專利名稱：兔抗鵝IgY+IgY(△Fc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種酶抗體結(jié)合物及其制備方法，具體地說(shuō)是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體。
背景技術(shù)：
酶免疫檢測(cè)技術(shù)是以酶的反應(yīng)放大作用和抗原-抗體特異性結(jié)合特性為原理、以酶抗體和/或抗原結(jié)合物為基礎(chǔ)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。其包括酶免疫組織化學(xué)染色和酶免疫檢測(cè)技術(shù)(包括固和非固相酶免疫檢測(cè)技術(shù))，前者主要用于組織、細(xì)胞的免疫檢測(cè)，后者主要用于抗原/抗體的檢測(cè)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是酶免疫檢測(cè)技術(shù)中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣泛的一種，其以快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)逐漸成為一種公認(rèn)的檢測(cè)技術(shù)。目前，該檢測(cè)技術(shù)已在部分動(dòng)物疫病檢測(cè)中使用，但僅有極少數(shù)鵝類疾病的檢測(cè)使用該技術(shù)。原因很多，其中缺乏一種高質(zhì)量、可商品化生產(chǎn)的酶標(biāo)記抗體是阻礙其發(fā)展的主要原因之一。
我國(guó)是世界養(yǎng)禽大國(guó)，更是世界主要鵝類養(yǎng)殖地和消費(fèi)國(guó)，鵝類養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展不僅直接關(guān)系到我國(guó)農(nóng)村發(fā)展、農(nóng)民增收，而且關(guān)系到我國(guó)畜牧業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。而酶標(biāo)記抗鵝抗體不僅為鵝類疫病的檢測(cè)搭建物質(zhì)平臺(tái)，更為鵝類整體免疫機(jī)理的研究提供物質(zhì)支持，并最終為鵝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體及其制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明中所使用的縮寫(xiě)分別代表PBS磷酸鹽緩沖液；PB磷酸緩沖液；DE52陰離子交換纖維素；Sephodex G200葡聚糖G200；IgY免疫球蛋白YIgY(ΔFc)免疫球蛋白Y(ΔFc)。
本發(fā)明的兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體是(1)它是由辣根過(guò)氧化物酶與兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體組成的酶抗體結(jié)合物，其可與鵝免疫球蛋白IgY和IgY(□Fc)特異性結(jié)合，并可使辣根過(guò)氧化物酶的底物顯色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之間，酶活性＞1000U/mg(臨聯(lián)茴香氨法)，ELISA使用濃度＞1∶1000，Weston-Blotting使用濃度＞1∶500的產(chǎn)品。
本發(fā)明的兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體是采用這樣的方法來(lái)制備的1)純化鵝卵黃免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v為卵黃∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混勻，3000r/min離心30min，取上清，用終濃度(w/v)分別為18％、14％、9％、14％的無(wú)水Na2SO4依次鹽析，3000r/min離心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用適量PBS懸浮，4℃PBS透析72h，將透析物2000r/min離心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)為洗脫液，過(guò)DE52纖維素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；2)兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體的制備和純化首免，弗氏完全佐劑與鵝卵黃免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v為1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多點(diǎn)注射；以后每隔14～28d加強(qiáng)免疫，二免改用弗氏不完全佐劑，劑量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳緣靜脈注射，心臟采血，37℃，1h，4℃過(guò)夜析出并收集血清；10ml血清經(jīng)50％和33％飽和硫酸銨依次鹽析3次，末次沉淀用2～4m1的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并對(duì)其透析除鹽，以PB(0.01mo1/L，pH7.4)為洗脫液過(guò)DE52離子交換層析柱純化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；3)改良過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體將N×4mg辣根過(guò)氧化物酶溶于N×1ml去離子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃攪拌20min，于醋酸鈉緩沖液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析過(guò)夜，加入N×mg純化的兔抗鵝抗體，立即加入0.2mol/L的碳酸鈉緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)pH值致9-9.5，20～25℃攪拌2h(注N為常數(shù))；4)標(biāo)記物的純化將上述標(biāo)記物平均分為2份，一份用50％飽和硫酸銨鹽析30min，離心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除鹽；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析過(guò)夜，并以其為洗脫液過(guò)SephodexG200層析柱，1ml/15min，2ml/管，將兩部分合并；5)酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量鑒定280nm和403nm測(cè)定其OD值，計(jì)算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、結(jié)合物標(biāo)記率(A403/A280×100％)酶結(jié)合物產(chǎn)率(酶含量×結(jié)合物總體積/最初加入酶量)，聯(lián)茴香胺法測(cè)定標(biāo)記物及的酶學(xué)活性，直接ELISA測(cè)法定其最佳使用濃度。當(dāng)酶標(biāo)記抗體的酶結(jié)合物產(chǎn)率在30％-60％之間、克分子比在1.0-2.0之間、酶結(jié)合物標(biāo)記率＞60％，酶活性＞1000U/m g、使用濃度＞1∶1000時(shí)符合制備標(biāo)準(zhǔn)。
采用本發(fā)明的方法可用于①本方法可用于提純鵝類卵黃免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)；②本方法可用于兔抗鵝辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記坑體的質(zhì)量鑒定；采用本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于①本產(chǎn)品可用于鵝類相關(guān)酶免疫組織化學(xué)染色。
②本產(chǎn)品可用于鵝類相關(guān)的各種勻相和非勻相免疫酶檢測(cè)技術(shù)，主要包括各種ELISA試驗(yàn)、Weston-Blotting、酶免疫沉淀試驗(yàn)等。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在應(yīng)用此酶標(biāo)記抗體可以建立多種鵝類疫病檢測(cè)技術(shù)，預(yù)防鵝類多種傳染病。
具體實(shí)施方式
1)純化鵝卵黃免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v為卵黃∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混勻，3000r/min離心30min，取上清，用終濃度(w/v)分別為18％、14％、9％、14％的無(wú)水Na2SO4依次鹽析，3000r/min離心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用適量PBS懸浮，4℃PBS透析72h，將透析物2000r/min離心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)為洗脫液，過(guò)DE52纖維素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；2)兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體的制備和純化首免，弗氏完全佐劑與鵝卵黃免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v為1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多點(diǎn)注射；以后每隔14～28d加強(qiáng)免疫，二免改用弗氏不完全佐劑，劑量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳緣靜脈注射，心臟采血，37℃，1h，4℃過(guò)夜析出并收集血清。10ml血清經(jīng)50％和33％飽和硫酸銨依次鹽析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并對(duì)其透析除鹽，以PB(0.01mol/L，pH7.4)為洗脫液過(guò)DE52離子交換層析柱純化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；3)改良過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體將N×4mg辣根過(guò)氧化物酶溶于N×1ml去離子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃攪拌20min，于醋酸鈉緩沖液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析過(guò)夜，加入N×mg純化的兔抗鵝抗體，立即加入0.2mol/L的碳酸鈉緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)pH值致9-9.5，20～25℃攪拌2h(注N為常數(shù))；4)標(biāo)記物的純化將上述標(biāo)記物平均分為2份，一份用50％飽和硫酸銨鹽析30min，離心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除鹽；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析過(guò)夜，并以其為洗脫液過(guò)SephodexG200層析柱，1ml/15min，2ml/管，將兩部分合并；5)酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量鑒定280nm和403nm測(cè)定其OD值，計(jì)算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、結(jié)合物標(biāo)記率(A403/A280×100％)酶結(jié)合物產(chǎn)率(酶含量×結(jié)合物總體積/最初加入酶量)，聯(lián)茴香胺法測(cè)定標(biāo)記物及的酶學(xué)活性，直接ELISA測(cè)法定其最佳使用濃度。當(dāng)酶標(biāo)記抗體的酶結(jié)合物產(chǎn)率在30％-60％之間、克分子比在1.0-2.0之間、酶結(jié)合物標(biāo)記率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用濃度＞1∶1000時(shí)符合制備標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，其特征是(1)它是由辣根過(guò)氧化物酶與兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體組成的酶抗體結(jié)合物，其可與鵝免疫球蛋白IgY和IgY(□Fc)特異性結(jié)合，并可使辣根過(guò)氧化物酶的底物顯色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之間，酶活性＞1000U/mg，ELISA使用濃度＞1∶1000，Weston-Blotting使用濃度＞1∶500的產(chǎn)品。
2.兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的制備方法，其特征是1)純化鵝卵黃免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v為卵黃∶PBS(pH7.4 0.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混勻，3000r/min離心30min，取上清，用終濃度(w/v)分別為18％、14％、9％、14％的無(wú)水Na2SO4依次鹽析，3000r/min離心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用適量PBS懸浮，4℃PBS透析72h，將透析物2000r/min離心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)為洗脫液，過(guò)DE52纖維素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰，提純鵝卵黃免疫球蛋白的濃度在1.0～5mg/ml之間，純度＞90％；2)兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體的制備和純化首免，弗氏完全佐劑與鵝卵黃免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v為1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多點(diǎn)注射；以后每隔14～28d加強(qiáng)免疫，二免改用弗氏不完全佐劑，劑量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳緣靜脈注射，心臟采血，37℃，1h，4℃過(guò)夜析出并收集血清；10ml血清經(jīng)50％和33％飽和硫酸銨依次鹽析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并對(duì)其透析除鹽，以PB(0.01mol/L，pH7.4)為洗脫液過(guò)DE52離子交換層析柱純化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰，兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)血清效價(jià)＞1∶32，純化兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體效價(jià)＞1∶16，且其濃度1mg/ml～4mg/ml、純度＞90％；3)改良過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體將N×4mg辣根過(guò)氧化物酶溶于N×1ml去離子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃攪拌20min，于醋酸鈉緩沖液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析過(guò)夜，加入N×mg純化的兔抗鵝抗體，立即加入0.2mol/L的碳酸鈉緩沖液(pH9.5)調(diào)節(jié)pH值致9-9.5，20～25℃攪拌2h，其中N為常數(shù)；4)標(biāo)記物的純化將上述標(biāo)記物平均分為2份，一份用50％飽和硫酸銨鹽析30min，離心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除鹽；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析過(guò)夜，并以其為洗脫液過(guò)SephodexG200層析柱，1ml/15min，2ml/管，將兩部分合并；5)酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量鑒定280nm和403nm測(cè)定其OD值，計(jì)算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、結(jié)合物標(biāo)記率(A403/A280×100％)酶結(jié)合物產(chǎn)率(酶含量×結(jié)合物總體積/最初加入酶量)，聯(lián)茴香胺法測(cè)定標(biāo)記物及的酶學(xué)活性，直接ELISA測(cè)法定其最佳使用濃度。當(dāng)酶標(biāo)記抗體的酶結(jié)合物產(chǎn)率在30％-60％之間、克分子比在1.0-2.0之間、酶結(jié)合物標(biāo)記率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用濃度＞1∶1000時(shí)符合制備標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明提供的是兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體及其制備方法。本發(fā)明辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體是利用鹽析、層析等蛋白純化技術(shù)和酶標(biāo)記技術(shù)，在提純鵝卵黃免疫球蛋白的基礎(chǔ)上，免疫家兔制備并純化兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體，再通過(guò)改良過(guò)碘酸鈉法將其與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，并采用鹽析及Sephodex G200純化，從而制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗體。應(yīng)用此酶標(biāo)記抗體可以建立多種鵝類疫病檢測(cè)技術(shù)，預(yù)防鵝類多種傳染病。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1818651SQ20061000980
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者王君偉, 孫凌霜 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)