專利名稱：：液相色譜－離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測食用植物油中叔丁基對(duì)苯二酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及食品安全檢測，特別是涉及在進(jìn)出口貿(mào)易及食品安全監(jiān)督管理過程中，運(yùn)用液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測食用植物油中的合成酚類抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚(tertiarybutylhydroquinone，TBHQ)的方法。
背景技術(shù)：
：食用植物油在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存的過程中，通常會(huì)添加合成酚類抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚(ButylatedHydroxyanisole，BHA)、二叔丁基對(duì)甲酚(BulylatedHydroxytoluene，BHT)、沒食子酸丙酯(PropylGallate，PG)及叔丁基對(duì)苯二酚等以阻緩其氧化變質(zhì)。目前應(yīng)用最為廣泛的是TBHQ(圖1)。美國于1972年批準(zhǔn)使用TBHQ。FAO/WHO(1995)對(duì)其暫定的每日允許攝入量(acceptabledailyintake，ADI)為0～0.7mg/kgbodyweight，允許使用在26種類食品中，最大理論攝入量(theoreticalmaximumdailyintake，TMDI)為200mg/kg。我國于1991年批準(zhǔn)使用，國家食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(GB2760-1996)最大使用限量為200mg/kg，允許在食用油脂、油炸食品、餅干、干果罐頭等9種食品中使用。然而，近年來對(duì)于TBHQ的毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)論仍存在很大爭議，歐盟、日本等國家認(rèn)為其毒理試驗(yàn)資料不完善，尚不允許在食品中使用。食用植物油是人類膳食基礎(chǔ)營養(yǎng)素的主要來源之一。在從對(duì)合成抗氧化劑的逐步認(rèn)識(shí)過程中，人們對(duì)其安全性越來越有疑慮，在選擇食用植物油時(shí)，都希望挑選沒有合成抗氧化劑的產(chǎn)品，要求食品監(jiān)督管理部門加強(qiáng)對(duì)市售產(chǎn)品中TBHQ的檢測。此外，在對(duì)外食品貿(mào)易中，由于貿(mào)易雙方國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的差異，TBHQ的含量也往往是嚴(yán)格要求進(jìn)行檢測分析的指標(biāo)。例如，2004年我國對(duì)日出口食品有7批因檢出TBHQ不合格，如果日本厚生勞動(dòng)省實(shí)施新的檢測方法(檢出靈敏度1ppm)，將會(huì)有更多的不合格批次。然而，我國目前尚沒有食用植物油中TBHQ的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，現(xiàn)行的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1050-2002“進(jìn)出口油脂中抗氧化劑的測定—液相色譜法”對(duì)TBHQ的檢出限為2ppm。因此，在我國建立快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)檢測方法也迫在眉睫。目前，樣品前處理方法主要包括直接的有機(jī)溶劑萃取、固相萃取和衍生化。三種樣品前處理方法各有利弊。直接的有機(jī)溶劑萃取法操作簡單，但雜質(zhì)干擾嚴(yán)重。固相萃取法和衍生化法雖然選擇性好，但處理步驟往往較為復(fù)雜，耗時(shí)長。此外，這些樣品前處理方法往往包含濃縮步驟，占去了整個(gè)檢測分析過程的大部分時(shí)間。而進(jìn)行定量檢測的方法，主要包括液相色譜法和氣相色譜法。這些分析方法的選擇性不夠好，為使組分與雜質(zhì)能很好地分離，分析時(shí)間往往超過20min。例如，對(duì)于液相色譜來說，通常需要采用耗時(shí)的梯度洗脫法；而對(duì)于氣相色譜來說，則需要通過程序升溫來實(shí)現(xiàn)組分的分離。此外，這些分析方法的靈敏度不夠高，檢出限都是ppm級(jí)，不能滿足目前的檢測要求。液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究開始于20世紀(jì)70年代，將針對(duì)沸點(diǎn)高、極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定化合物分離的液相色譜和靈敏度高、檢出限低、能提供化合物結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜串連在一起。離子阱質(zhì)譜儀(ITMS)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型質(zhì)譜儀，具有體積小，結(jié)構(gòu)簡單，與外部各種離子源兼容性好，離子存儲(chǔ)時(shí)間長和質(zhì)量選擇存儲(chǔ)等特點(diǎn)。目前，液相色譜/離子阱質(zhì)譜聯(lián)用已發(fā)展成為一種重要的分析技術(shù)，在食品藥物、環(huán)境化學(xué)、生物化學(xué)等許多研究領(lǐng)域中的應(yīng)用已逐漸展開，但應(yīng)用于合成酚類抗氧化劑檢測上尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中不足之處，而提供一種簡化樣品前處理步驟、縮短分析時(shí)間和降低檢出限的檢測食用植物油中TBHQ的方法。本發(fā)明目的可以通過如下方法來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明檢測食用植物油中的TBHQ的方法，是食用植物油經(jīng)萃取、離心分層后，移取上層萃取液，重復(fù)萃取2～3次，合并的萃取液經(jīng)離心分層后移取上清液至進(jìn)樣小瓶，在色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇/水，電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子模式的液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，利用二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z149對(duì)TBHQ進(jìn)行定量檢測。具體步驟如下首先，移取0.1～0.3mL食用植物油于玻璃離心管內(nèi)，加入1.5～2.5mL乙醇，于微型混合器上振蕩萃取3～5min后經(jīng)3000～4000r/min離心4～8min，移取上層萃取液至玻璃離心管內(nèi)，重復(fù)萃取2～3次，合并萃取液，經(jīng)3000～4000r/min離心4～8min后移取上清液至進(jìn)樣小瓶；然后，在色譜柱為C18(2.1mm×150mm，0.5μm)，柱溫25～35℃，流動(dòng)相為甲醇/水，流速0.15～0.40mL/min，進(jìn)樣體積5～20μL，檢測波長280nm，電噴霧離子源，負(fù)離子模式，霧化氣(氮?dú)?30～40psi，干燥氣(氮?dú)?8～12L/min，160～280℃，破碎電壓1.6～1.8V(破碎截止值m/z80)，質(zhì)量掃描范圍m/z50～300的液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，利用二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z149對(duì)TBHQ進(jìn)行定量檢測。可用作萃取劑的有機(jī)溶劑文獻(xiàn)報(bào)道有很多，如乙腈、甲醇，石油醚、乙醇等，由于相對(duì)于其他有機(jī)溶劑，乙醇無毒、來源廣泛、價(jià)格低廉，因此，本發(fā)明優(yōu)選乙醇作為萃取劑。能否通過液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)降低檢出限、增強(qiáng)選擇性、縮短分析時(shí)間的目的，關(guān)鍵在于質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇，如霧化氣壓力、干燥氣的流速和溫度、破碎電壓等。霧化氣(氮?dú)?經(jīng)霧化針以一定壓力進(jìn)入樣品流中，使經(jīng)液相色譜分離的組分得以霧化。霧化氣的壓力是影響霧化效果和樣品流穩(wěn)定的重要因素。霧化氣壓力太低不能滿足樣品的霧化要求，過高則造成樣品流的不穩(wěn)定而影響檢測效果，適于本發(fā)明的霧化氣壓力是30～40psi。干燥氣(氮?dú)?用以實(shí)現(xiàn)樣品的去溶劑化，干燥氣的流速和溫度是影響樣品去溶劑化效果的主要因素。干燥氣流速越大，去溶劑化效果越好，在檢測效果較優(yōu)的情況下，為節(jié)省氮?dú)?，適于本發(fā)明的干燥氣流速是8～12L/min。干燥氣溫度過低，樣品的去溶劑化效果不理想；干燥氣溫度過高，則往往造成樣品分子的熱分解。適于本發(fā)明的干燥氣溫度是160～280℃。多級(jí)反應(yīng)質(zhì)譜(MRM)模式下，破碎電壓影響二級(jí)質(zhì)譜檢測的重要因素。破碎電壓值過低，母離子m/z165不能很好地得以破碎，形成的碎片離子豐度低；破碎電壓值過高，母離子m/z165完全破碎，但碎片離子m/z149不能穩(wěn)定駐留在離子阱中，致使檢測到的碎片離子豐度不高。適于本發(fā)明的破碎電壓是1.6～1.8V，此時(shí)大部分母離子已破碎，并且形成的碎片離子峰面積最大。本發(fā)明經(jīng)大量實(shí)踐證明，采用液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用方法，以乙醇為萃取劑，線性范圍0～4542.5μg/L，R2＝0.9990，檢出限為0.3mg/kg，定量限為1mg/kg，回收率可達(dá)81.9％～109.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5.3％，與現(xiàn)行的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1050-2002“進(jìn)出口油脂中抗氧化劑的測定—液相色譜法”(TBHQ的檢出限為2mg/kg)相比，該方法完全能夠滿足檢測要求，并且該方法可通過增大進(jìn)樣量的方式進(jìn)一步降低方法的檢出限。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)首先，TBHQ離子阱二級(jí)質(zhì)譜檢測的選擇性好，降低了對(duì)于液相色譜組分分離效果的要求，10min內(nèi)即可完成檢測。其次，TBHQ離子阱二級(jí)質(zhì)譜檢測的靈敏度高，使得樣品的前處理過程省去了耗時(shí)的濃縮步驟。這兩點(diǎn)保證了TBHQ的整個(gè)檢測方法擁有液相色譜法和氣相色譜法不可比的低檢出限、簡單的樣品前處理和大大縮短的分析時(shí)間，這是該方法的特點(diǎn)。第三，以乙醇作為萃取劑回收率高，且乙醇無毒、成本低廉、易于獲取。圖1-a是TBHQ二級(jí)質(zhì)譜萃取離子流圖、圖1-b是質(zhì)譜圖及圖1-c是質(zhì)譜裂解方式圖2是TBHQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，列舉1個(gè)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不只限于這個(gè)實(shí)施例。移取0.2mL食用植物油于10mL玻璃離心管內(nèi)，加入2mL乙醇，于微型混合器上振蕩萃取5min后經(jīng)4000r/min離心5min，移取上層萃取液至10mL玻璃離心管內(nèi)，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，經(jīng)4000r/min離心5min后移取0.8mL至1.5mL進(jìn)樣小瓶進(jìn)行液相色譜/離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析。TBHQ的液質(zhì)聯(lián)用分析條件如下。[色譜條件]色譜柱為ZORBAXEclipseXDB-C18(2.1mm×150mm，0.5μm)；柱溫35℃；流動(dòng)相為甲醇/水(50∶50)，流速0.4mL/min；進(jìn)樣體積5μL；檢測波長280nm。[質(zhì)譜條件]電噴霧(ESI)離子源；負(fù)離子模式；母離子m/z165；主要碎片離子m/z149；霧化氣(氮?dú)?30.0psi；干燥氣(氮?dú)?10.0L/min，160℃；破碎截止值m/z80；破碎電壓1.7V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～300。TBHQ的含量根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z149的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍(0～4542.5μg/L，R2＝0.9990)求得。食用植物油中TBHQ的濃度按下式計(jì)算本發(fā)明對(duì)10種北京市售食用植物油進(jìn)行檢測分析(表1)，回收率為81.9～109.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，％)≤5.3，完全可以滿足定量分析的要求。表110種食用植物油中TBHQ的檢出濃度權(quán)利要求1.液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測食用植物油中叔丁基對(duì)苯二酚的方法，其特征在于食用植物油經(jīng)萃取、離心分層后，移取上層萃取液，重復(fù)萃取2～3次，合并的萃取液經(jīng)離心分層后移取上清液至進(jìn)樣小瓶，在色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇/水，電噴霧離子源，負(fù)離子模式的液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，利用二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z149對(duì)叔丁基對(duì)苯二酚進(jìn)行定量檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測食用植物油中叔丁基對(duì)苯二酚的方法，其特征在于萃取劑是乙醇。全文摘要液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用檢測食用植物油中叔丁基對(duì)苯二酚(tertiarybutylhydroquinone，TBHQ)的方法。本發(fā)明以乙醇作為萃取劑，食用植物油經(jīng)萃取后的上清液，在色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇/水，電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子模式的液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，利用二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z149對(duì)TBHQ進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是樣品前處理簡便、快捷，省去了繁瑣耗時(shí)的樣品濃縮過程，萃取劑無毒，檢測的靈敏度高、選擇性好、速度快。文檔編號(hào)G01N30/38GK1815223SQ20061000189公開日2006年8月9日申請日期2006年1月25日優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日發(fā)明者郝鵬鵬,黃文,倪晉仁申請人:北京大學(xué)