專利名稱：尼帕病毒的熒光定量rt－pcr檢測試劑及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以尼帕病毒基因片段H基因為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)δ崤敛《具M行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尼帕病毒(Nipah virus，NPV)病是一種烈性人畜共患傳染病。1998年9月，在馬來西亞的人和豬群中暴發(fā)流行一種嚴重的發(fā)熱性腦炎病，這次暴發(fā)流行的傳染病最初懷疑是日本乙型腦炎。到1999年2月，類似的疾病再次暴發(fā)，這次暴發(fā)與馬來西亞怡保市的豬向南部地區(qū)運輸有關(guān)。同年3月，新加坡11名屠宰從馬來西亞進口豬的工人發(fā)生呼吸道癥狀和腦炎癥狀的疾病，由于采取了禁止從馬來西亞進口豬的措施，新加坡的暴發(fā)流行很快得到了控制。同時，馬來西亞通過撲殺疫區(qū)和疫區(qū)周圍地區(qū)的100多萬頭豬，到2000年5月疫情得到了控制。至2000年11月，馬來西亞共發(fā)病人數(shù)為265人，死亡105人，新加坡發(fā)病人數(shù)為11人，死亡1人。Nipah病毒除可引起人、豬感染外，也可感染狗、貓和羊等家畜。人感染后的潛伏期為7-20天。病人一般表現(xiàn)為發(fā)熱(可持續(xù)3-14天)，頭痛，少數(shù)病例出現(xiàn)呼吸癥狀，部分患者在24-48小時內(nèi)出現(xiàn)嗜睡、意識混亂、痙攣、顫抖，幾天后發(fā)展為昏迷，多數(shù)病例在昏迷中死亡。
這種傳染病的某些特征與日本乙型腦炎有明顯的不同，該病多發(fā)于與豬接觸的成年男子，兒童很少發(fā)生；與蚊子傳播無關(guān)；也不受乙型腦炎疫苗免疫的影響等。因此，分離新的病原體受到了馬來西亞研究者的重視。1999年3月，用3個嚴重病人的腦脊液接種Vero細胞進行了病毒分離，分離到的病毒經(jīng)鑒定屬于副粘病毒，由于此病毒最先從Kampung Sungai Nipah村的一名死者身上分離到，故將其命名為Nipah病毒。
該病毒屬副粘病毒科單股負鏈RNA病毒，核衣殼螺旋對稱，有囊膜，囊膜有穿膜糖蛋白，包括細胞受體結(jié)合蛋白和融合蛋自(F蛋白)，前者又包括糖蛋白(G蛋白)、血凝素(H)或血凝素—神經(jīng)氨酸酶(NH)。Nipah病毒的基因組測序工作已經(jīng)完成，基因組長度為18246bp。由核衣殼基因(N)、磷蛋自基因(P)/V基因/C基因、基質(zhì)蛋自基因(M)、融合蛋白基因(F)、糖蛋自基因(G)、聚合酶基因(L)等組成。Nipah病毒可在Vero、BHK-21、PS等細胞系中生長良好。
根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化很難確診。與病豬接觸的人多發(fā)病，以出現(xiàn)腦炎癥狀為主，病理變化以血管炎和血管內(nèi)皮細胞形成合胞體為主，可作為診斷的參考依據(jù)。實驗室檢查可見淋巴細胞減少，血小板減少，低血鈉，肝組織中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高。目前采用的診斷方法主要有(1)病毒的分離培養(yǎng)與鑒定；(2)用特異性抗體和透射電鏡檢測Nipah病毒；(3)核磁共振是診斷Nipah腦炎敏感而有效的方法；(4)從病料中提取病毒基因組，進行RT-PCR檢測；(5)采用免疫組化的方法進行病毒的組織定位；(6)對病毒基因進行限制性核酸序列分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用尼帕病毒N基因序列設(shè)計合成的尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供這種檢測試劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供這種檢測試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明系選擇尼帕病毒N基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計合成引物和探針。將設(shè)計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，得到最適合的引物和探針。
本發(fā)明所述的尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為76bp，引物和探針序列為引物NPV-N-F5’-GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTT-3’NPV-N-R5’-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3’探針(FAM)5’-CTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法由以下步驟組成一、選擇NPV N基因的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為
GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGGCAGTGATCAAGATATCGATGAAGGGG；二、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；四、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；五、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；六、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如權(quán)利要求1所述的擴增效率和特異性好的引物和探針。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明研制的Nipah病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑可快速、安全和準(zhǔn)確地直接檢測各種樣品中的Nipah病毒，克服了RT-PCR檢測方法費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點，可對樣品中的NPV進行準(zhǔn)確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點。在加強進口動物特別是進口豬的檢疫，對于預(yù)防Nipah病毒傳入我國具有實際應(yīng)用價值。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為1、本試劑與常規(guī)的RT-PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量、可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。尼帕病毒熒光定量RT-PCR可對樣品中低含量的NPV病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進行準(zhǔn)確檢測，是一種NPV檢測的良好方法。
2、本試劑可對細胞培養(yǎng)物、分泌物、血液、組織等多種樣品中的NPV進行快速檢測，樣品適用范圍廣，沒有生物安全隱患，使用安全的優(yōu)點。
3、本熒光定量RT-PCR試劑除了具有特異性高、敏感性強外，可同時進行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險。比常規(guī)PCR快速，無需擴增后的電泳分析?？朔顺Ｒ?guī)RT-PCR和免疫捕獲RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物須電泳檢測、費時、不敏感和不能定量的缺點。
4、與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR作出一個定量的、客觀的估計，判定出陽性、陰性和可疑。CT值為35.00可確定為陽性和陰性的臨界值(cut-off)。更重要的是熒光定量RT-PCR特別適用于保存時間長而無法進行分離病毒的大批量樣品的檢測。
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內(nèi)作出定性、定量檢測結(jié)果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測臨床樣品中NPV的敏感和可靠的方法。
具體實施例方式
1、NPV N基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版)，中國科學(xué)出版社，2003年1月，第1217頁至第1259頁，進行尼帕病毒N基因克隆和測序，構(gòu)建NPV N基因重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為pBAD-N。
2、設(shè)計引物和探針本發(fā)明選擇NPV N基因的保守片段為靶目標(biāo)，通過對GenBank中報道的NPV各分離病毒株基因的DNA序列和上述1克隆和測序的尼帕病毒NPV基因DNA序列進行同源性分析比較，選定NPVNPV基因的保守片段(76bp)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR。將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的一對引物和一條探針，擴增目標(biāo)片段長度為76bp。
3、RNA提取尼帕病毒RNA和標(biāo)準(zhǔn)品同時制備。參照世界動物衛(wèi)生組織(OIE)編著的《動物疫病診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》(2004年)第2.10.10章節(jié)，用酚/氯仿核酸抽提法提取RNA，用無RNA酶的超純水溶解總RNA，分泌物、組織、血液(抗凝血)、血清和細胞組織等材料直接提取RNA。熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR試驗用同批次提取的RNA。
4、NPV熒光定量RT-PCRNPV熒光定量RT-PCR采用50μL體積反應(yīng)液，在7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進行42℃30min反轉(zhuǎn)錄；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec，60℃1min，擴增40個循環(huán)。
引物和探針的濃度進行精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強度增加值(ΔRn)。每次檢測時，設(shè)立用水代替病毒RNA樣品的4個陰性對照(或正常組織、細胞陰性對照)；設(shè)立相當(dāng)于1000、100、10、1TCID50/每反應(yīng)管的NPV標(biāo)準(zhǔn)各4個對照；每個樣品檢測做3管平行試驗。在4個陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，可進一步判定結(jié)果。每個樣品須作多個備份，以進行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗。
5、常規(guī)RT-PCR常規(guī)RT-PCR的上游引物和下游引物與熒光定量RT-PCR相同，擴增目標(biāo)片段長度為76bp，按常規(guī)方法進行擴增。檢測用2％瓊脂糖電泳分析，陽性擴增結(jié)果出現(xiàn)一條76bp特異性條帶。
6、NPV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性用NDV、BVDV、PPV以及正常Vero、BHK-21細胞、野外采集豬的組織樣品和血清進行特異性比較檢測。對NPV樣品進行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測，比較它們的敏感性。
7、熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗在評估NPV熒光定量RT-PCR檢測NPV方法中的組內(nèi)和組間試驗的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時，用NPV樣品，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進行熒光定量RT-PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。
8、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及核酸拷貝數(shù)的計算上述1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBAD-N，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，LB培養(yǎng)基(含Amp100μg/mL)增殖，堿裂解法提取，經(jīng)試劑盒純化，質(zhì)粒濃度用分光光度計測OD260定量。模板濃度的計算在作絕對定量時，首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)品進行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀釋，通過測OD知道質(zhì)粒原液(標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度后，換算出每個PCR管中模板的數(shù)量。做熒光定量RT-PCR檢測，以拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低CT值和最高ΔRn，提高擴增效率和敏感性。應(yīng)用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)系列稀釋，制備DNA不同含量的檢測樣品。對設(shè)計的二對引物和各自的探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探針終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。
10、對樣品的檢測用熒光定量RT-PCR對NPV樣品、NDV、BVDV、PPV以及正常Vero、BHK-21細胞、野外采集豬的組織等試驗樣品進行檢測。提取的RNA稀釋后檢測，陽性樣品的CT值均小于或等于35.0，陰性對照樣品的CT值均大于38.0，試驗特異性強。CT值38.0可作為是陽性和陰性的臨界值。CT值大于38.0可判為陰性，CT值小于或等于35.0可判為陽性，在35.0-38.0之間為可疑，須重新試驗。熒光定量RT-PCR檢測NPV的特異性強，敏感性高，重復(fù)性很好。
11、NPV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測程序11.1試劑盒組成(50μl反應(yīng)×50次)根據(jù)上述1～10試驗結(jié)果，按照反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗確定的反應(yīng)條件，配制如下試劑盒組份

11.2操作方法11.2.1總RNA提取(1)取1ml-1.5ml組織樣品研磨上清液或液體樣品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，離心5min，棄上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振蕩混勻，置室溫5min，徹底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心蓋上帽蓋，用力快速振蕩15sec，室溫放置3min。
(4)12000rpm，4℃，離心15min。
(5)小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混勻，室溫放置10min。
(6)13000rpm，4℃，離心10min，棄上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振蕩混勻，12000rpm，4℃，離心5min。小心充上清液。管底部可見有乳白色膠樣RNA沉淀。
(8)小心打開管蓋，室溫自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA?？芍苯佑糜诜崔D(zhuǎn)錄或-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 11.2.2反應(yīng)組份配制(1)取一支200μl光學(xué)PCR反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為50μl，向反應(yīng)管中加入下列反應(yīng)物 (2)定量按需要對標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，至少7個稀釋度。
(3)設(shè)立對照陽性對照和陰性對照各設(shè)2管。
11.2.3擴增按下列參數(shù)設(shè)置反應(yīng)條件

11.2.4結(jié)果分析和判定(1)結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。
(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)——陰性對照無Ct值，并且無擴增曲線，一直為水平線。
——陽性對照的Ct值應(yīng)小于35.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，2個陽性對照擴增曲線基本重合，特別是在Threshold(熒光臨界值)附近。否則，此次實驗視為無效。
——定量用的標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線出現(xiàn)典型的擴增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，7個點具良好的線性范圍，平臺區(qū)匯于一起，相關(guān)系數(shù)在0.98以上。
(3)結(jié)果描述及判定——陰性Ct值應(yīng)大于38.0或無擴增曲線，表示樣品中無尼帕病毒。
——陽性Ct值小于或等于35.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中存在尼帕病毒。
——有效原則Ct值在35.0～38.0的樣本建議重做。重做結(jié)果Ct值大于38.0或無擴增曲線者為陰性，否則為陽性。
——定量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線作出定量。
權(quán)利要求
1.一種尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為76bp，引物和探針序列為引物NPV-N-F5’-GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTT-3’NPV-N-R5’-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3’探針(FAM)5’-CTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-3’(TAMRA)。
2.按照權(quán)利要求1所述的尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(一)、選擇尼帕病毒特異而各毒株間比較保守的N基因序列的保守片段為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGGCAGTGATCAAGATATCGATGAAGGGG；(二)、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；(三)、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；(四)、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；(五)、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；(六)、經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經(jīng)過大量臨床樣品的檢測應(yīng)用評估，得到如權(quán)利要求1所述的擴增效率和特異性好的引物和探針。
3.權(quán)利要求1所述的尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑在制備NPV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以尼帕病毒基因片段為靶目標(biāo)設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)δ崤敛《具M行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法。本發(fā)明系選擇尼帕病毒特異而各毒株間比較保守的N基因片段為靶目標(biāo)，精心設(shè)計、合成引物和探針。將設(shè)計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，得到最適合的引物和探針。本發(fā)明所述的尼帕病毒熒光定量RT－PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為76bp。本試劑可對尼帕病毒進行快速檢測。
文檔編號G01N21/64GK1840701SQ20061001061
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者花群義, 周曉黎, 董俊, 楊云慶, 徐自忠, 肖榮海, 尹尚蓮 申請人:云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心