專利名稱：分析物的電化學(xué)分析改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析物的電化學(xué)檢測的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
WO 00/011473描述了利用電化學(xué)檢測分析物的電位傳感器電極來電化學(xué)分析復(fù)雜樣品中分析物(例如抗原)的方法。用于這些方法中的傳感器電極通常包含用導(dǎo)電聚合物(例如聚吡咯)涂布的導(dǎo)電電極。將能夠選擇性結(jié)合待檢測分析物的受體分子固定在導(dǎo)電聚合物內(nèi)或被導(dǎo)電聚合物吸附，使得可以檢測期望的分析物。檢測通過特異性復(fù)合體的形成來實現(xiàn)，所述特異性復(fù)合體包含分析物和便于電化學(xué)檢測的標(biāo)記物組分，它與受體分子在傳感器電極表面結(jié)合。
WO 00/011473的檢測方法通常包括下面總結(jié)的幾個步驟(a)提供含有導(dǎo)電聚合物涂層并含有固定化或吸附受體的傳感器電極，所述受體對于所關(guān)注的分析物是特異性的；(b)通過浸沒在樣品中處理所述傳感器電極，使得所述期望的分析物在傳感器表面與固定化或吸附的受體結(jié)合，來形成還包含標(biāo)記物組分的復(fù)合體；(c)從樣品中取出所述傳感器電極，隨后監(jiān)控當(dāng)經(jīng)處理的傳感器電極和參考電極都浸沒在適當(dāng)?shù)臒o活性測量緩沖液中時兩個電極之間的電位差；以及隨后(d)監(jiān)控傳感器電極和參考電極之間的電位差，隨后暴露于另一種電化學(xué)活性的緩沖液，因此增進(jìn)標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性。
WO 03/019171描述了生產(chǎn)電位傳感器電極的改進(jìn)方法，還描述了利用這些傳感器電極進(jìn)行電化學(xué)檢測的改進(jìn)方法。然而，WO 03/019171中描述的電化學(xué)檢測的改進(jìn)方法仍然依賴于首先測量當(dāng)經(jīng)處理的傳感器電極和參考電極都浸沒在適當(dāng)?shù)臒o活性測量緩沖液中時兩個電極之間的電位差，隨后監(jiān)控傳感器電極和參考電極之間的電位差，然后暴露于另一種增進(jìn)標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性的緩沖液。
本發(fā)明人目前研發(fā)了電化學(xué)檢測的簡化方法，其不需要單獨的步驟在每次使用所述方法對指定分析物進(jìn)行檢測時，在暴露于增進(jìn)標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性的緩沖液之前，測量當(dāng)經(jīng)處理的傳感器電極和參考電極都浸沒在無活性測量緩沖液中時兩個電極之間的電位差。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種分析樣品中分析物的電化學(xué)檢測方法，其包括(a)提供含有用導(dǎo)電聚合物層涂布的導(dǎo)電電極的傳感器電極；(b)在使得在導(dǎo)電聚合物層上形成包含分析物和電化學(xué)活性標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的條件下，使所述傳感器電極與含有由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液接觸；(c)使所述傳感器電極和電化學(xué)活性分析物復(fù)合體與增進(jìn)電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性的電化學(xué)活性測量溶液接觸；(d)施加電流以在所述傳感器電極上感生預(yù)定的保持電位；(e)除去電流并且使所述傳感器電極回復(fù)至開路靜息電位；(f)測量下列參數(shù)中的一個或多個，作為樣品中存在的分析物的量的指標(biāo)(i)保持電位和開路靜息電位之間的差，(ii)所述傳感器電極從保持電位回復(fù)至開路靜息電位的速率，(iii)將所述傳感器電極保持在預(yù)定的保持電位所需的電流量。
本發(fā)明的方法是例如WO 00/11473和WO 03/019171描述的方法的簡化，因為不需要單獨的步驟來測量無活性測量緩沖液和增進(jìn)標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性的第二緩沖液中傳感器電極和參考電極之間的電位差。因此，不需要制備單獨的無活性測量溶液，并且不需要另外的流體和/或電極操縱步驟來將所述傳感器電極從無活性測量溶液轉(zhuǎn)移到活性測量溶液。


圖1示意性說明了根據(jù)本發(fā)明的測量方法，其中將電位激勵至預(yù)定的電位y，隨后斷開，測量開路電位一段時間(t)直到達(dá)到最終電位z。測量Δzy，以及電流和速率。
圖2示意性說明了關(guān)于圖1的測量方法，但是在達(dá)到預(yù)定電位y和最終測量步驟之前具有電位波形。
圖3示意性說明了根據(jù)本發(fā)明的測量方法，其在最終測量步驟之前包括四個激勵電位(driven potential)和開路電位循環(huán)。
圖4顯示了利用本發(fā)明的方法基于辣根過氧化物酶的使用的測試結(jié)果。在預(yù)先準(zhǔn)備好-130mV的保持電位之后，測量暴露于各種濃度的HRP之后的傳感器電極響應(yīng)(電位，以mV計)。測量開路電位60秒。
具體實施例方式
本發(fā)明的方法利用涂布有導(dǎo)電聚合物層的傳感器電極。在下面和在本申請人的已公開國際專利申請WO 00/11473和WO 03/019171中更全面地描述了這些傳感器電極的基本特征和通過用傳導(dǎo)性聚合物層涂布導(dǎo)電電極來生產(chǎn)電極的優(yōu)選方法，所述專利申請的內(nèi)容通過引用整體并入本文。
所述傳感器電極可以是基本上任何適合的包含傳導(dǎo)性或半傳導(dǎo)性層的電極。適合的電極包括具有金屬或準(zhǔn)金屬傳導(dǎo)性的標(biāo)準(zhǔn)電位電極，它們在水性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，例如金和其它貴金屬電極。所述傳感器電極是電化學(xué)涂布的，優(yōu)選在至少一個主要表面的至少一部分上，用導(dǎo)電聚合物層，例如聚吡咯、聚噻吩、聚呋喃、聚苯胺等涂布。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(見WO 00/11473和WO 98/37409)，通過由包含單體、極性溶劑和本底電解質(zhì)的溶液的電化學(xué)合成，將所述聚合物的薄層沉積在導(dǎo)電電極上。吡咯是優(yōu)選的單體，但是也可以使用其它單體例如噻吩、呋喃或苯胺。還可以使用這些單體中兩種或多種的組合，以產(chǎn)生導(dǎo)電共聚物。
優(yōu)選的支持電解質(zhì)是十二烷基硫酸鈉，但是可以使用其它電解質(zhì)。所述電解質(zhì)也作為摻雜劑。去離子水優(yōu)選用作極性溶劑。
所述電化學(xué)聚合溶液通常由單體和支持電解質(zhì)的水溶液組成。然而，可以向聚合溶液中加入其它組分例如提供可以用作生物受體或傳感器表面化學(xué)修飾的連接物的特異性官能團(tuán)的組分(見WO 00/11473和WO 98/37409)。
電化學(xué)聚合典型地在由待涂布的傳感器電極、輔助電極和參考電極組成的三個電極細(xì)胞中進(jìn)行?，F(xiàn)有技術(shù)(見WO 00/11473和其中包含的參考文獻(xiàn))中已經(jīng)描述了適當(dāng)?shù)慕M合方式?？梢詫⒍鄠€傳感器電極組合成具有一個電接觸的組。整個傳感電極陣列可以在單一的聚合反應(yīng)中涂布。這可以使用單一的輔助電極或每對傳感和參考電極使用一個輔助電極。例如，包含與每對傳感和參考電極相關(guān)聯(lián)的第三反電極的陣列(例如用于電流分析)可以使用第三反電極作為輔助電極進(jìn)行涂布。在另外的排列中，參考電極可以用作聚合步驟的輔助(反)電極?？梢圆倏v參考電極以起到聚合的輔助電極的作用，例如用Ag/AgCl電極，Ag/AgCl的比率可以臨時改變，使得它起到聚合的輔助電極的作用，隨后在聚合后恢復(fù)至作為參考電極的作用。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所眾所周知的，為了修飾聚合物的結(jié)構(gòu)和/或傳導(dǎo)特性，導(dǎo)電聚合物通常在電化學(xué)合成階段摻雜。浸沒在溶液中的導(dǎo)電聚合物進(jìn)行離子交換的容易度和達(dá)到離子平衡的快速性基本上取決于在電沉積階段導(dǎo)入的摻雜劑陰離子的大小摻雜劑陰離子的離子半徑越大，離子交換反應(yīng)進(jìn)行得越快，并且越快達(dá)到平衡狀態(tài)。這與“金屬電極導(dǎo)電聚合物”系統(tǒng)的電位改變值和速率直接相關(guān)，響應(yīng)于溶液中離子組成的變化。聚合期間可以確定響應(yīng)的類型(陰離子、陽離子、氧化還原)及其速率。
典型的摻雜劑陰離子是硫酸根離子(SO42-)，其在聚合過程中引入，中和聚合物主鏈上的正電荷。硫酸根離子不易于通過離子交換釋放，因此有助于保持聚合物的結(jié)構(gòu)。
對于氧化還原和pH敏感性傳感器，當(dāng)制備電化學(xué)聚合溶液時，優(yōu)選使用陰離子的離子半徑大的鹽作為本底電解質(zhì)。在這種情況下，離子響應(yīng)被最小化并且氧化還原或pH響應(yīng)占優(yōu)勢，通過聚合物膜和周圍溶液之間的電子交換提供電位響應(yīng)。
陰離子的離子半徑大的適當(dāng)?shù)柠}包括十二烷基硫酸鈉和硫酸葡聚糖。這些鹽在電化學(xué)聚合溶液中的濃度根據(jù)檢測類型而在0.0001-0.05M范圍內(nèi)變化。
氧化還原響應(yīng)可以通過將摻雜劑離子引入到聚合物中來提高，由于周圍溶液中的變化使傳感器在氧化還原狀態(tài)下額外變化，將摻雜劑離子引入到聚合物中可以改變它們的氧化還原狀態(tài)。如果溶液組分中有一種被氧化，那么所述摻雜劑應(yīng)該是還原形式，反之亦然。K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]可以作為兩種情況下的實例給出。電化學(xué)聚合溶液中的這些電解質(zhì)的濃度可以在0.001-0.1M范圍內(nèi)改變來滿足檢測的具體需求。
導(dǎo)電聚合物涂布的電極的表面可以通過用生物分子涂布來進(jìn)一步修飾，所述生物分子特異性地結(jié)合分析物(本文中也稱為“受體”)或者可以用作生物分子或傳感器表面化學(xué)修飾的連接物或銜接物的其它官能團(tuán)或分子(見WO 00/11473、WO 98/37409和WO 96/02001)。
生物分子，例如能夠特異性結(jié)合所檢測分析物的受體分子可以利用熟知的固相涂布技術(shù)固定在傳感器上。生物分子可以在聚合反應(yīng)期間引入到導(dǎo)電聚合物中，或者它們可以在聚合物涂布步驟之后在單獨的修飾步驟中被吸附到涂布的傳感電極的表面上，或者它們可以共價連接至聚合物涂層(見WO 00/11473、WO 98/37409和WO 96/02001)。
在具體實施方案中，生物分子可以是能夠通過特異性結(jié)合相互作用將其它分子，或者甚至是整個細(xì)胞附著在傳感器表面上的“銜接分子”。通過選擇適當(dāng)?shù)你暯臃肿?，還可以制造包含能夠結(jié)合整個范圍內(nèi)的不同受體分子的銜接分子的“通用”傳感電極。僅僅通過結(jié)合適當(dāng)特異性的銜接分子受體就可以在“通用”傳感電極上賦予對于所檢測分析物的特異性。
蛋白質(zhì)抗生物素蛋白和鏈親和素優(yōu)選用作銜接分子。本發(fā)明的作者進(jìn)行的調(diào)查研究已經(jīng)顯示，固定在導(dǎo)電聚合物膜內(nèi)的抗生物素蛋白和鏈親和素在長時間內(nèi)保留了它們的天然特性(至少一年，可能更長)并且可以在整個時期內(nèi)用來與生物素綴合的受體連接。使生物素與大范圍的不同分子綴合的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，具有固定化的抗生物素蛋白或鏈親和素的傳感電極可以容易地僅僅通過使適當(dāng)?shù)纳锼鼗荏w通過生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈親和素結(jié)合相互作用結(jié)合而對于給定的分析物具有特異性。
盡管抗生物素蛋白和鏈親和素是優(yōu)選的銜接分子，但是在本發(fā)明范圍內(nèi)也可使用作為替代的銜接分子，例如蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、凝集素和FITC。銜接分子的引入可以使其它生物分子或整個細(xì)胞附著在傳感電極表面，例如通過蛋白質(zhì)A/抗體、蛋白質(zhì)G/抗體、FITC/抗FITC或凝集素/糖結(jié)合相互作用。生物分子可以作為替代地直接被吸收或者與聚合物涂布的傳感器表面共價結(jié)合。
為了進(jìn)行本發(fā)明的方法，首先使傳感器電極與包含由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液接觸。本文所用的術(shù)語“樣品”在其范圍內(nèi)包括任何期望檢測出存在分析物的材料，包括但不限于生物流體例如全血、血清、血漿、尿、淋巴、腦脊髓液、腹水、胸膜滲出液或精液，環(huán)境流體例如化學(xué)工業(yè)的流出物或廢品、食品和飲料工業(yè)中使用或生產(chǎn)的材料，例如乳，或任意上述的稀釋物或提取物。所述樣品還可以包含固體材料的溶液或提取物。應(yīng)該理解，特定類型的樣品可以直接檢測，而不需要任何進(jìn)一步的處理，例如稀釋。這種樣品還被認(rèn)為是“包含由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液”。所述包含由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液在本文中還可以稱為“檢驗溶液”。
所述傳感器電極和包含由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液之間的接觸可以通過將傳感器電極全部或部分浸沒在溶液中實現(xiàn)。在這個實施方案中，所述溶液可以便利地置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，例如微量滴定板的孔、微量離心管或任意適當(dāng)尺寸的容納所述傳感器電極或包含所述傳感器電極的電極組的其它容器。作為替代方案，可以通過將溶液液滴置于傳感器電極表面上來實現(xiàn)接觸。檢測溶液的體積通常為5-200μl，這取決于傳感電極的幾何尺寸。
在一定條件下使所述傳感器電極與包含樣品的溶液接觸足夠的時間，所述條件使得在傳感器電極表面上，更具體地，在傳感器電極地導(dǎo)電聚合物層上形成特異性電化學(xué)活性分析物復(fù)合體。作為舉例說明但不限制本發(fā)明，傳感器電極和檢測溶液之間的接觸時間，在15-40℃連續(xù)攪拌或不連續(xù)攪拌的情況下，典型地為3-30分鐘。電化學(xué)活性分析物復(fù)合體必須包含至少是待檢測的分析物和電化學(xué)活性標(biāo)記物組分。因此，傳感器電極表面上這種復(fù)合體的形成直接或間接與樣品中分析物的濃度成比例。
所述分析物復(fù)合體在傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層處或其上形成，使得電化學(xué)活性標(biāo)記物組分與導(dǎo)電聚合物保持物理上的緊密接近。因此，所述標(biāo)記物組分可以對導(dǎo)電聚合物的氧化還原特性具有直接或間接的作用，并且這種作用提供樣品中存在的分析物的量的指示，因為包含化學(xué)計量量的分析物和標(biāo)記物組分的復(fù)合體的形成與樣品中分析物的濃度直接或間接成比例。因此，傳導(dǎo)性聚合物涂層有效轉(zhuǎn)導(dǎo)傳感器的元件，即傳導(dǎo)性聚合物的氧化還原狀態(tài)作為轉(zhuǎn)導(dǎo)物，將與分析物濃度相關(guān)的化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為可測量的電信號。
所述電化學(xué)活性標(biāo)記物組分可以是直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電層的氧化還原特性的任何標(biāo)記物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述電化學(xué)活性標(biāo)記物組分可以是具有下列特性的帶電標(biāo)記物a)它在電化學(xué)活性測量溶液的pH下帶有凈電荷；和b)當(dāng)傳感器電極上感生預(yù)定的保持電位時，這種電荷的量改變，從而使顆粒根據(jù)其優(yōu)選的電荷狀態(tài)而帶正電或負(fù)電。
適當(dāng)?shù)膸щ姌?biāo)記物的特征還在于，它們的電荷量響應(yīng)于恒定pH下測量溶液的離子強度的變化而改變，或響應(yīng)于恒定離子強度下pH的變化而改變。這種作用可以通過在傳感器電極上感生預(yù)定的固定電位來模擬，從而使顆粒根據(jù)其優(yōu)選的電荷狀態(tài)帶正電或負(fù)電。因此，在本發(fā)明的方法中，不需要在兩個分開的測量溶液中測量傳感器電極對參考電解的電位-即在無活性測量緩沖液和與測量緩沖液在恒定離子強度下pH不同或恒定pH下離子強度不同的第二種緩沖液中。相反，將標(biāo)記物組分從“無活性”向“活性”緩沖液轉(zhuǎn)移的作用，通過感生預(yù)定電位來模擬。施加預(yù)定的電位時，帶電標(biāo)記物上的電荷量改變，以便對導(dǎo)電聚合物層的氧化還原特性具有可檢測的影響。
優(yōu)選的帶電標(biāo)記物包括但不限于金、二茂鐵或膠乳微球。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，電化學(xué)活性標(biāo)記物組分可以是酶標(biāo)記物。適當(dāng)?shù)拿笜?biāo)記物包括任何能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)變成產(chǎn)物的酶，通過酶的作用直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成。
在一個實施方案中，所述酶可以能夠?qū)鞲衅麟姌O的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒有可檢測影響的底物轉(zhuǎn)變成能夠直接或間接影響導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的產(chǎn)物。
在另外的實施方案中，所述酶可以能夠?qū)⒛軌蛑苯踊蜷g接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的底物轉(zhuǎn)變成對導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒有可檢測影響的產(chǎn)物。
所述酶產(chǎn)物或底物可以通過改變導(dǎo)電聚合物的化學(xué)組成和/或通過改變接近于導(dǎo)電聚合物層表面的測量溶液的pH和/或離子強度，來直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成。
優(yōu)選的酶標(biāo)記物包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶和葡糖氧化酶。
在又一個實施方案中，所述標(biāo)記物組分可以包含多亞基酶復(fù)合體或多酶級聯(lián)物，或形成其中的一部分。例如，所述酶標(biāo)記物可以能夠?qū)鞲衅麟姌O的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成沒有可檢測影響的底物轉(zhuǎn)變成作為第二種酶的底物的產(chǎn)物，第二種酶的作用產(chǎn)生直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成的產(chǎn)物。所述第二種酶還可以形成部分的電化學(xué)活性分析物復(fù)合體，或可以分開地與傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層相關(guān)聯(lián)。作為替代方案，第一種酶可以分開地與傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層相關(guān)聯(lián)，或可以甚至存在于本體溶液種，而第二種酶形成部分的電化學(xué)活性分析物復(fù)合體。
電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的形成可以以診斷測試研發(fā)領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的很多方式進(jìn)行，這些方式尤其包括所有形式的異質(zhì)和均質(zhì)、競爭性和三明治測試，如下面詳細(xì)描述的。
本發(fā)明的方法可以適于對很多分析物進(jìn)行定量測試。具體而言，所述方法可以用于進(jìn)行三明治或競爭性形式的電化學(xué)結(jié)合測試。
典型的三明治測試需要對所關(guān)注的分析物具有特異性的“捕捉”受體。所述受體可以是基本上任何能夠特異性結(jié)合所關(guān)注分析物的類型的特異性結(jié)合劑。適當(dāng)?shù)氖荏w包括但不限于天然存在或重組生物結(jié)合劑例如抗體或其片段，例如F(ab′)2片段、scAbs、Fv和scFv片段等，核酸、凝集素、所有類型的配體-結(jié)合受體，例如激素受體、細(xì)胞因子受體等，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)和適配體(aptamer)。
典型地，捕捉受體被固定在傳感器電極的表面上，例如可以被吸附到聚合物涂布的電極表面或引入到聚合物涂層中。當(dāng)傳感器電極在使用中時，樣品中存在的任何分析物將與被固定的捕捉受體結(jié)合。被結(jié)合分析物的電化學(xué)檢測需要第二受體，能夠在空間上不同于結(jié)合捕捉劑的位點的位點處結(jié)合分析物。所述第二受體典型地與標(biāo)記物組分綴合，例如電荷或酶標(biāo)記物，如本文所述，所述標(biāo)記物組分允許電化學(xué)檢測。在這個實施方案中，在傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層上形成的所述“電化學(xué)活性分析物復(fù)合體”是捕捉受體、分析物、第二受體和標(biāo)記物組分的復(fù)合體。
上述測試的親和力反應(yīng)步驟等同于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)三明治結(jié)合測試。分析的三明治形式尤其對檢測多價抗原有用，其中檢測中使用的捕捉劑和標(biāo)記第二受體優(yōu)選為結(jié)合抗原上不同的、空間差異的抗原決定部位的抗體。所述三明治形式還可以用于抗原攜帶兩個或多個空間分離的同樣抗原決定部位的情況。在后一實施方案中，用在檢測中的所述捕捉劑和標(biāo)記第二受體可以是特異性相同的抗體。
典型的競爭性結(jié)合測試還需要對所關(guān)注的分析物有特異性的“捕捉”受體，典型地，它固定在傳感器電極的表面上，如三明治測試中描述的。當(dāng)傳感器電極與樣品接觸時，樣品中存在的任意分析物將與固定的捕捉受體結(jié)合。競爭分子也能夠結(jié)合捕捉劑，與分析物競爭結(jié)合可用的捕捉劑。所述競爭分子用能夠電化學(xué)檢測的標(biāo)記物組分標(biāo)記，例如電荷或酶標(biāo)記物。在這個實施方案中，在傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層上形成的“電化學(xué)活性分析物復(fù)合體”是捕捉受體、競爭分子和標(biāo)記物組分的復(fù)合體。
在競爭性電化學(xué)測試中，所述競爭分子可以是標(biāo)記的分析物或標(biāo)記的分析物的結(jié)構(gòu)類似物，它們能夠結(jié)合被固定化/被吸附的捕捉劑上的相同分析物結(jié)合位點。標(biāo)記的分析物作為競爭分子的用途尤其優(yōu)選用于檢測小的分析物分子。作為替代方案，所述競爭分子可以結(jié)合被固定化/被吸附的捕捉劑上的不同位點。例如，如果被固定化的捕捉劑是抗體，那么所述競爭分子可以是抗免疫球蛋白抗體(優(yōu)選地Fab-特異性)或甚至是適當(dāng)特異性的抗個體基因型抗體。競爭性檢測方法通常依賴于傳感器電極表面上存在過量的捕捉位點。那些不結(jié)合分析物的捕捉劑可用于結(jié)合競爭分子。假設(shè)捕捉結(jié)合位點的總數(shù)保持恒定，那么結(jié)合的競爭分子的量將與存在的分析物的量成反比。
上述方法的親和力反應(yīng)步驟基本上等同于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)三明治或競爭性酶聯(lián)免疫吸收測試(ELISA)。盡管本發(fā)明的方法尤其適用于進(jìn)行電化學(xué)ELISA測試，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明的基礎(chǔ)測試可以用來進(jìn)行其它類型的測試，包括改變pH、離子強度或氧化還原電位，例如包括替代的受體(例如單鏈核酸、酶、細(xì)胞基系統(tǒng)等)的測試。本發(fā)明的方法還可以用于對分析物進(jìn)行直接的酶測試，所述分析物也是適當(dāng)酶的底物。在這種實施方案中，所述還構(gòu)成標(biāo)記物組分的酶可以是固定在導(dǎo)電聚合物內(nèi)或直接吸附到導(dǎo)電聚合物上的，而不是與其它受體組分綴合。
電化學(xué)活性分析物復(fù)合體形成之后，使所述傳感器電極與增進(jìn)電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性的電化學(xué)活性測量溶液或緩沖液接觸?！霸鲞M(jìn)電化學(xué)活性”意味著，活性測量溶液提供使得分析物復(fù)合體的標(biāo)記物組分的特性或活性改變的條件，例如響應(yīng)于外部電流的施加和隨后的除去。標(biāo)記物復(fù)合體的特性或活性的這種改變反過來直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電層的氧化還原特性。
例如，在分析物復(fù)合體包含帶電標(biāo)記物組分的實施方案中，活性測量溶液的pH和/或離子強度是一定的，使得帶電標(biāo)記物組分上的電荷的量可以響應(yīng)于外加電流而變化。與帶電標(biāo)記物一起使用的活性測量溶液的摩爾濃度、離子強度和pH可以根據(jù)標(biāo)記物(lavel)上電荷的量/強度和極性而變化。在分析物復(fù)合體包含酶標(biāo)記物組分的實施方案中，所述活性測量溶液可以包含酶的底物。適當(dāng)?shù)呐c酶標(biāo)記物一起使用的活性測量溶液是包含在特定酶的最佳pH下酶活化所需的所有試劑的低離子強度緩沖液，例如對于辣根過氧化物酶，緩沖液可以是包含0.1mg/ml OPD和0.03％w/v過硼酸的50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.0)。
使傳感器電極與電化學(xué)活性測量溶液接觸的步驟(c)可以以幾種不同方式實現(xiàn)。在一個實施方案中，傳感器電極可以從步驟(b)的包含樣品的溶液轉(zhuǎn)移到步驟(part)(c)的活性測量溶液中。傳感器電極可以從容納包含樣品的溶液的第一個容器或器皿中物理地轉(zhuǎn)移到分開的容納活性測量溶液的第二個容器或器皿中?？梢栽趯鞲衅麟姌O從包含樣品的溶液中移出之后，在轉(zhuǎn)移到活性測量溶液中之前，清洗傳感器電極，以除去任何痕量的樣品溶液，包括除去任何未結(jié)合的分析物。
在所述方法的另外實施方案中，可以在單一的容器或器皿中進(jìn)行步驟(b)和(c)，僅僅是在傳感器表面上形成電化學(xué)活性分析物復(fù)合體之后，向部分(b)的包含樣品的溶液中加入過量的部分(c)的活性測量溶液。過量加入活性測量溶液降低了任意的樣品影響，同時除去了輕微結(jié)合的復(fù)合體。這個實施方案與將傳感器電極“轉(zhuǎn)移”至測量溶液中的實施方案以相同的方式工作，因為所測量的影響發(fā)生在傳感器表面，并且本體溶液中發(fā)生的任何反應(yīng)對結(jié)合在傳導(dǎo)性聚合物涂層表面的復(fù)合體的測量幾乎不具有或沒有顯著影響。
在不依賴于各種溶液的容器的用途的本方法實施方案中，首先可以將包含樣品的溶液液滴置于傳感器上。當(dāng)要用活性測量溶液替換樣品時，可以簡單地清洗傳感器來除去樣品溶液，隨后將活性測量溶液液滴置于傳感器上。
所述傳感器可以短時間(典型地10秒-60秒)停留在活性測量溶液中，隨后施加電流來激活傳感器并且將傳感器電極電位達(dá)到預(yù)定的電位。所述預(yù)定的電位優(yōu)選涉及在與活性測量溶液的組成基本類似，但不含電化學(xué)活性組分的對照測量溶液中，傳感器電極相對參考電極的靜息電位。對于酶標(biāo)記物的情況，所述對照測量溶液是與活性測量溶液同樣組成、同樣pH和同樣離子強度，但缺少酶底物的溶液。對于帶電標(biāo)記物的情況，所述對照測量溶液是比活性測量緩沖液離子強度較低或pH不同的溶液。對于任何給定的傳感器系統(tǒng)，預(yù)定電位的適當(dāng)值或窄的值范圍可以簡單地確定，通過以測量對照測量溶液中系統(tǒng)的靜息電位作為校準(zhǔn)步驟。應(yīng)該理解，選定的預(yù)定電位可以與靜息電位的實際測量值有些不同，而不會在材料方面影響測試方法的功能。一旦已經(jīng)確定了或提供了預(yù)定電位的適當(dāng)值，對于具體的傳感器系統(tǒng)，就沒有必要在每次使用所述傳感器時重復(fù)這種測量。
可以保持激勵預(yù)定的保持電位的電流來將傳感器電極保持在預(yù)定的電位適當(dāng)?shù)臅r間(典型地1秒-10秒)。隨后將所述電流切斷，在限定時間(典型地1秒-180秒)測量開路電位。這期間，由于分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性，傳感器的電位回復(fù)到其松弛狀態(tài)，圖1(a)。傳感器回復(fù)到其松弛狀態(tài)所需的時間取決于被測量的反應(yīng)和在表面上發(fā)生的反應(yīng)的濃度，這反過來依賴于樣品中存在的分析物的量。
對于分析物復(fù)合體中引入酶標(biāo)記物的情況，電化學(xué)活性反應(yīng)(底物向產(chǎn)物的酶促轉(zhuǎn)化)在傳感器電極的表面連續(xù)發(fā)生，因此，一旦保持電流(電感應(yīng)電位)被除去，所述電極迅速回復(fù)到電化學(xué)感應(yīng)的靜息電位。電感應(yīng)保持電位和電化學(xué)感應(yīng)靜息電位(本文中也稱為開路靜息電位)之間的差指示樣品中分析物的濃度。(NB這種活性測量溶液中電化學(xué)感應(yīng)靜息電位的值與不含電化學(xué)活性組分的對照緩沖液中的靜息電位不同)。
在進(jìn)行這種方法的過程中，可以采取也是分析物濃度的指標(biāo)的其它測量，它們是保持給定的預(yù)定電位所需的電流量，和；電位回復(fù)到電化學(xué)感應(yīng)的靜息電位的最初速率因此，本發(fā)明的方法可以基于下列參數(shù)的任何一個，或者兩個或多個的任意組合測量(i)保持電位和開路靜息電位之間的差，
(ii)傳感器電極從保持電位回復(fù)到開路靜息電位的速率，(iii)將傳感器電極保持在預(yù)定的保持電位所需的電流量。
所述方法最優(yōu)選基于參數(shù)(i)的測量，但是包含參數(shù)(ii)和(iii)的任一個或兩者作為“二次測量”將會大大提高分析結(jié)果的可靠性，因為可以使用三個協(xié)同相關(guān)的測量，而不是只使用一個測量。
盡管所述方法只需要施加電流將傳感器保持在單一的預(yù)定電位，但是也可以使用替代的活化方式來增強傳感器響應(yīng)和確保參考電極達(dá)到最佳的平衡。例如，測量開路電位之前，設(shè)定電位之前可以將所述傳感器激勵至高于或低于預(yù)定電位的一個以上電位下。或者可以進(jìn)行幾個活化電位和/或松弛步驟，例如圖2和3中舉例說明的。
本發(fā)明的測試方法的測量步驟、步驟(d)至(f)需要包含傳感器電極、參考電極和反電極或輔助電極的電極組件。通過雙電極系統(tǒng)中的單個電極可以提供參考電極和反電極的功能。作為替代方案，在三電極系統(tǒng)中可以使用分開的反電極和參考電極。適當(dāng)?shù)膮⒖茧姌O包括例如標(biāo)準(zhǔn)Ag/AgCl電極或甘汞電極。適當(dāng)?shù)姆措姌O包括由鉑、其它貴金屬或其它惰性傳導(dǎo)性材料例如石墨或碳制成的電極。
所述參考電極和所述反電極可以在傳感器電極外部，或者可以與傳感器電極整合來形成電極組件。
測量步驟中，為了將傳感器電極保持在預(yù)定的電位，在反電極和傳感器電極之間施加電流，當(dāng)所有電極與活性測量溶液接觸時，相對于參考電極測量傳感器電極的電位。因此，在傳感器電極的導(dǎo)電聚合物表面上形成電化學(xué)活性分析物復(fù)合體之后，但是在與活性測量溶液接觸之前或其間，可以組合所述電極組件。例如，傳感器電極、反電極和參考電極可以全部或部分地浸沒在活性測量溶液中，并且通過適當(dāng)?shù)难b置連接來形成電化學(xué)電池。不需要使參考電極和反電極與步驟(b)中的樣品溶液接觸。
在另外的實施方案中，可以在整合的傳感器組件中預(yù)先形成一個或多個傳感器電極、反電極和參考電極。傳感器組件可以在用導(dǎo)電聚合物層涂布之前形成，其中出于聚合物層電化學(xué)聚合的目的還可以使用參考電極和反電極，如WO 00/11473和WO 03/019171中描述的。WO00/11473和WO 03/019171中還描述了適當(dāng)?shù)膫鞲衅鹘M件。最終傳感器組件的很多不同規(guī)劃可能包括例如“量桿(dipstick)”型傳感器，包含整合的電化學(xué)傳感器的多孔板(如WO 03/081253中描述的)和引入電化學(xué)傳感器的側(cè)流設(shè)備(如WO 2004/010143中描述的)。
參考下面的非限制性實施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明實施例1除了另外聲明，所有材料和試劑以及它們的制備方法都如WO00/11473和WO 03/019171中描述的。
使用WO 00/11473或WO 03/019171中描述的電化學(xué)涂層技術(shù)來制備用含有被固定化的/被吸附的鏈親和素的聚吡咯膜涂布的傳感器電極。
用0.1M，pH7.8的磷酸鉀緩沖液清洗鏈親和素涂布的傳感器，包括將各個傳感器連續(xù)地放置在用250μl緩沖液(下面的步驟中傳感器可以儲存在這種緩沖液中)填充的微滴定板的三個孔中。
制備在0.1M，pH7.8的磷酸鉀緩沖液中的生物素化辣根過氧化物酶(HRP)濃縮物。QC使用的常規(guī)濃度為0.0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ng/ml。(其它試驗可能需要不同濃度)將200μl各個濃度的HRP-生物素放置在微滴定板的孔中。
每個孔中放置一個傳感器。各個傳感器的工作區(qū)域必須完全浸沒在溶液中。
用生物素化HRP濃縮物在室溫下培養(yǎng)傳感器15分鐘。
用0.1M，pH7.8的磷酸鉀緩沖液清洗傳感器。注意這個步驟之后，可以將傳感器儲存在清洗緩沖液中1-2小時。
使用恒電位儀(例如autolab)進(jìn)行測量，可以將傳感器預(yù)先準(zhǔn)備在固定電位下，隨后測量開路電位。
將傳感器放置在含有0.1mg/ml鄰苯二胺(OPD)和0.03％w/v過硼酸的50mM、pH 5.0的檸檬酸鹽緩沖液中。
將傳感器在-130mV下預(yù)先準(zhǔn)備10秒，并且測量開路電位60秒。結(jié)果示于圖4。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括(a)提供含有用導(dǎo)電聚合物層涂布的導(dǎo)電電極的傳感器電極；(b)在一定條件下使所述傳感器電極與含有由于存在分析物而待檢測的樣品的溶液接觸，所述條件使得在導(dǎo)電聚合物層上形成包含分析物和電化學(xué)活性標(biāo)記物組分的電化學(xué)活性分析物復(fù)合體；(c)使所述傳感器電極和電化學(xué)活性分析物復(fù)合體與增進(jìn)電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性的電化學(xué)活性測量溶液接觸；(d)施加電流以在所述傳感器電極上感生預(yù)定的保持電位；(e)除去電流并且使所述傳感器電極回復(fù)至開路靜息電位；(f)測量下列參數(shù)中的一個或多個，作為樣品中存在的分析物的量的指標(biāo)(i)保持電位和開路靜息電位之間的差，(ii)所述傳感器電極從保持電位回復(fù)至開路靜息電位的速率，(iii)將所述傳感器電極保持在預(yù)定的保持電位所需的電流量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(d)中施加恒定的電流，使得所述傳感器電極保持在單一的預(yù)定保持電位下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(d)中所述電流是變化的，使得所述傳感器電極在預(yù)定的保持電位之前，保持在一個或多個不同的電感應(yīng)電位和/或開路電位下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中步驟(c)通過將所述傳感器電極從步驟(b)的包含樣品的溶液轉(zhuǎn)移至步驟(c)的測量溶液中來進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中步驟(c)通過向步驟(b)的包含樣品的溶液中加入過量的步驟(c)的測量溶液來進(jìn)行。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性標(biāo)記物組分包含能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶，所述酶的作用直接影響所述傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、脲酶、過氧化氫酶或葡糖氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶能夠?qū)鞲衅麟姌O的導(dǎo)電聚合物層的氧化還原組成沒有可檢測影響的底物轉(zhuǎn)變成直接或間接影響導(dǎo)電聚合物層的氧化還原組成的產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶能夠?qū)⒅苯踊蜷g接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層的氧化還原組成的底物轉(zhuǎn)變成對導(dǎo)電聚合物層的氧化還原組成沒有可檢測影響的產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述酶能夠?qū)鞲衅麟姌O的導(dǎo)電聚合物層的氧化還原組成沒有可檢測影響的底物轉(zhuǎn)變成作為第二種酶的底物的產(chǎn)物，第二種酶的作用產(chǎn)生第二種產(chǎn)物，所述第二種產(chǎn)物的產(chǎn)生直接或間接影響傳感器電極的導(dǎo)電聚合物涂層的氧化還原組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的電化學(xué)活性標(biāo)記物組分包含具有下列特性的帶電標(biāo)記物a)在權(quán)利要求1的電化學(xué)活性測量溶液的pH下帶有凈電荷；和b)當(dāng)傳感器電極處感生預(yù)定的保持電位時，這種電荷的量改變，從而使顆粒根據(jù)其優(yōu)選的電荷狀態(tài)而帶正電或負(fù)電。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述帶電標(biāo)記物是金、二茂鐵或膠乳微球。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述傳感器電極的導(dǎo)電聚合物層含有固定在其中或吸附到其上的捕捉受體，所述捕捉受體能夠定量地結(jié)合樣品中待檢測的期望分析物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中步驟(b)中電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的形成通過下面的步驟進(jìn)行(b1)使傳感器電極與包含樣品的溶液接觸，使得所述分析物結(jié)合被固定化或被吸附的捕捉受體；(b2)使傳感器電極與包含第二受體的溶液接觸，所述第二受體能夠在空間上不同于結(jié)合捕捉受體的位點的位點處結(jié)合分析物，所述第二受體與標(biāo)記物組分綴合。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中步驟(b)中電化學(xué)活性分析物復(fù)合體的形成通過下面的步驟進(jìn)行(b1)使傳感器電極與包含樣品的溶液接觸，使得所述分析物結(jié)合被固定化或被吸附的捕捉受體；(b2)使傳感器電極與包含能夠結(jié)合捕捉受體的競爭分子的溶液接觸，所述競爭分子與標(biāo)記物組分綴合。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中所述步驟(b1)和(b2)通過使所述傳感器電極與包含樣品的溶液接觸來同時進(jìn)行，所述溶液中已經(jīng)加入與標(biāo)記物組分綴合的第二受體或競爭分子。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述樣品是乳、食品均勻混合物或土壤提取物。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述樣品是生物流體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述生物流體是全血、血清、淋巴、尿、唾液、腹水、胸膜滲出液、腦脊髓液或精液。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用對所檢測的分析物具有特異性的傳感器電極進(jìn)行電化學(xué)分析的方法。所述方法包括將傳感器電極浸沒在懷疑含有所述分析物的樣品溶液中；通過暴露于溶液形成電化學(xué)活性的復(fù)合體，所述溶液包含第二受體或者用帶電標(biāo)記物或酶標(biāo)記物標(biāo)記的競爭分子；隨后使傳感器暴露于電化學(xué)上活性溶液。測量步驟包括將所述傳感器電極的電位激勵至預(yù)定的固定電位，通過施加電流或活化波形，隨后監(jiān)控傳感器電極和參考電極之間的電位差，然后清除保持電流來實現(xiàn)。電流、速率和電位都可以測量并且用于確定分析物濃度或傳感器狀態(tài)。
文檔編號G01N27/416GK101057143SQ200580038295
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
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