專利名稱：一種檢測恩諾沙星的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測恩諾沙星的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)是氟喹酮類抗生素，具有下列特性由于獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其成為獸醫(yī)臨床藥物中十分重要的抗生素。恩諾沙星對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和支原體類病原菌均具有廣譜抗菌活性，在一定的濃度下對細(xì)菌支原體也具有殺菌作用，還能殺死對抗生素具有抗藥力的細(xì)菌，例如抗β-乳酸菌素、氨基糖苷等。恩諾沙星因其具有獨特的作用，自80年代開始就被廣泛的應(yīng)用于動物和魚蝦類的疾病的預(yù)防和治療。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，凡使用過恩諾沙星的動物，在一定時期內(nèi)其產(chǎn)品都有殘留，因其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，所以在動物食品中殘留會對人類健康造成威脅和影響，歐美國家及我國均要求對其限量使用。2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定在所有食品動物的肌肉、脂肪中最高殘留限量為100μg/kg，在所有食品動物的肝、腎中最高殘留限量為200μg/kg。因此，恩諾沙星已經(jīng)列為獸藥殘留監(jiān)控的重點。
檢測恩諾沙星殘留量的化學(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC/MS)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測恩諾沙星的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括恩諾沙星特異性抗體、包被有抗抗體的酶聯(lián)板和酶標(biāo)記物；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)恩諾沙星半抗原。
所述恩諾沙星半抗原是將恩諾沙星和8-氨基辛酸通過?；椒ǖ玫降?。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星半抗原可將堿性磷酸酯酶與恩諾沙星半抗原通過戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在恩諾沙星半抗原上。
所述恩諾沙星特異性抗體可為恩諾沙星單克隆抗體或恩諾沙星多克隆抗體；它們均是用恩諾沙星半抗原與載體蛋白采用氯甲酸異丁酯法或水溶性碳二亞氨法偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述恩諾沙星多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述恩諾沙星單克隆抗體優(yōu)選為恩諾沙星鼠單克隆抗體，所述恩諾沙星多克隆抗體優(yōu)選為恩諾沙星兔多克隆抗體。
所述恩諾沙星鼠單克隆抗體優(yōu)選為恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-4CGMCC No.1610分泌的單克隆抗體。
所述恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-4CGMCC No.1610已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
以上抗體均可以用恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按混合酸酐法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將恩諾沙星半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，顯示液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。
所述濃縮復(fù)溶液為含0.01M-0.05M含有1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
其中制備酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液含有3～10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
包被抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明提供的檢測恩諾沙星的方法，包括以下步驟1)樣品前處理動物組織(雞肉、雞肝)稱2.0g均質(zhì)物，加入含有乙腈-0.1MNaOH(V乙腈∶VNaOH＝84∶16)溶液10ml混勻，3000g以上，15℃離心10min，取出5ml上清液，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合均勻，加入二氯甲烷5ml，混勻，3000g以上，15℃離心10min，去上層液，取下層有機(jī)相液體，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或者氮氣吹干；然后用0.6ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混勻，3000g以上，15℃離心10min，吸掉上層有機(jī)相和中間部分液體，取下層50μ1加入150μl稀釋了的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶1稀釋)混勻即可分析。
水產(chǎn)品水產(chǎn)品樣本的提取等同于雞肉提取方法，如在兩相之間出現(xiàn)太多的泡沫或膠狀物，難以取出足夠的下層提取液，應(yīng)將樣品瓶放在80℃水浴中5min后再離心。
血漿用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集血樣本，血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后3000g，15℃離心10分鐘，取出血漿1ml，加入3ml乙腈混勻，3000g以上，15℃離心10min，取上清，加入1ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液，混勻，再加入二氯甲烷4ml，混勻，再在3000g，15℃離心10min，去上層液體，取下層有機(jī)相，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或氮氣吹干，用0.6ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液溶解，加入1ml正己烷混勻，3000g，15℃離心10min，吸掉上層有機(jī)相和中間白色雜質(zhì)，取下層50μl加入150μl稀釋了的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶1稀釋)混勻即可分析。
2)利用上述的檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品；3)分析檢測結(jié)果。
恩諾沙星是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將恩諾沙星和8-氨基辛酸合成恩諾沙星半抗原，給恩諾沙星接出了一個含8個碳的間隔臂，這樣突出了恩諾沙星分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——(4-乙基)-1-哌嗪基，使制備的恩諾沙星抗體對恩諾沙星的特異性很高。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對免疫不利，半抗原與OVA、RSA和MSA的結(jié)合摩爾比分別為12∶1、17∶1和17∶1。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測動物組織、血清、水產(chǎn)品等樣品中恩諾沙星的殘留量。本發(fā)明的檢測原理是微孔條上包被抗抗體時，加入恩諾沙星抗體工作液后使得抗體充分的結(jié)合在抗抗體上，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和酶標(biāo)抗原，樣品中殘留的恩諾沙星和酶標(biāo)抗原競爭抗恩諾沙星抗體，顯色；顯色終止后用酶標(biāo)儀將波長設(shè)定在400nm，測定每孔吸光度值(OD值)，樣本吸光度值與其殘留物恩諾沙星的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星的含量。也可根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品溶液顏色的深淺，與系列濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液顏色比較判斷樣品中恩諾沙星的濃度范圍。
本發(fā)明檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中恩諾沙星的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；采用高特異性的恩諾沙星單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，節(jié)省操作時間，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利，檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在恩諾沙星的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。


圖1為以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測恩諾沙星含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實施方式
下述實施例的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測方法以抗抗體的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星半抗原工作液(用含有0.05％甘油的水溶液稀釋的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星半抗原)，8ml/瓶，1瓶。
(3)恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液恩諾沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，3ml/瓶。所用的恩諾沙星藥物稀釋液為含0.1-0.5％N’N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，8ml/瓶，1瓶。
(5)恩諾沙星鼠單克隆抗體工作液將恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-4CGMCC No.1610分泌的單克隆抗體用含有2％小牛血清稀釋成蛋白濃度為2.0μg/L，8ml/瓶，1瓶。
(6)濃縮洗滌液濃縮洗滌液含有0.01M pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液1-2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液0.03M含有1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，30ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的2倍。
(9)包被緩沖液包被緩沖液pH9.6 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。
(10)封閉液含3-10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
其中，抗抗體包被的酶標(biāo)板、恩諾沙星特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星半抗原的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、包被原的制備以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
2、包被有羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板制備方法用包被緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、恩諾沙星鼠單克隆抗體制備免疫原將半抗原和甲狀腺蛋白(BCG)等載體蛋白混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的具體制備方法恩諾沙星是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將恩諾沙星和8-氨基辛酸合成恩諾沙星半抗原，給恩諾沙星接出了一個含8個碳的間隔臂，這樣突出了恩諾沙星分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——(4-乙基)-1-哌嗪基，使制備的恩諾沙星抗體對恩諾沙星的特異性很高。
動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以恩諾沙星半抗原與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5-10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株-恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-4CGMCC No.1610分泌的單克隆抗體。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1-5×106個/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105-106個/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
三、酶標(biāo)半抗原的制備恩諾沙星半抗原的合成方法恩諾沙星半抗原的制備原理將恩諾沙星和8-氨基辛酸合成恩諾沙星半抗原。給恩諾沙星接出了一個含8個碳的間隔臂，這樣突出了恩諾沙星分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——(4-乙基)-1-哌嗪基。使制備的恩諾沙星抗體對恩諾沙星的特異性很高。
其半抗原的制備的過程為取200mg恩諾沙星和100mg 8-氨基辛酸和50mgNHS(N-羥基琥珀酰亞胺，活化酯)用水?dāng)嚢璺磻?yīng)過夜。
酶標(biāo)半抗原的制備將恩諾沙星半抗原與堿性磷酸酯酶采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)，得到堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星抗原。
具體的酶標(biāo)半抗原的制備如下取200mg恩諾沙星半抗原和200mg堿性磷酸酯酶和100ul戊二醛，用水?dāng)嚢璺磻?yīng)過夜。
利用該試劑盒檢測樣品中殘留的恩諾沙星的方法如下一、樣品前處理動物組織(雞肉、雞肝)稱2.0g均質(zhì)物，加入含有乙腈和0.1M Na0H(V乙腈∶VNaOH＝84∶16)溶液10ml混勻，3000g以上，15℃離心10min。取出5ml上清液，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合均勻，加入二氯甲烷5ml，混勻，3000g以上，15℃離心10min。去上層液，取下層有機(jī)相液體，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或者氮氣吹干；然后用0.6ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混勻，3000g以上，15℃離心10min，吸掉上層有機(jī)相和中間部分液體，取下層50μl加入150μl稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶1稀釋)混勻即可分析。
水產(chǎn)品水產(chǎn)品樣本的提取等同于雞肉提取方法，如在兩相之間出現(xiàn)太多的泡沫或膠狀物，難以取出足夠的下層提取液，應(yīng)將樣品瓶放在80℃水浴中5min后再離心。
血漿用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集血樣本，血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后3000g，15℃離心10分鐘，取出血漿1ml，加入3ml乙腈混勻，3000g以上，15℃離心10min，取上清，加入1ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液，混勻，再加入二氯甲烷4ml，混勻，再在3000g，15℃離心10min，去上層液體，取下層有機(jī)相，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或氮氣吹干，用0.6ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液溶解，加入1ml正己烷混勻，3000g，15℃離心10min。吸掉上層有機(jī)相和中間白色雜質(zhì)，取下層50μl加入150μl稀釋了的濃縮復(fù)溶液(按V濃縮復(fù)溶液∶V水＝1∶1稀釋)混勻即可分析。
二、檢測方法向包被有羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板微孔中加入恩諾沙星鼠單克隆抗體工作液100μl，37℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋20倍的濃縮洗滌液250μl，15-30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，同時加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的恩諾沙星半抗原工作液50μl，37℃反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液4-硝基酚磷酸鹽緩沖液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。

公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以恩諾沙星濃度的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對應(yīng)每一個樣品中恩諾沙星的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液中恩諾沙星的濃度。利用計算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個檢測過程只需1.5小時就可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。
實施例2、恩諾沙星酶聯(lián)免疫試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度和保存期實驗1.標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密度試驗從實施例1制備的酶聯(lián)免疫試劑盒中取三批02、06、和10，從三批中各取10個試劑盒，從每個酶標(biāo)板中，各抽出20個微孔，測定4.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，計算變異系數(shù)。用該方法考察板內(nèi)精密度。測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，三批試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)精密度的測定范圍在4.80％-9.11％之間，因此確定精密度范圍均小于25％。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(CV％)

2.樣品可重復(fù)性試驗每個樣本按10μg/kg濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，分別取實施例1制備的三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。見表2-表6。
表2雞肉樣品可重復(fù)性試驗

表3蝦樣品可重復(fù)性試驗

表4魚樣品可重復(fù)性試驗

表5雞肝樣品可重復(fù)性試驗

表6雞血樣品可重復(fù)性試驗

結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于20％，魚樣本的變異系數(shù)均低于20％，蝦樣本的變異系數(shù)均低于20％，雞肝樣本的變異系數(shù)均低于20％，雞血樣本的變異系數(shù)均低于20％。
3、試劑盒的準(zhǔn)確度取兩個濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為10μg/kg(L)和20μg/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，具體方法如實施例1中樣品前處理步驟，分別計算準(zhǔn)確度。
表7試劑盒的準(zhǔn)確度

結(jié)果表明雞肉樣品添加準(zhǔn)確度在69.8％-98.2％之間，雞肝樣品添加準(zhǔn)確度在68.4％-96.8％之間，魚樣品添加準(zhǔn)確度在67.8％-112.7％之間，蝦樣品添加準(zhǔn)確度在67.4％-110.8％之間，雞血樣品添加準(zhǔn)確度在69.5％-103.5％之間。
4、試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、恩諾沙星添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括恩諾沙星特異性抗體、包被有抗抗體的酶聯(lián)板和酶標(biāo)記物；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)恩諾沙星半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述恩諾沙星特異性抗體為恩諾沙星單克隆抗體或恩諾沙星多克隆抗體；它們均是用恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述恩諾沙星半抗原是將恩諾沙星和8-氨基辛酸通過?；椒ǖ玫降?；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述恩諾沙星單克隆抗體為恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-2-4 CGMCC No.1610分泌的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或氫氧化鈉溶液；所述封閉液為含有3-10％的牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1-2mol/L的硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，終止液為1-2mol/L氫氧化鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述復(fù)溶液為0.01M-0.05M含有1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被有抗抗體的酶聯(lián)板所用的包被緩沖液為pH 9.6 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液。
9.一種檢測恩諾沙星的方法，包括以下步驟1)樣品前處理肌肉、肝臟稱2.0g均質(zhì)物，加入含有體積比為84∶16乙腈和0.1MNaOH溶液10ml混勻，3000g以上，15℃離心10min，取出5ml上清液，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合均勻，加入二氯甲烷5ml，混勻，3000g以上，15℃離心10min，去上層液，取下層有機(jī)相液體，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或者氮氣吹干；然后用0.6ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混勻，3000g以上，15℃離心10min，吸掉上層有機(jī)相和中間部分液體，取下層50μl加入150μl稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液混勻即可分析；水產(chǎn)品水產(chǎn)品樣本的提取等同于肌肉、肝臟的提取方法，如在兩相之間出現(xiàn)太多的泡沫或膠狀物，難以取出足夠的下層提取液，應(yīng)將樣品瓶放在80℃水浴中5min后再離心；血漿取血漿1ml，加入3ml乙腈混勻，3000g以上，15℃離心10min，取上清，加入1ml稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液，混勻，再加入二氯甲烷4ml，混勻，再在3000g，15℃離心10min，去上層液體，取下層有機(jī)相，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干或氮氣吹干，用0.6ml稀釋1倍的的濃縮復(fù)溶液溶解，加入1ml正己烷混勻，3000g，15℃離心10min，吸掉上層有機(jī)相和中間白色雜質(zhì)，取下層50μl加入150μl稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液混勻即可分析；2)利用權(quán)利要求1-8中任一所述的檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測恩諾沙星的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括恩諾沙星特異性抗體及包被有包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯示液、終止液、濃縮復(fù)溶液；所述包被原為恩諾沙星抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)恩諾沙星抗原。本發(fā)明的方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的定性、定量檢測動物組織如動物組織、血清血漿、水產(chǎn)品等樣品中恩諾沙星殘留量。
文檔編號G01N33/577GK1811436SQ20061000725
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬宇平, 史為民, 丁雙陽, 馮才偉, 江海洋, 吳小平 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)