專利名稱：膽固醇測定的制作方法
膽固醇測定
本發(fā)明涉及區(qū)別樣品混合物中不同類別脂質(zhì)分子的測定系統(tǒng)。特別 是，本發(fā)明涉及確定血漿或血清中膽固醇濃度的方法。本發(fā)明還涉及實(shí)施 所述方法所用的裝置。
脂質(zhì)是活生物體中存在的有機(jī)化合物的一個(gè)多樣組。它們在水中是不 溶的，但是可溶于有機(jī)溶劑。將脂質(zhì)廣泛分類成兩個(gè)類別(i)復(fù)雜脂質(zhì)； 和(ii)簡單脂質(zhì)。復(fù)雜脂質(zhì)是長鏈脂肪酸的酯并且包括甘油酯類、糖脂類、 磷脂類、膽固醇酯類和蠟。不含有脂肪酸的簡單脂質(zhì)包括類固醇類(例如， 膽固醇)和萜類。
脂質(zhì)可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，其為這樣的形成，即其中脂質(zhì)， 諸如膽固醇和甘油三酯在血液和淋巴中輸送。為了簡短，在這里使用術(shù)語 "血清"，但是涉及"血清"應(yīng)當(dāng)解釋為涉及血清或血漿。在血漿中發(fā)現(xiàn) 的脂蛋白屬于三個(gè)主要分類(i)高密度脂蛋白(HDL)， (ii)低密度脂蛋白
(LDL)，和(iii)非常低密度的脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)。
膽固醇在血流中主要以LDLs形式輸送，并且利用肝中的LDL受體從 血液除去。將含有膽固醇的LDLs結(jié)合到LDL受體，然后將其攝入細(xì)胞。 作為遺傳缺陷發(fā)生在一些個(gè)體中的LDL受體缺乏，被認(rèn)為是血液中高水 平膽固醇的原因，使他們易于患動(dòng)脈粥樣硬化，即有害斑塊在血管壁上的 發(fā)展，其可以導(dǎo)致心臟病發(fā)作和中風(fēng)。充分證明的是，在血漿中多種脂蛋 白濃度和動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)之間存在有力的關(guān)系。同樣己知，不同類別的 脂蛋白(HDL、 LDL和VLDL)在動(dòng)脈粥樣硬化中各自起不同的作用。例如， 將HDL認(rèn)為是抗致動(dòng)脈粥樣化的(antiatherogenic)，而已知LDL是高度致 動(dòng)脈粥樣化的(它攜帶的膽固醇與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān))。VLDL 被認(rèn)為是輕微致動(dòng)脈粥樣硬化的，而且在女性中更顯著。
因此多種脂質(zhì)成分的每一種，特別是膽固醇，在血液中的相對濃度的 知識，將是有利的，因?yàn)檫@將在治療具有這些脂質(zhì)的不適當(dāng)血液濃度的患 者中幫助臨床醫(yī)生。
已經(jīng)開發(fā)了用于確定血液中一些脂質(zhì)成分濃度的測定。這樣的測定通 常涉及首先從患者取血樣，然后將其送到臨床實(shí)驗(yàn)室用于分析。這樣的測 定不得不利用昂貴的裝置和試劑進(jìn)行，并且需要相當(dāng)長的時(shí)間以產(chǎn)生結(jié) 果。這耽擱治療。而且，所述測試是復(fù)雜的并且因此是昂貴的。另外，在 實(shí)驗(yàn)室中使用的裝置不容易便攜，并且因此不能由GPs或護(hù)士在出診時(shí)使 用，或者甚至作為家用測試試劑盒使用。因此，存在提供用于分析血液血 清中脂質(zhì)并且特別是膽固醇濃度的改進(jìn)方法的需要。
Liebermann-Burchard(L-B)反應(yīng)測定是測量血液中總膽固醇的眾所周 知方法，并且被認(rèn)為是"金標(biāo)準(zhǔn)"。這是基于吸光度的測定，并且

圖1顯 示該Liebermann-Burchard反應(yīng)的示意圖。首先，制備由30%冰醋酸、60% 乙酸酐和10。/。硫酸的溶液組成的L-B反應(yīng)試劑。其次，然后將5 ml該L-B 試劑加入到0.2 ml由血漿獲得的樣品，將其混合在一起然后進(jìn)行放置20 分鐘。L-B反應(yīng)通常在包含已經(jīng)從血漿萃取到有機(jī)溶劑中的膽固醇樣品上 進(jìn)行。L-B反應(yīng)的產(chǎn)物是兩個(gè)有色的產(chǎn)物。Liebermann-Burchard反應(yīng)產(chǎn)物 的典型吸光度光譜顯示在圖2中。然后利用分光光度計(jì)測量產(chǎn)物的吸光度， 所述產(chǎn)物的濃度與膽固醇濃度相關(guān)?？梢岳媚懝檀紭?biāo)準(zhǔn)物，從吸光度對 膽固醇濃度的校正曲線確定膽固醇的總濃度(Burke等，Clin. Chem. 20(7)， 794-801(1974))。
然而，L-B反應(yīng)測定的問題是它需要相對大量的試劑，這是一個(gè)明顯 的缺點(diǎn)，因?yàn)樗鲈噭┦欠浅８g性的并需要特殊關(guān)注。通常同樣需要的 是，將膽固醇從血漿萃取并且該萃取步驟構(gòu)成測定中麻煩的額外步驟。因 此，L-B反應(yīng)測定在許多實(shí)驗(yàn)室中己經(jīng)由酶聯(lián)測定取代，因?yàn)樵贚-B反應(yīng) 測定中需要相當(dāng)大量的樣品數(shù)量并且使用腐蝕性試劑。然而，用于確定總 膽固醇濃度的這樣的酶-聯(lián)測定的使用趨向于更容易和更安全地進(jìn)行，但是 不如L-B測定精確。因?yàn)楫a(chǎn)生的結(jié)果是不太精確的，所以臨床醫(yī)生將優(yōu)選 L-B反應(yīng)測定準(zhǔn)確度，特別是對于具有更高冠心病危險(xiǎn)因素的個(gè)體確定治 療過程時(shí)。
因此，即使存在測定血液樣品中膽固醇濃度的有效方法，也應(yīng)當(dāng)理解 這些方法具有許多限制。
因此本發(fā)明實(shí)施方案的目的是排除或減輕現(xiàn)有技術(shù)的問題，并且提供 用于測定取自受試者的樣品中膽固醇濃度的改進(jìn)方法。進(jìn)一步的目的是提 供用于實(shí)施所述方法的裝置。
如上所述，常規(guī)的L-B反應(yīng)測定測量吸光度，因此需要相對大體積的 L-B反應(yīng)試劑。例如，用于測量吸光度的比色杯趨向于保持約1 ml的樣品 而起作用。應(yīng)當(dāng)理解，L-B試劑的成分是非常腐蝕性的，其因此在使用時(shí) 需要特殊的關(guān)注。因此，對于測量血樣中的膽固醇濃度，L-B測定由實(shí)驗(yàn) 室技術(shù)人員使用是相當(dāng)麻煩的。
因此，本發(fā)明人用L-B測定的試劑進(jìn)行了一些研究，以了解是否可以 提供改進(jìn)的測定用于測定血樣中的膽固醇濃度，以致它們是更容易使用 的，更少危險(xiǎn)的，以及更精確的。從他們的研究中，他們非常地驚奇地發(fā) 現(xiàn)L-B反應(yīng)的產(chǎn)物實(shí)際上發(fā)熒光，并且圖3顯示L-B產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜。 意外觀察到，所述熒光在470-600 nm的范圍延伸。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供測定樣品中總膽固醇濃度的方 法，所述方法包含下列步驟-
(i) 向樣品中加入引起Liebermann-Burchard(L-B)反應(yīng)的試劑；禾口
(ii) 利用熒光分析測定樣品中的總膽固醇濃度。
由所述術(shù)語"總膽固醇"，本發(fā)明發(fā)明人指的是樣品中的膽固醇總濃 度，其包括結(jié)合到載體分子諸如脂蛋白例如LDL的全部膽固醇，以及可 以存在于樣品中的任何游離膽固醇。
樣品可以是食品，其需要分析在其中的總膽固醇濃度。優(yōu)選地，所述 樣品是生物樣品，其可以從要測試的受試者獲得。所述樣品可以包含任何 生物流體，例如，血液血清或血漿，或淋巴。特別優(yōu)選的是，所述樣品包 含血液血清。本發(fā)明方法的另一個(gè)好處是可以在所述方法中直接使用液體 樣品(例如血清或血漿)。這與常規(guī)的L-B反應(yīng)測定相反，所述L-B反應(yīng)測 定可能需要從初級樣品萃取膽固醇，之后將其與L-B試劑結(jié)合。
用于膽固醇的Liebermann-Burchard(L-B)反應(yīng)是眾所周知的，并且顯 示L-B反應(yīng)的示意解在圖1中。優(yōu)選地，加入到樣品的試劑導(dǎo)致存在
于樣品中的全部總膽固醇即膽固醇及其酯的反應(yīng)，其可以與脂蛋白締合(例
如LDL或HDL)，其可以存在于樣品中。L-B試劑優(yōu)選將雙鍵添加到樣品 中的膽固醇，如圖l中所圖解。因此，由術(shù)語"引起L-B反應(yīng)的試劑"， 本發(fā)明發(fā)明人指的是當(dāng)加入到含有膽固醇的樣品時(shí)，引起或誘導(dǎo)樣品中膽 固醇愈加不飽和的試劑。
根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的方法使用與一般Liebermann-Burchard反應(yīng) 測定(L-B)或用于測定膽固醇濃度的其它測定相同的試劑，所述其它測定可 以基于L-B反應(yīng)，例如，Abell-Kendal測定，其對于技術(shù)人員將是己知的 (Abell等，J.Biol.Chem. 195(1)357-366頁)。然而，不同于如常規(guī)L-B反應(yīng) 測定中在550 nm測量有色產(chǎn)物的吸光度，根據(jù)本發(fā)明的方法包含測量熒 光以確定樣品中的膽固醇濃度。因此，由術(shù)語"熒光分析"，本發(fā)明發(fā)明 人指的是L-B反應(yīng)的產(chǎn)物的熒光測量。
L-B反應(yīng)試劑可以包含三種不同試劑，
第一種試劑包含膽固醇溶劑。適合的膽固醇溶劑的實(shí)例包括乙酸、二 噁烷、和/或氯仿。優(yōu)選地，所述膽固醇溶劑包含冰醋酸。
第二L-B反應(yīng)試劑是強(qiáng)酸。本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是相 信酸執(zhí)行從膽固醇萃取水的消除反應(yīng)而保持更高程度的共軛。本發(fā)明人相 信當(dāng)根據(jù)本發(fā)明激發(fā)時(shí)，該共軛(即增加雙鍵數(shù)量)發(fā)熒光。所述強(qiáng)酸優(yōu)選 足含氣酸類(X-OH)諸如磷酸(H3P04)并且更優(yōu)選H2S04。所述酸也可以是 HN03、 H2Se04、 HC104、禾卩HMn04。'備選地，所述酸可以是路易斯酸諸 如Al2Cl6、 SnCU禾口 FeCl3或二氧化鈦。
最優(yōu)選的是，所述強(qiáng)酸包含硫酸，優(yōu)選地，以約3-20體積％的濃度， 或約0.5-2.5摩爾的A12C6。
第三L-B反應(yīng)試劑包含乙酸酐。優(yōu)選乙酸酐對溶劑的比例是0.25:1至 10:1之間，更優(yōu)選0.5:1至5:1之間，并且還更優(yōu)選1:1至3:1之間。在優(yōu) 選實(shí)施方案中，乙酸酐對溶劑的比例約是2:1。
優(yōu)選L-B試劑包含約30體積％的冰醋酸，約60體積％的乙酸酐，和 約10體積％的硫酸。 另外，L-B試劑也可以包含添加劑諸如，無水硫酸鈉，或水楊酸鈉等，
將其用于穩(wěn)定樣品中的雜質(zhì)。可以在約0.5-3體積％的范圍內(nèi)添加所述添 加劑。
優(yōu)選地，所述方法包含在測定中將試劑與樣品混合。所述方法優(yōu)選包 含在低于約500 nm并且更優(yōu)選低于約470 nm的激發(fā)波長處激發(fā)樣品(即 L-B反應(yīng)的產(chǎn)物)的步驟。可以使用特別優(yōu)選的450 nm或更短波長的激發(fā) 波長，以便引起L-B反應(yīng)的產(chǎn)物發(fā)熒光。
所述方法優(yōu)選還包含在500-650 nm之間并且更優(yōu)選在520-600 nm之 間的發(fā)射波長觀察所發(fā)射熒光的步驟?？梢允褂锰貏e優(yōu)選的540 nm的發(fā) 射波長，在所述波長可以觀察到用于測定膽固醇濃度的大多數(shù)精確讀數(shù)。
應(yīng)當(dāng)理解，測量熒光是超過利用常規(guī)的L-B基于吸光度測定的顯著改 進(jìn)。測量L-B反應(yīng)產(chǎn)物熒光而不是如常規(guī)方法中測量它的吸光度的優(yōu)點(diǎn)包 括需要更小體積試劑的事實(shí)。這是特別有利的，因?yàn)長-B反應(yīng)的試劑是非 常腐蝕性的，因此對使用有危險(xiǎn)。因此，對于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員或其它使用 者，減少根據(jù)第一方面的方法的熒光測定中需要的試劑量比常規(guī)L-B吸光 度測定的情況更加安全。而且，利用較小體積的試劑也指的是較小的裝置 可以用于實(shí)施所述測定。
另外，測量熒光比測量吸光度更加靈敏，并且也進(jìn)行得更快。因此， 可以利用熒光進(jìn)行比測量吸光度更精確的膽固醇濃度測定。因此，應(yīng)當(dāng)理 解，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于迅速和精確確定樣品中的總膽固醇濃度， 并且因此是超過現(xiàn)有技術(shù)的顯著進(jìn)步。
因此，優(yōu)選的方法由改進(jìn)的L-B反應(yīng)測定組成，其可以非常迅速地進(jìn) 行測定膽固醇濃度。然后臨床醫(yī)生可以利用該信息以決定某一治療過程。 因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可以包含從患者取血樣，然后將血液血清從 紅細(xì)胞分離。這可以由已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如離心或過濾。然后可以將血清 分離成約1 ml體積或更少的等分部分，然后將其進(jìn)行熒光分析以確定其中 的膽固醇濃度。
可以將L-B反應(yīng)試劑加入到所述等分部分。然后可以在450 nm激發(fā) 它，以便引起L-B反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)熒光。然后可以在540 nm的發(fā)射波長測量 該熒光。由此數(shù)值，然后可以測定樣品中的膽固醇濃度。
另外，為了開發(fā)根據(jù)第一個(gè)方面的方法，本發(fā)明人也開發(fā)了用于實(shí)施 所述方法的裝置。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供用于測定樣品中總膽固醇濃度的 裝置，所述裝置包含用于進(jìn)行L-B測定的反應(yīng)儲器；適于含有根據(jù)第一方
面方法所需要的試劑的容納裝置；在所述儲器中混合樣品和試劑的設(shè)備；
可用于激發(fā)樣品以致它發(fā)熒光的激發(fā)裝置，和可用于檢測由樣品所發(fā)射的 熒光的檢測裝置。
優(yōu)選地，所述裝置包含許多儲器。第一儲器可以用于含有樣品并且在 這里指的是樣品儲器。所述容納裝置可以包含第二儲器， 一種試劑儲器，
用于含有L-B試劑。反應(yīng)儲器可以是第三儲器，其中可以進(jìn)行測定樣品中 總膽固醇濃度的測定(在從各自的第一和第二儲器引入樣品和試劑之后)。 優(yōu)選排列所述反應(yīng)儲器，以便可以由所述激發(fā)裝置激發(fā)。優(yōu)選排列所述反 應(yīng)儲器，以便從所述測定(L-B反應(yīng))產(chǎn)生的熒光可以由所述檢測裝置檢測。
應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)所述裝置，以便可以將樣品 直接引入到所述反應(yīng)儲器中。這將不需要第一儲器或樣品儲器。
所述反應(yīng)儲器可以包含，或連接到，其中可以包含L-B反應(yīng)試劑的容 納裝置。所述試劑可以包含膽固醇溶劑體系，例如，冰醋酸，并且還有， 乙酸酐，并且優(yōu)選硫酸。應(yīng)當(dāng)理解，這些L-B反應(yīng)試劑是腐蝕性的。
所述裝置可以包含閱讀器和優(yōu)選盒，其適于被放置與之功能聯(lián)通。。 所述閱讀器可以包含激發(fā)和檢測裝置，而所述盒可以包含用于L-B試劑的 反應(yīng)儲器和容納裝置，還有其它上面提到的儲器。優(yōu)選地，可以將所述盒 插入到，或結(jié)合到所述閱讀器。所述閱讀器可以包含其中可以插入所述盒 的對接裝置(docking means)。所述對接裝置可以是槽。因此，優(yōu)選地，可 以從所述閱讀器除去所述盒。所述裝置的使用者可以將樣品插入到所述盒 中的樣品儲器中。所述盒可以包含預(yù)裝有所述試劑的試劑儲器形式的容納 裝置。當(dāng)將所述盒插入到閱讀器中時(shí)，可以將樣品和試劑推入所述盒中的 反應(yīng)儲器，所述反應(yīng)儲器與閱讀器中的激發(fā)裝置和檢測裝置對齊。然后可 以從樣品讀熒光。因此，有利地是，所述盒的使用意味著使用者不需要觸 摸或進(jìn)行接觸腐蝕性的L-B反應(yīng)試劑。
所述盒可以包含儲器，并且優(yōu)選容納裝置。因此， 一旦已經(jīng)排出所述
試劑，可以從所述閱讀器除去攜帶L-B反應(yīng)試劑的盒，并且將其用含有新 的(未使用的)L-B反應(yīng)試劑的新盒替換。
優(yōu)選地，所述裝置包含適合于基于檢測的熒光而測定樣品中總膽固醇 濃度的加工裝置。所述裝置可以包含用于顯示樣品中總膽固醇濃度的顯示 裝置，優(yōu)選作為讀出。例如，所述顯示裝置可以包含LCD屏或者可以依 賴計(jì)算機(jī)，用于供電、和/或計(jì)算、和/或顯示。
優(yōu)選地，所述裝置是便攜的，并且可以通過從那里取樣而用于計(jì)算患 者中的膽固醇濃度。所述樣品可以是任何生物流體，例如，血液、血漿、 淋巴等或食品。
優(yōu)選地，所述激發(fā)裝置包含可用于在約400 nm-500 nm照射所述樣品 的照明源。所述照明源可以包含燈泡或LED。所述激發(fā)裝置可以包含450 nm干涉濾光器。所述激發(fā)裝置可以包含用于極化由照明源產(chǎn)生的光的極 化裝置。所述激發(fā)裝置可以包含適合于將光聚焦在所述樣品上的聚焦裝 置。所述聚焦裝置可以包含透鏡。
優(yōu)選地，所述檢測裝置包含光電二極管或光電倍增管等，其優(yōu)選是紅 敏的。由樣品發(fā)射的熒光優(yōu)選在大約500nm-650nm，并更優(yōu)選在540 nm 檢測。所述熒光可以通過第二透鏡收集，并且可以經(jīng)過起偏振器。散射的 激發(fā)光可以通過切斷濾光器除去。為了測量熒光強(qiáng)度，來自光電二極管的 電流或來自光電倍增加管的計(jì)數(shù)速率可以從安培計(jì)、伏特計(jì)或速率計(jì)模塊 讀出。
所述裝置可以包含激發(fā)校正系統(tǒng)，以便可以計(jì)算光源的波動(dòng)。所述裝 置可以包含至少一種在計(jì)算膽固醇濃度之前供校準(zhǔn)用的熒光標(biāo)準(zhǔn)。
所述裝置可以設(shè)計(jì)成從結(jié)合在其中的電池取出動(dòng)力(例如，以將動(dòng)力供 給LCD和包含在其中的任何處理器)。備選地，動(dòng)力可以取自計(jì)算機(jī)(例如 經(jīng)由連接至便攜式計(jì)算機(jī)或PDA的USB)或者甚至取自移動(dòng)電話。
因此，將所述裝置配置成，當(dāng)所述盒進(jìn)入閱讀器或在其后某些時(shí)間， 檢測和測量所述測定的熒光強(qiáng)度，從而測定樣品中的膽固醇濃度。
有利地，根據(jù)第二方面的裝置可以用于進(jìn)行快速和容易的測定，可以 使其進(jìn)行確定生物流體中的膽固醇濃度。然后臨床醫(yī)生可以決定有效的治療過程。另外，所述裝置是便攜的并且可以由進(jìn)行出診的GPS或護(hù)士使用， 或者甚至作為家用的測試試劑盒。
應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法的知識使本發(fā)明人能夠設(shè)計(jì)小 的，優(yōu)選便攜的裝置，使用小體積的樣品和試劑。優(yōu)選所述裝置包含閱讀 器和盒。這樣的盒表示本發(fā)明的重要特征。因此根據(jù)本發(fā)明的第三方面，
提供包含進(jìn)行L-B測定的反應(yīng)儲器的盒；適合于含有對于根據(jù)本發(fā)明第一 方面的方法所需試劑的容納裝置。
所述盒應(yīng)當(dāng)是適合的，以便所述反應(yīng)儲器可以與閱讀器對齊(align)以 容許從包含在所述反應(yīng)儲器內(nèi)的任何樣品進(jìn)行熒光測量。
優(yōu)選所述盒還包含樣品儲器；容納裝置是以試劑儲器的形式；并且也 具有將樣品儲器和試劑儲器連接至反應(yīng)儲器的通道。
描述于此的全部特征(包括任何伴隨的權(quán)利要求、摘要和附圖)，和/或 如此公開的任何方法或過程的全部步驟，可以與以上任何方面以任何組合 相結(jié)合，不同之處在于組合，在那里至少一些這樣的特征和/或步驟是相互 排他的。
為了更好理解本發(fā)明，并且顯示本發(fā)明的實(shí)施方案如何實(shí)現(xiàn)效果，對 于后附的簡圖，現(xiàn)在將通過實(shí)例的方式進(jìn)行參考，其中-圖1顯示Liebermann-Burchard反應(yīng)的示意圖； 圖2顯示Liebermann-Burchard反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度光譜； 圖3顯示Liebermann-Burchard反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜； 圖4是顯示相對于如實(shí)施例1中參考的膽固醇濃度的熒光強(qiáng)度的曲線
圖5是顯示如實(shí)施例1中所參考測定膽固醇濃度的百分比誤差的曲線
圖6顯示如實(shí)施例2中所參考的根據(jù)本發(fā)明的盒的實(shí)施方案的示意性 視圖7顯示如實(shí)施例2中所參考的根據(jù)本發(fā)明的閱讀器的實(shí)施方案的透 視圖8顯示插入到如實(shí)施例2中參考的閱讀器中的盒的正視圖；圖9圖解了，當(dāng)路易斯酸A12C16(A); SnCU(B)和FeCl3(C)用在如實(shí)施 例3中參考的本發(fā)明方法中時(shí)，光源的激發(fā)光譜(Ex-黑色跡線)和L-B測定 產(chǎn)物的發(fā)射光譜(Em-較淺的跡線)；和
圖10表示當(dāng)分別如實(shí)施例3中所參考利用路易斯酸，A12C16(A); SnCU(B)和FeCl"C)在L-B反應(yīng)中代替硫酸時(shí)，顯示相對于濃度標(biāo)準(zhǔn)膽固 醇(以LDL形式)的熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)曲線圖。
本發(fā)明人進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以便研究熒光分析的使用以確定膽固醇濃 度。樣品中膽固醇水平的知識將在幫助臨床醫(yī)生決定特別的治療過程中是 有利的。然后將這些描述在下列實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用于開發(fā)根據(jù)本發(fā)明 的方法和裝置。
實(shí)施例1-總膽固醇的測量
本發(fā)明人研究了是否可以使用熒光測量以確定樣品中的總膽固醇濃 度。這將與如膽固醇常規(guī)測定中的測量吸光度相反。
方法
根據(jù)本發(fā)明的方法類似于常規(guī)的Liebermann-Burchard反應(yīng)測定 (L-B)，因?yàn)槭褂孟嗤脑噭?。圖1圖解了 Liebermann-Burchard反應(yīng)。關(guān) 于圖2，顯示了 L-B產(chǎn)物的吸光度光譜?？梢钥吹?，所述吸光度光譜在400 和700 nm之間顯示廣泛的吸光度范圍，這是為什么用常規(guī)測定進(jìn)行吸光 度測量以測量樣品中的膽固醇濃度。
然而，代替如常規(guī)L-B測定和它的變化中在550 nm或600 nm測量有 色產(chǎn)物的吸光度，在本發(fā)明中，測量熒光。關(guān)于圖3，顯示L-B反應(yīng)產(chǎn)物 的熒光發(fā)射光譜。在造成顏色的波長(即550 nm至700 nm)下的激發(fā)不促 進(jìn)該熒光。然而，當(dāng)選擇450 nm的激發(fā)波長時(shí)，所述熒光出乎意料地延 伸超過470-600 nm的范圍。
測量熒光代替測量吸光度的優(yōu)勢是增加的靈敏度和減少的體積需要。 修改的程序目前使用50微升的血漿和1 ml的試劑。這是因?yàn)槌Ｒ?guī)的1 cm 路徑長度的比色杯可以用于所述熒光測量。然而，十微升區(qū)域的試劑體積 將容易是可能的。這不能利用吸光度實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榧?xì)胞路徑長度對于精確測
量將是太短的(至少0.01 Au的吸光度對于準(zhǔn)確度將是需要的)。除非另有 陳述，在Perkin-ElmerLS-50發(fā)光分光計(jì)中進(jìn)行熒光測量。
總膽固醇的測量
用0和20 mM范圍內(nèi)的總膽固醇的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)是由標(biāo)準(zhǔn)的、表征的LDL 樣品形成。將50微升樣品加入到1 ml的L-B反應(yīng)試劑中，并且在室溫下 溫育5分鐘(雖然更短或更長溫育時(shí)間對于成功測量可以是充分的)。利用 450 nm的激發(fā)波長和540 nm的發(fā)射波長測量各自樣品的熒光。對于總膽 固醇濃度繪制熒光，如圖4中所圖解。相關(guān)系數(shù)R2對于1的接近性顯示 測量的高度線性。
將擬合線的梯度用于從各自試樣的熒光計(jì)算總膽固醇。真實(shí)的和測量 的總膽固醇之間百分比誤差顯示在圖5中。所述結(jié)果顯示，熒光L-B反應(yīng) 測定可以在零至20 mM的范圍內(nèi)以非常高的準(zhǔn)確度用于血清膽固醇的測 量，所述范圍覆蓋了來自臨床樣品所預(yù)期的范圍。
因此，本發(fā)明人意識到，將可以在450nm激發(fā)血樣，并且在540 nm 測量所述發(fā)射，以便確定膽固醇的濃度。
實(shí)施例2-確定膽固醇濃度的測定
上面的實(shí)施例1描述L-B反應(yīng)測定產(chǎn)物的熒光測量(即不是吸光度)如 何可以用于確定樣品中的總膽固醇濃度。本發(fā)明人觀察到，利用通常用于 L-B測定的試劑的膽固醇測定的產(chǎn)物可以在450 nm的波長激發(fā)，并且也 可以在540 nm測量它的發(fā)射。因此，本發(fā)明人意識到，可以利用熒光分 析設(shè)計(jì)用于分析患者血樣的膽固醇濃度的方法。
雄
血樣最初取自患者，然后利用充分建立的常規(guī)方法離心，以便分離所 述血清。備選地，可以將血樣從血清過濾成單獨(dú)的細(xì)胞。然后將血清分成 1 ml的等分部分，然后將其進(jìn)行生物化學(xué)分析以確定樣品中的膽固醇濃 度，如下所述。
將25微升的血液血清加入到2 ml的L-B反應(yīng)試劑(60%乙酸酐、30% 乙酸和10%硫酸)中。然后在450nm激發(fā)樣品以便引起L-B反應(yīng)的產(chǎn)物發(fā) 熒光。在540 nm的發(fā)射波長測量所述熒光，然后由此數(shù)值可以如上面的 實(shí)施例1中所描述而確定樣品中的膽固醇濃度。
實(shí)施例3-計(jì)算膽固醇濃度的裝置
本發(fā)明人意識到，根據(jù)本發(fā)明的方法，特別是加入需要精確分析的小 體積試劑，可以根據(jù)本發(fā)明第二方面設(shè)計(jì)包含閱讀器和盒的便攜裝置。
關(guān)于圖6-8，顯示由本發(fā)明人開發(fā)的便攜裝置，可將其用于計(jì)算患者 血樣中的總膽固醇濃度。所述裝置由詳細(xì)顯示在圖6中的盒1和詳細(xì)顯示 在圖7中的閱讀器50組成。
盒1具有一系列相互連接的儲器，沿著所述儲器流體可以流動(dòng)，以便 進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的測定。盒1經(jīng)由狹槽52插入到閱讀器50用于檢測和測 量熒光強(qiáng)度，用于盒l(wèi)中進(jìn)行的測定。
關(guān)于圖6，盒1具有樣品儲器2，其中包含取自患者的生物流體諸如 血液?？梢蕴峁┻^濾器18用于從血液除去血細(xì)胞，留下血漿或血清或其 它體液，用其進(jìn)行所述測定。所述流體沿著通道推進(jìn)到反應(yīng)儲器6中，在 其中進(jìn)行所述測定。
,試劑儲器14含有L-B反應(yīng)測定的試劑，并且所以當(dāng)將這些推進(jìn)到反 應(yīng)儲器6中，將它們與所述生物流體混合，并且啟動(dòng)膽固醇測定(L-B反應(yīng))。 所述盒也可以包括用于校準(zhǔn)閱讀器50的熒光標(biāo)準(zhǔn)22。
在所述裝置(即所述盒1和閱讀器50)的一個(gè)實(shí)施方案中，在反應(yīng)儲器 6中進(jìn)行所述測定。所述盒1插入到閱讀器50之前的狹槽52中，如圖8 中所示。將所述盒1置于閱讀器50中引起反應(yīng)儲器6與存在于閱讀器50 中的相應(yīng)光源32以及相應(yīng)檢測光電二極管38對齊。
光源32可以采取LED的形式(或引導(dǎo)自LED)，并且為測定產(chǎn)物提供 具有所需熒光激發(fā)照明的L-B反應(yīng)測定以發(fā)熒光。來自LED32的光的波 長約在450 nm。它可以經(jīng)過450 nm干涉濾色片(未顯示)，之后定向至反 應(yīng)儲器6。閱讀器50具有激發(fā)校正系統(tǒng)46。因此，將所述測定的熒光用 透鏡或類似的收集光學(xué)收集，并且可以在540 nm的波長經(jīng)過起偏振器。
對于熒光強(qiáng)度的測量，將光電二極管38的電流輸出擴(kuò)增并讀作為電流或 電壓。
因此，將閱讀器50配置成將盒1保持以檢測并測量所述測定的熒光 強(qiáng)度，從而確定總膽固醇濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置具有LCD 讀出顯示42，在其上顯示膽固醇濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，閱讀器50 可以由PC、便攜式電腦、或PDA26的USB端口提供動(dòng)力，并且使它的 讀出通過PC、便攜式電腦、或PDA26的USB端口供給，使臨床醫(yī)生讀 出關(guān)于膽固醇濃度的信息。備選地，所述裝置可以包括盒1和閱讀器50 的兩個(gè)方面并且包含可以自動(dòng)計(jì)算膽固醇本身濃度的微處理器44。
盒1和閱讀器裝置50的優(yōu)勢在于利用L-B反應(yīng)試劑的快速和容易的 測定系統(tǒng)，可以將其進(jìn)行以確定膽固醇的濃度。盒1是便攜的，并且可以 用用于測定的L-B試劑制備而便宜地制造。
實(shí)施例4:用不同的強(qiáng)酸進(jìn)行的測定
本發(fā)明人重復(fù)了描述在實(shí)施例l和2中的實(shí)驗(yàn)以說明，除硫酸以外的 強(qiáng)酸可以根據(jù)本發(fā)明用于測量樣品中膽固醇濃度。本發(fā)明人因此利用路易 斯酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明人首先研究從L-B測定的產(chǎn)物產(chǎn)生的光譜，其中將路易斯酸、 A12C16、 SnCU和FeCl3代替硫酸用于所述反應(yīng)中。各自酸的終濃度是1.8 M(如實(shí)施例1和2中對于硫酸)。圖9圖解了當(dāng)使用路易斯酸A12C16(A); SnCU(B)和FeCl3(C)時(shí)，光源的激發(fā)光譜(Ex-黑色跡線)和L-B測定產(chǎn)物的 發(fā)射光譜(Em-淺色跡線)。所述發(fā)射光譜等于利用硫酸時(shí)獲得的發(fā)射光譜。 這圖解了當(dāng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行測定時(shí)，其它強(qiáng)酸，在該情況下是路易斯酸， 可以用于L-B測定中。
圖10表示顯示當(dāng)在L-B反應(yīng)中利用路易斯酸，A12C16(A); SnCU(B) 和FeCl3(C)代替硫酸時(shí)，熒光強(qiáng)度對于標(biāo)準(zhǔn)膽固醇濃度(以LDL形式)的校 準(zhǔn)曲線圖。這些曲線圖的線性度說明，當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明方法的L-B反應(yīng)中 使用路易斯酸時(shí)，可以獲得膽固醇濃度的可靠測量。
權(quán)利要求
1.一種測定樣品中總膽固醇濃度的方法，所述方法包含下列步驟(i)向樣品中加入引起Liebermann-Burchard(L-B)反應(yīng)的試劑；和(ii)利用熒光分析測定樣品中的總膽固醇濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含生物流體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品包含血液血 清或血槳，或淋巴。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中加入到樣品中的試劑導(dǎo)致樣 品中存在的全部總膽固醇即膽固醇及其酯的水解，其可以是與脂蛋白締合 的(例如LDL或HDL)，其存在于樣品中。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑通過向其增加雙鍵 而還原樣品中的膽固醇。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑包含膽固醇溶劑， 乙酸酐，和硫酸。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑包含用于穩(wěn)定所述 試劑中雜質(zhì)的添加劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述添加劑包含無水硫酸鈉，或水楊酸鈉。.
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中通過在低于約500 nm的激 發(fā)波長下激發(fā)樣品(即L-B反應(yīng)的產(chǎn)物)而誘導(dǎo)所述熒光，并且在500-650 nm之間的發(fā)射波長下測量得到的熒光。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中通過在約450nm的激發(fā)波長下激發(fā) 樣品而誘導(dǎo)所述熒光，并且在約540 nm的發(fā)射波長下測量得到的熒光。
11. 用于測定樣品中總膽固醇濃度的裝置，所述裝置包含用于進(jìn)行 L-B測定的反應(yīng)儲器；適于含有需要進(jìn)行L-B測定的試劑的容納裝置；用 于在所述儲器中結(jié)合樣品和試劑的裝置；激發(fā)樣品以便它發(fā)熒光的激發(fā)裝 置，和用于檢測由所述樣品發(fā)射的熒光的檢測裝置。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的裝置，其中所述裝置包含閱讀器和盒，并且其 中所述盒包含所述反應(yīng)儲器和所述容納裝置。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的裝置，其中所述閱讀器包含激發(fā)裝置和檢測裝 置；并且其中所述盒包含樣品儲器，試劑儲器形式的所述容納裝置，和將 樣品儲器和試劑儲器連接到反應(yīng)儲器的通道。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13任何一項(xiàng)的裝置，其中所述裝置包含適合 于基于檢測的熒光而測定樣品中總膽固醇濃度的加工裝置。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11至14任何一項(xiàng)的裝置，其中所述裝置包含顯示樣品中總膽固醇濃度的顯示裝置。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11至15任何一項(xiàng)的裝置，其中所述激發(fā)裝置包含 可用于在約400 nm-500 nm照射所述樣品的照明源。
17. 根據(jù)權(quán)利要求11至16任何一項(xiàng)的裝置，其中所述檢測裝置在500 nm-650nm之間檢測由所述樣品發(fā)射的熒光。
18. 由權(quán)利要求12或13定義的盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定樣品(例如血樣)中膽固醇濃度的方法。所述方法包含下列步驟將引起Liebermann-Burchard(L-B)反應(yīng)的試劑加入到樣品；然后利用熒光分析測定樣品中總膽固醇濃度。本發(fā)明也涉及用于進(jìn)行本發(fā)明方法的裝置，并且特別是以閱讀器和盒形式的裝置。
文檔編號G01N33/92GK101180542SQ200580047579
公開日2008年5月14日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月11日
發(fā)明者加雷斯·羅伊斯頓·瓊斯, 托馬斯·戴維·克拉克 申請人:科學(xué)技術(shù)設(shè)備委員會