專利名稱：制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大霉素檢測方法。
背景技術：
硫酸慶大霉素作為一種常用的抗生素被廣泛的應用于農(nóng)、畜、禽、林和水產(chǎn)品的病蟲害防治，由于使用者的濫用常常出現(xiàn)硫酸慶大霉素殘留量大的問題。硫酸慶大霉素殘留會嚴重危害人類的健康和我國畜禽產(chǎn)品及水產(chǎn)品的出口，所以要對食品進行嚴格的安全檢測。目前檢測硫酸慶大霉素的方法有色譜檢測法和微生物檢測法，但存在檢測時間長的問題，而且色譜檢測法樣品前處理操作難度大、無法檢測微量殘留、無法定量分析。面對高速發(fā)展的時代和快速、簡便、準確檢測的需要，目前的這些硫酸慶大霉素檢測法都無法滿足要求。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了解決目前硫酸慶大霉素檢測法檢測時間長的問題，而提供的一種制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法。制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大霉素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解于20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大霉素蛋白偶聯(lián)物；(3)取2mL硫酸慶大霉素牛血清白蛋白偶聯(lián)物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每只鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大霉素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)采用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，并用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物；(8)采用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物加入梯度稀釋的抗體中酶聯(lián)，反應完全后用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數(shù)作為工作濃度，并通過抗原稀釋的倍數(shù)計算、繪制出標準曲線。硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按上述標準曲線繪制得出的工作濃度稀釋，制成包被液后加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然后按繪制上述標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經(jīng)梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯(lián)反應1～1.5h并用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據(jù)上面所述繪制出的標準曲線查出對應數(shù)值再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得出樣品硫酸慶大霉素殘留量。本發(fā)明可以通過顏色改變快速做出定性分析，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為反應底物溶液，無抗原混合液為藍色，有抗原混合液則變?yōu)辄S色，根據(jù)顏色的變化可進行定性分析；而且特異性強，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)遇到硫酸慶大霉素催化其發(fā)生水解、氧化或還原反應，形成有色、發(fā)光或熒光產(chǎn)物易于識別。酶聯(lián)免疫測定法是根據(jù)酶標記的抗體或抗抗體來進行的抗原-抗體反應。由于酶的專一性催化和放大反應的作用；所以本發(fā)明靈敏度高，準確度高，可檢測至ng級，從而可檢測出極微量硫酸慶大霉素的存在。本發(fā)明一次可作多份樣品檢測，更適宜于處理大批量樣品。本發(fā)明檢測時間短為1～1.5h，比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法快2～3h。本發(fā)明檢測方法簡單易行，可獨立操作，而且成本低不足進口試劑盒價格的一半，更易于推廣使用。
圖1是根據(jù)具體實施方式
九繪制出的標準曲線圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大霉素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解于20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大霉素蛋白偶聯(lián)物；(3)取2mL硫酸慶大霉素牛血清白蛋白偶聯(lián)物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每只鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大霉素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)采用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，并用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物；(8)采用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物加入梯度稀釋的抗體中酶聯(lián)，反應完全后用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數(shù)作為工作濃度，并通過抗原稀釋的倍數(shù)計算、繪制出標準曲線。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(8)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(5)中采用飽和硫酸銨三步法分離抗體。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(5)中制備的抗體于4℃環(huán)境中保藏。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(3)中加強免疫小鼠每只注射硫酸慶大霉素0.227mg。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按具體實施方式
一得出的工作濃度稀釋，制成包被液后加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然后按繪制具體實施方式
一標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經(jīng)梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯(lián)反應1～1.5h并用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據(jù)具體實施方式
一繪制出的標準曲線查出對應數(shù)值再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得出樣品硫酸慶大霉素殘留量。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟(一)中抗體稀釋200×，制成包被液。其它步驟與實施方式六相同。
抗體稀釋200×為抗體最佳工作濃度。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
六的不同點是步驟(一)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。其它步驟與實施方式六相同。
具體實施方式
九本實施方式檢測硫酸慶大霉素。首先是繪制標準曲線(1)取0.17g硫酸慶大霉素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解于20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌30h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中透析7h，微孔膜收集抗原硫酸慶大霉素蛋白偶聯(lián)物；(3)取2mL硫酸慶大霉素牛血清白蛋白偶聯(lián)物和8mL福氏完全佐劑乳化，每只鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫每只小鼠注射硫酸慶大霉素0.227mg，直到抗體效價為1∶16以上，采用雙向瓊脂擴散實驗測定抗體效價；(4)分離血清；(5)采用飽和硫酸銨三步法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，并用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物；(8)采用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物加入梯度稀釋的抗體中酶聯(lián)，抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1，反應完全后用TMB顯色，混合液變?yōu)辄S色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，所選孔中抗體稀釋200×，以抗體稀釋200×作為工作濃度，并通過抗原稀釋的倍數(shù)計算、制出標準曲線和標準數(shù)據(jù)表，標準曲線如圖1所示，圖1中曲線R2＝0.9847(R2值≥0.97的點可取為線性點)符合y＝-0.0064x+1.3788的直線公式，標準數(shù)據(jù)表如表1所示，表1中n為抗原稀釋的倍數(shù)。
選取樣品進行硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測(一)抗體按工作濃度稀釋200×，制成包被液后加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然后按1∶1體積比向包被液中加入經(jīng)梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯(lián)反應1.1～1.4h并用TMB顯色，混合液仍為藍色證明樣品中無硫酸慶大霉素殘留，混合液變?yōu)辄S色證明樣品中有硫酸慶大霉素殘留；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量變色混合液的OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據(jù)標準曲線圖1和標準數(shù)據(jù)表表1查出的數(shù)值再乘以樣品對應的稀釋倍數(shù)n，即得出樣品硫酸慶大霉素殘留量。
表1
權利要求
1.制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法，其特征在于制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法如下(1)取0.17g硫酸慶大霉素分別與0.12g牛血清白蛋白和0.12g卵清白蛋白溶解于20mL、pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，再分別加入濃度為2.5％的戊二醛10mL，攪拌28～32h；(2)在pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中透析6～8h，微孔膜收集抗原硫酸慶大霉素蛋白偶聯(lián)物；(3)取2mL硫酸慶大霉素牛血清白蛋白偶聯(lián)物與8mL完全福氏佐劑或8mL不完全福氏佐劑乳化，每只鼠腹腔內注射乳化抗原0.2mL，加強免疫注射硫酸慶大霉素，直到抗體效價為1∶16以上；(4)分離血清；(5)采用硫酸銨鹽析法分離血清中的抗體，再以DEAE-離子交換劑法純化抗體；(6)梯度稀釋抗體，并用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉；(7)梯度稀釋抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物；(8)采用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度按棋盤法將梯度稀釋的抗原硫酸慶大霉素卵清白蛋白偶聯(lián)物加入梯度稀釋的抗體中酶聯(lián)，反應完全后用TMB顯色；(9)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，挑選OD450值為1～1.5的孔，以所選孔中抗體的稀釋倍數(shù)作為工作濃度，并通過抗原稀釋的倍數(shù)計算、繪制出標準曲線。
2.根據(jù)權利要求1所述的制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法，其特征在于步驟(8)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。
3.根據(jù)權利要求1所述的制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法，其特征在于步驟(5)中采用飽和硫酸銨三步法分離抗體。
4.根據(jù)權利要求1所述的制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法，其特征在于步驟(5)中制備的抗體于4℃環(huán)境中保藏。
5.根據(jù)權利要求1所述的制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法，其特征在于步驟(3)中加強免疫小鼠每只注射硫酸慶大霉素0.227mg。
6.硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法，其特征在于硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法步驟如下(一)抗體按權利要求1得出的工作濃度稀釋，制成包被液后加入ELISA檢測板，再用濃度為1％的酪蛋白-PBS溶液封閉，然后按繪制權利要求1標準曲線過程中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比加入經(jīng)梯度稀釋的樣品，再在41℃條件下酶聯(lián)反應1～1.5h并用TMB顯色；(二)用酶標儀在紫外光λ＝450nm下測量OD值，選擇OD450值為0.4～1.5的樣品稀釋液；(三)根據(jù)權利要求1繪制的標準曲線查出對應數(shù)值再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得出樣品硫酸慶大霉素殘留量。
7.根據(jù)權利要求6所述的硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法，其特征在于步驟(一)中抗體稀釋200×，制成包被液。
8.根據(jù)權利要求6所述的硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法，其特征在于步驟(一)中抗原稀釋液與抗體稀釋液的體積比為1∶1～10。
全文摘要
制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大霉素酶聯(lián)免疫快速檢測方法，它涉及一種制作硫酸慶大霉素檢測標準曲線的方法及硫酸慶大霉素檢測方法。它解決了目前硫酸慶大霉素檢測法檢測時間長的問題。繪標準曲線蛋白與硫酸慶大霉素偶聯(lián)后注射入小鼠體內制備抗體，再用免疫反應棋盤法選擇抗原抗體反應的工作濃度，然后挑選OD
文檔編號G01N33/543GK1928559SQ200610010569
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月18日 優(yōu)先權日2006年9月18日
發(fā)明者王靜, 曹維強, 丁志剛, 金芬, 邵華, 楊錨 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所