專利名稱：小反芻獸疫病毒熒光定量rt－pcr檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以小反芻獸疫病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)合成、制備的生物制劑，尤其是能夠?qū)π》雌c獸疫病毒進(jìn)行檢測(cè)的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是FAO/OIE規(guī)定的A類烈性傳染病，我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物疫病，是一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，主要感染小反芻獸，特別是山羊高度易感，其它野生動(dòng)物也可發(fā)生。該病以突然發(fā)熱、精神沉郁、眼和鼻排出分泌物、口腔潰瘍、呼吸失調(diào)、咳嗽、惡臭的腹瀉和高死亡率為特征。本病發(fā)病率可達(dá)100％，嚴(yán)重暴發(fā)期死亡率為100％。。
本病于1942年在西非科特迪瓦首次發(fā)現(xiàn)，隨后證實(shí)該病存在于非洲的尼日利亞、塞內(nèi)加爾和加納。近年來(lái)該病呈蔓延的趨勢(shì)，并且越來(lái)越明顯。由西非、中非和東非向東擴(kuò)散，目前已經(jīng)傳播到西亞和南亞地區(qū)，且有上升趨勢(shì)。目前，與我國(guó)接壤的南亞地區(qū)印度、尼泊爾、孟加拉國(guó)、巴基斯擔(dān)和阿富汗也暴發(fā)了PPR。該病作為一種重大的跨國(guó)動(dòng)物疫病，嚴(yán)重威脅我國(guó)的動(dòng)物衛(wèi)生安全，對(duì)該病開(kāi)展研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
小反芻獸疫的病原是副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste despetits ruminants virus，PPRV)。PPR和牛瘟(Rinderpest，RP)除臨床癥狀和病理變化相似以外，二者還具有血清學(xué)相關(guān)性，以前認(rèn)為PPRV是RPV的一株變異株，PPRV適應(yīng)于山羊，有時(shí)是綿羊，并喪失感染牛的能力；Gibbs等證實(shí)PPRV和同屬的RPV、犬瘟熱、人類麻診病毒抗原性存在明顯的聯(lián)系，具有血清學(xué)相關(guān)性，能夠產(chǎn)生交叉保護(hù)?，F(xiàn)在根據(jù)PPRV部分F基因序列的遺傳特性，把PPRV毒株化分為四群三群起源于非洲，一群起源于亞洲；其中非洲群中的一株也在亞洲發(fā)現(xiàn)。
PPR病毒的基因組由單股負(fù)鏈無(wú)節(jié)段RNA組成，RNA鏈從3’至5’依次分布著N-P-M-F-HN-L6個(gè)基因，編碼相應(yīng)的6種主要結(jié)構(gòu)蛋白。PPR病毒粒子呈圓形，在病毒包膜的里面是核衣殼，由核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)組成。N蛋白由N基因編碼，包含一個(gè)開(kāi)放的閱讀框架(ORF)，編碼525個(gè)氨基酸殘基；P蛋白和L蛋白構(gòu)成病毒的多聚合酶。在病毒包膜上有1種基質(zhì)蛋白(M蛋白)和2種糖蛋白突起(F蛋白和HN蛋白)。M蛋白由M基因編碼，該基因長(zhǎng)1466nt，包含一個(gè)開(kāi)放的閱讀框架(ORF)，編碼335個(gè)氨基酸殘基。HN糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，具有較高的變異性，含有T細(xì)胞決定簇，可能與宿主細(xì)胞的特異性有關(guān)。F糖蛋白具有細(xì)胞融合活性，由F基因編碼的蛋白，該基因長(zhǎng)2321nt，從第489nt到第549nt內(nèi)含有4個(gè)ATG，第4個(gè)ATG為編碼蛋白的起始子，編碼一個(gè)含546氨基酸，分子量為59.310Da的蛋白多肽。F基因在麻疹病毒屬中高度保守，其5’端序列在具有病毒特異性；F蛋白是決定病毒感染成功與否的關(guān)鍵因素，能夠引起病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變，具有病毒誘導(dǎo)細(xì)胞溶血素、細(xì)胞溶合和啟動(dòng)感染的生物學(xué)活性。HN和F糖蛋白在該屬病毒中是主要的保護(hù)性免疫原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。
常用的抗原檢測(cè)方法主要有病毒分離試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散(AGID)、對(duì)流免疫電泳(CIEP)、免疫捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)等。病毒分離試驗(yàn)鑒定PPR病毒可以用原代羔羊腎或非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞組織培養(yǎng)分離。PPR病毒產(chǎn)生的CPE在5天內(nèi)出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、收縮，最終形成合胞體，合胞體的細(xì)胞核呈圓形，猶如表盤狀排列。PPR病毒分離物通常采用病毒中和試驗(yàn)(VN)或電子顯微鏡作進(jìn)一步鑒定。病毒RNA檢測(cè)目前常用PPR特異性的cDNA探針和RT-PCR兩種方法檢測(cè)。還有報(bào)道根據(jù)編碼N蛋白的3’末端基因序列設(shè)計(jì)一組引物，該引物可以特異性擴(kuò)增一個(gè)300堿基對(duì)的片段，用限制性內(nèi)切酶消化或用非放射性寡核苷酸探針雜交技術(shù)驗(yàn)證擴(kuò)增片段的特異性來(lái)診斷PPR。
該病常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)采用病毒中和試驗(yàn)(VN)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA。病毒中和試驗(yàn)通常在原代羔羊腎細(xì)胞或Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)管培養(yǎng)進(jìn)行。RPV抗體和PPRV抗體會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可與牛瘟病毒進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，當(dāng)PPR中和滴度高于牛瘟?xí)r，則判為PPR陽(yáng)性。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(C-ELISA)Libeau G應(yīng)用重組桿狀病毒表達(dá)的核蛋白(N-B)建立C-ELISA試驗(yàn)用于檢測(cè)PPRV抗體。針對(duì)PPRV核蛋白的特異性MAb能夠和這種N-B的特異性位點(diǎn)結(jié)合。
對(duì)于快速檢測(cè)PPR病毒，病毒分離方法費(fèi)時(shí)，不能作出快速診斷，且有生物安全隱患，需要選用敏感的宿主或細(xì)胞。其它檢測(cè)方法的敏感性和特異性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用小反芻獸疫病毒H基因序列設(shè)計(jì)合成的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供這種檢測(cè)試劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供這種檢測(cè)試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明系選擇小反芻獸疫病毒H基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計(jì)合成引物和探針。將設(shè)計(jì)的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)，得到最適合的引物和探針。
本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為76bp，引物和探針序列為引物PPV-H-F5’-GGGTCCCCCTGTTTTCCAT-3’PPV-H-R5’-CGCTAAAAGACATCTCCGATAGTCA-3’探針(FAM)5’-TGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGT-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑的制備方法由以下步驟組成一、選擇PPV H基因的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為GGGTCCCCCTGTTTTCCATATGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGTGATGACTATCGGAGATGTCTTTTAGCG；二、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針；三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；四、探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR；五、將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針；六、經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，得到如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增效率和特異性好的引物和探針。
研究建立特異、敏感、可對(duì)低含量PPV病毒感染、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，在檢疫、診斷、分子流行病學(xué)研究具有重要意義。本發(fā)明研制的小反芻獸疫病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR將PCR與熒光檢測(cè)相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)PCR費(fèi)時(shí)、易污染、擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)和每次檢測(cè)的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)，可對(duì)樣品中的PPV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1、本試劑與常規(guī)的RT-PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR可對(duì)樣品中低含量的PPV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，是一種PPV檢測(cè)的良好方法。
2、本試劑可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物、分泌物、血液、組織等多種樣品中的PPV進(jìn)行快速檢測(cè)，樣品適用范圍廣，沒(méi)有生物安全隱患，使用安全的優(yōu)點(diǎn)。
3、本熒光定量RT-PCR試劑除了具有特異性高、敏感性強(qiáng)外，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。比常規(guī)PCR快速，無(wú)需擴(kuò)增后的電泳分析?？朔顺Ｒ?guī)RT-PCR和免疫捕獲RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物須電泳檢測(cè)、費(fèi)時(shí)、不敏感和不能定量的缺點(diǎn)。
4、與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR作出一個(gè)定量的、客觀的估計(jì)，判定出陽(yáng)性、陰性和可疑。CT值為30.00可確定為陽(yáng)性和陰性的臨界值(cut-off)。更重要的是熒光定量RT-PCR特別適用于保存時(shí)間長(zhǎng)而無(wú)法進(jìn)行分離病毒的大批量樣品的檢測(cè)。
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時(shí)之內(nèi)作出定性、定量檢測(cè)結(jié)果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測(cè)臨床樣品中PPV的敏感和可靠的方法。
具體實(shí)施例方式
1、PPV H基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照黃培堂等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，中國(guó)科學(xué)出版社，2003年1月，第1217頁(yè)至第1259頁(yè)，進(jìn)行小反芻獸疫病毒H基因克隆和測(cè)序，構(gòu)建PPV H基因重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pBAD-H。
2、設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明選擇PPV H基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過(guò)對(duì)GenBank中報(bào)道的PPV各分離株病毒基因的DNA序列和上述1克隆和測(cè)序的小反芻獸疫病毒PPV基因DNA序列進(jìn)行同源性分析比較，選定PPV基因的保守片段(69bp)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR。將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針，經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，確定擴(kuò)增效率和特異性最好的一對(duì)引物和一條探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為76bp。
3、RNA提取小反芻獸疫病毒RNA和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)制備。參照黃禎祥主編《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，科學(xué)出版社(1990年)第143-146頁(yè)，先測(cè)定毒價(jià)，以Reed和Muench氏法計(jì)算TCID50。取100μL病毒原液，參照盧圣棟主編《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)》，科學(xué)出版社(1999年)第61-62頁(yè)，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用無(wú)RNA酶的超純水溶解總RNA，稀釋成相當(dāng)于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每個(gè)反應(yīng)管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和細(xì)胞組織等材料直接提取RNA。熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR試驗(yàn)用同批次提取的RNA。
4、PPV熒光定量RT-PCRPPV熒光定量RT-PCR采用50μL體積反應(yīng)液，在7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行42℃30min反轉(zhuǎn)錄；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec，60℃1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
引物和探針的濃度進(jìn)行精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強(qiáng)度增加值(ΔRn)。每次檢測(cè)時(shí)，設(shè)立用水代替病毒RNA樣品的4個(gè)陰性對(duì)照(或正常組織、細(xì)胞陰性對(duì)照)；設(shè)立相當(dāng)于1000、100、10、1TCID50/每反應(yīng)管的FMDV標(biāo)準(zhǔn)各4個(gè)對(duì)照；每個(gè)樣品檢測(cè)做3管平行試驗(yàn)。在4個(gè)陰性對(duì)照為陰性、陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)有效，可進(jìn)一步判定結(jié)果。每個(gè)樣品須作多個(gè)備份，以進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)。
5、常規(guī)RT-PCR常規(guī)RT-PCR的上游引物和下游引物與熒光定量RT-PCR相同，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為76bp，按常規(guī)方法進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)用3％瓊脂糖電泳分析，陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)一條76bp特異性條帶。
6、PPV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性用RPV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21細(xì)胞、野外采集山羊和綿羊的組織樣品和血清進(jìn)行特異性比較檢測(cè)。對(duì)PPV樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)，比較它們的敏感性。
7、熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)在評(píng)估PPV熒光定量RT-PCR檢測(cè)PPV方法中的組內(nèi)和組間試驗(yàn)的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時(shí)，用相當(dāng)于1000TCID50的樣品RNA，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，每次試驗(yàn)的每個(gè)樣品做6個(gè)平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。
8、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及核酸拷貝數(shù)的計(jì)算上述1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD-H，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，LB培養(yǎng)基(含Amp100μg/mL)增殖，堿裂解法提取，經(jīng)試劑盒純化，質(zhì)粒濃度用分光光度計(jì)測(cè)OD260定量。模板濃度的計(jì)算在作絕對(duì)定量時(shí)，首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀釋，通過(guò)測(cè)OD知道質(zhì)粒原液(標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度后，換算成每個(gè)PCR管中模板的數(shù)量。做熒光定量RT-PCR檢測(cè)，以拷貝數(shù)或TCID50的對(duì)數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低CT值和最高ΔRn，提高擴(kuò)增效率和敏感性。應(yīng)用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和PPV細(xì)胞毒，經(jīng)系列稀釋，制備DNA和RNA不同含量的檢測(cè)樣品。對(duì)設(shè)計(jì)的二對(duì)引物和各自的探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探針終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。
10、對(duì)PPV樣品的檢測(cè)用熒光定量RT-PCR對(duì)PPV細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、RPV、BTV、EHD、BVDV、正常BHK21細(xì)胞、山羊和綿羊組織等試驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測(cè)。提取的RNA稀釋后檢測(cè)，陽(yáng)性樣品的CT值均小于或等于30.0，陰性對(duì)照樣品的CT值均大于35.0，試驗(yàn)特異性強(qiáng)。CT值35.0可作為是陽(yáng)性和陰性的臨界值。CT值大于35.0可判為陰性，CT值小于或等于30.0可判為陽(yáng)性，在30.0-35.0之間為可疑，須重新試驗(yàn)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)PPV的特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性很好。
11、PPV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測(cè)程序11.1試劑盒組成(50μl反應(yīng)×50次)根據(jù)上述1～10試驗(yàn)結(jié)果，按照反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)確定的反應(yīng)條件，配制如下試劑盒組份

11.2操作方法
11.2.1總RNA提取(1)取1ml-1.5ml組織樣品研磨上清液或液體樣品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，離心5min，棄上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振蕩混勻，置室溫5min，徹底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec，室溫放置3min。
(4)12000rpm，4℃，離心15min。
(5)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μ1溶液III，混勻，室溫放置10min。
(6)13000rpm，4℃，離心10min，棄上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振蕩混勻，12000rpm，4℃，離心5min。小心充上清液。管底部可見(jiàn)有乳白色膠樣RNA沉淀。
(8)小心打開(kāi)管蓋，室溫自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底R(shí)NA，溶解RNA?？芍苯佑糜诜崔D(zhuǎn)錄或-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 11.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200μl光學(xué)PCR反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為50μl，向反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)物 (2)定量按需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，至少7個(gè)稀釋度。
(3)設(shè)立對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各設(shè)2管。
11.2.3擴(kuò)增按下列參數(shù)設(shè)置反應(yīng)條件

11.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)——陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)擴(kuò)增曲線，一直為水平線。
——陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線基本重合，特別是在Threshold(熒光臨界值)附近。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
——定量用的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，7個(gè)點(diǎn)具良好的線性范圍，平臺(tái)區(qū)匯于一起，相關(guān)系數(shù)在0.98以上。
(3)結(jié)果描述及判定——陰性Ct值應(yīng)大于35.0或無(wú)擴(kuò)增曲線，表示樣品中無(wú)小反芻獸疫病毒。
——陽(yáng)性Ct值小于等于30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在小反芻獸疫病毒。
——有效原則Ct值在30.0～35.0之間的樣本建議重做。重做結(jié)果Ct值大于35.0或無(wú)擴(kuò)增曲線者為陰性，否則為陽(yáng)性。
——定量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作出定量。
權(quán)利要求
1.一種小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑，其特征在于包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為76bp，引物和探針序列為引物PPV-E-F5’-GGGTCCCCCTGTTTTCCAT-3’PPV-E-R5’-CGCTAAAAGACATCTCCGATAGTCA-3’探針(FAM)5’-TGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGT-3’(TAMRA)。
2.按照權(quán)利要求1所述的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(一)、選擇小反芻獸疫病毒特異而各分離病毒株間比較保守的H基因序列的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為GGGTCCCCCTGTTTTCCATATGACCAACTATCTCACAGTGAACATGAGTGATGACTATCGGAGATGTCTTTTAGCG；(二)、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針；(三)、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行OligoDNA的合成；(四)、探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMAR；(五)、將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)后，初步確定候選引物和探針；(六)、應(yīng)用初步確定的候選引物和探針，經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用評(píng)估，得到如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增效率和特異性好的引物和探針。
3.權(quán)利要求1所述的小反芻獸疫病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑在制備PPV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以小反芻獸疫病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)π》雌c獸疫病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明系選擇小反芻獸疫病毒特異而各分離病毒株間比較保守的H基因片段為靶目標(biāo)，通過(guò)精心設(shè)計(jì)、合成引物和探針。將設(shè)計(jì)合成的多對(duì)引物和探針進(jìn)行最佳配對(duì)篩選實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對(duì)比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，得到最適合的引物和探針。本發(fā)明所述的小反芻獸疫病毒熒光定量RT－PCR檢測(cè)試劑包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為76bp。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1840700SQ20061001061
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者花群義, 周曉黎, 董俊, 楊云慶, 徐自忠, 肖榮海, 尹尚蓮 申請(qǐng)人:云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心