專利名稱：兔抗人smn全長多克隆抗體的優(yōu)選與提取法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及早期基因診斷疾病、SMN蛋白功能研究及疾病預(yù)后判斷的方法，具體的說是對脊髓性肌萎縮癥的兔抗人SMN全長多克隆抗體的優(yōu)選與提取法。
背景技術(shù)：
脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一類以脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性變、肢體近端無力、萎縮為主要特征的遺傳性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性對稱性肌無力及肌萎縮，近端重于遠(yuǎn)端，下肢重于上肢。兒童期起病的SMA呈常染色體隱性遺傳，群體發(fā)病率為1/6000-1/10000，攜帶者頻率為1/40-1/60。根據(jù)發(fā)病年齡和病情的輕重，臨床上將兒童期起病的SMA分為3型I型患兒多在2歲內(nèi)死于呼吸肌麻痹；II、III型雖然病情相對較輕，但晚期嚴(yán)重致殘，生活自理能力差，給社會(huì)和家庭帶來極大負(fù)擔(dān)。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白基因(survival of motor neuron，SMN)為兒童型SMA的致病基因，該基因定位于5q11.2-13.3區(qū)域，編碼含294個(gè)氨基酸的SMN蛋白，SMN蛋白在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，與其它多種蛋白相結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，參與機(jī)體mRNA的剪接過程，是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的必須成份，完全缺失SMN的個(gè)體將在胚胎期即死亡。在病人中進(jìn)行SMN蛋白表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SMN蛋白下降水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，即患者病情越重，其外周血及肌肉組織中SMN蛋白含量越低，病情較輕者其SMN蛋白含量較高。多年來本病在治療上一直未取得突破，其主要原因在于SMN蛋白功能及SMN表達(dá)調(diào)控機(jī)制未闡明。因此只有進(jìn)行SMN蛋白功能的研究，從而揭示SMA發(fā)病機(jī)制，才能從根本上解決SMA的早期診斷、預(yù)后判斷和治療等問題。
研究SMN蛋白的功能及其致病機(jī)制，高質(zhì)量的SMN抗體是必備條件。由于SMN蛋白不同區(qū)域其功能不同，如氨基端主要與蛋白在細(xì)胞內(nèi)正確定位有關(guān)，中間的核心區(qū)域是剪接體蛋白裝配與合成的關(guān)鍵，而羧基端則與SMN蛋白自身聚積和穩(wěn)定性有關(guān)。
從包括中國專利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，目前國內(nèi)尚無現(xiàn)成的SMN抗體，而國外學(xué)者制備的SMN抗體均為羧基端或氨基端多肽抗體，此類抗體制備時(shí)僅需合成數(shù)十個(gè)氨基酸的多態(tài)去免疫家兔，制備工藝較為簡單、快速，但由于無法同時(shí)涵蓋SMN蛋白的三個(gè)不同的關(guān)鍵區(qū)域，因此這類抗體的敏感性及特異性均較低，限制了抗體使用的深度和廣度，如僅能用于細(xì)胞免疫熒光染色或僅能用于免疫組化，并且容易導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果，因此不是最佳的SMN抗體。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是在SMN基因中擴(kuò)增出其全長編碼序列，并進(jìn)行兔抗人SMN全長多克隆抗體的優(yōu)選與提取法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是制備抗體，首先必須合成制備抗體所需的蛋白。選用哪一段蛋白來制備抗體及如何合成正確序列的蛋白是本發(fā)明的關(guān)鍵。如果僅合成羧基端或氨基端數(shù)十個(gè)氨基酸的蛋白來制備抗體，將導(dǎo)致抗體的特異性和敏感性均不夠高。由于SMN基因全長編碼區(qū)僅882bp，編碼的蛋白序列為294個(gè)氨基酸，因此完全可制備全長編碼區(qū)的SMN蛋白。兔抗人SMN全長多克隆抗體的優(yōu)選，其特征是選用涵蓋1至294位氨基酸的全長SMN蛋白來制備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區(qū)。
直接通過合成多肽來制備這么大片段且編碼正確的蛋白十分昂貴，也是不現(xiàn)實(shí)的，因此本發(fā)明選擇誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)His基因融合蛋白的方法來制備該H的蛋白片段。所述的His基因融合蛋白，必須自行設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SMN基因全長編碼區(qū)，與表達(dá)載體連接后構(gòu)建His基因融合載體。
本發(fā)明的兔抗人SMN全長多克隆抗體的具體提取方法1、制備正常人全長編碼區(qū)cDNA片段新鮮腦組織來源于急性顱腦外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～30分鐘；小心吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～15分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000rpm離心3～8分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀15～30分鐘。溶解沉淀后即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存?zhèn)溆?。將此RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區(qū)cDNA片段。
2、引物設(shè)計(jì)及His基因融合載體的選擇要保證長達(dá)882bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段(目的基因片段)正確無誤，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。為了保證目的基因片段(SMN基因1-294氨基酸片段)與His基因融合載體連接后，氨基酸編碼不發(fā)生移碼改變，我們選擇了pET-28a-c(+)載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI做為連接點(diǎn)。之所以選擇這2種內(nèi)切酶，是因?yàn)镾MN基因片段上沒有這2個(gè)切點(diǎn)，而且它們也是比較常見的限制性內(nèi)切酶。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設(shè)計(jì)了4條引物，序列如下1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切點(diǎn))1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切點(diǎn))442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC 3’1F和1R用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列。
3、制備目的基因片段并連接到pET-28a-c(+)表達(dá)載體上以正常人全長編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1F、1R和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增SMN基因1～882cDNA序列。應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌并挑取陽性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒。EcoRI和XhoI雙酶切證實(shí)陽性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析儀測序鑒定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了30個(gè)陽性TA克隆才挑到了一個(gè)序列完全正確的克隆。應(yīng)用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21。
4、含目的基因片段的His基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結(jié)果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達(dá)產(chǎn)量高。
5、制備并純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離并回收目的蛋白片段。
6、制備并純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，此后每7～14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性。加強(qiáng)免疫4次后，Western Blot方法檢測抗體的效價(jià)達(dá)1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶。上述結(jié)果提示該抗體的敏感性和特異性均很高。此時(shí)，從新西蘭大白兔頸總動(dòng)脈放血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80℃。我們將該抗體命名為兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMN full-lengthpolyclonal antibody)。
7、兔抗人SMN多克隆抗體的應(yīng)用(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜30～60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫?fù)u育2～6小時(shí)或4～8℃搖育過夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫?fù)u育45～90分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片(請參閱圖1的結(jié)果)。
(2)免疫熒光染色pcDNA3.1mycHisBSMN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4～8％多聚甲醛固定細(xì)胞，5～10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞30～60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應(yīng)30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘；封片鏡下觀察，結(jié)果見圖2。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了兔抗人SMN全長多克隆抗體，保證了抗體的高度特異性，有助于進(jìn)行SMN蛋白功能及發(fā)病機(jī)制研究，有助于兒童型脊髓性肌萎縮癥的早期快速診斷及預(yù)后判斷。同時(shí)本發(fā)明在優(yōu)選的基礎(chǔ)上提出了其制備及提取的方法，對于脊髓性肌萎縮癥今后的治療方面的研究有著極積的作用。


圖1是本發(fā)明抗體用于免疫印跡的結(jié)果照片。標(biāo)記1為不表達(dá)SMN蛋白的空CHO細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1mycHisBSMN表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞；3為正常人外傷手術(shù)后的肌肉組織。3所示片段大小為38KD，而2由于所表達(dá)的是SMN-His融合蛋白，故約39KD。
圖2是本發(fā)明抗體檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO細(xì)胞的結(jié)果。1為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1mycHisBSMN的CHO細(xì)胞(帶綠色熒光)，2為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空CHO細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1針對SMN全長蛋白來制備抗體。
選擇His基因融合蛋白的方法來制備該目的蛋白片段，His基因融合蛋白，必須構(gòu)建含SMN基因1至294位氨基酸(882bp)目的片段的His基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物。
具體提取方法1、制備正常人全長編碼區(qū)cDNA片段新鮮腦組織來源于急性顱腦外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴10分鐘，4℃12000rpm離心15分鐘；小心吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入500μl異內(nèi)醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管15次，置冰浴10分鐘，4℃12000rpm離心15分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入1ml 75％乙醇，振蕩，4℃7500rpm離心5分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀20分鐘。溶解沉淀后即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存?zhèn)溆?。將此RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區(qū)cDNA片段。
2、引物設(shè)計(jì)及His基因融合載體的選擇為了保證目的基因片段(SMN基因1-294氨基酸片段)與His基因融合載體連接后，氨基酸編碼不發(fā)生移碼改變，我們選擇pET-28a-c(+)載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI做為連接點(diǎn)。之所以選擇這2種內(nèi)切酶，是因?yàn)镾MN基因片段上沒有這2個(gè)切點(diǎn)。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則自行設(shè)計(jì)引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共設(shè)計(jì)了4條引物，序列如下1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切點(diǎn))1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切點(diǎn))442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3’
1F和1R用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列。對于1F和1R引物設(shè)計(jì)是有一定技巧的，在1F的5’端添加了EcoRI切點(diǎn)序列g(shù)AATTC，其后的堿基序列與SMN基因氨基酸片段一致，1R為反向序列，在其5’端添加了XhoI切點(diǎn)序列CTCgAg，其后的堿基序列與SMN基因氨基酸片段一致，使目的基因片段可通過EcoRI和XhoI雙酶切連到pET-28a-c(+)載體上。442F和486R引物設(shè)計(jì)遵從常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則即可。
3、制備目的基因片段并連接到pET-28a-c(+)表達(dá)載體上以正常人全長編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1F、1R和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增SMN基因1～882cDNA序列。應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌并挑取陽性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒。EcoRI和XhoI雙酶切證實(shí)陽性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730DNA序列分析儀測序鑒定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性。共挑取了30個(gè)陽性TA克隆才挑到了一個(gè)序列完全正確的克隆。應(yīng)用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21。
4、含目的基因片段的His基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結(jié)果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達(dá)產(chǎn)量高。
5、制備并純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離并回收目的蛋白片段。
6、制備并純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，此后每14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性。加強(qiáng)免疫4次后，Western Blot方法檢測抗體的效價(jià)達(dá)1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶。上述結(jié)果提示該抗體的敏感性和特異性均很高。此時(shí)，從新西蘭大白兔頸總動(dòng)脈放血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinA Column(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80℃。
7、兔抗人SMN多克隆抗體的應(yīng)用(1)免疫印跡(請參閱圖1)5％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶1000稀釋，室溫?fù)u育3小時(shí)，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5分種；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000稀釋，室溫?fù)u育60分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次10分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片。
(2)免疫熒光染色(請參閱圖2)pcDNA3.1mycHisBSMN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶100稀釋，室溫反應(yīng)3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5分種；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶200稀釋，室溫反應(yīng)60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5分鐘；封片鏡下觀察。
權(quán)利要求
1.兔抗人SMN全長多克隆抗體的優(yōu)選，其特征是選用涵蓋1至294位氨基酸的全長SMN蛋白來制備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區(qū)。
2.本發(fā)明根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的引物，其特征是共設(shè)計(jì)了4條引物，序列如下1F 5’-AgAATTCATggCgATgAgCAgC-3’(含EcoRI切點(diǎn))1R 5’-ACTCgAgATTTAAggAATgTg-3’(含XhoI切點(diǎn))442F 5’-AAT CTg TCC gAT CTA CTT TC-3’486R 5’-TTC ATT TTC ATT CTC TTg AgC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征是1F和1R用于PCR擴(kuò)增目的基因片段，即SMN基因1-882bp片段，442F、486R用來測序證實(shí)所擴(kuò)增的目的基因片段序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征是同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端與3’端的4個(gè)堿基不互補(bǔ)，正反向引物序列不互補(bǔ)，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。
5.本發(fā)明的兔抗人SMN全長多克隆抗體的具體提取方法，其特征是(1)制備正常人全長編碼區(qū)cDNA片段新鮮腦組織來源于急性顱腦外傷手術(shù)患者，組織一經(jīng)離體，迅速放置液氮中；稱取50mg腦組織，加入1ml TRIZOL液體，勻漿器搗爛組織，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中；加入200μl氯仿，上下甩動(dòng)，使TRIZOL與氯仿充分混勻，冰浴5～10分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～30分鐘；吸取上清移至一個(gè)新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)Ep管5～15次，置冰浴5～15分鐘，4～10℃10000～13000rpm離心10～15分鐘，見管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振蕩，4～10℃7000～10000rpm離心3～8分鐘；去上清，翻轉(zhuǎn)Ep管，室溫干燥沉淀15～30分鐘。溶解沉淀后即得總核糖核酸(RNA)，-80℃保存?zhèn)溆茫粚⒋薘NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，即為正常人腦組織全長編碼區(qū)cDNA片段；(2)His基因融合載體的選擇保證長達(dá)882bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的目的基因片段SMN基因1-294氨基酸片段與His基因融合載體連接后，氨基酸編碼不發(fā)生移碼改變，選擇了pET-28a-c(+)載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI做為連接點(diǎn)；(3)制備目的基因片段并連接到pET-28a-c(+)表達(dá)載體上以正常人全長編碼區(qū)cDNA片段為模板，采用引物1F、1R和高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增SMN基因1～882cDNA序列；應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌并挑取陽性TA克隆，搖菌并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒；EcoRI和XhoI雙酶切證實(shí)陽性TA克隆并采用引物442F、486R及ABI PRISMR3730 DNA序列分析儀測序鑒定連接在pMD18-T載體上的目的基因片段序列的正確性；應(yīng)用EcoRI和XhoI雙酶切正確的TA克隆，用膠回收試劑盒回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和XhoI雙酶切回收的pET-28a-c(+)載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21；(4)含目的基因片段的His基因融合載體的表達(dá)鑒定挑取1粒轉(zhuǎn)化好的His基因融合載體克隆，用5ml LB培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯蘭染色，結(jié)果顯示His基因融合蛋白片段大小正確，表達(dá)產(chǎn)量高；(5)制備并純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白制備His基因融合蛋白，PAGE-SDS膠電泳分離并回收目的蛋白片段；(6)制備并純化兔抗人SMN全長多克隆抗體(Rabbit anti-human SMNfull-length polyclonal antibody)SMN目的蛋白與完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，此后每7～14天加強(qiáng)免疫1次，每次均從耳緣靜脈取血1ml，凝固后離心取血清，Western Blot方法檢測SMN多克隆抗體的滴度及特異性；加強(qiáng)免疫4次后，Western Blot方法檢測抗體的效價(jià)達(dá)1∶2000，且具有高度特異性，無非特異性條帶；從新西蘭大白兔頸總動(dòng)脈放血，離心收集抗體血清分裝，采用Immobilized ProteinAColumn純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80℃。
6.兔抗人SMN多克隆抗體的應(yīng)用，其特征是(1)免疫印跡2.5～10％脫脂奶做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜30～60分種；兔抗人SMN全長多克隆抗體(濃度為5μg/μl)做為一抗，1∶500～1∶1000稀釋，室溫?fù)u育2～6小時(shí)或4～8℃搖育過夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1∶5000～1∶10000稀釋，室溫?fù)u育45～90分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5～15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片；(2)免疫熒光染色pcDNA3.1mycHisBSMN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，4～8％多聚甲醛固定細(xì)胞，5～10％山羊血清室溫封閉細(xì)胞30～60分鐘；兔抗人SMN抗體(濃度為5μg/μl)1∶50～1∶150稀釋，室溫反應(yīng)1～3小時(shí)，1XPBS搖洗3次，每次5～10分種；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1∶100～1∶300稀釋，室溫反應(yīng)30～60分鐘，1XPBS搖洗3次，每次5～10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兔抗人SMN全長多克隆抗體的優(yōu)選與提取法，屬對脊髓性肌萎縮癥的早期基因診斷疾病、SMN蛋白功能研究及疾病預(yù)后判斷的方法。兔抗人SMN全長多克隆抗體選用涵蓋1至294位氨基酸的全長SMN蛋白來制備抗體，針對SMN蛋白的所有功能區(qū)。采用制備正常人全長編碼區(qū)cDNA片段，引物設(shè)計(jì)及His基因融合載體的選擇，制備目的基因片段，并純化His基因融合蛋白及收集目的蛋白，最終制備并純化兔抗人SMN全長多克隆抗體，并使兔抗人SMN多克隆抗體得以應(yīng)用。本發(fā)明抗體的特異性和敏感性，有助于SMN蛋白功能及發(fā)病機(jī)制研究，早期快速診斷及預(yù)后判斷，對于脊髓性肌萎縮癥今后的治療方面的研究有著極積的作用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1810835SQ20061000806
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日
發(fā)明者王檸, 陳萬金, 吳志英 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院