專利名稱：：Trpc通道治療心血管疾病的用途的制作方法TRPC通道治療心血管疾病的用途本發(fā)明涉及TRPC通道、其失活突變體，或編碼該TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列用于制備治療心血管疾病的藥物的用途，以及篩選TRPC通道或其失活突變體調(diào)節(jié)劑的方法。動(dòng)脈粥樣硬化是西方世界心血管疾病的主要原因之一。在2001年這些疾病在美國(guó)引起約一百萬人死亡。此外，由于JSUI中國(guó)家生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)的心血管疾病成為全世界的流行病.WHO報(bào)道到2010年心血管疾病將成為發(fā)展中國(guó)家的主要死亡原因。因此，對(duì)預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的新藥物有巨大的醫(yī)學(xué)需要。動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生和jObl—個(gè)復(fù)雜并且沒有完全理解的過程，其依賴于大量外遺傳因子(例如生活方式、營(yíng)養(yǎng)、鍛煉)和遺傳因子，大量臨床觀察顯示動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣化發(fā)生的病理生理學(xué)中涉及排列在血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙(Ross,R.N.(1999)，Engl.J.Med.340:115-126)。因此，涉及內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)可能是抗動(dòng)脈粥樣硬化療法的主要耙標(biāo)。由于重要的內(nèi)皮功能如氣化氮(NO)的產(chǎn)生受胞內(nèi)Ca"水平的控制，因此Ca"調(diào)節(jié)蛋白看來特別具有意義.TRPC通道(一類新的鐵通道蛋白)是表達(dá)于心血管和其他系統(tǒng)的Caz+透過性非選擇性陽離子通道?；谛蛄型葱裕琓RPC3、TRPC6和TRPC7組成了獨(dú)特的TRPC亞家族。在表達(dá)系統(tǒng)中，這些通道通過G蛋白偶聯(lián)受體或胞內(nèi)Ca"存儲(chǔ)的消耗而激活(Clapham等人(2001)，Nat.Rev.Neurosci.2:387-396)。在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中TRPC3還促進(jìn)氧化脅迫激活的陽離子流(Balzer等人(1999)Cardiovasc.Res.42:543-549)。為了研究TRPC1在平滑肌細(xì)胞中的功能性作用，在WO02/059155中使用了針對(duì)TRPC1特異性表位的抗體。然而，該表位并未在其他TRPC通道中發(fā)現(xiàn)。WO05/049084公開了在分離的大鼠心室肌細(xì)胞中使用化合物2-氨基乙氧基硼酸二苯酯(2-APB)進(jìn)行的功能研究。然而，已知該化合物尤其對(duì)TRPC3顯示非特異性和可疑的效應(yīng)(vanRossum等人(2000)，J.Biol.Chem.，275，28562-28568)。根據(jù)本發(fā)明，我們使用遺傳方法在動(dòng)脈粥樣硬化兔的內(nèi)皮細(xì)胞中體內(nèi)抑制了TPRC3、TRPC6和TRPC7的活性。4^人吃驚地，我們?cè)陲@性負(fù)TRPC3基因處理的血管中發(fā)現(xiàn)了血管功能的顯著改善和動(dòng)脈粥樣硬化組織學(xué)標(biāo)志的減少，這意味著抑制TRPC通道(特別是上述通道)的活性顯示了抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)在TRPC通道和心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化之間建立了新的聯(lián)系。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題涉及TRPC通道、其失活突變體，或者編碼該TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列用于制備治療心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的藥物的用途。優(yōu)選的TRPC通道為TRPC3通道、TRPC6通道或TRPC7通道，尤其是TRPC3通道或TRPC6通道，特別是TRPC3通道。相應(yīng)的氨基酸序列為SEQIDNO:1(TRPC3)、，SEQIDNO:5(TRPC6)和SEQIDNO:9(TRPC7)，特別是編碼TRPC3通道的^J^紗列SEQIDNO:1。相應(yīng)的核苷酸序列為SEQIDNO:2(TRPC3)、SEQIDNO:6(TRPC6)和SEQIDNO:10(TRPC7)，特別是編碼TRPC3通道的核苷酸序列SEQIDNO:2。本發(fā)明的術(shù)語"失活突變體"指作為陽離子通道功能性失活，但能抑制同源的天然存在TRPC通道的通道活性的突變體?？梢赃@樣實(shí)現(xiàn)抑制替換天然多聚通道集群中的TRPC通道亞基，以達(dá)到使細(xì)胞膜中所有天然存在的TRPC通逸基本上都含有突變通道亞基，或者完全被突變通道替換。使通道亞基失活的突變可以優(yōu)選位于的TRPC3的孔隙區(qū)內(nèi)(SEQIDNO:1中的樣酸603-645)、TRPC6的孔隙區(qū)內(nèi)(SEQIDNO:5中的#^酸660-705)和TRPC7的孔隙區(qū)內(nèi)(SEQIDNO:9中的#^酸610-650)。具體實(shí)例為具有氨基酸序列SEQIDNO:3的突變TRPC3通道(TRPC3DN)、具有氨基酸序列SEQIDNO:7的突變TRPC6通道(TRPC6DN)和具有M酸序列SEQIDNO:11的突變TRPC7通道(TRPC7DN)。編碼TRPC3DN的核苷紗列為核苷紗列SEQEDNO:4，編碼TRPC6DN的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:8，編碼TRPC7DN的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:12。特別優(yōu)選的實(shí)例為具有M^f列SEQIDNO:3的顯性負(fù)突變體TRPC3DN。編碼TRPC3DN的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:4。此外，"失活突變體"可以由TRPC3、TRPC6或TRPC7的任何部分組成，所述部分保留了在蛋白質(zhì)合成或轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜的任何步驟中與天然存在TRPC通勤目互作用的能力，從而抑制天然存在TRPC通道的功能。這些部分可以是例如TRPC3(SEQIDNO:1)的氨基酸0-302(參閱Balzer等人(1999)Cardiovasc.Res.42:543-549)。可以使用如實(shí)施例中示例性描述的完整細(xì)胞膜片鉗方法檢測(cè)和/或分析失活突變體。本發(fā)明的另一主題涉及TRPC通道、其失活突變體，或者編碼該TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列用于發(fā)現(xiàn)TRPC通道調(diào)節(jié)劑特別是抑制劑的用途，所述TRPC通道調(diào)節(jié)劑作為治療心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。優(yōu)選的TRPC通道為TRPC3通道、TRPC6通道或TRPC7通道，尤其是TRPC3通道或TRPC6通道，特別是如上文詳細(xì)描述的TRPC3通道，一般地，使TRPC通道或其失活突變體，或者編碼該TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列接觸測(cè)試化合物，并測(cè)量或檢測(cè)該測(cè)試化合物對(duì)TRPC通道或其失活突變體，或者編碼該TRPC通道或失活突變體的核普酸序列對(duì)測(cè)試化合物的影響。本發(fā)明的術(shù)語"TRPC通道調(diào)節(jié)劑"指TRPC通道的調(diào)節(jié)分子("調(diào)節(jié)劑")，尤其是抑制或激活分子("抑制劑"或"激活劑")，特別是可按照本發(fā)明測(cè)定法鑒定的TRPC通道抑制劑。抑制劑一般是例如結(jié)合以部分或完全阻斷其活性、降低、阻止、延遲激活、失活、脫敏或減量調(diào)節(jié)至少一種如上文詳細(xì)描述的TRPC通道中的至少一種的活性或表達(dá)的化合物，激活劑一般是例如提高、打開、激活、促進(jìn)、增強(qiáng)其活性、使其敏感、激動(dòng)或增量調(diào)節(jié)如上文詳細(xì)描述的TRPC通道中的至少一種活性或表達(dá)的化合物。這些調(diào)節(jié)劑包括遺傳修飾形式的TRPC通道，優(yōu)選TRPC通道的失活突變體如TRPC3DM以及天然存在或合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、肽、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、核酶、小有機(jī)分子等。測(cè)量TRPC通道活性的實(shí)例為包含以下步驟的測(cè)定法(a)接觸表達(dá)TRPC通道的萸光細(xì)胞，(b)在使熒光細(xì)胞接觸調(diào)節(jié)劑或測(cè)試化合物之前、同時(shí)或之后通過通道激活劑刺激Ca"內(nèi)向通量，以及(c)測(cè)量或檢測(cè)熒光的改變。在下文和實(shí)施例中描述了該測(cè)定的其他細(xì)節(jié)以及備選或優(yōu)選實(shí)施方案。因此，本發(fā)明的另一主題涉及TRPC或其失活突變體，或者編碼該TRPC或失活突變體的核苷酸序列的調(diào)節(jié)劑的篩選方法，其中該方法包含以下步驟(a)接觸表達(dá)TRPC通道或其失活突變體的細(xì)胞，(b)在使該細(xì)胞接觸測(cè)試化合物之前、同時(shí)或之后通過通道激活劑刺激Ca"內(nèi)向通量，以及(c)測(cè)量或檢測(cè)TRPC通道活性的改變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包含以下步驟(d)通過比較不存在測(cè)試化合物時(shí)TRPC通道活性的改變來選擇具有心血管疾病活性的測(cè)試化合物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(特別是選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的啟動(dòng)子)控制細(xì)胞中TRPC通道或其失活突變體的表達(dá)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞為如下文進(jìn)一步描述的焚光細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞或細(xì)胞系為MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3或CHO細(xì)胞，特別是HEK293細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^測(cè)量或檢測(cè)離子通量(特別是Ca"通量)的改變來測(cè)量或檢測(cè)TRPC通道活性，例如通過膜片鉗技術(shù)、全細(xì)胞電流、放射性標(biāo)記離子通量或特別是熒光，如使用電壓敏感性染料或離子敏感性染料(Vestergarrd-Bogind等人(1988)，J.MembraneBiol"88:67-75;Daniel等人(1991)J.Pharmacol.Meth.25:185-193;Hoevinsky等人(1994)J.MembraneBiol"137:59-70;Ackerman等人(1997)，NewEngl.J.Med.，336:1575-1595;Hamil等人(1981)，Pflugers.Archiv"391:185)。這些染料的實(shí)例為Di-4-ANEPPS(吡啶4-(2(6-(二丁基氨)-2-萘基)乙烯基)-l-(3-磺丙基)氫氧化物)、CC-2-DMPE(1，2-雙十四酰-sn-甘油基-3^酸乙醇胺三乙基銨)、DiSBAC2(二-(1，2-二巴比妥酸)-三甲基化氧雜菁)、0188厶€3((二-(1，3畫二巴比妥酸)-三甲基化氧雜華)、SBFI-AM(1，3-&羧酸，4，4，-1，4，10-三氧雜-7，13-二氮雜環(huán)十五烷-7，13-二基二(5-甲氧基-6，12-苯并呋喃二基)I二-(四-(乙酖基氧)甲基l酯))、fluo3am(l-[2-狄-5-(2，7-二氯_6_羥基_3_氧_9-咕噸基)苯氧基-2-(2，-氨基-5，-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)、fluo4am(1-2-#^-5-(2，7-二氯-6-羥基-4-氧-9-站化基)苯氧基-:2-P，-氨基-S，-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)或furahm(1-2-(5，-羧基唑-2'-基)-6-氨基苯并呋喃-5-氧卜2-(2'-氨基-5'-甲基-苯氧基)-乙烷-N，N，N，，N，-四乙酸)。通道激活劑的實(shí)例為二酰基甘油，特別是l-油基-2乙酰基-sn-甘油(OAG)、Gq偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑如去甲腎上腺素，特別是胰蛋白酶、刺激受體酪氨酸激酶的激動(dòng)劑如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或產(chǎn)生二?；视偷拿溉缌字富蚱浼せ顒?通道激活劑特別是OAG可用于直接刺激TRPC通道，這是本發(fā)明測(cè)定與間接的受體介導(dǎo)通道激活相比的額外優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槔缭诒景l(fā)明的測(cè)定中顯著降低了假陽性結(jié)果率。一般而言提供這樣的細(xì)胞其在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如上文所述)下表達(dá)TRPC通道或其失活突變體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知并如實(shí)施例中所述的遺傳方法產(chǎn)生這些細(xì)胞，誘導(dǎo)TRPC通道或其失活突變體表達(dá)之后，一般將細(xì)胞接種在如微量滴定板中并培養(yǎng)。通常細(xì)胞生長(zhǎng)并固定在多孔板的底部。其后通常洗滌細(xì)胞并在適當(dāng)?shù)纳蠘泳彌_液中加入染料，優(yōu)選熒光染料如fluo4am。去除加樣緩沖液之后，將細(xì)胞與測(cè)試化合物或調(diào)節(jié)劑一起孵育，特別是與上述生物化學(xué)或化學(xué)測(cè)試化合物(例如化合物文庫(kù)的形式)一起孵育。4吏用如熒光成像讀板儀(FLIPR)進(jìn)行Ca2+測(cè)量。為了刺激通過TRPC通道的Ca"內(nèi)向流量，一般應(yīng)該使用通道激活劑如OAG。作為TRPC通道活化的備選模式，可以使用胰蛋白酶作為Gq偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑。抑制劑的預(yù)期效應(yīng)將是如熒光增加的降低。激活劑將會(huì)引起例如激活劑引發(fā)熒光的進(jìn)一步增加或誘導(dǎo)如非激活劑依賴性的熒光增加。其后，可以分析和/或分離適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)劑，特別是抑制劑。為了篩選化合物文庫(kù)，優(yōu)選使用高通量測(cè)定法，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并市售的。本發(fā)明的術(shù)語"化合物文庫(kù)"指組合自任何多種來源的多種化合物，包括化學(xué)合成的分子和天然產(chǎn)物或組合化學(xué)文庫(kù)。有利地在陣列上和/或機(jī)器人系統(tǒng)中進(jìn)行本發(fā)明方法，例如包括機(jī)器人點(diǎn)板和機(jī)器人液體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，如使用微流控技術(shù)即孔道結(jié)構(gòu)的機(jī)器人系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，以高通量篩選系統(tǒng)的形式進(jìn)行該方法。在這樣的系統(tǒng)中，篩選方法有利地是自動(dòng)化和小型化的，特別是使用小型化孔和機(jī)器y^控制的微流控技術(shù)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在細(xì)胞系中進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)^/方法，所述細(xì)胞系含有如上文詳細(xì)描述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的TRPC通道基因，其中通道激活劑是溶解了的。例如優(yōu)選在血清白蛋白如牛血清白蛋白或钚酸存在下溶解激活劑OAG.本發(fā)明的另一主題涉及制備用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物的方法，其中該方法包含以下步驟(a)進(jìn)行如上文所述的方法，(b)分離檢測(cè)到的適于治療心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的測(cè)試化合物，以及(C)配制檢測(cè)到的測(cè)試化合物與一種或多種可藥用載體或輔助物質(zhì)?？伤幱迷泽w或輔助物質(zhì)為例如生理緩沖溶液如氯化鈉溶液、去礦質(zhì)水、穩(wěn)定劑如蛋白酶或核酸酶抑制劑，或者掩蔽劑如EDTA。以下的圖表、序列和實(shí)施例將解釋本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B顯示TRPC3DN不搬運(yùn)功能性離子流。圖2A和B顯示TRPC3DN對(duì)TRPC3和TRPC6的顯性負(fù)效應(yīng)。圖3顯示TRPC3DN對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔頸動(dòng)脈中乙酰M誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性的效應(yīng)。圖4顯示表達(dá)TRPC3DN的頸動(dòng)脈區(qū)段中流動(dòng)誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性的超聲波評(píng)估'圖5顯示表達(dá)TRPC3^的頸動(dòng)脈區(qū)段中動(dòng)脈粥樣硬化斑的大小。圖6顯示TRPC3Dw表M動(dòng)脈粥樣硬化頸動(dòng)脈中平均巨噬細(xì)胞密度的影響。圖7A和7B顯示使用FLIPR技術(shù)在可誘導(dǎo)TRPC3和TRPC6的細(xì)胞系中檢測(cè)OAG激活的Ca"信號(hào)。圖8A和8B展示FLIPR測(cè)定的SKF96365在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞系中TRPC3和TRPC6抑制的IC50。序列表描述SEQIDNO:1顯示TRPC3的^J^,列；SEQIDNO:2顯示編碼TRPC3的核苷酸序列；SEQIDNO:3顯示顯性負(fù)TRPC3通道(TRPC3DN)的完整M^列(突變氨基酸為粗體)；SEQIDNO:4顯示TRPC3^的完整核苷酸序列(突變核苷酸為粗體);SEQIDNO:5顯示TRPC6的^J^^列；SEQIDNO:6顯示編碼TRPC6的核苷酸序列；SEQIDNO:7顯示顯性負(fù)TRPC6通道(TRPC6DN)的完整M^列(突變絲酸為粗體)；SEQIDNO:8顯示TRPC6DN的完整核苷酸序列(突變核苷酸為粗體)；SEQIDNO:9顯示TRPC7的^J^^^列；SEQIDNO:10顯示編碼TRPC7的核苷酸序列；SEQIDNO:11顯示顯性負(fù)TRPC7通道(TRPC7DN)的完整氨基酸序列(突變氛基酸為粗體)；SEQIDNO:12顯示TRPC7DN的完整核苷酸序列(突變核苷酸為粗體)。實(shí)施例1.TRPC3DN的構(gòu)建和功能特性為了在體外和體內(nèi)研究TRPC通道的功能，我們使用顯性負(fù)通道突變體來調(diào)節(jié)天然TRPC通道的活性。之前已經(jīng)證明了該方法對(duì)于TRPC通道的可用性(Hofmann等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)，99，7461-7466)。我們通過定位誘變將野生型人TRPC3(NP_003296)的M酸621-623改變?yōu)楸彼醽懋a(chǎn)生顯性負(fù)TRPC3通道(TRPC3DN)。使用gateway沖支術(shù)(Invitrogen，Karlsruhe,德國(guó))將插入片段克隆進(jìn)4務(wù)飾的pcDNA3栽體骨架上。在該研究中使用表達(dá)毒萆堿性Mr受體的HEK293林系(HM1細(xì)胞)(Peralta等人(1988)Nature,334，434-437)。在5.5%(:02中，在補(bǔ)充了10%胎牛血清、2mM谷氨跣胺、100U/ml青霉素、100|ig/ml鏈霉素(Invitrogen,Karlsruhe,德國(guó))的DMEM/F12(1:1)中37匸培養(yǎng)細(xì)胞。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入G418(0.5mg/ml)。使用LipofectAMINE2000(Invitrogen,Karlsruhe,德國(guó))按照生產(chǎn)商的說明轉(zhuǎn)染hTRPC3(U47050)、hTRPC6(AF080394)、TRPC3DN和eGFP(pEGFP誦Nl，BDBiosciences,PaloAlto，CA)或YFP標(biāo){己形式的通道蛋白的cDNA。對(duì)于電生理實(shí)驗(yàn)，在35mm皿中用指定量的cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)轉(zhuǎn)移到蓋玻片上。轉(zhuǎn)移后24-48小時(shí)使用細(xì)胞。如果沒有另行說明，則共轉(zhuǎn)染0.4將eGFP作為膜片鉗實(shí)驗(yàn)的表達(dá)標(biāo)記物。室溫下4吏用HEKAEPC10膜片鉗放大器和PULSE軟件(HEKA，Lambrecht，德國(guó))記錄來自熒光細(xì)胞的全細(xì)胞電流。由硼硅玻璃拉出在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外緩沖液中電阻為2-5MQ的膜片移液管。保持電位設(shè)置為-70mV，以6.6kHz采集從-100至+60mV的160ms電壓斜線上升的電流。在2kHz濾過所有記錄。標(biāo)準(zhǔn)外部緩沖液^^有(以mM計(jì))NaCl140、KCI5.4、CaCl22、MgCl2l、葡萄糖IO、HEPESIO,用NaOH將pH調(diào)整為7.4。標(biāo)準(zhǔn)移液緩沖液含有(以mM計(jì))CsOH120、葡糖酸120、MgCl22、CaCl23、Cs4-BAPTA5、HEPES10，用葡糖酸將pH調(diào)整為7.3。游離[Ca2+使用CaBuf程序(GDroogmans，KULeuven)計(jì)算為200nM。通過使用10jiM氨甲酰M在HM1細(xì)胞中引發(fā)受體激活的電流。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均表達(dá)為均值±SEM。使用SigmaStat(SPSS,Chicago,IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)合并結(jié)果并分析。顯著性水平設(shè)置為p<0.05。1.1TRPC3Dw不摘t運(yùn)功能性離子流。為了確定TRPC3卵發(fā)揮負(fù)TRPC通道調(diào)節(jié)劑的作用，通過全細(xì)胞膜片鉗研究通道突變體的功能特性。圖1A和1B顯示了來自轉(zhuǎn)染了3ngTRPC3或TRPC3DN的HMl細(xì)胞的代表性電流記錄。通過乙酰膽堿受體激動(dòng)劑氨甲酰膽堿(10jiM)引發(fā)TRPC電流。在之前(con)和氨甲酰M存在下(carb)記錄電流。平均而言，表達(dá)TRPC3DN的細(xì)胞的電流密度(1.3pA/pF，n=11)與轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照的LacZ的細(xì)胞(1.2pA/pF，n=10)沒有差異。與圖1A和圖1B顯示的記錄一致，轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照的TRPC3的細(xì)胞顯示明著更高的電流密度(11.2pA/pF，n=11;p<0.001)。因此，TRPC3dn不搬逸明顯的離子電流。之前的研究提示TRPC3與其自身以及TRPC6和TRPC7直接相互作用(Hofmann等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)，99，7461-7466)。因此，通過與野生型TRPC3和TRPC6通道一起共表達(dá)來測(cè)試TRPC3DN的調(diào)節(jié)效應(yīng)。1.2TRPC3卵對(duì)TRPC3和TRPC6的顯性負(fù)效應(yīng)根據(jù)圖2A，用7jigTRPC3-YFP和7嗎LacZ(作為對(duì)照，空心柱)或7嗎TRPC3DN(灰色柱)共轉(zhuǎn)染HM1細(xì)胞。根據(jù)圖2B，如圖2A用7嗎TRPC6-YFP和LacZ或TRPC3DN共轉(zhuǎn)染HM1細(xì)胞。在-70mV測(cè)量氨甲跣M誘導(dǎo)的電流，歸一化為細(xì)胞容量.TRPC3DN顯著(*"p<0.001)抑制通過TRPC3和TRPC6的電流。2.TRPC3DN的體內(nèi)抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)如圖2A和圖2B所示，TRPC3^對(duì)TRPC3和TRPC6通道賦予顯性負(fù)影響.基于序列同源性和之前的報(bào)道(Hofmann等人(2002)，見上文)，可以推測(cè)同源TRPC7通道也被TRPC3DN抑制。為了研究TRPC3DN表達(dá)以及因此TRPC3、TRPC6和TRPC7對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制，使用病毒基因?qū)RPC3DN轉(zhuǎn)移至動(dòng)脈粥樣硬化兔的血管。用帶有TRPC3卵或作為對(duì)照的eGFP的病毒感染頸動(dòng)脈。基因轉(zhuǎn)移后8周，通過功能和組織學(xué)M評(píng)估疾病狀態(tài)。2.1病毒產(chǎn)生和動(dòng)物研究大自產(chǎn)生、擴(kuò)增并純化編碼TRPC3顯性負(fù)突變體的腺病毒。其后通過DNA測(cè)序(Medigenomix,Martinsried，德國(guó))檢查序列的正確性并通過Western印跡確認(rèn)蛋白質(zhì)的特異性表達(dá)，用含有1%膽固醇+5%玉米油的食物喂養(yǎng)20周齡的白色新西蘭兔。喂養(yǎng)一周后，通過基于導(dǎo)管的病毒基因轉(zhuǎn)移(見下文)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)全程中繼續(xù)膽固醇喂養(yǎng)。每組至少獨(dú)立研究8只動(dòng)物。在開始喂養(yǎng)前、剛好在基因轉(zhuǎn)移前和基因轉(zhuǎn)移2、4和8周后評(píng)估血清膽固醇水平。在專門進(jìn)行獸醫(yī)血清測(cè)量的有效實(shí)驗(yàn)室(Synlab，Augsburg，德國(guó))中進(jìn)行測(cè)量。還^^用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定LDL和HDL亞級(jí)分。在測(cè)量的所有時(shí)間點(diǎn)(每組n-8)上對(duì)照與接受TRPC3DN的動(dòng)物相比，血清膽固醇、LDL或HDL膽固醇均未觀察到顯著差異(p>0.05)。2.2將內(nèi)皮基因轉(zhuǎn)移至頸動(dòng)脈為了將基因轉(zhuǎn)移至頸動(dòng)脈，產(chǎn)生頸部正中切口并暴露左側(cè)總動(dòng)脈。用兩個(gè)小無創(chuàng)夾(BIEMER血管夾，F(xiàn)D561R)分離4cm的區(qū)段。通過小針(0.4x20)將約0.2mlTRPC3dn或eGFP病毒溶液(效價(jià)101。pfu)注射進(jìn)分離的區(qū)段。孵育時(shí)間為20分鐘。接著去除夾子并恢復(fù)血液循環(huán)?？p合頸部創(chuàng)口并使動(dòng)物復(fù)元。兔在手術(shù)后72小時(shí)鎮(zhèn)痛(Temgesic,定丙諾啡，每12小時(shí)皮下注射0.01mg/kg)。2.3測(cè)量?jī)?nèi)皮血管反應(yīng)性在實(shí)驗(yàn)的最后，基因轉(zhuǎn)移8周后，通過頸動(dòng)脈的高分辨力超聲波測(cè)定基礎(chǔ)血管;|*和乙酰M誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了TRPC3DN(陰影柱)或eGFP(空心柱)的動(dòng)脈粥樣硬化兔(圖3)以及使泉(非動(dòng)脈粥樣硬化)兔(實(shí)心柱)的頸動(dòng)脈區(qū)段上進(jìn)行腔管直徑的體內(nèi)測(cè)量。在注射給定劑量的乙跣膽堿之后每分鐘測(cè)量4次乙酖M誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性。與表達(dá)eGFP的區(qū)段相比，TRPC3卵表達(dá)顯著提高了乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性(***p<0.001)。與健康對(duì)照相比，在表達(dá)eGFP的區(qū)段中觀察到血管反應(yīng)性的降低(#p<0.01)。在第二種實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，測(cè)試了應(yīng)答于施用氯化鈉溶液的流動(dòng)誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性(圖4)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了TRPC3DN(陰影柱)或eGFP(空心柱)的動(dòng)脈粥樣多更化兔以及健康(非動(dòng)脈粥樣硬化)兔(實(shí)心柱)中測(cè)量頸動(dòng)脈區(qū)段的腔管直徑，在施用100ml氯化鈉的過程中(應(yīng)用5分鐘)測(cè)試流動(dòng)誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性。顯示了注入80ml后和應(yīng)用總體積1-2分鐘后進(jìn)行的測(cè)量。與表達(dá)eGFP的區(qū)段相比，TRPC3DN表達(dá)顯著提高了流動(dòng)誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性(**p<0.01)。2.4測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化的組織學(xué)標(biāo)記物為了在組織學(xué)上評(píng)估疾病^A，用肝素注射動(dòng)物并處死。在會(huì)厭遠(yuǎn)側(cè)從胸骨剪下約lcm的頸動(dòng)脈。用鹽水沖洗血管，小心干燥并急凍。從中央?yún)^(qū)域剪下一片動(dòng)脈用于研究GFP表達(dá)、HE和vanGieson染色以及免疫組織化學(xué)。余下的動(dòng)脈用于Sudanmacrostaining以檢測(cè)液體斑。就該目的而言，在用鹽水灌洗血管2分鐘并在中間縱向切開之后直接誘導(dǎo)蘇丹紅染色。其后將血管轉(zhuǎn)移至蘇丹染色液(溶于乙醇和丙酮的蘇丹III)。通過蘇丹紅染色測(cè)定相對(duì)斑大小，其后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)TRPC3dn或eGFP的頸動(dòng)脈區(qū)段的組織造影分析(圖5)。評(píng)估(在左側(cè)動(dòng)脈)接受TRPC3DN的兔的右側(cè)頸動(dòng)^c作為未處理對(duì)照。與eGFP(**p<0.01)和未處理(*p<0.05)對(duì)照相比，TRPC3DN降低了斑的大小。作為動(dòng)脈粥樣硬化iL艮的另一標(biāo)志物，通過免疫細(xì)胞化學(xué)研究血管內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞滲入.對(duì)于組織染色，從通過除去脂肪制備的所有血管的中間切下6pm的切片。室溫下用丙酮固定切片IO分鐘并風(fēng)干。接著用100%甲醇中0.6%的11202進(jìn)行透化5分鐘，用PBS洗滌三次并與20%兔血清一起孵育。接著在20X:將切片與抗巨噬細(xì)胞單克隆抗體(1:100，克隆RAM-ll，DAKO，Hamburg,德國(guó))孵育20-30分鐘并用PBS洗滌三次。接著在20匸將其與適當(dāng)?shù)纳锼貥?biāo)記的第二抗體孵育30分鐘，再用PBS洗滌三次，其后將切片與ABC試劑孵育30分鐘、用PBS洗滌并用二M聯(lián)苯胺和11202染色I(xiàn)O分鐘。其后用Harris/蘇木精/伊紅進(jìn)行復(fù)染。通過標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)程序在高倍放大(一般為600倍)下直接計(jì)數(shù)每個(gè)切片中血管內(nèi)膜的單個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)來進(jìn)行分析(圖6)。通過在表達(dá)TRPC3卵或eGFP的頸動(dòng)脈內(nèi)膜層的免疫細(xì)胞化學(xué)來鑒定巨噬細(xì)胞，與表達(dá)eGFP的血管相比，TRPC3DN引起巨噬細(xì)胞滲入的顯著降低(*p<0.05)。3.高通量鑒定TRPC3、TRPC6和TRPC7調(diào)節(jié)劑的測(cè)定法為了開發(fā)鑒定TRPC通道調(diào)節(jié)劑的測(cè)定法，使用Flp-InT-Rex系統(tǒng)(Invitrogen，Karsruhe，德國(guó))產(chǎn)生在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)TRPC3(登錄號(hào)U47050)或TRPC6(登錄號(hào)AF080394)cDNA的重組HEK293細(xì)胞系。通過標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)擴(kuò)增通道cDNA并克隆進(jìn)pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen，Karlsruhe,德國(guó))。用通道構(gòu)建體轉(zhuǎn)染Flp-InT-Rex293細(xì)胞之后，用潮霉素選擇穩(wěn)定細(xì)胞系。按照生產(chǎn)商的說明維持細(xì)胞并加入1將/ml強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)通il^達(dá)20-30小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)前20-30小時(shí)以40000-50000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞鋪在用多聚d-賴氨酸包被的96孔黑壁透明底微量滴定板(BDBiosciences,Bedford,MA)上。接著在室溫下洗滌細(xì)胞并在含有l(wèi)xHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES、0.02%普流尼克F-127(MolecularProbes)和0.05V。牛血清白蛋白(pH=7.4)的緩沖液中加入2nMfluo4am(MolecularProbes,Eugene,OR)30-45分鐘。去除加樣緩沖液并在室溫下將細(xì)胞與測(cè)試化合物孵育10分鐘。使用96孔熒光成像讀板儀(FLIPR)(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)進(jìn)行Ca2+測(cè)量。為了刺激通過TRPC3或TRPC6的Ca2+內(nèi)向通量，我們以30-50的終濃度使用通道激活劑l-油基-2-乙?；?sn-甘油(OAG)(Hofmann等，1999)。將OAG溶于含有l(wèi)xHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES、0.02%普流尼克F-127(MolecularProbes)(pH=7.4)的緩沖液中并加入細(xì)胞?；蛘呖梢詫AG溶于含有l(wèi)xHBSS(#14065-049，Invitrogen)、1mMCaCl2、20mMHEPES和0.1%牛血清白蛋白(pH=7.4)的緩沖液中。圖7A和7B顯示僅在強(qiáng)力霉素處理的細(xì)胞中觀察到對(duì)OAG的應(yīng)答，而在未誘導(dǎo)細(xì)胞中則沒有。因此，該結(jié)果證明OAG激活的Ca"信號(hào)分別通過TRPC3或TRPC6特異性介導(dǎo)，使用FLIPRII測(cè)量^^fluo-4的細(xì)胞的熒光變化。條帶代表應(yīng)用50HMOAG。顯示的是各來自9個(gè)孔的平均熒光值±SEM。熒光值對(duì)平均基線熒光(FJ進(jìn)行歸一化。為了用上述測(cè)定法鑒定TRPC3或TRPC6的調(diào)節(jié)劑，使用誘導(dǎo)細(xì)胞并在應(yīng)用OAG之前或之后將測(cè)試化合物加入孔中。抑制劑的預(yù)期效應(yīng)將是熒光增加的降低。通道激活劑將引起OAG激發(fā)的信號(hào)的進(jìn)一步增加或誘導(dǎo)OAG依賴性熒光增加.SKF96365(l-(j5-[3-(4-甲緣苯基)丙Hij國(guó)4國(guó)曱氧基苯乙基)-lH-咪唑-HCl)已被描述為非選擇性陽離子通道(包括TRPC3和TRPC6)的抑制劑(Boulay等人(1997)，J.Biol.Chem.，272，29672-29680;Zhu等人(1998)，J.Biol.Chem.，273，133-142)。如圖8A和8B所示，SKF96365在表達(dá)TRPC3的細(xì)胞中抑制OAG激活的熒光應(yīng)答，ICS0為1.8±0.12jiM(n=8)，在表達(dá)TRPC6的細(xì)胞中IQo為5.04±0.17jiM(n=8)。因此，給定的實(shí)施例證明了該測(cè)定法鑒定TRPC3和TRPC6調(diào)節(jié)劑的能力。在給定濃度的SKF96365存在下，測(cè)量表達(dá)TRPC3和TRPC6的細(xì)胞中30pMOAG誘導(dǎo)的熒光變化。顯示的是平均抑制值士SEM。抑制表示為SKF96365不存在的對(duì)照熒光的百分比。將劑量應(yīng)答曲線與通用劑量應(yīng)答方程擬合。Spline曲線*與復(fù)合數(shù)據(jù)的最佳擬合。作為TRPC3和TRPC6通道激活的備選模式，使用蛋白酶激活的受體激動(dòng)劑胰蛋白酶(200nM)誘導(dǎo)Flp-InT-REx-TRPC3和Flp-InT-REx-TRPC6細(xì)胞。該處理示例了使用Gq偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑刺激TRPC3或TRPC6。與未誘導(dǎo)的對(duì)照相比，在應(yīng)用后t-60秒胰蛋白酶在受誘導(dǎo)的Flp-InT-REx-TRPC3和Flp-InT-REx-TRPC6細(xì)胞中誘導(dǎo)顯著更強(qiáng)的熒光增加(表l)。因此，Gq偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑如胰蛋白酶也可用于刺激TRPC3和TRPC6應(yīng)答的測(cè)定法。表1:經(jīng)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的Flp-InT-REx-TRPC3和Flp畫InT-REx-TRPC6細(xì)胞中應(yīng)答于200nM胰蛋白酶的熒光變化(F/Fo)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>數(shù)值以平均值土SEM給出。經(jīng)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)組顯著不同(p<0.001，t檢驗(yàn))。SEC2工DNO:1megspslrrmtvmrekgrrqavrgpafmfndrgts;ltaeeerfldaaeygn工pvvrkmleesktlnvncvdymgqnalqlavgnehlevtelllkkenlar工gdallla工skgyvr工vea工lnhpgfaaskrltlspceqelqdddfvaydedgtrfspditpiil^ahcqkyewhmllmkgarierphdyfckcgdcmekqrhdsfshsrsr工naykglaspaylsiissedpvltale;lsnelakl認(rèn)工ekejkndyrklsmqckdfwgvldlcrdseevea工lngmiesaeplevhrhkaslsrvkla工kyevkkfvahpncqqqklt工wyenlsglreqt工a工kclwlwalglpfla工gyw工apcsriigkilrspfmkfvahaasfiiflgijlvfnasdrfegittijpltitvtdypkqifrvkttqbtwtemlimvwviigmMWSECKELWIjEGPREYIIiQIjWNVLDFGMLSIF工AAFTARFLAFLQATKAQQYVDSYVQESDLSEVTIiPPE工QYFTYARDKWI1PSDPQ工工SEGL1YAIAVVI1SFSRIAYILPANESFGPI1G工SLGRTVKD工FKFMVLFIMVFFAFM工GMF工ljYSYY:LGAKVNAAFTTVEESFKTIjFWS工FdHiSEVTSWLKYDHKFIEN工GYVLYGIYNVTMWVLiLNML!工AM工NSSYQE工EDDSDVEWKFARSKIiWLSYFDDGKT;LPPPFSLVPSPKSFVYF工MR工WFPKCRRRRLQKD工EMGMGNSKSRLNLFTQSNSRVFESHSFNS工LNQPTRYQQ工MKRLIKRYVLKAQVDKENDEVNEGELKEIKQD工SSLRYELLEDKSQATEELAIL工hklseklnpsmlrceSEQ工DNO:2ATGGAGGGAAGCCCATCCCTGAGACGCATGACAGTGATGCGGGAGAAGGGCCGGCGCCAGGCTGTCAGGGGCCCGGCCTTCATGTTCAATGACCGCGGCACCAGCCTCACCGCCGAGGAGGAGCGCTTCCTCGACGCCGCCGAGTACGGCAACATCCCAGTGGTGCGCAAGATGCTGGAGGAGTCCAAGACGCTGAACGTCAACTGCGTGGACTACATGGGCCAGAACGCGCTGCAGCTGGCTGTGGGCAACGAGCACCTGGAGGTGACCGAGCTGCTGCTCAAGAAGGAGAACCTGGCGCGCATTGGCGACGCCCTGCTGCTCGCCATCAGCAAGGGCTACGTGCGCATTGTAGAGGCCATCCTCAACCACCCTGGCTTCGCGGCCAGCAAGCGTCTCACTCTGAGCCCCTGTGAGCAGGAGCTGCAGGACGACGACTTCTACGCTTACGATGAGGACGGCACGCGCTTCTCGCCGGACATCACCCCCATCATCCTGGCGGCGCACTGCCAGAAATACGAAGTGGTGCACATGCTGCTGATGAAGGGTGCCAGGATCGAGCGGCCGCACGACTATTTCTGCAAGTGCGGGGACTGCATGGAGAAGCAGAGGCACGACTCCTTCAGCCACTCACGCTCGAGGATCAATGCCTACAAGGGGCTGGCCAGCCCGGCTTACCTCTCATTGTCCAGCGAGGACCCGGTGCTTACGGCCCTAGAGCTCAGCAACGAGCTGGCCAAGCTGGCCAACATAGAGAAGGAGTTCAAGAATGACTATCGGAAGCTCTCCATGCAATGCAAAGACTTTGTAGTGGGTGTGCTGGATCTCTGCCGAGACTCAGAAGAGGTAGAAGCCATTCTGAATGGAGATCTGGAATCAGCAGAGCCTCTGGAGGTACACAGGCACAAAGCTTCATTAAGTCGTGTCAAACTTGCCATTAAGTATGAAGTCAAAAAGTTTGTGGCTCATCCCAACTGCCAGCAGCAGCTCTTGACGATCTGGTATGAGAACCTCTCAGGCCTAAGGGAGCAGACCATAGCTATCAAGTGTCTCGTTGTGCTGGTCGTGGCCCTGGGCCTTCCATTCCTGGCCATTGGCTACTGGATCGCACCTTGCAGCAGGCTGGGGAAAATTCTGCGAAGCCCTTTTATGAAGTTTGTAGCACATGCAGCTTCTTTCATCATCTTCCTGGGTCTGCTTGTGTTCAATGCCTCAGACAGGTTCGAAGGCATCACCACGCTGCCCAATATCACAGTTACTGACTATCCCAAACAGATCTTCAGGGTGAAAACCACCCAGTTTACATGGACTGAAATGCTAATTATGGTCTGGGTTCTTGGAATGATGTGGTCTGAATGTAAAGAGCTCTGGCTGGAAGGACCTAGGGAATACATTTTGCAGTTGTGGAATGTGCTTGACTTTGGGATGCTGTCCATCTTCATTGCTGCTTTCACAGCCAGATTCCTAGCTTTCCTTCAGGCAACGAAGGCACAACAGTATGTGGACAGTTACGTCCAAQAGAGTGACCTCAGTGAAGTGACACTCCCACCAGAGATACAGTATTTCACTTATGCTAGAGATAAATGGCTCCCTTCTGACCCTCAGATTATATCTGAAGGCCTTTATGCCATAGCTGTTGTGCTCAGCTTCTCTCGGATTGCGTACATCCTCCCTGCAAATGAGAGCTTTGGCCCCCTGCAGATCTCTCTTGGAAGGACTGTAAAGGACATATTCAAGTTCATGGTCCTCTTTATTATGGTGTTTTTTGCCTTTATGATTGGCATGTTCATACTTTATTCTTACTACCTTGGGGCTAAAGTTAATGCTGCTTTTACCACTGTAGAAGAAAGTTTCAAgactttattttggtcaatatttgggttgtctgaagtgacttccgttgtgctcaaatatgatcacaaattcatagaaaatattggatacgttctttatggaat^tacaatgtaactatggtggtcgttttactcaacatgctaattgctatgattaatagctcatat'caagaaattgaggatgacagtgatgtagaatggaagtttgctcgttcaaaactttggttatcctattttgatgatggaaaaacattacctccacctttcagtctagttcctagtccaaaatcatttgtttatttcatcatgcgaattgttaactttcccaaatgcagaaggagaagacttcagaaggatatagaaatgggaatgggtaactcaaagtccaggttaaacctcttcactcagtctaactcaagagtttttgaatcacacagttttaacagcattctcaatcagccaacacgttatcagcagataatgaaaagacttataaagcggtatgttttgaaagcacaagtagacaaagaaaatgatgaagttaatgaaggtgaattaaaagaaatcaagcaagatatctccagccttcgttatgaacttttggaagacaagagccaagcaactgaggaattagccattctaattcataaacttagtgagaaactgaatcccagcatgctgagatgtgaatgaseqidno:3megspslrrmtvmrekgrrqavrgpafmpndrgts:ltaeeerfldaaeygn工pvvrkmleeskt:lnvncvdymgqnalqlavgneh:levtelllkkenlar工:gdal:lla工skgyvrivea工lnhpgfaaskrltlspceqelqdddfyaydedgtrfspd工tp工工laahcqkyewhmllmkgar工erphdyfckcgdcmekqrhdsfshsrsr工naykglaspaylslssedpvltalelsnelaklan工ekefkndyrklsmqckdfwgvldlcrdseevea工lngdlesaeplevhrhkaslsrvklaikyevkkfvahpncqqqllt工wyenlsglreqt工a工kclwlwalglpfla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ATGTTGAGGAACAGCACCTTCAAAAACATGCAGCGCCGGCACACAACGCTGAGGGAGAAGGGCCGTCGCCAGGCCATCCGGGGTCCCGCCTACATGTTCAACGAGAAGGGCACCAGTCTGACGCCCGAGGAGGAGCGCTTCCTGGACTCGGCTGAGTATGGCAACATCCCGGTGGTCCGGAAAATGCTGGAGGAGTCCAAGACCCTTAACTTCAACTGTGTGGACTACATGGGGCAGAACGCTCTGCAGCTGGCCGTGGGCAACGAGCACCTAGAGGTCACGGAGCTGCTGCTGAAGAAGGAGAACCTGGCACGGGTGGGGGACGCGCTGCTGCTGGCCATCAGCAAGGGCTATGTGCGCATCGTGQAGGCCATCCTCAACCACCCGGCCTTCGCGCAGGGCCAGCGCCTGACGCTCAGCCCGCTGGAACAGGAGCTGCGCGACGACGACTTCTATGCCTACGACGAGGACGGCACGCGCTTCTCCCACGACATCACGCCCATCATCCTGGCGGCGCACTGCCAGGAGTATGAGATCGTGCACATCCTGCTGCTCAAGGGCGCCCGCATCGAGCGGCCCCACGACTACTTCTGCAAGTGCAATGAGTGCACCGAGAAACAGCGGAAAGACTCCTTCAGCCACTCGCGCTCGCGCATGAACGCCTACAAAGGACTGGCGAGTGCTGCCTACTTGTCCCTGTCCAGCGAAGACCCTGTCCTCACCGCCCTGGAGCTCAGCAACGAGTTAGCCAGACTAGCCAACATTGAGACTGAATTTAAGAACGATTACAGGAAGTTATCTATGCAATGCAAGGATTTTGTAGTGGGCGTGCTGGACCTGTGCCGAGACACAGAAGAGGTGGAAGCAATTTTAAACGGTGATGTGAACTTCCAAGTCTGGTCCGACCACCACCGTCCAAGTCTGAGCCGGATCAAACTCGCCATTAAATATGAAGTCAAGAAGTTCGTTGCTCATCCTAACTGTCAGCAGCAATTGCTTACCATGTGGTATGAAAATCTCTCAGGCTTACGTCAACAGTCTATCGCTGTGAAATTCCTGGCTGTCTTTGGAGTCTCCATAGGCCTCCCTTTTCTCGCCATAGCCTATTGGATTGCTCCGTGCAGCAAGCTAGGACGAACCCTGAGGAGCCCTTTCATGAAGTTTGTAGCTCATGCAGTTTCTTTTACAATCTTCTTGGGATTATTAGTTGTGAATGCATCTGACCGATTTGAAGGTGTTAAAACCCTGCCAAACGAAACCTTCACAGACTACCCAAAACAAATCTTCAGAGTGAAAACCACACAGTTCTCCTGGACAGAAATGCTCATTATGAAGTGGGTCTTAGGAATGATTTGGTCCGAATGCAAGGAAATCTGGGAGGAGGGGCCACGGGAGTACGTGCTGCACTTGTGGAACCTGCTAGATTTCGGGATGCTGTCCATCTTCGTGGCCTCCTTCACAGCACGCTTCATGGCCTTCCTGAAGGCCACGGAGGCACAGCTGTACGTGGACCAGCACGTGCAGGACGACACGCTGCACAATGTCTCGCTTCCGCCGGAAGTGGCATACTTCACCTACGCCAGGGACAAGTGGTGGCCTTCAGACCCTCAGATCATATCGGAAGGGCTCTACGCGATAGCCGTCGTGCTGAGCTTCTCTCGCATTGCATACATTCTGCCAGCCAACGAGAGTTTTGGGCCCCTGCAGATCTCGCTAGGGAGAACTGTGAAAGATATCTTCAAGTTCATGGTCATTTTCATCATGOTATTTGTGGCCTTCATGATTGGGATGTTCAACCTGTACTCTTACTACCGAGGTGCCAAATACAACCCAGCGTTTACAACGGTTGAAGAAAGTTTTAAAACTGCGGCTGCGTCCATATTCGGCTTATCTGAAGTAATCTCAGTGGTGCTGAAATACGACCACAAATTCATCGAGAACATTGGCTACGTTCTCTACGGCGTTTATAACGTCACCATGGTGGTAGTGTTGCTCAACATGCTAATAGCCATGATAAACAAClrCCTATCAGGAAATTGAGGAGQATGCAGATGTGGAATGGAAGTTCGCCCGAGCAAAACTCTGGCTGTCTTACTTTGATGA^GGAAGAACTCTACCTGCTCCTTTTAATCTAGTGCCAAGTCCTAAATCATTTTATTATCTCATAATGAGAATCAAGATGTGCCTCATAAAACTCTGCAAATCTAAGGCCAAAAGCTGTGAAAATGACCTTGAAATGGGCATGCTGAATTCCAAATTCAAC3AAGACTCGCTACCAGGCTGGCATGAGGAATTCTGAAAATCTGACAGCAAATAACACTTTGAGCAAGCCCACCAGATACCAGAAAATCATGAAACGGCTCATAAAAAGATACGTCCTGAAAGCCCAGGTGGACAGAGAAAATGACGAAGTCAATGAAGGCGAGCTGAAGGAAATCAAGCAAGATATCTCCAGCCTGCGCTATGAGCTTCTTGAGGAAAAATCTCAAGCTACTGGTGAGCTGGCAGACCTGATTCAACAACTCAGCGAGAAGTTTGGAAAGAACTTAAACAAAGACCACCTGAGGGTGAACAAGGGCAAAGACATTTAG權(quán)利要求1.TRPC通道、其失活突變體，或者編碼所述TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列的用途，其用于制備治療心血管疾病的藥物。2.才艮據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述TRPC通道選自TRPC3通道、TRPC6通道和/或TRPC7通道。3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中TRPC3的M酸序列為M酸序列SEQIDNO:2，TRPC6的^J^,列為^J^^列SEQIDNO:5,TRPC7的^J^^列為4^,列SEQIDNO:9。4.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述失活突變體為具有氨基酸序列SEQIDNO:3的TRPC3DN、具有^J^斷列SEQIDNO:7的TRPC6DN或具有#^酸序列SEQIDNO:11的TRPC7DN。5.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中編碼TRPC3的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:2、編碼TRPC6的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:6且編碼TRPC7的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:10。6.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中編碼TRPC3DN的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:4、編碼TRPC6DN的核普酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:8且編碼TRPC7DN的核苷酸序列為核普酸序列SEQIDNO:12,7.TRPC通道、其失活突變體，或者編碼所述TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列的用途，其用于發(fā)現(xiàn)作為治療心血管疾病的藥物的TRPC通道調(diào)節(jié)劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述TRPC通道選自TRPC3通道、TRPC6通道和/或TRPC7通道。9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中TRPC3的^^,列為^J^^列SEQIDNO:1，TRPC6的^J^^列為^J^,列SEQIDNO:5，TRPC7的^J^^列為^J^^列SEQIDNO:9。10.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述失活突變體為具有M^列SEQIDNO:3的TRPC3DN、具有^J^酸序列SEQIDNO:7的TRPC6DN或具有^^酸序列SEQIDNO:11的TRPC7DN。11.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中編碼TRPC3的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:2、編碼TRPC6的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:6且編碼TRPC7的核香酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:10。12.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中編碼TRPC3DN的核苷酸序列為核苷斷列SEQIDNO:4、編碼TRPC6DN的核苷,列為核苷,列SEQIDNO:8且編碼TRPC7DN的核苷酸序列為核苷酸序列SEQIDNO:12。13.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的用途，其中使所述TRPC通道、其失活突變體，或者編碼所述TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列接觸測(cè)試化合物，并測(cè)量或檢測(cè)所述測(cè)試化合物對(duì)所述TRPC通道、其失活突變體，或者編碼所述TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列的影響。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的用途，其中所述心血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化。15.篩選TRPC通道、其失活突變體，或者編碼所述TRPC通道或失活突變體的的核苷酸序列的調(diào)節(jié)劑的方法，其中所述方法包含以下步驟(a)接觸表達(dá)TRPC或其失活突變體的細(xì)胞，(b)在所述細(xì)胞接觸測(cè)試化合物之前、同時(shí)或之后通過通道激活劑刺激Ca"內(nèi)向通量，以及(c)測(cè)量或檢測(cè)TRPC通道活性的改變。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟(d)通過比較缺乏所述測(cè)試化合物時(shí)TRPC通道活性的改變來選擇具有針對(duì)心血管疾病活性的測(cè)試化合物.17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中所述TRPC通道或其失活突變體在細(xì)胞中的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制.18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞為熒光細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、Swiss3T3或CHO細(xì)胞。21.根據(jù)權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的方法，其中通過測(cè)量或檢測(cè)離子通量，特別是Ca"通量來測(cè)量或檢測(cè)TRPC通道活性，其中優(yōu)選通過膜片鉗技術(shù)、全細(xì)胞電流、放射性標(biāo)記離子通量或特別是使用電壓敏感性染料或離子敏感性染料通過熒光進(jìn)行所述測(cè)量或檢測(cè)。22.根據(jù)權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述通道激活劑為選自以下的化合物二?；视?，特別是l-油基-2乙B5^-sn-甘油(OAG)、Gq偶聯(lián)的受體激動(dòng)劑，特別是去氧腎上腺素，尤其;U4蛋白酶、刺激受體酪氨酸激酶的激動(dòng)劑，特別是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或者產(chǎn)生二酰基甘油的酶，特別^1磷脂酶或其激活劑。23.根據(jù)權(quán)利要求15-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述TRPC選自TRPC3、TRPC6、TRPC7或其失活突變體。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述失活突變體為具有M^列SEQIDNO:3的TRPC3dn、具有^J^酸序列SEQIDNO:7的TRPC6DN或具有M酸序列SEQIDNO:11的TRPC7DN。25.根據(jù)權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的方法，其中以化合物文庫(kù)的形式提供所述測(cè)試化合物。26.根據(jù)權(quán)利要求15-25中任一項(xiàng)的方法，其中在陣列上進(jìn)行所述方法，27.根據(jù)權(quán)利要求15-26中任一項(xiàng)的方法，其中在機(jī)器人系統(tǒng)上進(jìn)行所述方法。28.根據(jù)權(quán)利要求15-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法為所述測(cè)試化合物的高通量篩選方法。29.根據(jù)權(quán)利要求15-28中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)的測(cè)試化合物為抑制劑。30.根據(jù)權(quán)利要求15-29中任一項(xiàng)的方法，其中將所述細(xì)胞接種在多孔測(cè)試平板的孔中。31.制備用于治療心血管疾病的藥物的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求15_30中任一項(xiàng)的方法，(b)分離檢測(cè)到的適于治療心血管疾病的測(cè)試化合物，以及(c)配制檢測(cè)到的測(cè)試化合物與一種或多種可藥用栽體或輔助物質(zhì)。32.根據(jù)權(quán)利要求15-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述心血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化。全文摘要本發(fā)明涉及TRPC通道、其失活突變體，或者編碼該TRPC通道或失活突變體的核苷酸序列用于制備治療心血管疾病的藥物的用途，以及篩選TRPC通道或其失活突變體的調(diào)節(jié)劑的方法。文檔編號(hào)G01N33/50GK101098709SQ200580046521公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2005年12月23日優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日發(fā)明者C·斯特魯冰申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬特股份有限公司