專利名稱：建立疏血通注射液或其中間體指紋圖譜的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疏血通注射液或其中間體指紋圖譜的建立方法和疏血通注射液或其中間體的鑒別方法，具體來說，是采用高效液相色譜法(HPLC)來建立疏血通注射液或其中間體指紋圖譜以及用指紋圖譜來鑒別疏血通注射液或其中間體。
背景技術：
疏血通注射液，是由水蛭、地龍兩味藥材的水提取物作為藥物活性成分的中藥注射劑是一種高效速效的治療心腦血管疾病的注射劑。中國專利申請03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7分別公開了疏血通注射液及其制備過程，前述申請的全部內容，引入本申請作為參考。
水蛭作為經(jīng)典的破血逐淤藥物，為中國藥典所收載。中國藥典收載的水蛭藥材品種有三種，其中作為藥用主要品種為水蛭科動物螞蟥(Whitmania pigra Whitman)。水蛭的主藥成分為蛋白質、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖類以及微量元素等。對水蛭中蛋白質、氨基酸、糖類及微量元素等成分的定性、定量研究已多有報道，主藥方法為薄層色譜法、高效液相色譜法、電泳法等。其中小分子成分主要為次黃嘌呤、黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷等，嘧啶和嘌呤均為含有N原子的不飽和的雜環(huán)化合物。
地龍作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿之功效，為中國藥典所收載。中國藥典收載的地龍藥材品種有四種，其中作為藥用主要品種為鉅引科動物參環(huán)毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，習稱廣地龍。地龍的主藥成分為蛋白質、氨基酸、核酸、酶、糖類等。對地龍中蛋白質、氨基酸等成分的定性、定量研究已有報道。其中小分子成分主要為次黃嘌呤及含氮化合物。
水蛭和地龍的化學成分復雜，因此，其制劑的質量控制，如果單用其中個別活性成分來說明藥物質量，具有一定的片面性。要控制其質量，最好采用它的物質群整體予以控制。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，對于有效控制中藥材或中成藥的質量，具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內部采用高效液相指紋圖譜控制質量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質群的整體作用結果，而對這樣一個整體的質量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質群的質量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanicalDrug(Draft).2000 August)。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質量控制方法，目前已經(jīng)成為國際共識。

發(fā)明內容
關于水蛭、地龍成分測定、藥材鑒別以及其制劑質量控制的方法有許多報道，但對它們指紋圖譜的建立方法卻未見報道。本發(fā)明在水蛭、地龍的水提取物作為藥物活性成分制劑質量控制研究的基礎上，對其指紋圖譜的建立方法進行了研究。
本發(fā)明的目的是通過對水蛭、地龍的水提取物作為藥物活性成分的制劑的HPLC指紋圖譜研究，摸索出一種水蛭、地龍的水提取物作為藥物活性成分制劑質量控制的方法，建立水蛭、地龍的水提取物作為藥物活性成分制劑、尤其是疏血通注射液或其中間體的標準指紋圖譜的方法，借此可將其作為質量控制及真?zhèn)舞b別的指標之一。本發(fā)明還同時提供了相應的標準指紋圖譜。
本發(fā)明通過下列步驟實施一種藥物指紋圖譜的建立方法，其中所述藥物是以水蛭和地龍的水提取物作為活性成分，包括如下步驟(1)制備供試品溶液；(2)制備參照物溶液；(3)測定分別精密吸取供試品溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，制定指紋圖譜；其特征在于，參照物為次黃嘌呤，高效液相色譜的條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為磷酸鹽(優(yōu)選磷酸二氫鉀)-水-甲醇梯度洗脫液，檢測波長為220nm～300nm。
其中，上述所述的藥物為注射劑，尤其是溶液型注射劑、注射用無菌粉末、注射用濃溶液、混懸型注射劑或乳劑型注射劑。
其中，上述所述的水蛭和地龍的水提取物是通過包含如下步驟的方法進行制備(1)水蛭、地龍用注射用水或生理鹽水洗凈，破碎形成勻漿，經(jīng)反復冷凍和解凍(解融)，離心分離，取上清夜；(2)上清液進行超濾，得到透過液或濾液；(3)將透過液或濾液用離子交換柱層析處理；(4)將步驟(3)所得到的洗脫液進行脫鹽處理，得到水蛭和地龍的提取物。
或者，上述所述的水蛭和地龍的水提取物是通過包含如下步驟的方法進行制備(1)水蛭、地龍用注射用水或生理鹽水洗凈，低溫浸漬，過慮，得到濾液和藥渣；(2)藥渣破碎后，與步驟(1)的濾液混合，形成勻漿，將勻漿反復冷凍和解凍，離心分離，取上清夜；
(3)將上清液進行超濾，得到透過液或濾液；(4)將步驟(3)所得到的透過液或濾液進行熱壓處理后，再進行超濾，得到水蛭和地龍的提取物。
上述所提及的水蛭、地龍，可以為干品，也可以為鮮品。
上述所述的水蛭、地龍的水提取物的制備方法，其中水蛭、地龍是分別提取或者混合在一起進行提取。
特別是，03148281.3、200410101538.8以及200510000266.7申請所公開的疏血通注射液制備過程，其全部內容，引入本申請作為本發(fā)明的一部分。
作為本發(fā)明一具體實施方案，本發(fā)明提供一種疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟(1)標準(對照)溶液的制備取疏血通注射液或其中間體，如果需要，用微孔濾膜(0.45um)濾過，作為標準(對照)溶液；(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；(3)測定分別精密吸取標準(對照)溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄50分鐘色譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和50％甲醇的梯度洗脫液，檢測波長為254±1nm。
上述所述的流動相梯度，優(yōu)選為

其中，柱溫為室溫；流速為0.8～1ml/min，優(yōu)選為0.8ml/min。理論板數(shù)按次黃嘌呤計算不低于9000。
其中，標準(對照)溶液的制備中，對于疏血通注射液，取注射液即可以作為標準(對照)溶液；對于疏血通注射液中間體，可以通過微孔濾膜(0.45um)濾過后作為標準(對照)溶液。
其中，所述的疏血通注射液中間體，是指水蛭、地龍經(jīng)浸漬、搗碎研磨、冷凍解融、分離純化的注射用水或生理鹽水的提取液，按照一定的比例混合后得到的均質溶液，其內在質量特征與成品有高度的一致性。
上述所述的方法，得到的疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜中，共有特征指紋峰有15個，其峰面積總和占總峰面積的95％以上。
其中，所述疏血通注射液標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.325～0.344，相對峰面積0.053～0.064；2號峰相對保留時間0.477～0.493，相對峰面積0.031～0.049；3號峰相對保留時間0.522～0.554，相對峰面積0.218～0.368；5號峰相對保留時間0.728～0.736，相對峰面積0.012～0.032；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.197～1.205，相對峰面積0.083～0.141；7號峰相對保留時間1.320～1.424，相對峰面積0.075～0.139；8號峰相對保留時間1.449～1.557，相對峰面積0.011～0.036；9號峰相對保留時間1.650～1.768，相對峰面積0.059～0.115；10號峰相對保留時間1.696～1.814，相對峰面積0.077～0.148；11號峰相對保留時間2.015～2.152，相對峰面積0.018～0.026；12號峰相對保留時間2.086～2.234，相對峰面積0.029～0.044；13號峰相對保留時間2.258～2.429，相對峰面積0.018～0.028；14號峰相對保留時間2.385～2.565，相對峰面積0.019～0.026；15號峰相對保留時間2.635～2.820，相對峰面積0.007～0.010。
更具體地，其中，所述疏血通注射液標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.336，相對峰面積0.060；2號峰相對保留時間0.486，相對峰面積0.041；3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.258～0.362；5號峰相對保留時間0.731，相對峰面積0.024；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.201，相對峰面積0.108～0.155；7號峰相對保留時間1.372，相對峰面積0.083～0.117；8號峰相對保留時間1.506，相對峰面積0.027；9號峰相對保留時間1.714，相對峰面積0.102；10號峰相對保留時間1.759，相對峰面積0.080～0.136；11號峰相對保留時間2.089，相對峰面積0.021；12號峰相對保留時間2.166，相對峰面積0.036；13號峰相對保留時間2.347，相對峰面積0.023；14號峰相對保留時間2.482，相對峰面積0.022；15號峰相對保留時間2.734，相對峰面積0.008。
其中，所述疏血通注射液中間體標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自
1號峰相對保留時間0.316～0.351，相對峰面積0.055～0.111；2號峰相對保留時間0.471～0.495，相對峰面積0.041～0.084；3號峰相對保留時間0.525～0.574，相對峰面積0.190～0.318；5號峰相對保留時間0.724～0.736，相對峰面積0.016～0.032；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.196～1.208，相對峰面積0.076～0.140；7號峰相對保留時間1.312～1.410，相對峰面積0.017～0.120；8號峰相對保留時間1.426～1.548，相對峰面積0.017～0.042；9號峰相對保留時間1.582～1.770，相對峰面積0.019～0.116；10號峰相對保留時間1.620～1.848，相對峰面積0.012～0.134；11號峰相對保留時間1.964～2.146，相對峰面積0.021～0.045；12號峰相對保留時間2.044～2.231，相對峰面積0.032～0.056；13號峰相對保留時間2.204～2.417，相對峰面積0.021～0.033；14號峰相對保留時間2.324～2.559，相對峰面積0.016～0.021；15號峰相對保留時間2.499～2.812，相對峰面積0.006～0.014。
更具體地，其中，所述疏血通注射液中間體標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.332，相對峰面積0.072；2號峰相對保留時間0.484，相對峰面積0.050；3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.217～0.295；5號峰相對保留時間0.730，相對峰面積0.026；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.202，相對峰面積0.089～0.130；7號峰相對保留時間1.367，相對峰面積0.089；8號峰相對保留時間1.492，相對峰面積0.027；9號峰相對保留時間1.689，相對峰面積0.082；10號峰相對保留時間1.733，相對峰面積0.096；11號峰相對保留時間2.039，相對峰面積0.033；12號峰相對保留時間2.123，相對峰面積0.041；13號峰相對保留時間2.291，相對峰面積0.029；14號峰相對保留時間2.422，相對峰面積0.018；15號峰相對保留時間2.664，相對峰面積0.011。
其中，1、2、8、11、13、14、15號峰為水蛭藥材特有峰；9、10號峰為地龍藥材特有峰；3、5、S、6、7、12號峰為水蛭、地龍藥材共有峰；10號峰有時有一肩峰，峰面積合并計算。
作為本發(fā)明又一目的，還提供一種疏血通注射液或其中間體的鑒別方法，包括如下步驟
(1)測定待測疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜；(2)將待測疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜與疏血通注射液或其中間體標準(對照)指紋圖譜對比，篩選符合疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜的疏血通注射液或其中間體；其中，步驟(1)是按照上述所述的疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜建立方法測定，步驟(2)的疏血通注射液或其中間體標準(對照)指紋圖譜分別為上述所述的疏血通注射液或其中間體標準(對照)指紋圖譜。
本發(fā)明的優(yōu)點主要有(1)以水蛭、地龍水溶性提取物建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著以水蛭、地龍大部分藥理活性，能有效地表征制劑的質量。水蛭的主要活性成分為水蛭素等水溶性成分，地龍的主要活性成分為蚓激酶等水溶性成分，故用水蛭、地龍的水提取物成分作為監(jiān)控指標就更具有代表性。
(2)以水蛭、地龍制劑整個指紋圖形作為一個整體看待，注重各個構成指紋特征峰的前后順序和相互關系，注重整體面貌特征，既避免了因只測定一、二個化學成分而判定制劑整體質量的片面性，又減少了為質量達標而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準確評價以水蛭、地龍的水提取物作為藥物活性成分的制劑、特別是疏血通注射液或其中間體的質量提供了新的對照標準，將為提高產(chǎn)品的質量及療效做出貢獻。
(3)本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。


圖1參照物次黃嘌呤HPLC圖譜圖2疏血通注射液對照溶液指紋圖譜(0～50分鐘)圖3疏血通注射液中間體對照溶液指紋圖譜(0～50分鐘)圖4相關性試驗陰性對照——水蛭提取液指紋圖譜(0～50分鐘)圖5相關性試驗陰性對照——地龍?zhí)崛∫褐讣y圖譜(0～50分鐘)圖6相關性試驗疏血通注射液指紋圖譜(0～50分鐘)圖7相關性試驗疏血通注射液中間體指紋圖譜(0～50分鐘)具體實施方式
以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明，但不構成對本發(fā)明的限制。
實施例1水蛭標準指紋圖譜的建立方法1、儀器與試劑試驗中先后在惠普高效液相色譜儀及色譜工作站HP1100、島津高效液相色譜儀LC2010A進行測試。
甲醇為色譜純，水為蒸餾水，磷酸二氫鉀為分析純。
次黃嘌呤對照品為上海生化廠進口分裝品，經(jīng)HPLC歸一化法測得純度為99.6％。
水蛭對照藥材為山東省微山湖所產(chǎn)，經(jīng)黑龍江省藥品檢驗所鑒定為水蛭科動物螞蟥(Whitmania pigra Whitman)。
地龍對照藥材為廣西玉林所產(chǎn)，經(jīng)黑龍江省藥品檢驗所鑒定為鉅引科動物參環(huán)毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))。
疏血通注射液以及疏血通注射液中間體由牡丹江友博制藥有限公司提供，分別為10批。
2、色譜條件色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相A0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，B50％甲醇，梯度為

檢測波長為254nm，柱溫為室溫；流速為0.8ml/min，理論板數(shù)按次黃嘌呤峰計算應不低于9000。
3、指紋圖譜測定(1)疏血通注射液指紋圖譜制備參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品10mg，精密稱重，置100ml瓶中，加0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成參照物溶液；疏血通注射液對照溶液的制備取注射液作為疏血通對照品溶液；分別精密吸取參照物溶液與對照溶液各10ul，注入液相色譜儀，記錄50分鐘色譜。以次黃嘌呤色譜峰(S峰)的保留時間和峰面積為1，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積比值。
參照物次黃嘌呤HPLC圖譜和疏血通注射液指紋圖譜(0～50分鐘)，分別見圖1和2。
(2)共有峰的確定根據(jù)10批疏血通注射液指紋圖譜給出的相關參數(shù)，疏血通注射液的色譜峰在50分鐘內全部出現(xiàn)。比較各批藥材的色平臺，確定了15個共有特征指紋峰，其峰面積總和占總峰面積的95％以上。
以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，所得到的疏血通注射液標準指紋圖譜中共有特征指紋峰的保留時間和峰面積見表1和2。
實施例2疏血通注射液中間體指紋圖譜的建立方法除標準溶液的制備不同外，其余條件和操作均按照實施例1進行。
疏血通注射液中間體標準溶液的制備取疏血通注射液中間體，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即得。
所得到疏血通注射液中間體指紋圖譜(0～50分鐘)，見圖3。
共有峰的確定根據(jù)10批疏血通注射液中間體指紋圖譜給出的相關參數(shù)，疏血通注射液中間體的色譜峰在50分鐘內全部出現(xiàn)。比較各批藥材的色平臺，確定了15個共有特征指紋峰，其峰面積總和占總峰面積的95％以上。
以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，所得到的疏血通注射液中間體標準指紋圖譜中共有特征指紋峰的保留時間和峰面積見表3和4。
實施例3指紋圖譜的穩(wěn)定性試驗按照指紋圖譜穩(wěn)定性測定方法操作，取疏血通注射液，考察16小時溶液穩(wěn)定，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。供試品常溫16小時內穩(wěn)定，符合指紋圖譜的技術要求(見表5和6)。
實施例4指紋圖譜的精密度試驗按照指紋圖譜精密度規(guī)定方法操作，取疏血通注射液，取1份，連續(xù)進樣5次，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％，儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好，基本符合指紋圖譜的技術要求(見表7和8)。
實施例5指紋圖譜的重現(xiàn)性試驗按照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，取疏血通注射液，取6份，分別檢測指紋圖譜，對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％，符合指紋圖譜的技術要求(見表9和10)。
實施例6疏血通注射液產(chǎn)品的藥材、中間體和注射液指紋圖譜的相關性試驗分別對疏血通注射液產(chǎn)品的藥材、中間體和成品進行了HPLC分析。結果表明，成品中各特征峰均可在藥材及中間體指紋圖譜中得到追蹤，而且中間體與成品的指紋圖譜非常接近。結果見圖4～7。
表1疏血通注射液共有峰保留時間和相對保留時間

表2疏血通注射液共有峰及非共有峰面積的比值(1)

表2 疏血通注射液共有峰及非共有峰面積的比值(2)

※非共有峰面積百分比表3疏血通注射液中間體共有峰保留時間和相對保留時間

表4疏血通注射液中間體共有峰及非共有峰面積的比值(1)

表4疏血通注射液中間體共有峰及非共有峰面積的比值(2)

※非共有峰面積百分比表4疏血通注射液穩(wěn)定性試驗結果(示保留時間和相對保留時間)

表5疏血通注射液穩(wěn)定性試驗結果(示峰面積和峰面積比值)

表6疏血通注射液精密度試驗結果(示保留時間和相對保留時間)

表7疏血通注射液精密度試驗結果(示峰面積和峰面積比值)

表8疏血通注射液重現(xiàn)性試驗結果(示保留時間和相對保留時間)

表9疏血通注射液重現(xiàn)性試驗結果(示峰面積和峰面積比值)

相對保留時間1號峰0.336 2號峰0.486 3號峰0.543 5號峰0.731S號峰1.000 6號峰1.201 7號峰1.372 8號峰1.5069號峰1.714 10號峰1.759 11號峰2.089 12號峰2.16613號峰2.347 14號峰2.482 15號峰2.734特征指紋峰峰面積相對比值1號峰0.060 2號峰0.041 3號峰0.290±25％ 5號峰0.024S號峰1.000 6號峰0.119±30％ 7號峰0.107±30％ 8號峰0.0279號峰0.102 10號峰0.114±30％ 11號峰0.021 12號峰0.03613號峰0.023 14號峰0.022 15號峰0.008特征指紋峰描述圖譜中1、2、8、11、13、14、15號峰為水蛭藥材特有峰；9、10號峰為地龍藥材特有峰；3、5、S、6、7、12號峰為水蛭、地龍藥材共有峰；10號峰有時有一肩峰，峰面積合并計算。
圖2疏血通注射液標準指紋圖譜相對保留時間1號峰0.332 2號峰0.484 3號峰0.543 5號峰0.730S號峰1.000 6號峰1.202 7號峰1.367 8號峰1.4929號峰1.689 10號峰1.733 11號峰2.039 12號峰2.12313號峰2.291 14號峰2.422 15號峰2.664特征指紋峰峰面積相對比值1號峰0.072 2號峰0.050 3號峰0.254±25％ 5號峰0.026S號峰1.000 6號峰0.108±30％ 7號峰0.089 8號峰0.0279號峰0.082 10號峰0.096 11號峰0.033 12號峰0.04113號峰0.029 14號峰0.018 15號峰0.011圖3疏血通注射液中間體標準指紋圖譜
Detector A(254nm)

圖4相關性試驗陰性對照——水蛭提取液指紋圖譜
Detector A(254nm)

圖5相關性試驗陰性對照——地龍?zhí)崛∫褐讣y圖譜
Detector A(254nm)

圖6相關性試驗疏血通注射液指紋圖譜
Detector A(254nm)

圖7相關性試驗疏血通注射液中間體指紋圖譜
權利要求
1.一種藥物指紋圖譜的建立方法，其中所述藥物是以水蛭和地龍的水提取物作為活性成分，包括如下步驟(1)制備供試品溶液；(2)制備參照物溶液；(3)測定分別精密吸取供試品溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，制定指紋圖譜；其特征在于，參照物為次黃嘌呤，高效液相色譜的條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為磷酸鹽(優(yōu)選磷酸二氫鉀)-水-甲醇梯度洗脫液，檢測波長為220nm～300nm。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的藥物為注射劑，尤其是溶液型注射劑、注射用無菌粉末、注射用濃溶液、混懸型注射劑或乳劑型注射劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述的水蛭和地龍的水提取物是通過包含如下步驟的方法進行制備(1)水蛭、地龍用注射用水或生理鹽水洗凈，破碎形成勻漿，經(jīng)反復冷凍和解融，離心分離，取上清夜；(2)上清液進行超濾，得到透過液或濾液；(3)將透過液或濾液用離子交換柱層析處理；(4)將步驟(3)所得到的洗脫液進行脫鹽處理，得到水蛭和地龍的提取物。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述的水蛭和地龍的水提取物是通過包含如下步驟的方法進行制備(1)水蛭、地龍用注射用水或生理鹽水洗凈，低溫浸漬，過慮，得到濾液和藥渣；(2)藥渣破碎后，與步驟(1)的濾液混合，形成勻漿，將勻漿反復冷凍和解融，離心分離，取上清夜；(3)上清液進行超濾，得到透過液或濾液；(4)將步驟(3)所得到的透過液或濾液進行熱壓處理后，再進行超濾，得到水蛭和地龍的提取物。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的方法，其中水蛭、地龍為干品或鮮品。
6.根據(jù)權利要求3-5所述的方法，其中水蛭、地龍是分別提取或者混合在一起進行提取。
7.一種疏血通注射液或其中間體的標準(或對照)指紋圖譜建立方法，包括如下步驟(1)對照溶液的制備取疏血通注射液或其中間體，如果需要，用微孔濾膜(0.45um)濾過，作為對照溶液；(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；(3)測定分別精密吸取對照溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄50分鐘色譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和50％甲醇的梯度洗脫液，檢測波長為254±1nm。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述的流動相梯度為按體積比計算，0分鐘時100％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，5分鐘時100％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，10分鐘時99％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和1％的50％甲醇，50分鐘時100％的50％甲醇。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其中所述疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜中，共有特征指紋峰有15個，其峰面積總和占總峰面積的95％以上。
10.根據(jù)權利要求7-9所述的方法，其中所述疏血通注射液標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.325～0.344，相對峰面積0.053～0.064；2號峰相對保留時間0.477～0.493，相對峰面積0.031～0.049；3號峰相對保留時間0.522～0.554，相對峰面積0.218～0.368；5號峰相對保留時間0.728～0.736，相對峰面積0.012～0.032；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.197～1.205，相對峰面積0.083～0.141；7號峰相對保留時間1.320～1.424，相對峰面積0.075～0.139；8號峰相對保留時間1.449～1.557，相對峰面積0.011～0.036；9號峰相對保留時間1.650～1.768，相對峰面積0.059～0.115；10號峰相對保留時間1.696～1.814，相對峰面積0.077～0.148；11號峰相對保留時間2.015～2.152，相對峰面積0.018～0.026；12號峰相對保留時間2.086～2.234，相對峰面積0.029～0.044；13號峰相對保留時間2.258～2.429，相對峰面積0.018～0.028；14號峰相對保留時間2.385～2.565，相對峰面積0.019～0.026；15號峰相對保留時間2.635～2.820，相對峰面積0.007～0.010。
11.根據(jù)權利要求7-10所述的方法，其中所述疏血通注射液標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.336，相對峰面積0.060；2號峰相對保留時間0.486，相對峰面積0.041；3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.258～0.362；5號峰相對保留時間0.731，相對峰面積0.024S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.201，相對峰面積0.108～0.155；7號峰相對保留時間1.372，相對峰面積0.083～0.117；8號峰相對保留時間1.506，相對峰面積0.027；9號峰相對保留時間1.714，相對峰面積0.102；10號峰相對保留時間1.759，相對峰面積0.080～0.136；11號峰相對保留時間2.089，相對峰面積0.021；12號峰相對保留時間2.166，相對峰面積0.036；13號峰相對保留時間2.347，相對峰面積0.023；14號峰相對保留時間2.482，相對峰面積0.022；15號峰相對保留時間2.734，相對峰面積0.008。
12.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其中所述疏血通注射液中間體對照指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.316～0.351，相對峰面積0.055～0.111；2號峰相對保留時間0.471～0.495，相對峰面積0.041～0.084；3號峰相對保留時間0.525～0.574，相對峰面積0.190～0.318；5號峰相對保留時間0.724～0.736，相對峰面積0.016～0.032；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.196～1.208，相對峰面積0.076～0.140；7號峰相對保留時間1.312～1.410，相對峰面積0.017～0.120；8號峰相對保留時間1.426～1.548，相對峰面積0.017～0.042；9號峰相對保留時間1.582～1.770，相對峰面積0.019～0.116；10號峰相對保留時間1.620～1.848，相對峰面積0.012～0.134；11號峰相對保留時間1.964～2.146，相對峰面積0.021～0.045；12號峰相對保留時間2.044～2.231，相對峰面積0.032～0.056；13號峰相對保留時間2.204～2.417，相對峰面積0.021～0.033；14號峰相對保留時間2.324～2.559，相對峰面積0.016～0.021；15號峰相對保留時間2.499～2.812，相對峰面積0.006～0.014。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述疏血通注射液中間體標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自1號峰相對保留時間0.332，相對峰面積0.072；2號峰相對保留時間0.484，相對峰面積0.050；3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.217～0.295；5號峰相對保留時間0.730，相對峰面積0.026；S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；6號峰相對保留時間1.202，相對峰面積0.089～0.130；7號峰相對保留時間1.367，相對峰面積0.089；8號峰相對保留時間1.492，相對峰面積0.027；9號峰相對保留時間1.689，相對峰面積0.082；10號峰相對保留時間1.733，相對峰面積0.096；11號峰相對保留時間2.039，相對峰面積0.033；12號峰相對保留時間2.123，相對峰面積0.041；13號峰相對保留時間2.291，相對峰面積0.029；14號峰相對保留時間2.422，相對峰面積0.018；15號峰相對保留時間2.664，相對峰面積0.011。
14.一種疏血通注射液或其中間體的鑒別方法，包括如下步驟(1)測定待測疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜；(2)將待測疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜與疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜對比，篩選符合疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜的疏血通注射液或其中間體；其中，步驟(1)是按照權利要求7或8所述的方法測定，步驟(2)的疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜分別為權利要求10-13中所述的疏血通注射液或其中間體標準指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以水蛭和地龍的水提取物作為活性成分的制劑的HPLC指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜，尤其是疏血通注射液或其中間體的指紋圖譜建立方法以及疏血通注射液或其中間體的鑒別方法。包括制備供試品溶液、制備參照物溶液和高效液相色譜測定，其特征在于，參照物為次黃嘌呤，高效液相色譜的條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為磷酸二氫鉀－水－甲醇梯度洗脫液，紫外檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握。
文檔編號G01N30/06GK1982892SQ20061000183
公開日2007年6月20日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權日2006年1月24日
發(fā)明者李振國 申請人:李振國