專利名稱：對干擾素治療腎細胞癌反應的鑒定標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用人基因多態(tài)性作為指示物(標記)，評估使用干擾素對腎細胞癌的腫瘤抑制效果的方法，在這種方法中使用的寡核苷酸，以及這種基因多態(tài)性的檢測試劑盒。
背景技術：
腎細胞癌是對目前實施的任何治療，例如，使用化學治療藥物、免疫治療藥物等的藥物治療、放射治療、外科手術和/或類似方法的反應率都較低的難治性疾病。此外，據報道，到診斷出患有腎細胞癌時已經發(fā)展為遠程轉移的病例高達大約30％。除外科手術外，上述藥物治療中使用干擾素(IFNs)的免疫治療被認為特別有效；但是，單獨施用IFN-α時，通過這種治療獲得的反應率低到只有大約15％，單獨施用IFN-γ時，反應率只達到10-15％。即使與抗癌劑組合使用，也沒有獲得產生的效果比IFN-α單一療法更高的其他治療方法。目前實施的使用IFN的免疫療法主要是單獨使用IFN-α或聯(lián)合使用IFN-γ的長期維持治療。
與此同時，基因組科學的發(fā)展正在快速闡明與藥物反應性有關的藥物動力學、酶和蛋白質的基因多態(tài)性等等。在人基因組分析中，因為最經常發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性標記，因此單核苷酸多態(tài)性(SNPs)已經引起大家注意。已知這種SNPs可用于分析與常見疾病、藥物反應等等相關的人基因組(參見非專利文件1、2和3)。也已經已知利用多種SNPs的單倍體分析可用于分析對疾病的易感性(參見非專利文獻4)。
近來，為了建立所謂的個體病人定制醫(yī)學，已經提議研究揭示給定的基因多態(tài)性和病人的藥物敏感性/藥物反應性之間的關系。
預測IFN治療效果的已知方法是分析HCV(人丙型肝炎病毒(人HCV))感染病人的基因組上的MxA-8/MxA123 MBL-221/MBL-CLD密碼子54 SNPs與IFN-α應答者(對該治療反應性的病人)和非應答者(對該治療沒反應性的病人)之間的關系，從而預測和評估HCV感染的病人對IFN治療的反應程度(專利文獻1)。另一個已知方法利用IFN-α受體2基因的啟動子區(qū)域和位置134處的SNP作為基因多態(tài)性標記來預測IFN治療反應(專利文獻2)。該文件公開的靶疾病從由乙型肝炎、丙型肝炎、惡性膠質瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、皮膚惡性黑色素瘤，類肝炎、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、毛細胞白血病、慢性髓細胞性性白血病、亞急性硬化性全腦炎、病毒性腦炎、免疫抑制病人的全身性帶狀皰疹和水痘、未分化鼻咽癌、伴隨聽力減退的內耳病毒感染性疾病、皰疹性角膜炎、扁平濕疣、尖銳濕疣、由腺病毒和/或皰疹病毒感染引起的結膜炎、生殖器皰疹、感冒瘡、子宮頸癌、癌性胸膜積水、角化棘皮瘤、基底細胞癌和δ型慢性活動型肝炎。
此外，評估IFN-α治療丙型肝炎的反應的已知方法是測量IRF-1基因啟動子區(qū)域位置196處的鳥嘌呤(G)被置換成腺嘌呤(A)(參見專利文獻3)。
但是迄今為止，還沒有文件具體報告IFN對腎細胞癌的治療反應與給定SNPs之間的關系。
已經報道IFN-α應答者和非應答者的幾百個基因表達圖譜(參見非專利文獻4和專利文獻4)。這些圖譜是利用如DNA芯片(高密度寡核苷酸或微陣列)、差異顯示、差異cDNA陣列、SAGE(基因表達系列分析)、表達序列標簽數(shù)據庫比較等技術產生的。這些方法可用來分析結腸癌、乳癌、卵巢癌、多發(fā)性硬化病變、白血病和腎細胞癌中的基因表達。此外非專利文獻4還包括了如IRF2、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5、STAT6等的基因；但是，沒有公開用于本發(fā)明的具體基因的SNPs。
未審查的日本專利出版物No.2003-88382[專利文獻2]未審查的日本專利出版物No.2003-339380[專利文獻3]未審查的日本專利出版物No.2001-136973[專利文獻4]未審查的日本專利出版物No.2004-507253[非專利文獻1]Brookes，A.J.，″The essence of SNPs″，Gene，USA，(1999)，234，177-186[非專利文獻2]Cargill，M，等，″Characterization of single-nucleotidepolymorphisms in coding regions of human genes″，Nature Genet.，USA，(1999)，22，231-238[非專利文獻3]Evans，W.E.，&Relling，M.V.，″Pharmacogenomicstranslating functional genomics into rational therapeutics″，Science，USA，(1999)，286，487-491[非專利文獻4]Schlaak，J.F.，et.al.，″Cell-type and Donor-specificTranscriptional Responses to Interferon-α″，J.Biol.Chem.，(2002)277，51，49428-49437發(fā)明公開的內容發(fā)明解決的問題本發(fā)明的主要目標是提供評估使用干擾素對腎細胞癌的治療反應(腫瘤抑制效果)的方法。
解決問題的方法為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人任意挑選了33個基因作為基因多態(tài)性分析的候選基因，這些基因包括IFN相關基因、據報道與IFN-γ信號轉導有關的基因，以及據報道添加/施用IFN時其表達發(fā)生改變的基因。發(fā)明人利用公共的多態(tài)性數(shù)據庫搜索了這些候選基因上的SNPs，最終選擇出了463個候選SNPs。然后，利用來源于兩個病人組施用IFN-α在腎細胞癌誘導出腫瘤抑制效果的IFN應答者組(對該治療起反應的病人)和IFN非應答者組(對該治療不起反應的病人)的基因組DNA樣品，確定選擇的這些SNPs的頻率差異。結果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)下列8個基因上SNPs在上述兩個組之間存在統(tǒng)計學上有意義的差異。
(1)STAT3基因(轉錄的信號轉導物和激活因子3STAT3(GenBank登記入冊號NT_010755))(以下簡稱″STAT3基因″)、(2)SSI3基因(細胞因子信號抑制劑3SSI3(GenBank登記入冊號NT_010641))(以下簡稱″SSI3基因″)、(3)IL-4R基因(白細胞介素4受體(GenBank登記入冊號NT_010393))(以下簡稱″IL-4R″)、(4)IRF2基因(干擾素調節(jié)因子2IRF2(GenBank登記入冊號NT_022792))(以下簡稱″IRF2基因″)、(5)ICSBP基因(干擾素共有序列結合蛋白ICSBP1(GenBank登記入冊號NT_019609)(以下簡稱″ICSBP1基因″)、(6)PTGS1基因(前列腺素內過氧化物合酶1PTGS1(GenBank登記入冊號NT_008470)(以下簡稱″PTGS1基因″)、(7)PTGS2基因(前列腺素內過氧化物合酶2PTGS2(GenBank登記入冊號NT_004487)(以下簡稱″PTGS2基因″)、(8)TAP2基因(轉運蛋白，ATP結合盒，主要組織相容性復合物2TAP2(GenBank登記入冊號NT_007592)(以下簡稱″TAP2基因″)本發(fā)明的發(fā)明人更進一步地研究了上述基因上存在的SNPs與IFN治療腎細胞癌的反應之間的關系。結果，發(fā)明人已經證實16個SNPs與施用IFN-α對腎細胞癌的腫瘤抑制效果密切相關，而且發(fā)明人也意識到這些SNPs可以作為評估IFN治療后的腫瘤抑制效果的標記。更具體地說，發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)檢測這些SNPs能夠預測施用的IFN對腎細胞癌的腫瘤抑制效果(治療反應)(預測性診斷)。發(fā)明人以這些發(fā)現(xiàn)為基礎，通過更進一步的研究完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了如下文1-11條所描述的評估對腎細胞癌病人進行IFN治療后的腫瘤抑制效果的方法。
條款1.一種評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，該方法包括下列步驟(i)到(iv)；(i)獲取來源于腎細胞癌病人的基因樣品(基因組DNA樣品)的步驟、(ii)利用在上述步驟(i)中獲得的基因樣品，制備選自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因中的至少一個基因的基因組DNA或其互補鏈的步驟、(iii)分析基因組DNA或其互補鏈的DNA序列，并確定其基因多態(tài)性、和(iv)利用上述步驟(iii)中確定的至少一個基因多態(tài)性作為標記，評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果。
條款2.一種依照條款1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是選自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因中的至少一個基因的多態(tài)性。
條款3.一種依照條款1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是選自下列(a)到(p)的至少一種多態(tài)性(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號rs1905341表示、(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號rs4796793表示、(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號rs2293152表示、
(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號rs2293153表示、(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號rs2280148表示、(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號rs1805011表示、(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號rs2797507表示、(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號rs796988表示、(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號rs2292982表示、(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號rs1213264表示、(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號rs1213265表示、(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號rs1213266表示、(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號rs2745557表示、(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號rs2071466表示、(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號rs2234898表示、(p)在IL-4R基因的位置18686553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號rs1801275表示。
條款4.一種依照條款3的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是條款3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一種。
條款5.一種依照條款1-4中任何一項的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中IFN選自IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ。
條款6.一種依照條款1-5中任何一項的方法，其中基因多態(tài)性是通過選自直接測序、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析、單核苷酸引物延伸法、PCR單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析、PCR限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析、侵入方法、定量實時PCR和使用質譜儀的質譜陣列中的至少一種方法確定的。
條款7.依照條款6的方法，其中通過侵入方法或直接測序確定基因多態(tài)性。
條款8.依照條款6的方法，其中通過PCR-RFLP分析確定基因多態(tài)性。
條款9.依照條款8的方法，其中利用限制性內切酶Mspl，用PCR-RFLP分析檢測人STAT3基因內含子4204027處的G到C突變rs2293152。
條款10.依照條款6的方法，其中利用選自下列(a)到(p)中的至少一種寡核苷酸作為基因多態(tài)性檢測探針或引物確定基因多態(tài)性(a)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號rs1905341表示的基因多態(tài)性位點，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs4796793表示的基因多態(tài)性位點，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2293152表示的基因多態(tài)性位點，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs2293153表示的基因多態(tài)性位點，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/C的由參考SNP ID編號rs2280148表示的基因多態(tài)性位點，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs1805011表示的基因多態(tài)性位點，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs2797507表示的基因多態(tài)性位點，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs796988表示的基因多態(tài)性位點，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號rs2292982表示的基因多態(tài)性位點，
(j)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs1213264表示的基因多態(tài)性位點，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs1213265表示的基因多態(tài)性位點，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由參考SNP ID編號rs1213266表示的基因多態(tài)性位點，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2745557表示的基因多態(tài)性位點，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2071466表示的基因多態(tài)性位點，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs2234898表示的基因多態(tài)性位點，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686553具有基因型T/T的由參考SNP ID編號rs1801275表示的基因多態(tài)性位點。
條款11.依照條款6的方法，其中基因多態(tài)性檢測引物對是下列(a)到(p)中的任何一個(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列組成的寡核苷酸引物對，以及(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了檢測對IFN治療腎細胞癌反應的鑒定標記的方法，特別是包括檢測來自腎細胞癌病人標本的特定的人基因多態(tài)性或基因型和評估所述病人的IFN治療反應(腫瘤抑制效果)的方法，用于該方法的試劑盒、基因多態(tài)性、基因型和用于該方法和試劑盒的基因型檢測探針和引物。他們在實施個體病人定制醫(yī)學中可用于確定藥物選擇優(yōu)先級。
實施本發(fā)明的最佳方式在本說明書中使用的氨基酸、肽、堿基序列、核酸等等的縮寫與IUPAC-IUB規(guī)則(IUPAC-IUB communication on BiologicalNomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984))，(″Enki-hairetsu matahaaminosan-hairetsu wo fukumu meisaisho nado no sakusei no tamenogaidorain″(準備含有堿基序列或氨基酸序列的說明書的指南Guidelinesfor preparation of specifications containing base sequences or amino acidsequences″(由日本專利局匯編)和相關領域使用的標準符號一致。
本說明書中使用的″基因多態(tài)性″和″多態(tài)性″指占據一個位點的多種等位基因群或這種群中的個體等位基因。在這些多態(tài)性中，只有一個核苷酸不同的那些多態(tài)性被定義為單核苷酸多態(tài)性或SNP。單核苷酸多態(tài)性在本說明書中縮寫為″SNP″。
單倍體標明了上述基因多態(tài)性(SNPs)的種類，以在連續(xù)的基因區(qū)域或基因群組中的多個SNP位點中的等位基因的種類和數(shù)量為基礎表示。
在本說明書中，基因型指給定基因多態(tài)性位點中的基因位點的等位基因狀況。例如，在STAT3基因的位置4243095處的SNP基因型(STAT3-2)表示為C/T雜合型或T/T純合型。這也可以表示為″STAT3-2 C/T或T/T″。當病人具有基因型STAT3-2 C/T或T/T時，預計病人可能對IFN治療腎細胞癌(腫瘤抑制效果)作出響應(PR部分響應)或作出很好的響應(CR完全響應)。因此，基因型STAT3-2C/T或T/T可用作鑒定對IFN治療腎細胞癌反應的鑒定標記。
本說明書中標明的人基因的基因組序列與在核酸序列數(shù)據庫NCBI(國家生物技術信息中心)(National Center for BiotechnologyInformation)登記的GenBank登錄號(e.g.NT_010641)下的核酸序列一致。同樣，在NCBI的SNP數(shù)據庫中的參考SNP ID編號(例如rs1213265)(參見參考SNP(refSNP)群報告，在<http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP>中可找到)下也可以發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中被稱為人基因多態(tài)性的SNPs的位點信息和核酸突變信息。也可以依照參考SNP ID編號標明本說明書中使用的SNP信息。
表1顯示從GenBank中獲得的關于基因序列、mRNA序列、SNP位點和核酸突變的基本信息。
表1

在表1中，基因下的那列顯示其中包含本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的SNPs的基因的名稱，后面是發(fā)明人任意分配的SNP編號。在該表中，″rs#_″表示參考SNPs的登錄號，″核酸″表示核酸突變(A/G指其中A轉變?yōu)镚的SNP)，″毗連群登記″表示基因組重疊群序列的登錄號，″毗連群位置″表示表明基因組序列中核酸突變的位置的位置編號，″mRNA″表示mRNA序列號的登錄號，″mRNA方向″表示包含基因多態(tài)性序列的mRNA的方向。更進一步地，″蛋白質″表示蛋白質序列的登錄號，″位置″表示其上存在基因多態(tài)性的位點的信息，″dbSNP等位基因″表示互補雙鏈上的等位基因的核酸信息，″氨基酸殘基″表示那些被改變(被替換)的氨基酸殘基，″密碼子位點″表示核酸編碼的氨基酸的密碼子位點信息，“氨基酸序列信息”表示氨基酸序列的位點上的信息，以及″備注″表示基因的同義詞。
如表1所示，僅僅在與IL-4R有關的基因多態(tài)性中鑒定到用于本發(fā)明的方法的由特定的人基因多態(tài)性引起的氨基酸替換，其他基因的基因多態(tài)性沒有引起氨基酸替換。
用于本說明書的術語″基因″不僅包括雙鏈DNAs，而且包括組成雙鏈DNAs的單鏈DNAs(有義鏈和反義鏈)。更具體地說就是，除非另作說明，否則依照本發(fā)明的基因(DNAs)包括包含人基因組DNAs的雙鏈DNAs、包含cDNAs的單鏈DNAs(有義鏈)、具有與所述有義鏈互補的序列的單鏈DNAs，以及其片段。更進一步地，所述基因(DNAs)可以包含調節(jié)區(qū)域、編碼區(qū)域、外顯子和內含子。多核苷酸包括RNA和DNA。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。多肽包括其片段、同源物、衍生物和變異體。更進一步地，變異體指天然發(fā)生的等位基因變異體、非天然發(fā)生的那些等位基因變異體、被修飾(缺失、替換、添加和插入)的那些變異體，以及基本上不改變編碼多肽功能的多核苷酸序列。例如，氨基酸序列的修飾可以通過突變和翻譯后修飾天然地發(fā)生，或者可以利用天然發(fā)生的遺傳元件人工促成這種修飾。
本發(fā)明的實現(xiàn)是基于發(fā)現(xiàn)在人基因(IFN基因，據報道與IFN-γ信號轉導系統(tǒng)有關的基因，以及據報道添加/施用IFN時其表達發(fā)生改變的基因)的給定位點處包含基因型的基因多態(tài)性，特別是SNP或SNPs與IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果密切相關，以及檢測這種基因多態(tài)性(給定位點的基因型)能夠評價腎細胞癌病人對IFN治療的反應。換句話說，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)某些人基因多態(tài)性，特別是特定的SNPs可用作評價對腎細胞癌的IFN治療的反應的標記而實現(xiàn)的。依照本發(fā)明，檢測來自腎細胞癌病人的標本的特定SNPs能夠預測腎細胞癌病人對IFN治療的反應。
本發(fā)明基本上需要檢測來自腎細胞癌病人標本的特定的人基因多態(tài)性，即由STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-14、IL-4R-22、L-4R-29、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5組成的基因多態(tài)性(基因型)。
待通過本發(fā)明的方法檢測(分型)的SNPs，即與IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制效果有關的基因多態(tài)性(或基因型)更具體地顯示在下列的(a)到(p)中。
(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號rs1905341表示、(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號rs4796793表示、(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號rs2293152表示、(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號rs2293153表示、(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號rs2280148表示、(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號rs1805011表示、(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號rs2797507表示、(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號rs796988表示、(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號rs2292982表示、(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號rs1213264表示、(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號rs1213265表示、(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號rs1213266表示、(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號rs2745557表示、(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號rs2071466表示、(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號rs2234898表示、和(p)在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號rs1801275表示。
依照本發(fā)明，檢測特定的人基因多態(tài)性(SNPs和單倍體)和/或基因型可以提供對理解和闡明腎細胞癌的腫瘤抑制效果和機制(IFN的腫瘤抑制效果)有用的的信息和方法，其可預測診斷腎細胞癌治療等等。更進一步地，依照本發(fā)明的這種檢測可以提供確定腎細胞癌病人治療方案的有效信息，特別是確定在實施適合個體腎細胞癌病人的定制醫(yī)學的過程中是否應當施用IFN作為治療方案的重要信息。
在本發(fā)明中，用于腎細胞癌病人的IFN治療的IFN實例包含天然IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ等等。這些IFNs可以包括在本發(fā)明的方法中，不僅可以單獨使用，而且可以與免疫治療藥物、化療藥物等等組合使用。
獲取包含基因多態(tài)性(SNPs)的人基因下文詳細描述了本發(fā)明。在本發(fā)明中，首先獲取來自腎細胞癌病人的基因樣品作為標本(步驟i)。獲取的基因樣品包含特定的基因多態(tài)性(SNPs)，更具體地包含上述(a)到(p)的基因多態(tài)性中的任何一種。這種樣品的可用實例有通過常規(guī)方法從腎細胞癌病人中提取的cDNA和基因組DNA。樣品可以是包含上述基因多態(tài)性的DNA的互補鏈。
cDNA或基因組DNA樣品來源的實例包括各種細胞、組織、從其中衍生的培養(yǎng)細胞等等。更具體的實例包括體液，例如血液、唾液、淋巴、呼吸道粘液、尿、精液等等。來源于上述來源的作為標本的樣品優(yōu)選來源于施用IFN(除已經施用IFN以外的藥物的病例以外，還特別包括施用任何藥物的病例)之前的病人的DNA或基因組DNA?？梢砸勒諛藴史椒▽嵤倪@些原始樣品中分離RNA、分離和純化mRNA、合成cDNA和克隆的過程。
在本發(fā)明的方法中，制備來自上述基因樣品的特定人基因的基因組序列或其互補鏈(例如包含上述(a)到(p)的基因多態(tài)性中的任何一種的基因或其互補鏈))(步驟ii)。
按照常規(guī)的基因工程技術，參考本說明書中公開的包含上述SNPs(a)到(p)中任何一種的基因的具體序列信息可以很容易地實施這一制備過程[Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken KozaIdenshi Kenkyuho I，II，III(″Biochemistry Experiment Lecture Part IIGene Studies I，II，III″)，由日本生物化學協(xié)會1986年匯編等]。特別地，依據標準方法(例如參見Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)))))等)，利用針對(a)到(p)中任何具體基因型的適當探針或限制性內切酶可以實施從腎細胞癌病人提取包含如上所述(a)到(p)的任何基因多態(tài)性的cDNA或基因組DNA的制備過程。更具體地說，通過制備包含基因型位點、能選擇性結合想要SNPs的DNA序列的探針，并使用這種探針實施單核苷酸引物延伸、侵入方法、實時定量PCR等等可以實現(xiàn)這一制備過程。
可用的篩選引物有基于目的基因的核酸序列信息設計的正向和反向引物。可以遵循標準方法，使用例如自動合成器合成這些引物。典型地可以標記這種篩選探針；但是，也可以使用非標記探針，只要他們能直接或間接地特異結合標記的配體就可以。探針和配體的標記試劑和標記技術在相關技術領域是公知的。實例包括可以通過切口平移、隨機引物法、激酶處理等等轉移的放射性試劑、生物素、熒光染料、化學發(fā)光試劑、螢光素酶和類似的酶、抗體等等。
可以通過基因擴增方法擴增提取的DNA或mRNA。通過擴增本發(fā)明的方法能夠實現(xiàn)更容易和更準確的檢測?；驍U增方法的實例包括PCR方法(Saiki，R.K.，Bugawan，T.L.等，Nature，324，163-166(1986))，NASBA方法(Comptom，J.，Nature，650，91-92(1991))，TMA方法(Kacian，D.L.，and Fultz，T.J.，美國專利No.5,399,491(1995))，SDA方法(Walker，G.T.，Little，M.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，89，392-396(1992))。
通過凝膠電泳或使用柱可以實現(xiàn)PCR方法擴增的基因片段的分離和純化。通過，例如質譜法或凝膠瓊脂糖電泳可以證實這些性能。依照擴增基因的特性，可以對利用這些方法擴增的基因檢測本發(fā)明的(a)到(p)的基因多態(tài)性(SNPs)(SNP分型)。
SNP分型依照本發(fā)明的方法，對上述標本的給定基因區(qū)域中的DNA進行測序和分析，并檢測其SNPs(SNP分型)(步驟iii)?？梢酝ㄟ^下列(1)到(8)的方法進行分型。
(1)核苷酸直接測序采用用于確定這類基因的核酸序列通常使用的核苷酸直接測序法，例如雙脫氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467(1977))、Maxim-Gilbert方法(Methods in Enzymology，65，499(1980))等，通過對給定基因進行DNA測序可以檢測基因多態(tài)性。通過將核苷酸直接測序法與DNA擴增法，例如PCR方法組合也可以有效檢測基因多態(tài)性。特別優(yōu)選實施PCR方法或與其等同的DNA擴增方法與該直接測序法組合的方法，因為這種組合方法方便，而且容易操作，盡管只需要少量的DNA樣品，但仍然可以實現(xiàn)靈敏準確的檢測。
例如，依照雙脫氧法、Maxum-Gilbert法等對PCR方法擴增的基因片段或其純化產物進行直接測序，基本上可以實施這種優(yōu)選方法?；蛘?，可以通過使用商品化的序列分析試劑盒確定核苷酸序列很容易地實施這種方法。因此，可以檢測具體人基因的上述給定位置存在/缺少SNPs。
在上下文的方法中通過PCR擴增的DNA片段是不受限制的，只要他們包含至少一個特殊位點就可以，其中推測會在該特殊位點發(fā)現(xiàn)以前提到的變異?？墒褂玫腄NA片段典型地由大約50到大約數(shù)千個堿基組成，更優(yōu)選由大約50到大約幾百個堿基組成。
(2)等位基因特異的寡核苷酸(ASO)斑點印跡分析檢測特定基因上的多態(tài)性的另一個方法是進行等位基因特異的寡核苷酸(ASO)斑點印跡分析(Conner，B.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，80，278-282(1983))。利用設計將靶SNP夾在中間的正向和反向引物，通過讓可與PCR擴增基因片段的等位基因特異的寡核苷酸探針雜交的DNA片段進行斑點印跡分析可以實施該方法。用這種方式可以檢測這種DNA片段上的SNP。
(3)單核苷酸引物延伸法通過單核苷酸引物延伸法，例如SNaPshot法、焦磷酸測序(pyrosequencing)和未審查的日本專利出版物No.2000-279197中公開的點突變檢測為基礎的方法也可以實現(xiàn)對特定基因的多態(tài)性檢測。在這些方法中，設計探針使其正好與緊接在靶SNP前的序列或靶SNP幾個堿基前的序列匹配，即設計探針使其3′末端位于檢測靶突變上游一個堿基或靠近檢測靶突變，該探針與DNA標本進行退火?？梢岳檬袌錾系腟NPs檢測試劑盒和其隨附的軟件實施這些方法。
例如利用ABI PRISM SnaPshot ddNTP引物延伸試劑盒(AppliedBiosystems制造)可以實施SnaPshot方法。在ABIPRISM310/377/3100/3700 DNA分析器(全部由Applied Biosystems制造)和GeneScan軟件上，通過利用反應后產生的熒光片段可以對SNPs進行分型。
可以按照如下描述進行焦磷酸測序。遵循標準方式從血液樣品等中分離基因組DNA，利用生物素標記的引物PCR擴增包含突變的幾十到數(shù)百個堿基，利用磁珠純化單鏈DNA并將純化的DNA用作標本。將該標本與設計用于從靶基因多態(tài)性上游的幾個堿基進行測序的引物退火，然后依照靠近進入軟件分析中的基因多態(tài)性的序列每次添加一種dNTP以引發(fā)反應。因為DNA聚合酶延伸核酸時會形成焦磷酸鹽(PPi)，PPi通過硫酸化酶會產生ATP。利用發(fā)光檢測器、CCD攝像機等可以確定螢光素酶與ATP底物反應發(fā)射的光。因此，依照添加的dNTPs，通過發(fā)射光的峰值分析進行靶基因分型是可能的。該方法在大約15分鐘可以對96個樣品進行分型。
常見的試劑和設備都可用于上述方法?？墒褂玫脑噭嵗ㄓ蒁NA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶，腺苷三磷酸雙磷酸酶組成的酶混合物、由螢光素和APS(腺苷5′磷酸鹽硫酸鹽)組成的底物液體、市場上買到的包含dNTP作為成分的SNP試劑盒，其中dNTP由dATP(脫氧腺苷三磷酸)、dCTP、dGTP和dTTP組成(Pyrosequending AB制造)等等?？墒褂玫脑O備實例包括用于自動DNA序列分析的PSQ96系統(tǒng)(Pyrosequending AB)和使用該系統(tǒng)的SNP軟件(PyrosequendingAB)。
可以依照美國專利No.6,159,693說明書中的描述實施焦磷酸測序，即分離核酸并通過PCR進行擴增，純化擴增的PCR產物，利用READITTM系統(tǒng)(Promega Corporation)與焦磷酸鹽反應，然后分析獲得的數(shù)據?？梢允褂美肦EADIT技術(Promega Corporation)的市場上可買到的Excel程序進行這種數(shù)據分析。
(4)PCR單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析更進一步地，可以通過PCR-SSCP分析實現(xiàn)用本發(fā)明方法檢測基因多態(tài)性的過程(Orita，M.，Iwahara，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，2776-2770(1989))。在該方法中，讓PCR擴增產物(單鏈DNA)進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而以每個PCR產物遷移的差異為基礎鑒定存在或缺少單核苷酸多態(tài)性。
(5)PCR限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析為了檢測本發(fā)明的特異基因上的SNPs或單倍體，當包含待檢測的靶多態(tài)性的核酸序列也包含限制性內切酶識別部位時，也可以通過限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析完成檢測(Botstein，D.R.等，Am.J.Hum.Gen.，32，314-331(1980))。
更具體地說，可以按照如下描述對如上所述基因多態(tài)性(a)到(p)的給定位點上的基因型實施RFLP分析。取如上所述的基因(c)上的給定位點的基因型作為一個例子，為了檢測STAT3基因的基因組序列位置4204027具有基因型G/G的基因多態(tài)性[STAT3-17]，可以利用不僅識別靶基因型位點，而且也識別該位點上下游的限制性內切酶進行RFLP分析。用于RFLP分析的酶可以是能識別靶基因型位點和該位點上下游序列的各種已知的限制性內切酶。象這樣的具體實例有Mspl。
更優(yōu)選通過PCR-RFLP法實施RFLP分析，即預先通過PCR或其修飾的方法擴增和制備DNA標本，并對大量制備的濃縮DNA樣本進行RFLP分析。因此，可以檢測其中位點被特異切割的靶基因多態(tài)性。
依據這種基因多態(tài)性檢測方法，首先從人標本中提取基因組DNA，通過PCR等擴增包含所述基因的基因多態(tài)性位點的DNA片段，從而獲得大量濃縮的基因樣品。然后利用特定的限制性內切酶切割擴增的DNA樣本，并遵循標準方法研究切割的DNA(存在或缺少切割，切割片段的堿基長度)。
(6)侵入方法還可以通過侵入方法(invader method)實施對本發(fā)明特異基因的SNPs的檢測?？梢詤⒖枷铝形募嵤┣秩敕椒ǎ籐yamichev，V.等，Nat.Bioltechnol.，17(3)292-296(1999)和國際專利出版物No.WO9823774(未審查的專利出版物No.2001-526526)。
這些出版物中公開的方法分析基因組DNA上的SNPs時不需要預先擴增靶DNA，它是按照如下描述實施的。
為了檢測具體靶基因，例如(a)、(b)，以及(d)到(p)中描述的基因中SNPs的存在，首先分離基因組DNA，然后利用，例如自動化合成器合成探針。首先設計待合成的由30到幾百個堿基組成的靶寡核苷酸探針，使其具有15到50個堿基的5′翼，在所述5′翼的3′末端側面上具有待檢測的核酸(本發(fā)明中的SNP)，并與除靶基因型核酸外的靶基因組DNA互補。由15或更多堿基組成的侵入寡核苷酸探針被設計成與靶基因組DNA互補，而且在其3′末端具有與待檢測核酸的互補的核酸。分離的基因組DNA和切割第一個探針5′翼(翼核酸內切酶)的酶同時添加到這些探針中，在適當?shù)姆磻旌衔镏羞M行反應。
當標本中的基因組DNA包含想要的SNP時，完成其中3′末端具有基因型的核酸的5′翼被分離的第一反應。當標本中的基因組DNA不包含該基因型核酸序列時，上述酶不發(fā)生切割。
通過酶切割從第一探針分離的5′翼互補結合作為靶的熒光共振能量傳遞(FRET)探針，5′翼的3′末端侵入到FRET探針當中。同樣，上述酶可以引起反應，從而分離已經被淬滅的熒光染料。
盡管第二個反應中使用的FRET探針是待檢測的靶，但它包含相同的序列，而且構建的這種探針基本上包含下列兩個元件。
(1)與第一個反應中的分離產物互補的3′區(qū)域，和(2)包含報告熒光染料和淬滅熒光染料的自身互補區(qū)域，其形成雙鏈體以模仿單鏈探針與靶雜交。
當上述報告熒光染料附著于其上也附著有上述淬滅熒光染料的探針上時，由于熒光共振能量傳遞報告染料被淬滅。當它不附著于具有上述淬滅熒光染料的探針上時，報告染料不被淬滅。因此，當通過切割從第一探針分離的5′翼與FRET探針雜交時，所述翼在第二反應中作為侵入寡核苷酸起作用，因此產生被酶特異識別的被入侵復合物。因此，上述特定酶切割FRET探針可以分離兩種熒光染料，并產生可檢測的熒光信號。通過在標準熒光微量滴定板讀數(shù)器上讀出這種熒光信號可以檢測包含想要SNPs的基因多態(tài)性。通過組合第一和第二反應可以將熒光信號放大1至106倍。更具體地說，使用不同熒光染料的兩個FRET探針可以實施SNP分型。
(7)實時定量PCR本發(fā)明通過實時定量PCR(TaqMan方法)可以很容易地對特定基因上的基因多態(tài)性進行檢測。
可以按照如下描述實施該方法。為了檢測包含靶SNP的基因多態(tài)性，制備用于檢測其上適當區(qū)域包含多態(tài)性(核酸位點)的DNA片段的正向和反向引物，每個引物由15到39個堿基組成。但是，設計的正向和反向引物不包含靶核酸位點(單核苷酸基因型)。然后制備探針，探針是具有由15到50個堿基組成的堿基序列的其上附著有報告熒光染料和淬滅熒光染料的寡核苷酸。必須挑選這種探針的堿基序列使正向引物的雜交區(qū)域不與探針的雜交區(qū)域重疊。設計探針使其具有與等位基因特異序列互補的序列，以檢測存在/缺少靶單核苷酸基因型。使用這種探針，通過PCR擴增標本中待測的給定基因，例如上述(a)到(p)描述的基因中的目的DNA片段，并實時測量反應混合物產生的熒光量。這樣就能實現(xiàn)SNP分型了。更具體地說，可以使用不同熒光染料的兩種探針實施SNP檢測(分型)。
在上述侵入分析和TaqMan方法中使用的報告熒光染料的優(yōu)選實例包括熒光素型熒光染料，例如FAM(6-羧基熒光素)，淬滅熒光染料的優(yōu)選實例包括若丹明型熒光染料，例如TAMRA(6-羧基-四甲基-若丹明)。這些熒光染料為大家所熟知，為方便使用可將他們包括在市場上可買到的實時PCR試劑盒中。報告熒光染料和淬滅熒光染料的結合部位不受限制，但是報告熒光染料典型地結合寡核苷酸探針的一端(優(yōu)選5′末端)，淬滅熒光染料結合另一端。將熒光染料結合到寡核苷酸上的方法是已知的，而且在出版物，例如Noble等，(1984)，Nuc.Acids Res.，123387-3403和lyer等，(1990)，J.Ame.Chem.Soc.，1121253-1254中已經公開。
TaqMan方法本身是一種已知的方法，設計的用于該方法的裝置和試劑盒已經上市銷售。在本發(fā)明中，也可以使用這些市場上買到的裝置和試劑盒。當使用這些市場上買到的裝置和試劑盒時，可遵循專利No.2,825,976中公開的程序，或PE Biosystems制造的ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)用戶手冊實施本發(fā)明的方法。
(8)使用質譜儀的質譜陣列質譜陣列法檢測由多態(tài)性引起的質量差。更具體地說，通過PCR擴增包含待檢測的多態(tài)性的區(qū)域，延伸引物正好雜交在SNP位置前，利用包含ddNTP/dNTP混合物的反應混合物，例如包含ddATP、dCTP、dGTP和dTTP的反應混合物進行延伸反應，從而依照SNPs產生具有不同3′端的片段。純化這些產物，并用MALDI-TOF質譜儀進行分析，從而確定分子量和基因型之間的相互關系(Pusch，W.，Wurmbach，JH.，Thiele，H.，Kostrzewa，M.，MALDI-TOF mass spectrometry-based SNPgenotyping，Pharmacogenomics，3(4)537-48(2002))。利用，例如Sequenom′s MassArray高通量SNP檢測系統(tǒng)可以很容易地實施該方法。
(9)其他分型方法也可以通過各種已知的方法，包括對DNA進行測序的方法和檢測基因多態(tài)性和基因突變的方法對本發(fā)明的方法中使用的基因進行SNPs分型。這些方法的實例如下。
(9-1)PCR-SSO(序列特異的寡核苷酸)分型載體上的對應SNP的固相探針與標本(基因擴增產物)雜交，從而確定基于存在/缺少錯配而產生的雜交效率差異。
(9-2)用于檢測點突變的PCR-SSP分型使用在3′末端設計有與點突變匹配的堿基、基因擴增用序列特異的引物，這種分型利用由引物3′末端是否互補引起的PCR擴增效率的顯著差異。
(9-3)PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析混合包含基因多態(tài)性的DNA片段和野生型DNA片段進行雜交，隨后在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，聚丙烯酰胺凝膠中變性劑，例如尿素、甲酰胺等等的濃度逐步增高。與沒有錯配的同源雙鏈相比，產生的DNA片段會在變性劑濃度較低的位置離解成單鏈DNAs。因為單鏈DNA比雙鏈DNA具有更快的電泳遷移率，基于DNA鏈之間的遷移率差異可以檢測單堿基多態(tài)性(差異)。
(9-4)PCR-DGGE/GC鉗(Shefield，V.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，232-236(1989))除上述PCR-DGGE分析之外，這種方法通過將GC含量高的區(qū)域偶聯(lián)到包含待檢測的基因多態(tài)性核酸的DNA片段上，彌補了發(fā)生多個堿基替換、缺失、添加或插入時檢測不完全的缺點。該方法需要添加GC鉗到包含待檢測基因多態(tài)性的DNA片段上的步驟。
(9-5)RNase保護分析(Finkelstein，J.等，Genomics，7，167-172(1990))(9-6)原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))(9-7)原位雜交(9-8)Southern印跡(Sambrook，J.等，Molecular Cloning aLaboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)(9-9)點雜交分析(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98503-517(1975)，etc.)
(9-10)熒光原位雜交(FISHTakahashi，E.等，Hum.Genet.，86，1416(1990))(9-11)比較基因組雜交(CGHKallioneimi，A.等，Science，258，818-821(1992))，和光譜核型分析(SKYRowley，J.D.等，Blood，93，2038-2042(1999))。
(9-12)使用酵母人工染色體載體克隆作為探針的方法(Lengauer，C.等，Cancer Res.，52，2590-2596(1992))。
因此通過本發(fā)明的方法可以檢測人基因SNPs和單倍體。
依照本發(fā)明的預測腎細胞癌病人對IFN治療反應的方法，當通過上述方法在標本中檢測的人基因多態(tài)性-指示物(標記)被鑒定出來時，預期標本對IFN治療高度敏感(步驟iv)。
因為預計對IFN治療的反應被確定為高的病人能產生優(yōu)良的治療效果，因此在藥物選擇階段優(yōu)先選擇IFN來治療腎細胞癌。這樣可以抑制給病人施用不必要的藥物，因此能減少藥物引起的副作用。
特別地，依照本發(fā)明的方法檢測的人基因的基因多態(tài)性或基因型與IFN對腎細胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)高度相關。因此，檢測結果可以實施腎細胞癌病人的個體定制醫(yī)學，即適當選擇對個體病人最有效的藥物的醫(yī)學治療。
寡核苷酸本發(fā)明更進一步地提供在本發(fā)明的評估(檢測)方法中用作檢測基因多態(tài)性的探針或引物的寡核苷酸。這種核苷酸不受限制，只要他們能特異擴增包含給定人基因多態(tài)性或基因型區(qū)域的序列就可以?？梢砸越o定基因多態(tài)性或基因型的序列信息為基礎，依照標準方式合成和構建這種核苷酸。
更具體地說，使用市場上買到的自動寡核苷酸合成器，例如GeneAssembler PlusPharmacia LKB)等等，通過典型的化學合成，例如亞磷酰胺方法、磷酸鹽三酯方法等等可以進行合成。通過合成化學合成的單鏈產物和其互補鏈，并讓它們在適當?shù)臈l件下退火，或者使用適當?shù)囊镄蛄泻虳NA聚合成酶將互補鏈附著到所述單鏈產物上可以獲得雙鏈片段。
用作上述探針或引物的寡核苷酸的優(yōu)選實例包括與設計含有給定基因的基因多態(tài)性序列的DNA片段部分匹配，并由至少10個，典型地大約10到大約35個連續(xù)堿基組成的寡核苷酸。引物對的實例包括被設計和合成為將基因DNA序列中的SNP夾合的兩種寡核苷酸序列。包含基因多態(tài)性序列的DNA片段本身可以用作寡核苷酸探針。
用作上述探針的寡核苷酸的優(yōu)選實例包括下列(a)到(p)描述的那些寡核苷酸。在下列寡核苷酸中，優(yōu)選的探針是那些具有由至少15個連續(xù)堿基組成的序列的包含給定基因的多態(tài)性區(qū)域的探針。
(a)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號rs1905341表示的基因多態(tài)性位點，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs4796793表示的基因多態(tài)性位點，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2293152表示的基因多態(tài)性位點，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4050541具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs2293153表示的基因多態(tài)性位點，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/G的由參考SNP ID編號rs2280148表示的基因多態(tài)性位點，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs1805011表示的基因多態(tài)性位點，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs2797507表示的基因多態(tài)性位點，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs796988表示的基因多態(tài)性位點，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號rs2292982表示的基因多態(tài)性位點，(j)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs1213264表示的基因多態(tài)性位點，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs1213265表示的基因多態(tài)性位點，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由參考SNP ID編號rs1213266表示的基因多態(tài)性位點，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2745557表示的基因多態(tài)性位點，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2071466表示的基因多態(tài)性位點，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs2234898表示的基因多態(tài)性位點，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置1868553具有基因型T/T的由參考SNP ID編號rs1801275表示的基因多態(tài)性位點。
本發(fā)明的用作上述引物對的寡核苷酸的具體實例包括在下文實施例中描述的分別針對上述基因的作為正向引物的序列號為1到16的那些引物和作為反向引物的序列號為17到32的引物。
檢測試劑盒使用試劑盒檢測標本中給定人基因的基因多態(tài)性或基因型的可以更容易地實施本發(fā)明的檢測(評估)方法。本發(fā)明更進一步地提供了這種試劑盒。
依照本發(fā)明的試劑盒的實施例包括作為關鍵成分的至少一種DNA片段，該片段部分或完全與包含給定人基因的上述任何基因多態(tài)性或基因型的DNA片段的堿基序列或其互補堿基序列雜交、或者包括作為關鍵成分的至少一種DNA片段，該片段與包含上述特定基因多態(tài)性位點或基因型位點中任何一個的上游的一到幾個堿基的堿基序列雜交。依照本發(fā)明的試劑盒的另一個實施例包括識別包含作為關鍵成分的上述任何特定基因多態(tài)性位點或基因型位點的幾個核酸的序列的限制性內切酶，例如Mspl。
包含在本發(fā)明的試劑盒中的其他成分包括標記試劑，實施PCR需要的試劑(例如TaqDNA聚合成酶、脫氧核苷酸三磷酸、DNA擴增引物等等)。標記試劑的實例包括化學修飾物質，例如放射性同位素、發(fā)光物質、熒光物質等等，DNA片段本身可以預先與這種標記試劑結合。為了方便測量，本發(fā)明的試劑盒可以更進一步地包含適當?shù)姆磻♂寗?、標準抗體、緩沖液、沖洗液、反應終止溶液等等。
因為本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)給定基因的基因多態(tài)性或基因型與IFN對腎細胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)高度相關，因此依照本發(fā)明，在實施定制醫(yī)學的過程中為個體腎細胞癌病人合適地選擇更有效的藥物成為可能。本發(fā)明提供了檢測作為與IFN治療對腎細胞癌的效果相關的標記的給定人基因多態(tài)性或基因型的方法，即檢測腎細胞癌病人的標本中的給定基因多態(tài)性或基因型作為對IFN治療腎細胞癌反應的鑒定標記的方法、用于這種方法的診斷試劑和診斷試劑盒。
實施例本發(fā)明更進一步地詳細描述了下列實施例，但不局限于這些實施例。
(1)分析樣本用于該測試中分析的樣本是在參與機構獲得受試者的知情同意后從非可追蹤的匿名血樣提取的基因組DNA樣品，以及來自已經在參與機構被提取的基因組DNAs的樣品。沒有經過同意的樣品和非匿名樣品不用來進行分析。更進一步，受試者信息(病人背景等等)不傳輸給實驗室工人或合作者Otsuka Pharmaceutical有限公司治療診斷學研究中心(以下簡稱″TRC″)。
有86個注冊樣品用于這項測試，其中76個樣品源自于血樣，而且已經制備10個樣品作為DNA。以Otsuka制藥有限公司倫理委員會(Ethical Committee of Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd)批準的申請發(fā)展小組實施的研究項目″旨在研究IFN治療腎細胞癌效果的預測因子的干擾素相關基因中的SNPs分析(倫理委員會接收號010724-1)″為基礎收集這些樣品。
遵照教育、文化、運動、科技部；衛(wèi)生、勞動和福利部；以及經濟、貿易和工業(yè)部在2001年3月宣布的″人基因組/基因分折研究道德準則″(第一通告)來實施這一項目。
收集的血樣是在參與機構制備為不可追蹤的匿名血樣，將血樣冷凍運輸?shù)絋RC。在TRC從這些血樣中提取基因組DNAs用作分析樣品。
已經從中提取基因組DNAs的樣品也是在參與機構制備的不可追蹤的匿名樣品，將樣品冷凍運輸?shù)絋RC備用。
在研究期間，嚴格處理用于這項研究的所有基因組DNA樣品，并將其保存在TRC實驗室的指定存儲器中(冷凍在4℃)。
(2)基因分析用于在這項測試中進行分析的基因有下列基因簇。
(2a)IFN-α受體和信號轉導系統(tǒng)IFNAR1(α鏈)(干擾素α受體1)、IFNAR2(β鏈)(干擾素β受體2)、JAK1(Janus激酶1、一種酪氨酸激酶蛋白質)、Tyk2、STAT1(轉錄信號轉導物和活化因子1，91kda)、STAT2(轉錄信號轉導物和活化因子2，113kda)、STAT3(轉錄信號轉導物和活化因子3、急性期反應因子)、p48(ISGF3γ，干擾素刺激轉錄因子3、γ、48kda)、SOCS-1(細胞因子信號抑制劑1/SSI-1)(別名JAB，CIS-1，SSI-1、)、SOCS-2(細胞因子信號抑制劑2/STATI2)(別名CIS-2，SSI-2、STATI2)、SOCS-3(細胞因子信號抑制劑3/SSI-3)(別名CIS-3，SSI-3)、Shp-2(別名PTPN11蛋白質酪氨酸磷酸酶，非受體型11(Noonan綜合征1))。
(2b)Th1/Th2系統(tǒng)STAT4(轉錄信號轉導物和活化因子4)、IL-2(白細胞介素2)、IFN-γ(干擾素γ)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、TNF-β(腫瘤壞死因子β)(LTA淋巴細胞毒素α，TNF超家族，成員1)、IL-4(白細胞介素4)、IL-4受體-α、IL-4受體-β、IL-5(白細胞介素5、集落刺激因子、嗜酸性粒細胞)、IL-6(白細胞介素6、干擾素β2)、IL-10(白細胞介素10)、IL-13(白細胞介素13)。
(2c)據報道其表達被IFN-α改變的基因PKR(PRKR、蛋白激酶、干擾素誘導的雙鏈RNA依賴的)、IRF1(IFN-調節(jié)因子1)、IRF2(IFN-調節(jié)因子2)、ICSBP(IFN共有序列結合蛋白)、Cox-1(PTGS1；前列腺素內過氧化物合酶1、前列腺素G/H合酶和環(huán)加氧酶)、Cox-2(PTGS2；前列腺素內過氧化物合酶2、前列腺素G/H合酶和環(huán)加氧酶)、MxA(Mx-1；肌尾病毒(流感病毒)抗性1、干擾素誘導蛋白p78(小白鼠))(2d)其他基因TAP1(運載體1、ATP結合盒、B亞家族(MDR/TAP))、TAP-2(運載體2、ATP結合盒、B亞家族(MDR/TAP))、LMP7(PSMβ8；蛋白酶體(prosome、macropain)亞單位、β型、8(大的多功能蛋白酶7)、CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞聯(lián)合蛋白質4)、GSTT1(谷胱甘肽S轉移酶θ1)、VHL、HIF-1α、HLF、VEGF(血管內皮生長因子)。
(3)分析SNPs在上述基因簇之中，在測試開始時在NCBI dbSNPs中注冊的SNPs與注冊的基因序列在Otsuka制藥有限公司的生物信息室(以下簡稱″BI室″)進行比較分析。進行比較的結果就是選擇作圖靠近注冊序列的那些SNPs用于本次測試分析，那些作圖不靠近注冊序列的SNPs在分析時被排除。最終分析的SNPs的數(shù)目是1167。
(4)檢測過程(4a)基因組DNA提取利用基因組提取試劑盒(PUREGENETM，Gentra Systems，Inc.)實施從全血中提取基因組DNA。遵照PUREGENETM附帶的標準規(guī)程實施提取過程。提取的基因組DNA在試劑盒包含的裂解溶液中裂解，測定吸光度以計算提取的總量。
(4b)PCR(用于侵入分析)通過PCR擴增用于分析的包含SNPs的基因組區(qū)域。用ExTaqTM(TaKaRa)作為DNA聚合酶，附送的10×Ex Taq緩沖液用作反應緩沖液。
在下列條件下進行反應。
模板量(基因組DNA)1-10ng引物濃度0.1-0.2uM總反應混合物體積15ulPCR循環(huán)(1)95℃2min.、(2)95℃30sec.、(3)50-64℃30sec.、(4)72℃1.5min.、(5)(2)到(4)×50個循環(huán)，和(6)維持在15℃PCR產物用作下列侵入分析的反應模板。
用于上述反應的正向引物的核酸序列由序列號1-16代表的序列顯示，反向引物的核酸序列由序列號17-32代表的序列顯示。表2顯示了引物、給定的人基因基因組和其中包含的SNPs之間的關系。
表2

(5)侵入分析在蒸餾水中稀釋包含擴增的SNP區(qū)域的PCR產物10-1000倍，通過95℃加熱5分鐘使稀釋的PCR產物變性以獲得單鏈DNAs，然后立即在冰上冷卻。將得到的用作反應模板的DNAs與試劑混合制備侵入分析的反應混合物。反應混合物的組成與384孔反應板形式的附加規(guī)程一致。
在63℃孵育反應混合物30-60分鐘，并與酶發(fā)生反應。反應之后，利用熒光微板讀數(shù)器Safire(TECAN)，通過兩個波長(紅色和綠色)的光，485±6nm的激發(fā)光，530±6nm的發(fā)射光(FAM染料)，以及560±6nm的激發(fā)光，620±6nm的發(fā)射光測量熒光強度。
利用基于Biomek FX/SAMI(Beckman Coulter)的SNPs自動化分型系統(tǒng)實施除稀釋之外的全部分型過程。
熒光強度的測量結果輸入配備了自動分型校正1.0版的BARCODE實驗室系統(tǒng)(BLABSTM，Mitsui Knowledge Industry Co.，Ltd.)，通過自動分型確定SNP基因型。研究員可以利用散點圖再一次確定分型結果。
(6)PCR-RFLP可以通過PCR-RFLP對不能通過侵入分析進行分型的SNPs進行分型。在這種方法中，通過限制性內切酶切割包含SNP的區(qū)域為基礎對SNPs進行分型。當SNP區(qū)域不包含限制性內切酶識別的適當位點時，通過設計靠近SNP的擴增引物并有意改變引物的序列可以形成限制性內切酶識別位點。
在該方法中，可以用限制性內切酶Nspl檢測STAT3-17上的SNPs。
實施PCR可以使用Vogelstein緩沖液，其他條件如下。
模板量(基因組DNA)5ng引物濃度0.1-0.2uM總反應混合物體積15uLPCR循環(huán)(i)95℃2min.、(ii)95℃30sec.、(iii)50-60℃30sec.、(iv)72℃1min.、(v)(ii)到(iv)的步驟進行35-45個循環(huán)，和(vi)維持在15℃用限制性內切酶處理PCR產物，并利用4％瓊脂糖凝膠電泳分析切割后的產物片段的長度以進行分型。
(7)基因分型基于對上文(5)中描述的侵入分析反應產生的兩種顏色的螢光強度的檢測可以確定基因型。因此，通過侵入分析可以對病人33個基因上的463個SNPs進行基因型分型。更進一步地，通過上文(6)中描述的PCR-RFLP同樣也可以對13個基因上的26個SNPs進行基因型分型。
(8)結果1(對鑒定CR+PR組和PD組有用的SNPs調查研究)在累積的86個病例中，3例被評估為無反應型，8例沒有轉移灶，24例具有恒定反應評價(NC組＝無變化組))(包括沒有轉移灶的一個病例)。除這34個病例外，剩余的52個病例用于分析。他們是CR組(完全反應組)、PR組(部分反應組)，以及PD組(進行性疾病組)。這些處理反應的評價與1999年四月第三版的腎癌的一般規(guī)則一致。在下文中更進一步地提到了這些規(guī)則″Guidelines to Evaluate theresponse to Chemotherapy in Solid Tumors″(J.Jpn.Soc.Cancer Ther.，21(5)929-924，June，1986)，由日本臨床腫瘤學協(xié)會出版通過統(tǒng)計學判別分析研究了每個SNP的鑒定能力，以判斷待分析的463個SNPs是否都是這些病例的鑒定因子。通過皮爾森卡方檢驗確定的顯著性p＞0.1的SNPs推測具有低的鑒定能力，因此被排除在分析外。
這樣就從463個SNPs中排除了445個SNPs，只留下18個SNPs作為候選SNPs。此外，當存在彼此間有密切相互關系的多個變量時，由于多變量分析的特性，需要調查多變量之中僅僅一個單變量的鑒定能力。因此，在實施邏輯回歸分析之前，利用Cramer′s V統(tǒng)計(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the HealthSciences，278，1993，John Wiley&Sons，Inc.，New York)調查了彼此有密切相互關系的SNPs，這樣就將待分析的SNPs的數(shù)目由18減少到了16。
在利用逐步的邏輯回歸模型(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the Health Sciences，638-647，1993，JohnWiley&Sons，Inc.，New York)調整與腫瘤抑制有關的背景因素的影響之后，假定通過上述分析最后剩下的SNPs具有鑒定能力。
調整的背景因素有性別、年齡、組織發(fā)現(xiàn)(細胞類型、等級、pT、pM、發(fā)作和復發(fā)、肺轉移、肝轉移、大腦轉移、骨轉移、淋巴結轉移)。使用的顯著性水平是0.05。
結果顯示在表3和表4中。



因為通過邏輯回歸分析被確定為能進行有效評估的唯一背景因素是存在/缺少肺轉移，因此該因素被強制合并到模型中，借此采用逐步邏輯回歸分析分析13種SNPs。結果顯示在表5中。
表5步驟0.肺轉移進入 步驟1.肺轉移&IL4R-29組合


在表5中，″效果″下的項目是測試的SNPs。″DF″指自由度。
Wald卡方指Wald′s卡方統(tǒng)計檢驗，Score卡方指Score′s卡方(χ2)統(tǒng)計檢驗，Pr＞ChiSq是Wald′s卡方檢驗或Score′s卡方檢驗的P值。
如表5所示，步驟0顯示調整存在肺轉移的影響之后的SNPs鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在調整存在肺轉移的影響后對鑒定仍然有用。
結果顯示發(fā)現(xiàn)對鑒定有用的SNPs有STAT3-2、IL-4R-29、IL-4r-22、IRF2-82和TAP2-5。在這六個SNPs之中顯示出具有最高鑒定能力的IL-4R-29被合并到邏輯回歸分析模型(肺轉移調整)中。
表5的步驟1中的P值顯示剩余SNPs在存在/缺乏肺轉移和組合了IL-4R-29時的鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有獨立于IL-4R-29的鑒定信息。
這種SNPs有STAT3-2、IRF2-82和TAP2-5。在調整存在/缺少肺轉移的影響之后，結果表明IL-4R-29和TAP2-5組合具有最高的鑒定能力。當在這一步驟中與IL-4R-29組合時，沒有SNPs新變成顯著性。
總之表5中顯示的結果表明除最好的候選SNPs IL-4R-29之外，顯示作為腎細胞癌病人的原發(fā)病灶和遷徙性病灶的預期腫瘤抑制的鑒定標記的SNPs是STAT3-2、IRF2-82、IL-4R-22和TAP2-5，其在步驟0中變得顯著。
將這階段的分類整合到模型中可以防止由病人的不均勻背景因素引起的統(tǒng)計學檢測傾斜，調整兩個組之間的病人的這種不均勻背景因素，以及證實兩個組之間的顯著性差異值。
對確定CR+PR組和NC+PD組有用的SNPs調查研究利用來自實施例1中描述的受試者的樣品，分析其中NC組被添加到PD組的病例的與IFN對治療腎細胞癌的效果有關的給定的基因多態(tài)性。
推測NC組中腫瘤大小不變的原因是腫瘤對IFN治療不起反應，或者雖然腫瘤對IFN起反應，但因為腫瘤大小太大，因此他們的外觀沒有變化。IFN反應評價依賴于考慮的原因，但在實施例中，NC組因為其恒定的腫瘤大小被認為是無反應組。基于這一考慮，按照如上所述將NC組添加到PD組中以進行基因多態(tài)性分型。
在收集的86個病例中，3例被評價為無反應，8例沒有轉移灶。將除去這11例后剩余的75例用于分析。
采用和實施例1相同的方式，通過統(tǒng)計學判別分析分析463個SNPs的個體鑒定能力，將推測具有低鑒定能力的SNPs從分析候選SNPs中除去。作為這種篩選的結果，從463個SNPs中排除了441個SNPs，只留下23個SNPs作為候選SNPs。
此外，在實施邏輯回歸分析之前，利用Cramer′s V調查了彼此有密切相互關系的SNPs的組合，這樣就將待分析的SNPs的數(shù)目由23減少到了17。
在調整與腫瘤抑制有關的背景因素的影響之后，利用逐步的邏輯回歸模型評估最后17個SNPs的鑒定能力。
只調整在上文的實施例1中發(fā)現(xiàn)的可能與腫瘤抑制相關的背景因素--肺轉移。顯著性水平是0.05。表6和7顯示了顯著性水平p≤0.1的23個SNPs作為個體SNP鑒定能力的的分析結果。
表6

表7

獲得表示這23個SNPs之間的相關度的Cramer′s V值，結果顯示STAT3-2、STAT3-21、STAT3-25和STAT3-52的鑒定能力被認為大致相同。同樣，STAT3-18和STAT3-31鑒定能力相等，而且IL-4R-14、IL-4R-18和IL-4R-26的鑒定能力也相等。因此，STATA3-2、STAT3-18和IL-4R-14被作為來自每個組的代表用于多變量分析。結果，只剩下17個SNPs用于分析。
在75例已經證實存在或缺少肺轉移的病例中，2例部分缺失SNP分析數(shù)據的病例被排除，剩下73例作為最后的候選者用于分析。
存在或缺少肺轉移被強制進入模型，并對17個SNPs進行逐步邏輯回歸分析。以與上文表5相同的方式將結果顯示在表8中。
表8步驟0.肺轉移合并 步驟1. 肺轉移肺轉移與STAT3-2組合 步驟2與STAT-3-2和PTGS1-4組合



表8中的步驟0顯示調整存在或缺少肺轉移影響之后的SNPs鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在調整存在/缺少肺轉移影響后對鑒定仍然有效。發(fā)現(xiàn)能進行有效鑒定的SNPs有STAT3-2、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5。在這六個SNPs之中顯示出最高鑒定能力的STAT3-2被合并到模型中。
步驟1的P值表示存在或缺少肺轉移與STAT3-2組合時，剩余的每個SNPs的鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有獨立于STAT3-2的鑒定信息。這種SNPs有SSI3-1、IL-4R-22、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5。在調整存在或缺少肺轉移的影響之后，結果表明在這些SNP之中STAT3-2和PTGS1-4組合具有最高的鑒定能力。與STAT3-2組合時，第一次顯示出對鑒定有用的SNPs有ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5。
步驟2表示存在/缺少肺轉移與STAT3-2和PTGS1-4組合時，剩余的每個SNPs的鑒定能力。當與STAT3-2和PTGS1-4組合時，顯示具有獨立于STAT3-2和PTGS1-4的信息的有用變量有IL-4R-22、IRF2-67和ICSBP-38。結果顯示在這一階段IRF2-67是首次鑒定有用的SNP。
總之表8中顯示的結果表明除最好的候選SNPs STAT3-2之外，在腎細胞癌病人的原發(fā)病灶和遷徙性病灶的預期腫瘤抑制的鑒定標記的SNPs有STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5，其在步驟0中變得重要；在步驟1中變成新的重要SNPs的ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5；在步驟2中變成新的重要SNPs的IRF2-67。
實施例1和2進行的在CR+PR組和PD組之間的比較分析顯示STAT3-2、IL-4R-29、IL-4R-14、IL-4R-22、IRF2-82和TAP2-5是與IFN對腎細胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)相關的基因多態(tài)性，而且TAP2-5、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4、PTGS1-5、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12、TAP2-5和IRF2-67在CR+PR組和NC+PD組之間的比較中也被認為是這種基因多態(tài)性。
在CR+PR組和PD組之間的比較中，結果顯示STAT3-2具有最高的鑒定能力，在CR+PR組和NC+PD組之間的比較中，結果顯示IL-4R-29具有最高的鑒定能力。在單獨的實驗中發(fā)現(xiàn)STAT3-3一樣與STAT3-18有關。
依照上文獲得的結果，本發(fā)明提供了預測腎細胞癌病人對干擾素治療反應的方法，通過從腎細胞癌病人標本制備基因組序列或其互補鏈，作為與IFN對腎細胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)有關的基因多態(tài)性、、確定基因組DNA序列或其互補DNA序列，利用至少一種選自STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-22、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12、TAP2-5、IL-4R-14、IL-4R-29和IRF2-67的基因的基因多態(tài)性或基因型的存在作為鑒定標記。
工業(yè)實用性依照本發(fā)明，檢測是否存在與IFN對治療腎細胞癌的效果(腫瘤抑制效果)有關的基因多態(tài)性，檢測的多態(tài)性作為指示物可以方便地用作對IFN治療腎細胞癌反應的鑒定標記。
序列表自由文本序列號1-32顯示引物序列。
序列表序列表<110>大塚制藥株式會社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>對干擾素治療腎細胞癌反應的鑒定標記(Identification marker responsive to interferontherapy for renal cell cancer)<130>SCT071777-47<150>JP 2004-314160<151>2004-10-28<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-2<400>1gagagtggga ggagggagag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-3<400>2gcagccagtg gaagaatagg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
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<220>
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<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
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<210>17<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-22
<400>22tgcgatgtgt ggagttgttt 20<210>23<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
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<220>
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<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-14<400>31gtggagtgtg aggaggagga 20<210>32<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-29<400>32agtagaaccc gagatgccct 20
權利要求
1.一種評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，該方法包括下列步驟(i)到(iv)(i)獲取來源于腎細胞癌病人的DNA樣品的步驟，(ii)利用在上述步驟(i)中獲得的DNA樣品，制備選自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因的至少一種基因的基因組DNA或者其互補鏈的步驟，(iii)分析基因組DNA或其互補鏈的DNA序列并確定其基因多態(tài)性的步驟，和(iv)利用上述步驟(iii)中確定的至少一種基因多態(tài)性作為標記評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的步驟。
2.權利要求1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是選自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因的至少一種基因的多態(tài)性。
3.權利要求1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是選自下列(a)到(p)的至少一種多態(tài)性(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號rs1905341表示，(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號rs4796793表示，(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號rs2293152表示，(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號rs2293153表示，(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號rs2280148表示，(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號rs1805011表示，(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號rs2797507表示，(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號rs796988表示，(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號rs2292982表示，(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號rs1213264表示，(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號rs1213265表示，(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號rs1213266表示，(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號rs2745557表示，(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號rs2071466表示，(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號rs2234898表示，(p)在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號rs1801275表示。
4.權利要求3的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是權利要求3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一個。
5.權利要求1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中IFN選自天然IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ。
6.權利要求1的評估IFN治療對腎細胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是通過選自直接測序、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析、單核苷酸引物延伸法、PCR單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析、PCR限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析、侵入方法、定量實時PCR和使用質譜儀的質量陣列中的至少一種方法確定的。
7.權利要求6的方法，其中通過侵入方法或直接測序確定基因多態(tài)性。
8.權利要求6的方法，其中通過PCR-RFLP分析確定基因多態(tài)性。
9.權利要求8的方法，其中PCR-RFLP分析是利用限制性內切酶Msp1檢測人STAT3基因內含子4204027處的G到C突變rs2293152。
10.權利要求6的方法，其中利用選自下列(a)到(p)的至少一種寡核苷酸確定基因多態(tài)性(a)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號rs1905341表示的基因多態(tài)性位點，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs4796793表示的基因多態(tài)性位點，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2293152表示的基因多態(tài)性位點，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs2293153表示的基因多態(tài)性位點，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的由參考SNP ID編號rs2280148表示的基因多態(tài)性位點，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs1805011表示的基因多態(tài)性位點，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的由參考SNP ID編號rs2797507表示的基因多態(tài)性位點，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs796988表示的基因多態(tài)性位點，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號rs2292982表示的基因多態(tài)性位點，(j)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs 1213264表示的基因多態(tài)性位點，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號rs1213265表示的基因多態(tài)性位點，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的由參考SNP ID編號rs1213266表示的基因多態(tài)性位點，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2745557表示的基因多態(tài)性位點，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號rs2071466表示的基因多態(tài)性位點，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號rs2234898表示的基因多態(tài)性位點，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點的至少10個連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點是在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的由參考SNP ID編號rs1801275表示的基因多態(tài)性位點。
11.權利要求6的方法，其中基因多態(tài)性檢測引物對是下列(a)到(p)中的任何一對(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對，(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列組成的寡核苷酸引物對，和(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對。
全文摘要
本發(fā)明提供了對IFN治療腎細胞癌反應的鑒定標記，以及檢測該標記的方法。即，該方法包括從腎細胞癌病人的標本中制備人基因的基因組DNA或其互補鏈，分析基因組DNA或其互補鏈的DNA序列以確定人基因的基因多態(tài)性，以及利用該多態(tài)性作為指示物評估IFN治療對腎細胞癌的腫瘤抑制效果。
文檔編號G01N27/62GK101048504SQ20058003725
公開日2007年10月3日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權日2004年10月28日
發(fā)明者關豐和, 白土敬之, 小川修, 內藤誠二, 塚本泰司, 東間纮, 平尾佳彥, 香川征, 野瀨善明, 中村剛 申請人:大塚制藥株式會社