A.H.等(Synthesis，1978，1)首先報(bào)道了具有如下通式的碳氧化合物，其中R＝Cl、烷基和芳基，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
利用合適的連接基團(tuán)R，可用包含表1第1行所示通式結(jié)構(gòu)的烯醇酸對(duì)微球表面特性進(jìn)行改性。
通過(guò)擴(kuò)展Meier，H.等在文獻(xiàn)Tetrahedron Lett.，1996，37(8)，1191中所報(bào)道的常規(guī)方法，可以制備包含乙烯基的單體，如3-羥基-4-(4-苯乙烯基)-3-環(huán)丁-1，2-二酮，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。在聚合反應(yīng)中，可以使用這種功能單體將烯醇酸基團(tuán)偶聯(lián)到微球表面。Sprenger，H.E.等在Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.，1968，7，530中報(bào)道了諸如3-羥基-4-乙烯基-3-環(huán)丁-1，2-二酮這樣的乙烯基烯醇酸，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
在一種不同的實(shí)施方式中，在此所述的方法可用環(huán)庚三烯酚酮實(shí)施。例如，可在所述的方法中用作表面改性劑的另一種烯醇酸是5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮，它具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu) 可對(duì)Uemura，T.等在Mol.Cryst.Liq.Cryst.，1983，95，287中所描述的方法進(jìn)行改進(jìn)，用來(lái)制備5-氨基環(huán)庚三烯酚酮，它可如下所示連接到微球表面上，其中該文獻(xiàn)全文參考于本文。
例如，J.Chem.Soc.(C)，1971，878；J.Chem.Soc.(PI)，1976，2329；J.Chem.Soc.，1951，2352報(bào)道了各種取代環(huán)庚三烯酚酮的合成過(guò)程，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。環(huán)庚三烯酚酮和帶環(huán)庚三烯酚酮表面基團(tuán)的微球的合成見(jiàn)述于后面提供的實(shí)施例4-6。
在另一些實(shí)施方式中，可用于所述方法的其他烯醇酸包括氰尿酸及其衍生物、硼酸及其衍生物、硅酸及其衍生物和其他烯醇酸及其衍生物。
氰尿酸及其衍生物包括由表1第2行所示通式表示的化合物。用氰脲酰氯活化的樹(shù)脂和用來(lái)活化羧基的結(jié)合于樹(shù)脂的三嗪用于在羧基位發(fā)生親核取代而產(chǎn)生酰胺，見(jiàn)述于Venkataranman，K.等，Tetrahedron Lett.，1979，32，3037，該文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
通過(guò)在聚合反應(yīng)過(guò)程中加入微球，可用如下所示的三嗪的乙烯基單體將氰尿酸或其衍生物偶聯(lián)到微球表面上。
例如，如上所示乙烯基單體可用來(lái)制備具有表面烯醇酸的微球，所述烯醇酸包含氰尿酸及其衍生物。類似地，巴比妥酸及其各種衍生物可通過(guò)聚合反應(yīng)或通過(guò)適當(dāng)官能化的連接基團(tuán)來(lái)引入(例如，見(jiàn)表1第3行)。
可用于本文所述方法的實(shí)施方式中的其他烯醇酸及其衍生物包括表1第5、6行所示通式結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物，它們具有弱酸性到中等酸性，可得自各種商業(yè)來(lái)源。屬于抗壞血酸系列的烯醇酸(見(jiàn)下式)的pKa約為4-4.2。
“醌型”化合物(見(jiàn)表1第7行)如氯冉酸也可商購(gòu)。利用合適的連接基團(tuán)，可將這些化合物固定到微球表面。2-羥基萘醌是中等強(qiáng)酸，類似于oxocarbonacid。該化合物曾被描述為半方形酸的插烯物(vinylog)。2-羥基萘醌的羥基可被硼酸、硅酸、硒酸或磷酸基團(tuán)置換，以改變?cè)摶衔锏乃嵝?，并由此改變與與該化合物偶聯(lián)的微球表面。
酰肼衍生物如氨基苯二酰一肼(表1第8行)具有可離子化的OH基，可用氨基固定在微球表面上。像氨基苯二酰一肼這樣的化合物已經(jīng)用于化學(xué)發(fā)光分析。
1，3-環(huán)己二酮及其衍生物(表1第9行)的pKa值約為4.8。像酚烯酮(phenolenone)這樣的化合物可以商購(gòu)，利用合適的連接基團(tuán)可將其偶聯(lián)到微球上。這種化合物的酸性可通過(guò)引入吸電子基和釋電子基來(lái)調(diào)節(jié)，所述基團(tuán)包括任何本領(lǐng)域已知的適合于這些化合物的基團(tuán)。
oxicam衍生物“Mobic”是烯醇酸類非類固醇消炎藥的一員，其pKa值為1.1和4.2。該化合物的高酸值是由其結(jié)構(gòu)中的砜基團(tuán)提供的。引入與OH共軛的砜，可用來(lái)提高烯醇酸的酸性(見(jiàn)表1第10-13行)。
表1第14行所示的結(jié)構(gòu)代表了可歸為“含氧”酸的一類酸，其酸性類似于oxo carbon acid的酸性。
表1第15行示出了可與其他單體發(fā)生聚合產(chǎn)生含烯醇酸表面的微球的最優(yōu)選的乙烯基單體的例子。
在其他實(shí)施方式中，本文所述的方法可用“混和烯醇酸”來(lái)進(jìn)行。例如，苯胺和茴香醚方形酸酯的易得性有利于將表1第16-19行所示通式結(jié)構(gòu)所代表的混和烯醇酸固定。類似化合物的合成見(jiàn)述于Gauger，J.等，Chem.Ber.，1970，103，2696；Bellus，D.，J.Am.Chem.Soc.，1978，100，8026；Law，K.Y.和Bailey，P.C.，J. Org.Chem.，1992，57，3278和Meier，H.等，Tetrahedron Lett.，1996，37，1191，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。環(huán)庚三烯酚酮的氨基衍生物可連接到oxo carbon acid如方形酸上(表1第19行)。
此外，本文所述的方法可用“活化烯醇酸”實(shí)施。例如，采用Lugade等在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2004/0039201號(hào)所述將方形酸轉(zhuǎn)化為方形酸氟化物的方法，對(duì)所述的任何“涂覆”烯醇酸的微球(即微球表面有烯醇酸分子)進(jìn)行活化，形成其烯醇酸氟化物的形式。這些新烯醇酸氟化物可用作交聯(lián)劑，其方式類似于Lugade等在該專利申請(qǐng)中所述的將方形酸氟化物用作交聯(lián)劑的方式。
借助其雙官能性質(zhì)，連有烯醇酸的微球還可用來(lái)形成特異性的金屬離子絡(luò)合物(例如參見(jiàn)下面所述)。而金屬螯合劑絡(luò)合物又可用于定位(site specific)捕獲生物分子，用于蛋白質(zhì)或肽的親合純化。
表1烯醇酸的例子表中字母“A”表示本領(lǐng)域已知的可用來(lái)將含烯醇酸的部分偶聯(lián)到微球(例如偶聯(lián)到微球表面上的官能團(tuán))的任何合適的連接基團(tuán)。基團(tuán)“A”還可包含乙烯基，以便在微球上的聚合物核發(fā)生聚合反應(yīng)期間將烯醇酸引入微球。





下面列出可在本發(fā)明的實(shí)施方式中用作微球的表面改性劑和偶聯(lián)活化劑的氰尿酸衍生物的一個(gè)例子。
研究了化合物二甲氧基三嗪甲基嗎啉(DMTMM)作為微球表面改性劑的情況。在文獻(xiàn)中，DMTMM用作肽鍵的活化劑。烷基取代的三嗪衍生物可以DMTMM商購(gòu)。DMTMM還可如下面提供的實(shí)施例1和2所述進(jìn)行合成。我們研究了它用作表面改性劑的情況，它與微球上的試劑偶聯(lián)(見(jiàn)下面)。
DMTMM能夠很好與微球偶聯(lián)，但偶聯(lián)了DMTMM的微球比使用常用表面改性劑—硫代-N-羥基琥珀酰亞胺(硫代-NHS)活化的微球的疏水性較高。換句話說(shuō)，用DMTMM改性的微球傾向于相互粘連在一起，而不是分散在水溶液中。相反，在連接有硫代-NHS基團(tuán)的微球上，當(dāng)硫代-NHS與微球上原有的羧基發(fā)生反應(yīng)，微球表面保留著喜水(即親水)基團(tuán)(硫基)。因此，微球能很好地分散在水、水溶液和溶劑中。相反，DMTMM因含有季銨鹽部分而溶于水，但與微球表面上的羧基反應(yīng)之后，它就失去此正電荷，同時(shí)也就失去水溶性。這樣，微球表面上的親水羧基被疏水芳環(huán)替代，從而降低了微球的親水性。
為了提高活化微球的親水性，用更高親水性的鏈替代DMTMM上的甲氧基，如下面的反應(yīng)式所示?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)通過(guò)制備二-(聚乙二醇)三嗪氯化物在生物分子中引入聚乙二醇鏈，如Sakurai等的日本專利第8092294所述，Roberts等還在Adv.Drug Delivery Rev.中(2002，54，459-476)作了綜述，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。其他包含親水基的三嗪化合物見(jiàn)述于Pyzhov等，DepositedDoc，1982，VINITI 1408-82；Martin等，J.Prak.Chem.，1981，323，694-699；Kashkin等，Zhurnal Organichkoi Khimii，1976，12，2030-2033；Ahne等，Synthesis，1975，184-186，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。因此，在一種實(shí)施方式中，所述的方法中所用的烯醇酸包括經(jīng)改性后包含親水基的DMTMM。如季銨離子、磺酸根、膦酸根、聚乙二醇(PEG)鏈、樹(shù)枝狀大分子結(jié)構(gòu)等的親水基可用來(lái)提高DMTMM和其他表面改性劑在與微球表面上的官能團(tuán)偶聯(lián)后的親水性。在此所述方法中，可用DMTMM的親水衍生物替代EDC/NHS表面改性活化劑。
X20＝-(CH2CH2-O)nCH3n＝1-100-(CH2)n-SO3--(CH2)n-PO3--(CH2)n-N(Y20)+，(Y20＝H，烷基)，n＝1-3-Si(OCH3)2-(CH2)3-N(CH3)3+-O-葡聚糖-O-碳水化合物-O-纖維素-O-卵磷脂下面的實(shí)施例3提供了用這樣的親水衍生物改變(活化)微球表面特性的一個(gè)例子。
含烯醇酸的微球表面可通過(guò)兩種途徑產(chǎn)生。例如，可以制備同時(shí)包含乙烯基和烯醇酸基的單體，然后可以使該單體與諸如苯乙烯的其他單體發(fā)生共聚反應(yīng)，產(chǎn)生表面含有烯醇酸基團(tuán)的微球，從而改進(jìn)表面特性。聚合反應(yīng)可用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行?；蛘?，將烯醇酸偶聯(lián)到微球上的過(guò)程包括將烯醇酸結(jié)合到微球表面。換句話說(shuō)，已經(jīng)形成的微球的表面可通過(guò)連接烯醇酸來(lái)改變。將烯醇酸連接到已形成的微球上可以用這里介紹的方法進(jìn)行，也可以用本領(lǐng)域已知的其他任何合適的方法進(jìn)行。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸分子。換句話說(shuō)，微球上可以偶聯(lián)兩種或更多種不同的烯醇酸。每種不同的烯醇酸分子可以直接與微球表面上的官能團(tuán)偶聯(lián)?；蛘撸煌┐妓岬膯误w可以與其他多個(gè)單體的組合發(fā)生共聚反應(yīng)，形成微球的聚合物核，使烯醇酸位于其表面上。
在一種實(shí)施方式中，經(jīng)過(guò)改性的表面特性可提高與試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。在另一種實(shí)施方式中，改性的表面特性提高了用所述微球進(jìn)行化驗(yàn)的性能。例如，不同生物分子可能需要不同的表面環(huán)境(即微球表面附近的環(huán)境)，以獲得最佳化驗(yàn)效果(例如與樣品中的被分析物產(chǎn)生最佳連接或發(fā)生最佳反應(yīng))。這些局部環(huán)境可用推薦的表面基團(tuán)產(chǎn)生和調(diào)整。這里介紹的一些表面改性劑將提高試劑穩(wěn)定性或化驗(yàn)效果。這里介紹的其他表面改性劑使得生物分子更容易連接到微球表面上。
例如，上述基于DMTMM的表面改性劑可用來(lái)減少生物材料沒(méi)有規(guī)律地偶聯(lián)到微球表面上的情況。這樣，所述表面改性劑可以不必用來(lái)形成“自偶聯(lián)”微球(即其表面基團(tuán)有選擇地自發(fā)與一種試劑偶聯(lián)的微球)，但所述表面改性劑可用來(lái)替代EDC/硫代-NHS交聯(lián)對(duì)，這種交聯(lián)對(duì)目前用于提供連有經(jīng)改進(jìn)的表面改性劑且表面性質(zhì)得到改進(jìn)的微球。
此外，在一些實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)EDC/硫代-NHS偶聯(lián)過(guò)程可能多少存在一些問(wèn)題。例如，EDC和硫代-NHS是吸濕固體，它們會(huì)與空氣中的水汽反應(yīng)，所以必須采取特殊的預(yù)防措施來(lái)使瓶中的表面改性劑保持不變。表面改性劑的工作溶液必須在使用之前臨時(shí)配制。EDC活化產(chǎn)生的脲副產(chǎn)物有時(shí)難以從珠懸浮體中除去，會(huì)干擾后面的偶聯(lián)反應(yīng)或化驗(yàn)。
相比于將試劑偶聯(lián)到微球上的標(biāo)準(zhǔn)方法，這里所述的方法具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，可單獨(dú)使用DMTMM型交聯(lián)劑來(lái)活化微球(不用兩種表面改性劑)。此外，DMTMM的水溶液在室溫下可穩(wěn)定存在數(shù)小時(shí)，若冷凍保存，穩(wěn)定時(shí)間更長(zhǎng)。不僅如此，DMTMM晶體對(duì)空氣中的水汽更加穩(wěn)定，因而使用起來(lái)更容易達(dá)到要求。另外，合成DMTMM不像合成EDC那么復(fù)雜，這可提高表面改性劑的質(zhì)量和一致性。
另一實(shí)施方式涉及包含偶聯(lián)到微球的聚合物核上的烯醇酸，使烯醇酸能改進(jìn)微球的表面特性。微球的聚合物核可用本領(lǐng)域已知的任何合適的聚合物形成。烯醇酸可包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸分子。試劑可通過(guò)烯醇酸與微球偶聯(lián)。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可被烯醇酸衍生物或混和官能團(tuán)替代。在另一些實(shí)施方式中，烯醇酸可概括地表示為與一個(gè)化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化的極性基團(tuán)。所述化學(xué)基團(tuán)可包括砜基或羰基。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸包含至少一個(gè)親水基團(tuán)。在另一種實(shí)施方式中，烯醇酸可包括三角酸、方形酸、克酮酸、玫棕酸或其他同系物。在不同的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮。在其他實(shí)施方式中，烯醇酸可包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。在又一實(shí)施方式中，烯醇酸可包括經(jīng)改性后含親水基團(tuán)的DMTMM。在另一些實(shí)施方式中，烯醇酸可包括混和官能團(tuán)。所述混和官能團(tuán)可包括硼酸或硼酸衍生物。在不同的實(shí)施方式中，烯醇酸可包括硅酸或硅酸衍生物。
在一種實(shí)施方式中，烯醇酸可以通過(guò)共聚反應(yīng)偶聯(lián)到聚合物核上，該共聚反應(yīng)采用含乙烯基和烯醇酸的單體和另一種不同單體。在一種不同的實(shí)施方式中，通過(guò)將烯醇酸連接到聚合物核表面，可將烯醇酸偶聯(lián)到聚合物核上。
改進(jìn)的表面特性可提高與試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。改進(jìn)的表面特性還可提高了用微球進(jìn)行化驗(yàn)的性能。所述試劑可以是生物分子。所述表面特性可包括電荷密度。此外，表面特性可包括pKa。微球的每種實(shí)施方式可根據(jù)本發(fā)明所述進(jìn)一步調(diào)整配置、組成和/或形成方式。上述微球的每種實(shí)施方式具有上述方法的所有優(yōu)點(diǎn)。
連有本發(fā)明所述表面改性劑的微球可以“即用型(ready to use)”微球的形式提供。此外，可以獨(dú)立試劑盒的形式提供一種或多種表面改性劑，用以活化微球上的表面基團(tuán)(偶聯(lián)到微球上的表面基團(tuán))。
在一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包括微球。該試劑盒還包括含諸如烯醇酸的一種或多種表面改性劑的活化試劑。此外，試劑盒包括一種或多種化學(xué)品，一種或多種器件，或它們的一些組合，可用來(lái)將烯醇酸偶聯(lián)到微球的聚合物核上(或偶聯(lián)到微球的聚合物核表面的基團(tuán)上)，使烯醇酸能改進(jìn)微球的表面特性?？赏ㄟ^(guò)烯醇酸將一種或多種試劑偶聯(lián)到微球上。所述試劑可包含在試劑含中，也可不包含在其中。
試劑盒和試劑盒的這些組件可如本文所述進(jìn)一步配置。例如，在一些實(shí)施方式中，烯醇酸可用烯醇酸衍生物或混和官能團(tuán)替代。在另一些實(shí)施方式中，烯醇酸可以概括地表示為與一種化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化的極性基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，所述化學(xué)基團(tuán)可以包括砜基或羰基。在此所述的試劑盒的每種實(shí)施方式具有上述方法的所有優(yōu)點(diǎn)。
以下實(shí)施例僅是為舉例目的，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的限制。
實(shí)施例1和2中的過(guò)程基于Kunishima，M.等，Tetrahedron Lett.，40，5327-5330，1999和Cronin，J.S.等，Syn.Commun.，26(18)，3491-3494，1996所述DMTMM的合成，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。
實(shí)施例12-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪的合成室溫，向14.43克(190毫摩爾)2-甲氧基乙醇、6.83克(81毫摩爾)碳酸氫鈉和1.3毫升(70毫摩爾)去離子水中加入5.0克(27毫摩爾)氰尿酰氯。溶液溫度升高到30℃并攪拌1小時(shí)，其間停止二氧化碳釋放。溶液溫度升高到45℃并持續(xù)攪拌過(guò)夜。冷卻之后，過(guò)濾混合物，用二氯甲烷洗滌固體。真空濃縮合并的濾液，得到8克2-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪的乳狀液，該乳狀液在制冷器中(-18℃)固化為蠟狀固體。
該產(chǎn)物的質(zhì)子核磁共振(1H NMR)得到如下結(jié)果(CDCl3，60MHz)δ4.7-4.4(m，4Hz)，3.8-3.5(m，4Hz)，3.4(s，6Hz)。該產(chǎn)物(凈產(chǎn)物)的紅外(IR)光譜發(fā)現(xiàn)了如下特征IR吸收頻率1557cm-1，1417cm-1，1330cm-1，1115cm-1，1050cm-1，1022cm-1和814cm-1。
實(shí)施例22-氯-4，6-二-(2-(二異丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪的合成室溫，向27.6克(190毫摩爾)2-(二異丙基氨基)乙醇、6.83克(81毫摩爾)碳酸氫鈉和1.3毫升(70毫摩爾)去離子水中加入5.0克(27毫摩爾)氰脲酰氯。溶液溫度升高到30℃并攪拌1小時(shí)，其間停止二氧化碳釋放。溶液溫度升高到45℃并持續(xù)攪拌過(guò)夜。冷卻之后，過(guò)濾混合物，用二氯甲烷洗滌固體。合并的濾液真空濃縮，得到6克2-氯-4，6-二-(2-(二異丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪的液體。
實(shí)施例3氯化4-(4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓(morpholinium)的合成向3.5毫升無(wú)水四氫呋喃中的1.05克(4毫摩爾)2-氯-4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪(如實(shí)施例1所述得到)中加入530微升N-甲基嗎啉。攪拌溶液30分鐘后過(guò)濾，在阿布德哈登干燥器中用丙酮干燥12小時(shí)，得到0.5克(34％)氯化4-(4，6-二-(2-甲氧基乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓的白色粉末。產(chǎn)物(凈產(chǎn)物)的IR光譜鑒定出以下特征IR吸收頻率1605cm-1，1417cm-1，1336cm-1，1300cm-1，1118cm-1，1094cm-1，1068cm-1，1053cm-1，1028cm-1，1009cm-1，991cm-1，972cm-1，858cm-1和821cm-1。
按照類似的方式，用實(shí)施例2得到的氯化物，得到氯化4-(4，6-二-(2-(二異丙基氨基)乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓。
實(shí)施例4用親水DMTMM衍生物活化羧基化微球的常規(guī)過(guò)程5.0E6羧基化微球懸浮在90微升合適的非親核緩沖液(pH5-9)中，向該懸浮液的等分懸浮液里，加入10微升50毫克/毫升最新描述的親水DMTMM衍生物之一(例如實(shí)施例3中所述化合物之一)在相同緩沖液中的溶液。攪拌懸浮液20-60分鐘。用本領(lǐng)域已知的任何方便的方法(例如反復(fù)離心和傾析)從微球中分離出過(guò)量的試劑?；罨⑶蛟诤线m的非親核緩沖液(pH4-9)中自發(fā)與含胺的分子(例如蛋白質(zhì))反應(yīng)約2小時(shí)。
實(shí)施例55-亞硝基環(huán)庚三烯酚酮的合成攪拌下，向2.05克(16.9毫摩爾)環(huán)庚三烯酚酮在6毫升去離子水和6毫升冰醋酸中的溶液里滴加1.25克(18.1毫摩爾)亞硝酸鈉在5毫升去離子水中的溶液。再攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾所得固體，真空干燥2小時(shí)，得到5-亞硝基環(huán)庚三烯酚酮的黃色固體。產(chǎn)物(凈產(chǎn)物)的IR光譜發(fā)現(xiàn)以下特征IR吸收頻率1603cm-1，1519cm-1，1316cm-1，1110cm-1，1015cm-1，845cm-1，812cm-1和781cm-1。
實(shí)施例65-氨基環(huán)庚三烯酚酮的合成在攪拌下，向0.39克5-亞硝基環(huán)庚三烯酚酮(2.6毫摩爾，由上一實(shí)施例得到)和10毫升無(wú)水乙醇中加入2.92克氯化亞錫(II)(12.9毫摩爾)。溶液回流40分鐘后，冷卻，過(guò)濾，液體部分分配在乙酸乙酯與水之間。有機(jī)部分真空濃縮，得到35毫克(10％)5-氨基環(huán)庚三烯酚酮的黃色固體。產(chǎn)物(凈產(chǎn)物)的IR光譜發(fā)現(xiàn)以下特征IR吸收頻率3319cm-1，3181cm-1，2925cm-1，1511cm-1，1410cm-1，1261cm-1，837cm-1，781cm-1和739cm-1。
實(shí)施例7連有環(huán)庚三烯酚酮表面基團(tuán)的微球的合成向100E6羧基化微球(事先用硫代-N-羥基琥珀酰亞胺和EDC活化)在0.5毫升碳酸鹽緩沖液(pH9)中的懸浮液里加入2毫克5-氨基環(huán)庚三烯酚酮溶解在25微升二甲基亞砜中形成的溶液。攪拌懸浮液4小時(shí)，從微球上洗去過(guò)量的試劑。
現(xiàn)參見(jiàn)附圖。圖1所示為可用來(lái)對(duì)本發(fā)明所述的微球的實(shí)施方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的測(cè)試系統(tǒng)的一個(gè)例子。應(yīng)當(dāng)指出，圖1未按比例繪制。具體地，圖中某些部分的比例放大了很多，以強(qiáng)調(diào)這些部分的特征。為了簡(jiǎn)潔，該測(cè)量系統(tǒng)的某些部分如數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)未在圖中示出。
在圖1中，測(cè)量系統(tǒng)是沿著比色皿12的截面所在平面展示的，微球10從比色皿12中流過(guò)。在一個(gè)實(shí)例中，所述比色皿可以是標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，如標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中所用的。不過(guò)，任何其他合適類型的觀察室或傳送室也可用來(lái)傳送供分析的樣品。微球10可根據(jù)本發(fā)明所述的實(shí)施方式形成。
測(cè)量系統(tǒng)包括光源14。光源14可包括本領(lǐng)域已知的任何合適的光源，如激光。光源可設(shè)計(jì)成能發(fā)射一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的光，如藍(lán)光或綠光。光源14可設(shè)計(jì)成當(dāng)微球通過(guò)比色皿的時(shí)候照射微球。光照射可引起微球發(fā)射具有一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)或波段的熒光。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)透鏡(未示出)，用來(lái)將來(lái)自光源的光聚焦到微球或流路上。該系統(tǒng)還可包括一個(gè)以上的光源。在一種實(shí)施方式中，多個(gè)光源可設(shè)計(jì)成以不同波長(zhǎng)的光(例如藍(lán)光和綠光)照射微球。在一些實(shí)施方式中，光源可設(shè)計(jì)成從不同方向照射微球。
自微球向前散射的光可通過(guò)折疊式反射鏡18或其他此類導(dǎo)光元件被導(dǎo)向檢測(cè)系統(tǒng)16。或者，檢測(cè)系統(tǒng)16可直接放在前向散射的光路上。按這種方式，折疊式反射鏡或其他導(dǎo)光元件可以不包括在該系統(tǒng)中。在一種實(shí)施方式中，向前散射光可以是被微球沿著與光源14的照射方向大約成180度角的方向散射的光，如圖1所示。前向散射光的角度不一定是與光源的照射方向剛好成180度，這樣來(lái)自光源的入射光將不會(huì)射到檢測(cè)系統(tǒng)的光敏表面上。例如，前向散射光可以是微球沿著與光源14的照射方向成小于或大于180度角的方向(例如成170度、約175度、約185度或約190度)散射的光。
也可在與光源照射方向成約90度的方向上收集被微球散射和/或發(fā)射的光。在一種實(shí)施方式中，可用一個(gè)或多個(gè)分束器或分色鏡將該散射光分成一個(gè)以上的光束。例如，在與光照方向約成90度的角度上散射的光可以用分束器20分成2條不同的光束。這兩條不同的光束又可用分束器22和24分成4條不同的光束。可將每條光束導(dǎo)向不同的檢測(cè)系統(tǒng)，所示檢測(cè)系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器。例如，可將4條光束中之一可導(dǎo)向檢測(cè)系統(tǒng)26。檢測(cè)系統(tǒng)26可用來(lái)檢測(cè)被微球散射的光。
可將其余3條光束導(dǎo)向檢測(cè)系統(tǒng)28、30和32。檢測(cè)系統(tǒng)28、30和32可用來(lái)檢測(cè)微球發(fā)射的熒光。每個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)可用來(lái)檢測(cè)不同波長(zhǎng)或不同波長(zhǎng)范圍的熒光。例如，檢測(cè)系統(tǒng)之一可用來(lái)檢測(cè)綠色熒光。另一檢測(cè)系統(tǒng)可用來(lái)檢測(cè)橘黃色熒光，而其他檢測(cè)系統(tǒng)可用來(lái)檢測(cè)紅色熒光。
在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)系統(tǒng)28、30和32上可分別連接濾光器34、36和38。濾光器可用來(lái)阻擋檢測(cè)系統(tǒng)不能檢測(cè)的波長(zhǎng)的熒光。此外，每個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)光學(xué)連接一個(gè)或多個(gè)透鏡(未示出)。透鏡可用來(lái)將散射光或發(fā)射熒光聚集在檢測(cè)器的感光表面上。
檢測(cè)器的輸出電流與射在其上的熒光成正比，得到電流脈沖。該電流脈沖可轉(zhuǎn)換為電壓脈沖，經(jīng)過(guò)低通過(guò)濾，然后用A/D轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化。DSP對(duì)脈沖下面的面積進(jìn)行積分，得到表示熒光強(qiáng)度的數(shù)值。
在一些實(shí)施方式中，由微球發(fā)射的熒光產(chǎn)生的輸出信號(hào)經(jīng)過(guò)處理后，可用來(lái)鑒定微球，提供有關(guān)微球表面已經(jīng)發(fā)生或正在發(fā)生的反應(yīng)的信息。例如，兩個(gè)輸出信號(hào)可用來(lái)鑒定微球，其他輸出信號(hào)可用來(lái)確定微球表面已經(jīng)發(fā)生或正在發(fā)生的反應(yīng)?？筛鶕?jù)兩個(gè)或多個(gè)不同檢測(cè)窗中產(chǎn)生的輸出信號(hào)比來(lái)鑒定微球。例如，如果檢測(cè)系統(tǒng)30和32具有不同的檢測(cè)窗，從檢測(cè)系統(tǒng)30產(chǎn)生的輸出信號(hào)與檢測(cè)系統(tǒng)32產(chǎn)生輸出信號(hào)之比，并結(jié)合每個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度，可以鑒定微球。因此，根據(jù)引入或連接到微球上的染料類型和/或待測(cè)反應(yīng)(即引入或連接到反應(yīng)中所涉及的反應(yīng)物的染料)，可以選擇不同的檢測(cè)器和濾光器。
雖然圖1所示系統(tǒng)包括兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)，它們具有兩個(gè)不同的檢測(cè)窗，以區(qū)分具有不同染色特性的微球，但應(yīng)當(dāng)理解，該系統(tǒng)可包括兩個(gè)以上的此類檢測(cè)窗(即3各檢測(cè)窗、4各檢測(cè)窗等)。在這種實(shí)施方式中，測(cè)量系統(tǒng)可包括額外的分束器和具有其他檢測(cè)窗的檢測(cè)系統(tǒng)。用于兩個(gè)以上檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)窗可根據(jù)上述方法確定。此外，每個(gè)額外的檢測(cè)系統(tǒng)都可連接濾光譜器和/或透鏡。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量系統(tǒng)可包括兩個(gè)或多個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)，用來(lái)區(qū)分在微球表面上發(fā)生反應(yīng)的不同材料。這些不同反應(yīng)物材料所具有的染色特性不同于微球的染色特性。
可用來(lái)對(duì)本發(fā)明所述表面改性微球進(jìn)行測(cè)量的其他測(cè)量系統(tǒng)的例子見(jiàn)述于Chandler等的美國(guó)專利第5981180號(hào)、Chandler的美國(guó)專利6046807、Chandler的美國(guó)專利6139800；Chandler的美國(guó)專利6366354 B1、Chandler的美國(guó)專利6411904 B1、Chandler等的美國(guó)專利6449562 B1、Chandler等的美國(guó)專利6524793 B1，這些文獻(xiàn)全文參考結(jié)合于本文。本發(fā)明所述測(cè)量系統(tǒng)也可根據(jù)這些專利所述的方法進(jìn)一步設(shè)計(jì)。此外，可使用本發(fā)明所述微球?qū)嵤┓绞降幕?yàn)和實(shí)驗(yàn)包括這些專利中所述的任何化驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)以及本領(lǐng)域已知的任何其他化驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)。
對(duì)于知曉本發(fā)明所揭示的益處的本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)理解的是，可以確信本發(fā)明提供了改變微球表面特性的方法。通過(guò)該描述，對(duì)本發(fā)明各方面的進(jìn)一步改進(jìn)和各種替代實(shí)施方式對(duì)暴露于技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此，這些描述僅僅是說(shuō)明性的，其目的是向本領(lǐng)域技術(shù)人員揭示實(shí)施本發(fā)明的一般方式。應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)將本說(shuō)明書(shū)所展示和描述的本發(fā)明的各種形式看作目前優(yōu)選的實(shí)施方式。本說(shuō)明書(shū)所展示和描述的要素和材料可以替換，各個(gè)部分和過(guò)程可以反向?qū)嵤景l(fā)明的某些特征可獨(dú)立應(yīng)用，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉本發(fā)明所描述的益處之后所顯見(jiàn)的那樣。只要不背離下面的權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍，可對(duì)本說(shuō)明書(shū)所描述的各個(gè)要素進(jìn)行改變。
權(quán)利要求
1.一種改變微球表面特性的方法，該方法包括將烯醇酸偶聯(lián)到微球上，來(lái)改變微球的表面特性，其中，可通過(guò)烯醇酸將試劑與微球偶聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包含至少一個(gè)親水基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括三角酸、方形酸、克酮酸或玫棕酸。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括改性后包含親水基團(tuán)的二甲氧基三嗪甲基嗎啉。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包含混合官能團(tuán)，所述混合官能團(tuán)包括硼酸或硼酸衍生物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括硅酸或硅酸衍生物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)包括含乙烯基和烯醇酸的單體與不同單體發(fā)生共聚反應(yīng)，形成具有改性的表面特性的微球。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)包括將烯醇酸連接到微球表面上。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，經(jīng)改性的表面特性提高了試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，經(jīng)改性的表面特性提高了用微球進(jìn)行化驗(yàn)的性能。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑包括生物分子。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，烯醇酸包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸分子。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面特性包括電荷密度。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面特性包括pKa。
17.一種微球，包含偶聯(lián)到微球的聚合物核上的烯醇酸，使烯醇酸能改變微球的表面特性，其中試劑通過(guò)烯醇酸與微球偶聯(lián)。
18.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包含至少一個(gè)親水基團(tuán)。
19.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括三角酸、方形酸、克酮酸或玫棕酸。
20.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括5-取代羥基環(huán)庚三烯酚酮。
21.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括氰尿酸或氰尿酸衍生物。
22.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括改性后包含親水基團(tuán)的二甲氧基三嗪甲基嗎啉。
23.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括混合官能團(tuán)，所述混合官能團(tuán)包括硼酸或硼酸衍生物。
24.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括硅酸或硅酸衍生物。
25.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸通過(guò)共聚反應(yīng)進(jìn)一步偶聯(lián)到聚合物核上，所述共聚反應(yīng)使用含乙烯基和烯醇酸的單體與不同單體進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，通過(guò)將烯醇酸連接到聚合物核的表面上，將所述烯醇酸進(jìn)一步偶聯(lián)到聚合物核上。
27.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，經(jīng)改性的表面特性提高了試劑與微球偶聯(lián)時(shí)的穩(wěn)定性。
28.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，經(jīng)改性的表面特性提高了用微球進(jìn)行化驗(yàn)的性能。
29.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，所述試劑包括生物分子。
30.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，烯醇酸包括一種或多種偶聯(lián)到微球上不同位置的烯醇酸分子。
31.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，所述表面特性包括電荷密度。
32.如權(quán)利要求17所述的微球，其特征在于，所述表面特性包括pKa。
33.一種試劑盒，它包含微球；含烯醇酸的活化試劑；一種或多種化學(xué)品，一種或多種器件，或它們的一些組合，可用來(lái)將烯醇酸偶聯(lián)到微球的聚合物核上，使烯醇酸能改性微球的表面特性，其中一種或多種試劑通過(guò)烯醇酸與微球偶聯(lián)。
34.一種改變微球表面特性的方法，它包含將烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)偶聯(lián)到微球上，以改性微球的表面特性，其中，試劑通過(guò)烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)與微球偶聯(lián)。
35.一種微球，它包含偶聯(lián)到微球的聚合物核上的烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)，使所述烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)能改性微球的表面特性，其中，試劑通過(guò)烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)與微球偶聯(lián)。
36.一種試劑盒，它包含微球；含烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)的活化試劑；一種或多種化學(xué)品，一種或多種器件，或它們的一些組合，可用來(lái)將烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)偶聯(lián)到微球的聚合物核上，使所述烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)能改性微球的表面特性，其中，試劑可通過(guò)烯醇酸、烯醇酸衍生物或混合官能團(tuán)與微球偶聯(lián)。
37.一種改變微球表面特性的方法，它包含將與一種化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)偶聯(lián)到微球上，以改性微球的表面特性，其中，試劑通過(guò)與該化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)偶聯(lián)到微球上。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)基團(tuán)包括砜基或羰基。
39.一種微球，它包含偶聯(lián)到微球的聚合物核上的與化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)，使與該化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)能改性微球的表面特性，其中，試劑通過(guò)與化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)偶聯(lián)到微球上。
40.如權(quán)利要求39所述的微球，其特征在于，所述化學(xué)基團(tuán)包括砜基或羰基。
41.一種試劑盒，它包含微球；含與化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)的活化試劑；一種或多種化學(xué)品，一種或多種器件，或它們的一些組合，可用來(lái)將與該化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)偶聯(lián)到微球的聚合物核上，使與該化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)能改性微球的表面特性，其中，試劑可通過(guò)與該化學(xué)基團(tuán)共軛的可離子化極性基團(tuán)偶聯(lián)到微球上。
42.如權(quán)利要求41所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)基團(tuán)包括砜基或羰基。
全文摘要
提供了形成染色微球的各種方法。一種方法包括利用熱或光活化與染料偶聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在微球存在下形成反應(yīng)中間體。反應(yīng)中間體通過(guò)共價(jià)鍵連接到微球的聚合物上，由此將染料偶聯(lián)到聚合物上，形成染色的微球。還提供了形成與一個(gè)分子偶聯(lián)的染色微球的其他方法。這些方法包括如上所述給微球染色，然后在染色微球外表面上合成分子。還提供了染色微球群。染色微球群中的每個(gè)染色微球包含一種染料，該染料通過(guò)一種化學(xué)結(jié)構(gòu)連接到每個(gè)染色微球的聚合物上。染色微球群的染色特性由染料引起的差異因數(shù)約小于10％。
文檔編號(hào)G01N33/546GK101044403SQ200580034420
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
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