專利名稱：：利用發(fā)光體k-37的脂蛋白測定的制作方法利用發(fā)光體K-37的脂蛋白測定本發(fā)明涉及用于鑒別樣品混合物中不同類別脂質(zhì)分子的測定系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明涉及確定血漿或血清中特別是脂蛋白濃度的方法。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施所述方法的裝置。脂質(zhì)是有生命生物中存在的多種組的有機(jī)化合物。它們在水中是不溶的，但是可溶于有機(jī)溶劑。將脂質(zhì)廣泛分類成兩個(gè)類別(i)復(fù)雜脂質(zhì)；和(ii)簡單脂質(zhì)。復(fù)雜脂質(zhì)是長鏈脂肪酸的酯并且包括甘油酯類、糖脂類、磷脂類、膽固醇和蠟。不含有脂肪酸的簡單脂質(zhì)，包括類固醇(例如，膽固醇)和萜類。脂質(zhì)可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白，其形式為其中諸如膽固醇和甘油三酯的脂質(zhì)在血液和淋巴中被輸送。血漿中發(fā)現(xiàn)的脂蛋白屬于三個(gè)主要分類(i)高密度脂蛋白(HDL)，(ii)低密度脂蛋白(LDL)，禾P(iii)極低密度的脂蛋白(VLDL)，以及中間密度脂蛋白(IDL)。為了簡潔，在這里使用術(shù)語"血清"，但是涉及"血清"應(yīng)當(dāng)解釋為涉及血清或血漿。充分記載的是，在血漿中多種脂蛋白的濃度和動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)之間存在有力的關(guān)系，即有害斑塊在血管壁上的發(fā)展可以導(dǎo)致心臟病發(fā)作。同樣已知，不同類別的脂蛋白(HDL、LDL和VLDL)在動(dòng)脈粥樣硬化中各自起不同的作用。例如，將HDL認(rèn)為是抗致動(dòng)脈粥樣化的(anti-atherogenic)，而已知LDL是高度致動(dòng)脈粥樣化的(它攜帶的膽固醇與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān))。因此，關(guān)于多種脂質(zhì)成分的每一種(S卩脂蛋白)在血液中的相對濃度的知識，將是有利的，因?yàn)檫@將幫助臨床醫(yī)生治療具有這些不適當(dāng)?shù)闹|(zhì)血液濃度的患者。應(yīng)當(dāng)理解，具有患者脂蛋白分布的知識對于臨床醫(yī)生將是最有利的。已經(jīng)開發(fā)了用于確定血液中一些脂質(zhì)成分濃度的測定。這樣的測定通常涉及首先從患者取血樣，然后將其送到檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室用于分析。這樣的測定利用昂貴的裝置進(jìn)行，并且出于計(jì)算原因需要相當(dāng)長的時(shí)間以產(chǎn)生結(jié)果。這耽誤治療。而且，所述測試是復(fù)雜的，并且因此是昂貴的。另外，在實(shí)驗(yàn)室中使用的裝置不容易便攜，并且因此不能由GPS或護(hù)士在出診時(shí)使用，或者甚至不能作為家用測試試劑盒使用。最近已經(jīng)開發(fā)了試圖在"治療點(diǎn)(pointofcare)"復(fù)制實(shí)驗(yàn)室測定的裝置，但是這些己經(jīng)證明是昂貴的并且需要熟練的使用者操作。因此，存在提供用于分析血清中脂蛋白分布的改進(jìn)方法的需要。血清是多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，并且雖然分離并直接測量不同類別脂蛋白濃度的方法是已知的，但是這樣的方法是復(fù)雜而昂貴的。用于確定血清的脂蛋白濃度的測定實(shí)施例公開在WO01/53829A1中。該文件涉及特別的有機(jī)發(fā)光體，4-二甲基氨基-4'-二氟甲基-磺酰-苯亞甲基-苯乙酮(DMSBA)，作為熒光探針的使用。所述探針的公式，確定為K-37,給定<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>探針K-37在水中不發(fā)光，但是在脂蛋白水溶液諸如血清中是高度發(fā)光的。特別是，熒光強(qiáng)度高度依賴于血清的脂蛋白含量并因而可以將K-37用作熒光探針以測量可能存在的脂蛋白濃度，即當(dāng)結(jié)合到脂蛋白的脂質(zhì)并在適當(dāng)輻射波長激發(fā)時(shí)K-37發(fā)熒光。因此，脂蛋白混合物的時(shí)間分辨(time-resolved)熒光衰減的測量可用于直接產(chǎn)生關(guān)于存在于那個(gè)混合物中的不同脂蛋白(LDL、和VLDL)的相對濃度的信息。然而，利用K-37時(shí)間分辨熒光衰減的問題是它的測量是復(fù)雜的并且需要昂貴的裝備。而且，它涉及所產(chǎn)生數(shù)據(jù)的髙度專業(yè)的計(jì)算機(jī)分析，其對于正確解釋可能是耗時(shí)的。因此，當(dāng)希望快速?zèng)Q定治療過程而不是花費(fèi)時(shí)間使用時(shí)間分辨熒光衰減以提供脂蛋白分析時(shí)，使用K-37時(shí)間分辨的熒光衰減以確定血液中脂質(zhì)成分濃度對于臨床醫(yī)生具有嚴(yán)重的限制。因此，即使存在通過利用具有探針K-37的時(shí)間分辨熒光分析而有效確定樣品中特定脂蛋白濃度的方法，應(yīng)當(dāng)理解該方法具有許多限制。因此本發(fā)明實(shí)施方案的目的是用現(xiàn)有技術(shù)排除或減輕所述問題，并且提供用于確定樣品中脂蛋白濃度的改進(jìn)方法。進(jìn)一步的目的是提供用于實(shí)施所述方法的裝置。本發(fā)明人開發(fā)了基于使用K-37測量生物分子中脂蛋白的簡化測定。為了利用K-37熒光測量確定血樣中總脂蛋白(即HDL、LDL、和VLDL)的濃度，本發(fā)明人認(rèn)識到將優(yōu)選，來自結(jié)合到多種脂蛋白類別的探針物質(zhì)的熒光應(yīng)答必須基本上對于給定的總脂蛋白濃度，即總脂蛋白濃度是相同的，不考慮它的組成(即樣品中HDL丄DL:IDL:VLDL的比例)。因此，本發(fā)明人相信，將優(yōu)選來自探針物質(zhì)的熒光強(qiáng)度響應(yīng)在脂蛋白分子的濃度范圍內(nèi)也應(yīng)當(dāng)基本上是線性的，所述脂蛋白分子的濃度范圍是從臨床測試中將遇到的樣品所預(yù)期的。雖然本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是它們相信來自探針物質(zhì)的熒光強(qiáng)度將取決于它對于樣品中特定脂蛋白分子(HDL、LDL、IDL或VLDL)的親合性，取決于脂蛋白分子絡(luò)合物內(nèi)環(huán)境的熒光量子收率，以及還有由壓緊在一起的探針分子之間的能量傳遞所引起的熒光猝滅。因此，本發(fā)明人推斷，可以選擇適合的探針物質(zhì)濃度，通過簡單的熒光測量，可以將所述探針物質(zhì)用于進(jìn)行總脂蛋白的精確測量。本發(fā)明人還認(rèn)識到，與對于HDL具有更高親合性的VLDL和LDL相比，這樣一種濃度的探針將需要平衡HDL中K-37的更高量子收率，和因此在HDL內(nèi)更高的猝滅程度，以在全部脂蛋白顆粒上產(chǎn)生恒定的熒光信號響應(yīng)。本發(fā)明人因此進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)(在實(shí)施例1中論述)以研究是否可以獲得探針物質(zhì)K-37和各自脂蛋白顆粒類型(HDL、LDL和VLDL)的脂蛋白濃度之間跨越真實(shí)血清樣中遇到的脂蛋白濃度范圍的線性和相等的關(guān)系。令他們驚奇地是，他們發(fā)現(xiàn)存在K-37的限定濃度，在所述濃度在K-37熒光和脂蛋白濃度之間存在線性關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供確定在樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法，所述方法包含下列步驟-(i)將O.lmM-1.0mM探針物質(zhì)K-37(如這里所限定)加入到樣品的等分部分，所述探針物質(zhì)結(jié)合至樣品中的脂蛋白，并且當(dāng)其如此結(jié)合時(shí)在適當(dāng)激發(fā)下發(fā)熒光；和(ii)利用熒光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。由術(shù)語"總脂蛋白"，我們指的是樣品中VLDL、HDL、LDL、IDL和乳糜微粒的共同濃度。有利地，在0.1-1.0mM濃度的K-37，可以更精確測定總脂蛋白濃度，因?yàn)橐馔獾貜乃龇椒ú襟E(ii)的熒光測量分析獲得相當(dāng)小的信號失真。適合地，加入到樣品的K-37濃度可以在大約0.2-l.OmM之間，更適合地，在大約0.3-0.9mM之間，并且甚至更適合地在大約0.5-0.8mM之間。優(yōu)選地，加入到樣品的K-37濃度在大約0.65-0.75mM之間。0.65mM的K-37是優(yōu)選濃度并且特別優(yōu)選的濃度是約0.7mM的K-37。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，將大約0.7mM的探針物質(zhì)K-37加入到所述方法步驟(i)的樣品中以便進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(ii)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)0.65mM的K-37在許多試驗(yàn)條件中是有用的，盡管當(dāng)測定含有蛋白質(zhì)的生物試樣時(shí)，0.7mM表示該探針的優(yōu)選濃度。優(yōu)選地，根據(jù)第一方面的方法包含在約400nm-500nm之間，并且更優(yōu)選約420nm-480nm之間，并且甚至更優(yōu)選約440nm-470nm之間的激發(fā)波長激發(fā)樣品。可以使用約450nm的特別優(yōu)選的激發(fā)波長，盡管在約450-470nm之間任何波長的激發(fā)也是特別優(yōu)選的。優(yōu)選地，所述方法包含在約500-650nm之間，并且更優(yōu)選約520nm-600nm之間的發(fā)射波長觀察熒光?？梢允褂眉s540nm(或更高)的特別優(yōu)選的發(fā)射波長，在那里，可以觀察到用于確定總脂蛋白濃度(即HDL、IDL、LDL和VLDL的濃度，如果存在，還有乳糜微粒)的最精確讀數(shù)。由術(shù)語"熒光分析"，我們指的是脂蛋白測定產(chǎn)物的熒光測量，通過首先激發(fā)樣品以致它發(fā)熒光，然后觀察所述熒光。樣品可以是需要知道其中總脂蛋白濃度的食品。優(yōu)選地，所述樣品是可以從要測試的受試者獲得的生物樣品。所述樣品可以包含任何生物流體，例如，血漿或血清，或淋巴。特別優(yōu)選的是所述樣品包含血清或血漿。本發(fā)明人認(rèn)識到，如果他們能夠鑒別測試樣品中的各種脂蛋白，則可以進(jìn)一步改善并且更詳細(xì)利用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的脂質(zhì)分布。因此，本發(fā)明人研究了除K-37以外的探針物質(zhì)的使用以觀察是否可以鑒別多種脂蛋白分子。他們驚奇地發(fā)現(xiàn)可獲得許多結(jié)合脂蛋白的染料，并且取決于結(jié)合的特定的脂蛋白它們顯示不同的熒光響應(yīng)。用這些染料的熒光測量可以鑒別存在于樣品中的脂蛋白類型。這通過下列比較而進(jìn)行，將由脂蛋白混合物中一種類型的脂蛋白所引起的增強(qiáng)的或減少的熒光與從校準(zhǔn)曲線確定的另一個(gè)脂蛋白(不存在特定性質(zhì)的脂蛋白)預(yù)期的熒光和由K-37測定給出的總脂蛋白含量的已知值進(jìn)行比較。例如相比于其它脂蛋白諸如LDL和VLDL，熒光染料尼羅紅(NileRed)在HDL中顯示顯著更高的熒光。因此，本發(fā)明人認(rèn)識到，可以將第二探針物質(zhì)(例如尼羅紅，或?qū)τ谔囟ㄖ鞍罪@示專一性、或熒光增強(qiáng)或減少的任何其它親脂性探針)用于鑒別樣品中的脂蛋白類別或亞類。在已經(jīng)確定總脂質(zhì)濃度以后，這是可能的。因此本發(fā)明的方法還可以包含利用第二探針通過特異于那個(gè)脂蛋白的染料熒光響應(yīng)的移位，以確定脂蛋白的特定類別或亞類的濃度?？梢詫⒌诙结樜镔|(zhì)加入到樣品的第二等分樣品，其探針結(jié)合至脂蛋白的特定類別或亞類，并且當(dāng)其結(jié)合時(shí)，其在適當(dāng)激發(fā)下改變熒光收率，其指示脂蛋白特定類別或亞類的濃度。優(yōu)選這個(gè)另外步驟包含在所述方法步驟(i)以后將探針尼羅紅加入到樣品的單獨(dú)等分樣品，以便測定樣品中的HDL。這詳細(xì)地描述在實(shí)施例3中。優(yōu)選地，為了利用尼羅紅確定樣品中HDL濃度，必須對由于HDL存在而產(chǎn)生的來自尼羅紅的過量熒光進(jìn)行計(jì)算。首先，通過K-37熒光與(如步驟(ii)確定的)脂蛋白濃度的直線相關(guān)而測量總脂蛋白濃度(測量"A")。第二，然后用多種濃度的LDL(和/或VLDL，因?yàn)闊晒鈱τ跐舛鹊捻憫?yīng)必須基本相同)校準(zhǔn)尼羅紅熒光以獲得具有斜率"X"和截距"Y"的校正曲線。技術(shù)人員將知道如何制備LDL(和域VLDL)的濃度范圍，并且對于各自濃度確定各自的熒光。第三，然后對于一系列濃度的HDL和恒定濃度的LDL構(gòu)建另外的校正曲線以產(chǎn)生斜率"Z"。第四，已知來自K-37測量的總脂蛋白濃度"A"和未知樣品的過量尼羅紅熒光"B"，未知樣品中HDL濃度"C"可以通過下列方程確定-C=(B-(AX-Y))/Z應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的實(shí)施中，可以使用預(yù)先制備或標(biāo)準(zhǔn)的校正曲線。而且，為了產(chǎn)生脂質(zhì)分布而開發(fā)的裝置(見下文)可以具有內(nèi)標(biāo)和/或具有將無需用戶干涉而允許自動(dòng)計(jì)算HDL水平的處理裝置裝置。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包含利用熒光分析確定樣品中HDL濃度。所述方法包含另外步驟，其中將探針物質(zhì)尼羅紅加入到樣品的第二等分部分，其探針結(jié)合至HDL及其它脂蛋白。在適當(dāng)激發(fā)之下，與樣品中HDL濃度成比例，尼羅紅越來越強(qiáng)烈地發(fā)熒光。當(dāng)在本發(fā)明方法中進(jìn)行該另外的步驟時(shí)，可以產(chǎn)生更詳細(xì)的由總脂蛋白濃度、和HDL濃度組成的樣品脂蛋白分布，所述脂蛋白分布將對臨床醫(yī)生是非常有用的。本發(fā)明人進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以確定應(yīng)該加入到樣品的尼羅紅最適濃度，以改善測定樣品HDL的準(zhǔn)確度，并且這需要相當(dāng)大的創(chuàng)造力。因此，加入到樣品的探針物質(zhì)尼羅紅濃度可以在接近0.1-1mM之間。有利地，在該濃度的尼羅紅下，HDL濃度的更精確濃度測定是可能的。適合地，加入到樣品的尼羅紅濃度可以在大約0.1-0.9mM之間，更適合地在大約0.2-0.7mM之間，并且甚至更適合地，在大約0.3-0.6mM之間。特別優(yōu)選的是將尼羅紅加入到樣品至終濃度約為0.4mM。優(yōu)選通過在約400nm-650nm之間的激發(fā)波長激發(fā)樣品來誘導(dǎo)尼羅紅優(yōu)選激發(fā)波長是400nm-650nm;優(yōu)選在約420nm-620nm之間，更優(yōu)選在約500nm-610nm之間，并且甚至更優(yōu)選在約590nm-610nm之間。關(guān)于尼羅紅，可以使用約600nm的激發(fā)波長，當(dāng)與另一個(gè)脂蛋白相比較時(shí)，來自HDL中尼羅紅的熒光響應(yīng)之間提供最大的鑒別(5X)。當(dāng)采用這些激發(fā)波長時(shí)，優(yōu)選使用如下更詳細(xì)論述的封閉人血清清蛋白(HSA)上的"脂肪酸和藥物結(jié)合域"試劑。然后可以在約540-700nm之間并且更優(yōu)選在約570-650nm之間的發(fā)射波長觀察并測量從尼羅紅得到的熒光。可以使用約620nm的優(yōu)選發(fā)射波長，在所述發(fā)射波長可以觀察到用于確定HDL濃度的最準(zhǔn)確讀數(shù)。本發(fā)明人研究了是否可以進(jìn)一步改善根據(jù)本發(fā)明方法中使用的單獨(dú)測定的準(zhǔn)確度，因此將他們的關(guān)注轉(zhuǎn)到人血清清蛋白(HSA)，其作為血清的主要組分，具有大約30-50mg/ml的濃度。已知HSA具有至少兩個(gè)類型的能結(jié)合多種配體的結(jié)合位點(diǎn)。第一類型在這里指的是"疏水性域"，而第二類型的域在這里指的是"藥物結(jié)合域"。這些域是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在NatureStructuralBiology(V5p827(1998))的論文中相互不同。該論文將疏水性域確定為脂肪酸可以結(jié)合的域，而所述藥物結(jié)合域能夠結(jié)合許多可以與HSA締合的藥物。從他們的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明人意外地確定，探針物質(zhì)K-37和尼羅紅可以獨(dú)立地都結(jié)合至HSA的疏水性結(jié)合位點(diǎn)/域。因此，K-37和尼羅紅都是HSA的配體。另外，意外地是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)結(jié)合到HSA時(shí)，K-37和尼羅紅發(fā)熒光。因此，雖然本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是本發(fā)明人相信當(dāng)結(jié)合至HSA時(shí)該另外的K-37熒光可以引起實(shí)質(zhì)的背景信號，其可以失真并在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(ii)中的總脂蛋白濃度測定中產(chǎn)生顯著誤差。類似地，本發(fā)明人相信當(dāng)結(jié)合至HSA時(shí)，該另外的尼羅紅熒光可以引起實(shí)質(zhì)的背景信號，其可以失真并且當(dāng)該另外步驟用于根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)在HDL濃度測定中產(chǎn)生顯著誤差。結(jié)果，本發(fā)明人研究了抑制配體K-37和配體尼羅紅與HSA結(jié)合的影響。特別是，他們嘗試封閉HSA的疏水性結(jié)合位點(diǎn)，在所述位點(diǎn)探針K-37和尼羅紅結(jié)合并發(fā)熒光。該工作描述在實(shí)施例3和4中。雖然本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是出乎他們的預(yù)料，他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)合至所述脂蛋白分子(HDL、LDL、VLDL)時(shí)，抑制所述配體K-37與疏水性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致探針物質(zhì)的熒光，相比于如果不添加配體結(jié)合抑制劑，這是樣品中總脂蛋白濃度的更精確測量。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)抑制配體尼羅紅與HSA的結(jié)合改善HDL測定的準(zhǔn)確度。因此，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法包含將配體結(jié)合抑制劑加入到樣品，所述配體結(jié)合抑制劑適合于基本上抑制所述探針物質(zhì)(K-37和/或尼羅紅)對于HSA并且優(yōu)選其疏水性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。特別優(yōu)選的是，在如步驟(i)之前或同時(shí)，也將配體結(jié)合抑制劑加入到樣品。也優(yōu)選的是，將所述抑制劑加入到尼羅紅所加入的單獨(dú)等分部分，用于進(jìn)行HDL測定。所述配體結(jié)合抑制劑可以是疏水性的。所述抑制劑可以是兩親性的(amphipathic)。配體結(jié)合抑制劑可以包含脂肪酸或其功能衍生物，以及其它疏水性分子。可以封閉HSA疏水性結(jié)合位點(diǎn)的適合的脂肪酸衍生物實(shí)例可以包含脂肪酸、它的酯、?；u化物、羧酸酐、或酰胺等。優(yōu)選的脂肪酸衍生物是脂肪酸酯。脂肪酸或其衍生物可以包含C,-C2。脂肪酸或其衍生物。優(yōu)選所述脂肪酸或其衍生物可以包含C3-C,8脂肪酸或其衍生物，更優(yōu)選，C5-C,4脂肪酸或其衍生物，并且甚至更優(yōu)選，CVC9脂肪酸或其衍生物。特別優(yōu)選的是，所述配體結(jié)合抑制劑包含辛酸(C8)或其衍生物，例如，辛酸鹽(酯)。優(yōu)選地，將所述配體結(jié)合抑制劑作為堿金屬辛酸鹽加入，優(yōu)選I族的堿金屬辛酸鹽，例如，辛酸鈉或辛酸鉀。優(yōu)選地，在進(jìn)行所述方法的步驟(i)之前，將約10-400mM之間，更優(yōu)選約20-200mM之間，并且甚至更優(yōu)選約50-150mM之間的配體結(jié)合抑制劑加入到樣品。特別優(yōu)選的是，加入約100mM的抑制劑。因此，在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以在進(jìn)行步驟(i)以前或同時(shí)將約100mM的辛酸鈉加入到樣品。當(dāng)本發(fā)明的方法也延伸至尼羅紅的用途時(shí)，優(yōu)選將約10-400mM之間，更優(yōu)選約20-200mM之間，并且甚至更優(yōu)選約50-150mM之間的配體結(jié)合抑制劑加入到樣品。最優(yōu)選的是使用約lOOmM的抑制劑。因此，在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選在加入尼羅紅之前或同時(shí)，將約100mM的辛酸鈉加入到樣品，并進(jìn)行根據(jù)所述方法的HDL測定。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將配體結(jié)合抑制劑，例如，約100mM辛酸鈉和大約0.7mM的K-37探針首先加入到取自所述樣品的第一等分部分，之后進(jìn)行所述方法步驟(i)中總脂蛋白濃度的熒光測量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將配體結(jié)合抑制劑，例如，約100mM辛酸鈉與大約0.4mM的尼羅紅探針首先加入到另一份等分部分，之后進(jìn)行所述方法中的HDL濃度熒光測量。有利地，與確定濃度的K-37探針組合的配體結(jié)合抑制劑導(dǎo)致獲得高度精確的總脂蛋白測量(以及當(dāng)加入尼羅紅探針時(shí)的HDL濃度)。實(shí)施例1和3說明染料K37的熒光測量如何可以用于確定樣品中總脂蛋白濃度，以及尼羅紅熒光測量如何可以用于確定樣品中HDL濃度。所述實(shí)施例也描述了用配體結(jié)合抑制劑封閉HSA以便優(yōu)化由K-37或尼羅紅熒光產(chǎn)生的結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，本發(fā)明人認(rèn)識到，可以發(fā)生單一平行方法用于分析脂蛋白組成。因此，優(yōu)選方法由兩個(gè)測定(總脂蛋白和HDL)組成，其幾乎立刻產(chǎn)生結(jié)果。臨床醫(yī)生可以使用該信息以決定某一治療過程。本發(fā)明人另外發(fā)現(xiàn)了尼羅紅也與以上涉及的HSA上的藥物結(jié)合域相互作用。該藥物結(jié)合域的配體包括藥物分子諸如甲狀腺素、布洛芬、安定、甾類激素和它們的衍生物(藥物)、血紅素、膽紅素、親脂性前藥、丙酮節(jié)羥香豆素(warfarin)、基于香豆素的藥物、麻醉藥、安定、布洛芬和抗抑郁藥(例如硫代黃嘌呤(thioxanthine》。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了試劑可以用于封閉該藥物結(jié)合域而且這導(dǎo)致用尼羅紅的測定結(jié)果的進(jìn)一步改善。上述藥物，或?qū)τ谠撚蚓哂杏H合性的任何其它分子可以用作封閉HSA的藥物結(jié)合域用的試劑。然而最優(yōu)選的是，將苯甲酸或其衍生物(例如三氯苯甲酸或三碘苯甲酸)用于封閉所述藥物結(jié)合域。因此，本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案可以包含從患者取血樣，然后從所述血細(xì)胞分離血清。這可以通過已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如過濾或離心。然后可以將血漿分成兩個(gè)等分部分，將每個(gè)進(jìn)行生化分析以確定脂質(zhì)成分的濃度。第一等分部分可以用于確定樣品中總脂蛋白濃度；第二等分部分可以在知道樣品中總脂蛋白時(shí)用于確定樣品中HDL濃度?？梢詫SA配體結(jié)合抑制劑如辛酸鈉加入到第一等分部分。優(yōu)選也將探針K37加入到步驟(i)中的第一等分部分，優(yōu)選至終濃度約為0.7mM。然后可以在接近450nm激發(fā)第一等分部分以便引起所述探針發(fā)熒光。然后可以在540nm或以上的發(fā)射波長測量所述熒光。由此值，然后可以確定樣品中的總脂蛋白(HDL、LDL、IDL禾QVLDL，并且如果存在還有乳糜微滴)的濃度?？梢詫SA配體結(jié)合抑制劑例如辛酸鈉加入到第二等分部分至終濃度約為100mM。也可以加入將結(jié)合到HSA藥物結(jié)合域的試劑諸如苯甲酸至l-10mM或更多，具體而言是約5mM的濃度。然后可以加入探針尼羅紅至約0.4mM的終濃度。然后可以在大約600nm激發(fā)該樣品以便引起所述探針發(fā)熒光?？梢栽诖蠹s620nm的發(fā)射波長測量所述熒光，并且由此值然后可以如實(shí)施例3中所述確定樣品中HDL濃度。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法可以包含(A)將100mM辛酸鈉(配體結(jié)合抑制劑)與大約0.7mM的K-37探針加入到取自生物樣品的第一等分部分；在大約450nm激發(fā)；并且在大約540nm的發(fā)射波長進(jìn)行所述方法步驟(i)中總脂蛋白濃度的熒光測量；和(B)將100mM辛酸鈉(配體結(jié)合抑制劑)和5mM苯甲酸鈉(封閉HSA藥物結(jié)合域的試劑)與大約0.4mM的尼羅紅探針加入到取自所述樣品的第二等分部分；在大約600nm激發(fā)；并且在大約620nm的發(fā)射波長進(jìn)行熒光測量以確定HDL濃度；和(C)根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(ii)計(jì)算總脂蛋白濃度以及HDL濃度。另外，為了開發(fā)根據(jù)第一方面的方法，本發(fā)明人也開發(fā)了用于進(jìn)行所述方法的裝置。因此，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供用于確定樣品中總脂蛋白濃度的裝置，所述裝置包含用于進(jìn)行脂蛋白測定的反應(yīng)儲(chǔ)器；適合于含有根據(jù)第一方面方法所需試劑的容納裝置；可操作用于激發(fā)樣品以便它發(fā)熒光的激發(fā)裝置，和可操作用于檢測由樣品所發(fā)射熒光的檢測裝置。優(yōu)選所述裝置包含用于混合反應(yīng)儲(chǔ)器中樣品和試劑的裝置。優(yōu)選地，所述裝置包含許多類型的儲(chǔ)器。第一類型的儲(chǔ)器可以是用于含有樣品并且在這里稱為樣品儲(chǔ)器。所述反應(yīng)儲(chǔ)器可以是第二類型的儲(chǔ)器，其中可以進(jìn)行確定樣品中脂蛋白濃度的測定(在引入樣品和試劑之后)。所述裝置可以包含單一反應(yīng)儲(chǔ)器并且可以在不同樣品等分部分的反應(yīng)之間清洗。備選地，可以將多個(gè)(例如單一應(yīng)用)的反應(yīng)儲(chǔ)器與激發(fā)裝置接觸。所述容納裝置可以包含第三儲(chǔ)器(第一試劑儲(chǔ)器)，其含有K-37染料及其它用于總脂蛋白測定的試劑(例如配體結(jié)合抑制劑)。當(dāng)要確定HDL(例如利用尼羅紅)時(shí)，所述容納裝置可以包含第四儲(chǔ)器(第二試劑儲(chǔ)器)，所述第四儲(chǔ)器含有尼羅紅染料及其它用于確定HDL的試劑(例如配體結(jié)合抑制劑和用于封閉HSA藥物結(jié)合域的試劑)。備選地，可以將K-37試劑和尼羅紅試劑包括在單獨(dú)的容納裝置中。因此用于K-37測定的試劑可以在第一容納裝置中的第一試劑儲(chǔ)器之內(nèi)，并且用于尼羅紅測定的試劑可以在第二容納裝置中的第二試劑儲(chǔ)器之內(nèi)。優(yōu)選安排所述反應(yīng)儲(chǔ)器以便可以將其與激發(fā)裝置進(jìn)行光學(xué)接觸。優(yōu)選安排所述反應(yīng)儲(chǔ)器，以致從所述測定產(chǎn)生的熒光可以由檢測裝置檢測。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)所述裝置以致可以將樣品直接引入到所述反應(yīng)儲(chǔ)器。這將排除對第一或樣品儲(chǔ)器的需要。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一試劑儲(chǔ)器在適合的稀釋劑中含有探針物質(zhì)K-37，并且還可以含有HSA配體結(jié)合抑制劑例如辛酸鈉。第二試劑儲(chǔ)器可以包含探針物質(zhì)尼羅紅并且任選包含HSA配體結(jié)合抑制劑，例如，辛酸鈉，并且也任選包含用于封閉HSA藥物結(jié)合域的試劑諸如苯甲酸。所述裝置可以包含閱讀器，并優(yōu)選地，包含適于放在與之功能通信的盒。優(yōu)選地，可以將所述盒插入到，或結(jié)合到所述閱讀器。所述閱讀器可以包含其中可以插入所述盒的對接裝置。所述對接裝置可以是槽。因此，優(yōu)選地，可以從所述閱讀器除去所述盒。所述盒可以包含或各自包含容納裝置和反應(yīng)以及樣品儲(chǔ)器(如果存在)。因此，一旦已經(jīng)排空所述試劑，可以從閱讀器除去攜帶測定試劑的盒，并且用含有新的測定試劑的新盒替換。應(yīng)當(dāng)理解，可以將自身包含的盒(包含全部儲(chǔ)器)容易地用作單一用途的反應(yīng)盒?？梢院唵蔚貜乃鲩喿x器除去盒并用包含試劑的新盒替換，并且可以將樣品配置到所述盒之內(nèi)的反應(yīng)儲(chǔ)器中。閱讀器可以包含激發(fā)裝置并且優(yōu)選包含檢測裝置。優(yōu)選地，所述裝置包含適合于基于檢測的熒光而確定樣品中總脂蛋白濃度的處理裝置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述處理裝置也適合于基于熒光分析而確定樣品中HDL的濃度。所述處理裝置可以適合于以總脂蛋白和HDL的濃度為基礎(chǔ)計(jì)算樣品中的LDL、VLDL和IDL濃度。所述裝置可以包含用于顯示樣品中總脂蛋白濃度并且優(yōu)選HDL濃度的顯示裝置，優(yōu)選作為讀數(shù)(read-out)。例如，所述顯示裝置可以包含LCD屏幕，或者可以依賴于計(jì)算機(jī)以驅(qū)動(dòng)和/或計(jì)算和/或顯示。優(yōu)選地，所述裝置是便攜的，并且可以用于通過在那里取樣而產(chǎn)生患者的脂蛋白分布。所述樣品可以是任何生物流體，例如，血液、血清、淋巴等。優(yōu)選地，所述激發(fā)裝置包含照明源，可操作用于在大約400nm-500nm照亮所述樣品(用于K-37測定)，并且對于尼羅紅測定的優(yōu)選實(shí)施方案，在大約600nm。因此優(yōu)選所述光源能夠在約400nm-600nm之間照亮所述樣品。照明源可以包含燈泡或者一個(gè)或多個(gè)LEDs并且可以利用450nm干涉濾波器和600nm的干涉濾波器改變激發(fā)波長。所述激發(fā)裝置可以包含極化裝置，可操作用于極化由照明源產(chǎn)生的光。所述激發(fā)裝置可以包含適合于將光聚焦在樣品上的聚焦裝置。所述聚焦裝置可以包含透鏡。優(yōu)選地，所述檢測裝置包含光電二極管或光電倍增管，其優(yōu)選是黃色-紅色敏感的。由樣品發(fā)射的熒光優(yōu)選在大約500nm-650nm檢測，并且更優(yōu)選在540nm和更長的波長用于K-37測定。檢測裝置能檢測在620nm發(fā)射的熒光用于包括尼羅紅的測定。所述熒光可以用第二透鏡收集，并且可以經(jīng)過起偏振器?？梢杂媒刂篂V波器除去散射的激發(fā)光。為了測量熒光強(qiáng)度，來自光電二極管的電流或來自光電倍增管的計(jì)數(shù)速率可以從安培計(jì)、伏特計(jì)或速率表模塊讀出。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置可以包含適合于接收兩個(gè)(或更多)盒的閱讀器。這樣一種閱讀器可以包含兩個(gè)(或更多)激發(fā)裝置，所述激發(fā)裝置可以與每個(gè)反應(yīng)儲(chǔ)器對齊。另外，所述裝置可以包含用于每個(gè)反應(yīng)儲(chǔ)器的檢測裝置。所述裝置也可以包含激發(fā)校正系統(tǒng)以便可以解釋光源的波動(dòng)。所述裝置可以包含至少一個(gè)熒光標(biāo)準(zhǔn)，以在確定脂蛋白濃度之前用于校準(zhǔn)。所述標(biāo)準(zhǔn)可以是內(nèi)標(biāo)。因此，將所述裝置配置成當(dāng)所述盒進(jìn)入閱讀器時(shí)或其后一段時(shí)間，同時(shí)或依次檢測并測量每個(gè)測定的熒光強(qiáng)度，從而產(chǎn)生由總脂蛋白濃度和HDL濃度組成的脂蛋白分布。有利地，根據(jù)第二方面的裝置可以用于進(jìn)行快速和容易的測定，其可以同時(shí)進(jìn)行以產(chǎn)生來自生物流體的脂蛋白分布。然后，具有脂蛋白和HDL濃度知識的臨床醫(yī)生可以決定有效的治療過程。另外，所述裝置是便攜的并且可以由出診的GPs或護(hù)士使用，或者甚至作為家用測試試劑盒。描述于此的全部特征(包括任何伴隨的權(quán)利要求、摘要和附圖)，和/或如此公開的任何方法或過程的全部步驟，可以以任何組合與任何以上方面相結(jié)合，其中至少一些這樣特征和/或步驟是相互排他的組合除外。為了更好理解本發(fā)明，并且為了顯示本發(fā)明實(shí)施方案如何可以起作用，經(jīng)由實(shí)例，現(xiàn)在將對附圖進(jìn)行參考，其中-圖1是顯示如實(shí)施例1中涉及的在HDL中三個(gè)濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度的曲線圖；圖2是顯示如實(shí)施例1中涉及的在LDL中三個(gè)濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度的曲線圖；圖3是顯示如實(shí)施例1中涉及的在VLDL中三個(gè)濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度的曲線圖；圖4是顯示如實(shí)施例1中涉及的HDL、LDL和VLDL中的0.4mM的K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度的曲線圖；圖5是顯示如實(shí)施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.65mM的K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度曲線圖；圖6是顯示如實(shí)施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.9mM的K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度曲線圖；圖7是顯示如實(shí)施例1中涉及的一系列HDL、LDL、禾卩VLDL混合物中0.65mM的K-37的相對于總脂質(zhì)濃度的熒光強(qiáng)度曲線圖；圖8顯示如說明書和實(shí)施例3中所涉及的染料尼羅紅的結(jié)構(gòu)；圖9是如實(shí)施例3中所涉及的相對于熒光強(qiáng)度的LDL濃度校正曲線；圖10是如實(shí)施例3中所涉及的相對于HDL濃度的過量熒光的校正曲線；圖11是顯示如實(shí)施例3中所涉及的相對于HDL濃度的誤差曲線圖；圖12顯示如實(shí)施例5中涉及的根據(jù)本發(fā)明的盒的實(shí)施方案的示意性視圖；圖13顯示如實(shí)施例5中涉及的根據(jù)本發(fā)明的閱讀器的實(shí)施方案的透視圖；圖14顯示如實(shí)施例5中所涉及的插入到所述閱讀器中的盒的主視圖；圖15是說明如實(shí)施例6中涉及的相對于HDL濃度的尼羅紅熒光(ex460nm和em620nm)的曲線圖；圖16是說明如實(shí)施例6中涉及的相對于HDL濃度的尼羅紅熒光(ex600nm和em620nm)的曲線圖;禾口圖17是說明在HDL(+辛酸鹽)或HSA(+辛酸鹽)存在下在460nm和600nm的激發(fā)波長的尼羅紅熒光光譜分析的曲線圖。本發(fā)明人進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以便研究熒光探針對于確定樣品中總脂蛋白以及HDL濃度的用途，以便產(chǎn)生患者的脂蛋白分布?；颊咧鞍追植嫉闹R，在幫助臨床醫(yī)生決定特定的治療過程中是有利的。然后將描述在下列實(shí)施例中的這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用于開發(fā)根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置。實(shí)施例1-總脂蛋白濃度的測量本發(fā)明人研究了熒光染料K-37對于檢測一系列樣品中的總脂蛋白濃度(其等于總甘油三酯加上膽固醇加上膽固醇酯，因?yàn)榧僭O(shè)全部脂質(zhì)結(jié)合到脂蛋白)的應(yīng)用。染料K-37對于技術(shù)人員是已知的，并且是容易利用的。首先將所述染料在確定波長激發(fā)，然后在如下所述的另一個(gè)確定波長測量熒光。將熒光強(qiáng)度用于計(jì)算樣品中總脂蛋白濃度(即根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(ii))。方法將溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的染料K-37以不同濃度范圍加入到一個(gè)濃度系列的溶解在磷酸鹽緩沖液中的HDL、LDL、和VLDL。實(shí)驗(yàn)的目的是對于每個(gè)顆粒類型(HDL、LDL、和VLDL)在將要在真實(shí)血漿或血清樣品中遇到的脂蛋白濃度范圍內(nèi)獲得熒光和脂蛋白濃度之間的線性和相等關(guān)系。在Perkin-ElmerLS50熒光計(jì)中在450nm的激發(fā)波長和540nm的發(fā)射波長測量熒光強(qiáng)度。結(jié)果圖1至3說明磷酸鹽緩沖液中HDL、LDL、和VLDL中的K-37在三個(gè)濃度即0.4mM、0.65mM、和0.9mM的熒光強(qiáng)度對總脂蛋白濃度。對于線性擬合至每個(gè)系列(在頂部的0.4mM、在中央的0.65mM和在下面的0.9mM)顯示W(wǎng)值。相同數(shù)據(jù)也繪制在圖4至6中，并且由K-37濃度分組。來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是1)對于全部三個(gè)脂蛋白顆粒類型(HDL、LDL、禾PVLDL)，R2顯示在K-37濃度為0.65mM的總脂蛋白濃度和熒光強(qiáng)度之間存在良好的線性關(guān)系。對于LDL和VLDL中的0.9mM的K-37也觀察到良好的線性關(guān)系，但是在HDL中0.9mM的K-37的線性度不太好。對于具有0.4mM的K-37的全部脂蛋白，線性度是不良的。值得注意的是，雖然它在線性度不良的濃度仍起作用，但是它是不準(zhǔn)確的。然而，可以利用多項(xiàng)式擬合處理非線性度。2)認(rèn)為影響線性度的兩個(gè)因素。在低染料濃度，在高總脂蛋白濃度下存在響應(yīng)的平化。雖然本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是他們相信這因?yàn)榇嬖诳捎糜诔浞终紦?jù)所述脂蛋白顆粒的染料不足而發(fā)生。在高染料濃度，隨著低的總脂蛋白濃度存在一個(gè)平面響應(yīng)。這是當(dāng)所述染料非常接近地充滿在所述顆粒中時(shí)由熒光的自猝滅所引起的。3)當(dāng)在磷酸鹽緩沖液中測量時(shí)，0.65mM的K-37濃度對于跨越適當(dāng)范圍的全部脂蛋白顆粒類型給出了線性的和非常類似的熒光響應(yīng)。因此，然后將0.65mM的K-37加入到一系列HDL/LDL/VLDL混合物，如上所述測量熒光強(qiáng)度。所述數(shù)據(jù)圖解在圖7中。如圖可以看出，總脂蛋白濃度與熒光強(qiáng)度是高度相關(guān)的(R、0.9983)，證實(shí)該濃度的K-37(0.65mM)適于總脂蛋白濃度的高度精確的測量。當(dāng)將這個(gè)應(yīng)用到來自患者的生物樣品時(shí)，本發(fā)明人在高脂質(zhì)濃度觀察到一些彎曲。因而，選擇0.7mM濃度的K-37作為血清或血漿中使用的最理想的K-37濃度。因此，選擇該濃度作為根據(jù)本發(fā)明方法所用的最適濃度。實(shí)施例2-HSA的封閉然后本發(fā)明人進(jìn)行了優(yōu)化根據(jù)本發(fā)明的方法的進(jìn)一步研究。到最后，他們認(rèn)識到HSA具有K-37結(jié)合并發(fā)熒光的疏水性結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)結(jié)合至HSA時(shí)K-37的這個(gè)另外的熒光引起實(shí)質(zhì)的背景信號，其失真并從而引起脂蛋白分子即HDL、LDL和VLDL測量中的顯著誤差。他們因此決定用配體結(jié)合抑制劑諸如辛酸鈉封閉HSA上的疏水性結(jié)合位點(diǎn)，以觀察是否可以將另外的熒光最小化。設(shè)想，以這種方法抑制K-37與HSA的結(jié)合將改善利用K-37熒光測量獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確度。在50mg/mlHSA存在或不存在下，將染料K37以0.5mM的濃度加入到總脂質(zhì)濃度為5mM的LDL。在有和沒有加入0.1M辛酸鈉的情況下進(jìn)行測量，所述辛酸鈉作為配體結(jié)合抑制劑。腿對于全部樣品測量熒光強(qiáng)度并概況在下面的表中:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>所述結(jié)果顯示單獨(dú)LDL中的K-37的熒光強(qiáng)度是213500單位。當(dāng)辛酸鹽加入到LDL時(shí)K-37的熒光強(qiáng)度是209700單位(即與無辛酸鹽的情況大致相同)，認(rèn)為辛酸鹽的存在未有助于獨(dú)自結(jié)合到LDL的K-37的熒光強(qiáng)度。結(jié)合到HSA的K-37的熒光強(qiáng)度是79300單位，然而在HSA和辛酸鹽存在下K-37的熒光強(qiáng)度是3600。這說明HSA有助于K-37熒光并且因此有助于干涉信號。辛酸鹽的加入顯著減少所述干涉并從而消除HSA的破裂作用。所述結(jié)果因此顯示在辛酸鹽存在下HSA大量抑制K-37的熒光強(qiáng)度，但是對于LDL中的K37熒光的影響小。這顯示辛酸鹽在封閉HSA上的K-37結(jié)合位點(diǎn)方面是顯著成功的，使K-37熒光成為總脂蛋白濃度的因此，本發(fā)明人相信可以將結(jié)合HSA疏水性結(jié)合位點(diǎn)的配體結(jié)合抑制劑諸如辛酸鹽在測量K-37熒光之前加入到血樣以改善總脂蛋白濃度的準(zhǔn)確性。另外，本發(fā)明人認(rèn)為該技術(shù)還可以用于封閉其它配體對于HSA疏水性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，并且用于代替可能己經(jīng)結(jié)合于此的配體，并且所述配體比辛酸鹽具有更低的對HSA的親合性。在該工作之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)0.65mM的K-37和100mM的辛酸鹽是最佳的。實(shí)施例3-HDL的測量然后本發(fā)明人研究了是否可以鑒別血樣中存在的不同類型脂蛋白。因此，他們測試了利用除K-37以外的熒光探針例如尼羅紅的功效，以考察是否可以鑒別脂蛋白類型。令他們意外的是，他們發(fā)現(xiàn)通過利用尼羅紅代替K-37，可以確定血樣中HDL的濃度。力7去測量的原則是探針尼羅紅在HDL中比在LDL和VLDL中更有熒光性，后者具有非常類似但是不同的隨濃度的熒光響應(yīng)。尼羅紅的結(jié)構(gòu)圖解在圖8中。對于總脂蛋白，所述測量比K-37測量更復(fù)雜，因?yàn)楸仨殞碜訦DL中尼羅紅的過量熒光進(jìn)行計(jì)算，而不僅僅是全部脂蛋白的總熒光。程序如下-1)校準(zhǔn)將溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼羅紅以通常在4和10mM之間的多種總脂蛋白濃度與LDL混合(一般地，將50微升染料與50微升脂蛋白和lml磷酸鹽緩沖液混合)。將樣品放在熒光計(jì)中并測量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長450nm，發(fā)射波長600nm)。將熒光強(qiáng)度相對于LDL總脂質(zhì)濃度繪圖，給出了具有斜率"X"和截距"Y"的校準(zhǔn)直線，如圖9中所示。然后對于LDL和HDL的混合物重復(fù)所述程序。將HDL以0和3.0mM之間的濃度加入，加入LDL而對于全部樣品將總脂蛋白濃度保持在6mM(但是3-12mM將是界限)。然后測量這些樣品的熒光強(qiáng)度。然后對由于HDL存在而產(chǎn)生的過量熒光進(jìn)行繪圖，給出了具有斜率"Z"的校準(zhǔn)直線，如圖IO中圖解。2)未知物的測量在研究下，將溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼羅紅與樣品混合。在對于上述校準(zhǔn)的相同條件下，將樣品放入熒光計(jì)中并測量熒光強(qiáng)度。3)HDL濃度的計(jì)算HDL的計(jì)算需要知道總脂蛋白濃度"A"，其可以例如但非排他地從K-37的熒光強(qiáng)度測量。對于特定的樣品，將要預(yù)期是否樣品不包含HDL的熒光強(qiáng)度是從顯示在圖10中的校準(zhǔn)線獲得的。測量的熒光強(qiáng)度減去該計(jì)算的熒光強(qiáng)度而得到由于樣品中存在的HDL而產(chǎn)生的過量熒光。然后可以利用圖10中所示的校正線和下列等式獲得未知樣品中的HDL濃度"C":-C=(B-(AX-Y))/Z制備HDL/LDL/VLDL混合物的濃度范圍，意欲包括在實(shí)際臨床樣品中將預(yù)期的濃度范圍。將上面論述的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)用于計(jì)算來自所述混合物的HDL濃度。圖11圖解了真實(shí)HDL濃度和從尼羅紅熒光確定的HDL濃度之間的誤差，顯示最大誤差僅為大約0.15mM。本發(fā)明人還推敲了供血清樣品之用的尼羅紅濃度是0.4mM。作為這些數(shù)據(jù)結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)顯示可以鑒別存在于樣品中的脂蛋白類型，并且可以利用染料尼羅紅確定HDL濃度。在實(shí)施例2中描述的發(fā)現(xiàn)之后，關(guān)注于加入辛酸鹽以封閉HSA的疏水性結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明人然后觀察到，尼羅紅也結(jié)合到HSA并且發(fā)熒光。當(dāng)結(jié)合到HSA時(shí)，尼羅紅的這個(gè)另外熒光也引起實(shí)質(zhì)的背景信號，其失真并從而引起HDL測量中的顯著誤差。他們因此決定用如用于K-37封閉的相同配體結(jié)合抑制劑即辛酸鈉封閉HSA中的疏水性結(jié)合位點(diǎn)。用尼羅紅和HSA進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是基于實(shí)施例2中所論述的那些，并且全部利用0.5mM尼羅紅。表2樣品熒光強(qiáng)度尼羅紅加5mMLDL187.532尼羅紅加50mg/mlHSA58.905尼羅紅加5mMLDL+50mM辛酸鹽183.786尼羅紅加50mg/mlHSA+50mM辛酸鹽9.118PBS+50mM辛酸鹽7.382表2中表示的結(jié)果顯示，單獨(dú)在LDL中的尼羅紅的熒光強(qiáng)度是187.532單位。當(dāng)辛酸鹽加入到LDL時(shí)尼羅紅的熒光強(qiáng)度是183.786單位(即與無辛酸鹽的情況大致相同)，認(rèn)為辛酸鹽的存在未有助于獨(dú)自結(jié)合到LDL的K-37的熒光強(qiáng)度。結(jié)合到HSA的尼羅紅的熒光強(qiáng)度是58.905單位，而在HSA和辛酸鹽存在下的尼羅紅熒光強(qiáng)度是9.118。這說明HSA有助于尼羅紅熒光并且因此有助于干涉信號。辛酸鹽的加入顯著減少所述干涉并從而消除HSA的破裂作用。所述結(jié)果因此顯示尼羅紅與HSA在辛酸鹽存在下大量抑制熒光強(qiáng)度，但是對于LDL中的尼羅紅熒光的影響小。這顯示，辛酸鹽在封閉HSA上的尼羅紅結(jié)合位點(diǎn)是顯著成功的，使尼羅紅熒光成為脂蛋白濃度的真實(shí)測量。因此，本發(fā)明人相信可以將擬合HSA疏水性結(jié)合位點(diǎn)的配體結(jié)合抑制劑諸如辛酸鹽在測量尼羅紅熒光之前加入到血樣以改善脂蛋白(HDL)濃度的準(zhǔn)確性。在該工作之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)0.4mM尼羅紅和50mM或更優(yōu)選約100mM的辛酸鹽對于血清樣品的分析是最佳的。實(shí)施例6描述了其中可以通過添加結(jié)合至HSA藥物結(jié)合域的試劑(例如苯甲酸)而進(jìn)一步改善尼羅紅的熒光測量的進(jìn)一步開發(fā)工作。實(shí)施例4-產(chǎn)生脂蛋白分布的同時(shí)測定實(shí)施例1和3說明染料K37的熒光測量如何可以用于確定樣品中總脂蛋白濃度，和尼羅紅的熒光測量如何可以用于確定樣品中HDL濃度。實(shí)施例2描述了封閉HSA以改善由K-37熒光產(chǎn)生的結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，本發(fā)明人認(rèn)識到，可以產(chǎn)生單一平行方法用于分析患者血樣的脂質(zhì)組成以便產(chǎn)生該患者的脂蛋白分布。優(yōu)選方法由兩個(gè)測定組成，都可以在非常類似的條件下進(jìn)行，并且由此，可以非常迅速地產(chǎn)生結(jié)果。臨床醫(yī)生可以使用該信息以決定治療過程。方法最初從患者取血樣，然后利用充分建立的常規(guī)方法離心以便分離血清。然后將血清分成兩個(gè)1ml的等分部分(a&b)，將每個(gè)進(jìn)行生物化學(xué)分析以確定脂質(zhì)成分的濃度。將等分部分(a)用于確定總脂蛋白濃度；并且將等分部分(b)用于確定HDL濃度，如下所述。等分部分(a)-將HSA配體結(jié)合抑制劑辛酸鈉加入到1ml血清至100mM的濃度，如上面實(shí)施例2中所描述。然后將溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的探針K-37在攪拌下緩慢加入到樣品至0.7mM的終濃度。然后在約450nm激發(fā)樣品以便引起所述探針發(fā)熒光。在上述520nm或540nm的發(fā)射波長測量所述熒光，并且然后由此值可以確定樣品中總脂蛋白(HDL、LDL、和VLDL)的濃度，如上面實(shí)施例l中所描述。等分部分(b)-將HSA配體結(jié)合抑制劑辛酸鈉加入到1ml血清至50mM或100mM的濃度，如上面實(shí)施例3中所描述。此外，可以將苯甲酸加入到所述血清至5mM的濃度。然后在攪拌之下緩慢將探針尼羅紅加入到樣品至0.4mM的終濃度。然后在600nm激發(fā)樣品以便引起所述探針發(fā)熒光。在620nm的發(fā)射波長測量所述熒光，并且然后由此值可以確定樣品中HDL濃度，如上面實(shí)施例3中所描述。實(shí)施例5-用于產(chǎn)生脂蛋白分布的裝置關(guān)于圖12-14，顯示了由本發(fā)明人開發(fā)的便攜裝置，其可用于產(chǎn)生患者的脂蛋白分布。所述裝置由詳細(xì)顯示在圖12中的盒1和顯示在圖13和14中的閱讀器50組成。盒1具有一系列互連的儲(chǔ)器，沿著所述儲(chǔ)器流體可以流動(dòng)，以便進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的測定。盒1經(jīng)由縫52插入到閱讀器50用于對盒1中進(jìn)行的這些測定的每一個(gè)檢測和測量熒光強(qiáng)度。關(guān)于圖12，盒1具有樣品儲(chǔ)器2，其中包含取自患者的生物流體諸如血液。提供過濾器18，用于從血液除去血細(xì)胞，留下淋巴或血清或其它體液，用其進(jìn)行所述測定。將所述流體分成兩個(gè)等分部分(a和b，如實(shí)施例4屮所述)，并沿著通道分別推進(jìn)到反應(yīng)儲(chǔ)器4、8中。將分別含有K-37和辛酸鈉的兩個(gè)試劑儲(chǔ)器10、12連接到反應(yīng)儲(chǔ)器4(等分部分(a))。將染料和辛酸鹽推進(jìn)到反應(yīng)儲(chǔ)器4中并啟動(dòng)總脂蛋白測定。將分別含有尼羅紅；和辛酸鈉+任選苯甲酸的兩個(gè)試劑儲(chǔ)器16、17連接到反應(yīng)儲(chǔ)器8(等分部分(b))。將尼羅紅和辛酸鹽推進(jìn)到儲(chǔ)器8中，與所述流體混合，并啟動(dòng)HDL測定。應(yīng)當(dāng)理解，可以使一個(gè)含有辛酸鈉的一個(gè)試劑儲(chǔ)器代替兩個(gè)儲(chǔ)器12、17，并且可以將辛酸鹽從這一個(gè)儲(chǔ)器根據(jù)需要進(jìn)料到反應(yīng)儲(chǔ)器4、8。所述盒也包括熒光標(biāo)準(zhǔn)20、24，可以將其分別用于校準(zhǔn)閱讀器50。在所述裝置(即盒1和閱讀器50)的一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)測定在反應(yīng)儲(chǔ)器4,8中進(jìn)行。將盒1插入到閱讀器50前面的縫52，如圖13所示。將盒1開槽到閱讀器50中，引起兩個(gè)反應(yīng)儲(chǔ)器4、8與存在于閱讀器50中的相應(yīng)的激發(fā)裝置(光源30、34)以及相應(yīng)的檢測裝置(光電二極管36、40)各自對齊。在另一個(gè)實(shí)施方案中，閱讀器50可以僅具有一個(gè)光源或LED，代替用于每個(gè)儲(chǔ)器4、8的單獨(dú)LEDs。LEDs(或來自LED的波導(dǎo)管P0、34每個(gè)為相應(yīng)的測定提供需要的熒光激發(fā)照明用于使各自的測定發(fā)熒光。來自LEDs30、34的每一個(gè)光波長大約在450-470nm，并且對于一些測定實(shí)施方案也可以是大約600nm。所述光可以經(jīng)過450nm或600nm的干涉濾波器(未顯示)，之后將其定向到反應(yīng)儲(chǔ)器4、8。閱讀器50可以具有激發(fā)校正系統(tǒng)46。因此，將兩個(gè)測定(a和b)的熒光用透鏡或類似的收集光學(xué)器件收集，并且對于測定a(總脂蛋白)可以在540nm的波長和對于測定b(HDL)在約600nm或620nm的波長經(jīng)過起偏振器。備選地，可以將普通的起偏振器用于這兩個(gè)測定。為了測量熒光強(qiáng)度，光電二極管36、40的電流輸出放大并讀出為電流或電壓。因此，將閱讀器50配置成保持盒1以檢測并測量兩個(gè)測定的每一個(gè)的熒光強(qiáng)度，從而確定總脂蛋白和HDL濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置具有LCD讀數(shù)顯示42，在其上顯示每一血液組分的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案，所述閱讀器50可以由PC的USB端口、便攜式電腦、PDA26提供動(dòng)力并且具有通過其提供的它的讀數(shù)，使臨床醫(yī)生讀出關(guān)于脂蛋白濃度信息。備選地，所述裝置可以包含所述盒和測量儀器的兩個(gè)方面并且包含可以計(jì)算每一脂質(zhì)組分本身濃度的微處理器44。所述盒1和閱讀器裝置50的優(yōu)勢在于快速并容易的測定系統(tǒng)，其可以同時(shí)進(jìn)行以產(chǎn)生來自生物流體的脂蛋白分布。然后臨床醫(yī)生可以決定有效的治療過程。所述盒l(wèi)是可任意使用的并且可以便宜地制造，準(zhǔn)備有用于兩個(gè)測定的試劑。實(shí)施例6:根據(jù)本發(fā)明測定的進(jìn)一步優(yōu)化在人血清樣品上進(jìn)行進(jìn)一步測試以研究用于誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明方法的指示HDL水平的熒光的最佳激發(fā)波長。本發(fā)明人測試了許多波長并且確定，當(dāng)利用尼羅紅時(shí)，600nm的激發(fā)波長和620nm的發(fā)射波長提供最佳結(jié)果(參見圖15)。令本發(fā)明人意外的是，該激發(fā)波長是最佳的，因?yàn)樗_(dá)到所述光譜的非常長波長的邊緣。對于某些樣品，本發(fā)明人觀察到具有460nm激發(fā)波長和620nm發(fā)射波長的更有噪聲(noisier)的圖(參見圖16)。本發(fā)明人相信，當(dāng)在600nm激發(fā)時(shí)，尼羅紅在HDL中比VLDL和LDL多發(fā)約5倍的熒光，與之相反，在460nm激發(fā)時(shí)，在那里它僅多發(fā)約2倍的熒光。當(dāng)從LDL加VLDL的標(biāo)準(zhǔn)曲線減去時(shí)，這為噪聲提供了更好的信號。雖然本發(fā)明人不希望受限于任何假設(shè)，但是他們相信在460nm激發(fā)時(shí)在血清樣品中觀察到的"噪聲"是信噪比的效應(yīng)。本發(fā)明人注意到尼羅紅結(jié)合至HSA并且特別是在低脂質(zhì)濃度。他們因此在HDL(+辛酸鹽)或HSA(+辛酸鹽)存在下都在460nm和600nm的激發(fā)波長進(jìn)行尼羅紅熒光的光譜分析(參見圖17)。這些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生出乎意料的光譜行為，本發(fā)明人相信這可以由下列事實(shí)解釋，即尼羅紅是在剛性的但是(but)極性的環(huán)境(HAS上結(jié)合位點(diǎn))中，并且尼羅紅顯示扭曲的分子內(nèi)電荷傳遞(TICT)(Joumalof激發(fā)和發(fā)射頻變至更長的波長。在這激發(fā)狀態(tài)中的分子具有不同的偶極矩并且因此表現(xiàn)類似一個(gè)不同的種。在600nm激發(fā)時(shí)，由于與其它脂蛋白相比較的HDL中尼羅紅之間超過TICT狀態(tài)激發(fā)補(bǔ)償?shù)妮^大信號差異，產(chǎn)生更好的信噪比，因?yàn)門ICT熒光是通過620nm發(fā)射波長設(shè)置排除的。換言之，雖然本發(fā)明人在600nm更理想地激發(fā)HSA/尼羅紅，但是它的熒光受到儀器拒絕。這引導(dǎo)本發(fā)明人認(rèn)識到，通過利用另外封閉劑可以進(jìn)一步改進(jìn)HDL/尼羅紅測定。他們嘗試封閉HSA藥物結(jié)合域的試劑。令他們意外的是，他們發(fā)現(xiàn)大約5mM的試劑諸如苯甲酸以及它的三氯和三碘衍生物全部對于從HSA置換尼羅紅起作用，而不影響脂蛋白發(fā)熒光。苯甲酸具有猝滅溶液中尼羅紅殘留熒光約20%的附加優(yōu)點(diǎn)。權(quán)利要求1.確定樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法，所述方法包含下列步驟-(i)將0.2mM-1.0mM探針物質(zhì)K-37(此處定義)加入到樣品的第一等分部分，所述探針物質(zhì)結(jié)合樣品中的脂蛋白，并且當(dāng)其如此結(jié)合時(shí)在適當(dāng)激發(fā)下發(fā)熒光；和(ii)利用熒光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中加入到第一等分部分的K-37濃度在大約0.5-0.85mM之間。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述方法包含將配體結(jié)合抑制劑加入到第一等分部分，所述配體結(jié)合抑制劑適合于基本上抑制所述探針物質(zhì)與人血清白蛋白上的疏水性結(jié)合域的結(jié)合，之后確定脂蛋白或HDL濃度。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述配體結(jié)合抑制劑包含脂肪酸或其功能衍生物。5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的方法，其中所述配體結(jié)合抑制劑包含辛酸(Cs)或其衍生物，例如，辛酸鹽(酯)。6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中，對于每個(gè)步驟，通過在400nm-650nm的激發(fā)波長激發(fā)第一等分部分來誘導(dǎo)熒光，并且在約540nm-700nm之間的發(fā)射波長測量得到的熒光。7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含確定脂蛋白特定類別或亞類濃度的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中將第二探針物質(zhì)加入到樣品的第二等分部分；其中第二探針結(jié)合脂蛋白的特定類別或亞類，以致當(dāng)與它們結(jié)合時(shí)所述第二探針在適當(dāng)激發(fā)之下改變熒光產(chǎn)率；并且該熒光指示脂蛋白特定類別或亞類的濃度。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中脂蛋白的類別或亞類是HDL。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中第二探針物質(zhì)是尼羅紅。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中加入到樣品的探針物質(zhì)尼羅紅的濃度在大約0.1-0.9mM之間。12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任何一項(xiàng)的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求5-7任何一項(xiàng)的配體結(jié)合抑制劑加入到第二等分部分。13.根據(jù)權(quán)利要求8-12任何一項(xiàng)的方法，其中將封閉HSA藥物結(jié)合域的試劑也加入到第二等分部分，之后確定HDL濃度。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述試劑是苯甲酸或其鹽或衍生物。15.根據(jù)權(quán)利要求10-14任何一項(xiàng)的方法，其中通過在400nm-650nm之間的激發(fā)波長激發(fā)第二等分部分并且在約540nm-700rnn之間的發(fā)射波長測量得到的熒光來誘導(dǎo)熒光。16.根據(jù)權(quán)利要求10-15任何一項(xiàng)的方法，其中通過在400nm-500nm之間的激發(fā)波長激發(fā)第一等分部分；在約600nm的激發(fā)波長激發(fā)第二等分部分；并且在約620nm的發(fā)射波長測量從每個(gè)等分部分得到的熒光來誘導(dǎo)熒光。17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是生物流體。18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包含血漿或血清，或淋巴。19.一種裝置，用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求l-18任何一項(xiàng)的脂蛋白測定，所述裝置包含反應(yīng)儲(chǔ)器；適合于含有根據(jù)權(quán)利要求1-18任何一項(xiàng)方法所需試劑的容納裝置；可操作用于激發(fā)所述樣品以便它發(fā)熒光的激發(fā)裝置，和可操作用于檢測由所述樣品發(fā)射的熒光的檢測裝置。20.根據(jù)權(quán)利要求19的裝置，其中所述裝置包含閱讀器和盒，所述盒包含所述反應(yīng)儲(chǔ)器和所述容納裝置。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的裝置，其中所述激發(fā)裝置包含照明源，可操作用于在大約460nm并且也任選在600nm照亮所述樣品。22.根據(jù)權(quán)利要求19-21任何一項(xiàng)的裝置，其中所述檢測裝置在大約500nm-700nm檢測由樣品發(fā)射的熒光。全文摘要本發(fā)明涉及確定樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法。所述方法包含下列步驟將結(jié)合樣品中脂蛋白的探針物質(zhì)K-37加入到樣品的等分部分，并且當(dāng)其如此結(jié)合時(shí)在適當(dāng)激發(fā)下發(fā)熒光。然后利用熒光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。所述方法可以采用對于脂蛋白的類別或亞類是特異性的第二探針物質(zhì)，以便使用者可以鑒別脂蛋白。本發(fā)明還涉及可以用于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。文檔編號G01N35/00GK101133329SQ200580047864公開日2008年2月27日申請日期2005年12月12日優(yōu)先權(quán)日2004年12月11日發(fā)明者加雷斯·羅伊斯頓·瓊斯,戴維·托馬斯·克拉克申請人:科學(xué)技術(shù)設(shè)備委員會(huì)