專利名稱：罌粟堿的酶聯(lián)免疫定量檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及罌栗堿的檢測方法，尤其是涉及一種針對罌粟堿的酶聯(lián)免疫定量檢測方法及其試劑盒，屬于化合物分析檢測領域。
背景技術：
罌粟堿(1-[(3，4-二甲氧基苯基)甲基]-6，7-二甲氧基異喹啉)是自然界中存在的一種重要的芐基異喹啉類生物堿，在阿片類植物中含量通常很低(低于1％)，目前多用化學合成方法獲得。在臨床上罌粟堿常用于治療腦、心和外周血管痙攣引起的缺血以及腎、膽和胃腸道等內臟痙攣，但其無選擇的肌肉松弛作用也常導致血壓降低，心律失常，其對人的致死劑量為100-500mg/kg。中藥罌粟殼是罌粟科植物Papaver somniferum L.的干燥成熟果殼，其主要生物活性成分包括嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可汀等。罌粟殼的主要功能為斂肺、澀腸和止痛，因此常被用于治療久咳、久瀉、脫肛和脘腹疼痛等，但久服易成癮。
由于罌粟堿及罌粟殼中所含其它成分的毒副作用和久服成癮的危害，國家衛(wèi)生部于1996年將罌粟堿列入麻醉藥品管制品種，并對罌粟殼的流通和管理作了相應的嚴格規(guī)定。然而近年來一些不法經營者為了招徠顧客，通過不正當途徑獲得罌粟殼，并添加在其銷售的食品(如火鍋、鹵味調料等)中，因此有必要通過檢測(尤其是現(xiàn)場檢測)相關食品中嗎啡、罌粟堿等成分以實現(xiàn)對罌粟殼使用情況的監(jiān)督，同時為了控制產品質量和用藥安全，在生產過程和藥理研究中也需要對罌粟堿含量進行快速、準確的測定。
目前檢測罌粟堿的常用方法有化學分析法、光譜法、色譜法、電泳法、電化學法和免疫分析方法等，但對于基體成分復雜的生物、食品類樣品，前三種方法的樣品預處理過程繁瑣、儀器運行費用高、操作復雜。而免疫分析方法通常對樣品處理要求低、設備和操作相對簡單。但現(xiàn)有的免疫分析方法，基本都是采用Yeremenko等(Yeremenko S.N.，SukhovI.Y，Ye I.，et al.，Khim.-Farm.Zh.，1992，26100-101)創(chuàng)立的方法合成全抗原，制備抗體，最終所建立的酶聯(lián)免疫分析方法的靈敏度都不是十分理想。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單快速、操作方便、靈敏度高，適于水溶液中及植物成分(如果實、殼等)、食品中罌粟堿含量測定的酶聯(lián)免疫分析方法。它包括如下步驟
(1)活化罌粟堿(PAP)的芐基甲氧基，分別與不同的載體蛋白偶聯(lián)制成免疫全抗原和包被全抗原；(2)用免疫全抗原免疫動物，獲得多克隆抗體；(3)用包被全抗原包被酶標板；(4)封閉后，加入上述多克隆抗體與待測樣品的混合液進行競爭性結合反應，同時以多克隆抗體與標準罌粟堿溶液的混合液作為參比；(5)加入酶標二抗；(6)加底物顯色，終止反應后目測即可得到罌粟堿的大致含量。
此外，根據(jù)需要還可以包括步驟(7)定量檢測吸光度值，確定罌粟堿的含量。待測樣品中罌粟堿的濃度與吸光度值成反比。
該方法基于競爭酶聯(lián)免疫分析的原理，以固定于固相載體上的載體蛋白偶聯(lián)的罌栗堿與溶液中游離的罌粟堿分子競爭性地結合反應體系中少量的罌粟堿抗體，通過測量最終與固相罌粟堿結合的抗體數(shù)目來指示溶液中參與競爭的游離罌粟堿的含量。這是一種競爭抑制的過程，最終的測量信號(吸光度值)與罌粟堿的含量成反比。
對于免疫分析方法而言，抗體是決定整個方法性能的重要基礎，而抗體的效果在很大程度上取決于能引起相應動物發(fā)生免疫反應的抗原的結構。罌粟堿作為一類小分子化合物，雖然能與抗體發(fā)生免疫反應，即具有抗原性，但卻不能直接引起動物機體的免疫應答反應，即不具有免疫原性。它只相當于抗原分子上的一個抗原決定簇，被稱為半抗原。為此，必須將其與其它載體蛋白偶聯(lián)，如牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)等，獲得全抗原后，才能用于動物免疫。但是為了使最終獲得的抗體與全抗原上的半抗原結構具有良好的結合性質，在罌粟堿全抗原合成的過程中，分子活化和偶聯(lián)位置的選擇是至關重要的。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)與Yeremenko等用罌粟堿分子中異喹啉環(huán)的3位連接蛋白制備全抗原相比，盡量保持罌粟堿分子在合成全抗原過程中基本特征骨架(6，7-二甲氧基異喹啉環(huán))的完整性，可以使獲得的針對罌粟堿小分子的多克隆抗體的免疫反應性更好，而且以該抗體與經相應基團連接牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白的罌粟堿包被抗原組合構成的免疫分析方法的靈敏度更高。本發(fā)明選擇在罌粟堿的芐基甲氧基上進行活化，與載體蛋白偶聯(lián)形成全抗原，既保持6，7-二甲氧基異喹啉環(huán)的完整性，又保證偶聯(lián)位置與特征環(huán)距離最遠，使罌粟堿分子的特征結構得到充分暴露。
上述測定罌粟堿含量的酶聯(lián)免疫分析方法中，步驟(1)的載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)；罌粟堿(PAP)通過其甲氧基苯環(huán)連接載體蛋白，具體反應途徑如下1.罌粟堿在HBr水溶液中加熱回流生成苯環(huán)3位或4位的單脫甲基罌粟堿(MDMPAP)； 2.苯環(huán)3位或4位的單脫甲基罌粟堿(3-MDMPAP或4-MDMPAP)在強堿條件下經鹵代羧酸活化生成單脫甲基罌粟堿-O-羧烷基醚，如經α-溴乙酸活化生成單脫甲基罌粟堿-O-羧甲基醚(3-PAP-O-CME或4-PAP-O-CME)； 上述反應中的溴乙酸還可以用3-溴丙酸，3-氯丙酸代替。
3.單脫甲基罌粟堿-O-羧烷基醚經N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)作用與載體蛋白偶聯(lián)成全抗原，如PAP-O-CME與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)成全抗原PAP-BSA。

本發(fā)明未采用在罌粟堿分子中異喹啉環(huán)的3位引入具有反應性的氨基進行活化的傳統(tǒng)方法，而是選擇在罌粟堿(PAP)的芐基甲氧基上進行活化，與牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)或鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)形成全抗原，既保持6，7-二甲氧基異喹啉環(huán)的完整性，又保證偶聯(lián)位置與特征環(huán)距離最遠，使罌粟堿分子的特征結構得到充分暴露。通過上述方法獲得的牛血清白蛋白偶聯(lián)的罌粟堿全抗原(PAP-BSA)、雞卵清白蛋白偶聯(lián)的罌粟堿全抗原(PAP-OVA)或鑰孔嘁血藍蛋白偶聯(lián)的罌粟堿全抗原(PAP-KLH)，經免疫家兔，得到高親和力的多克隆抗體，為整個檢測方法的建立奠定了基礎。
針對罌粟堿的抗體可以與包被全抗原上的罌粟堿決定簇發(fā)生特異性的結合，但任何一個物質過量都會造成競爭反應無效，本發(fā)明抗原包被液的濃度應在2-10μg/mL之間，5μg/mL時最佳；而多克隆抗體工作濃度在0.8-10μg/mL之間，4μg/mL時最佳。在上述條件下，包被全抗原與多克隆抗體的反應曲線符合免疫反應的特征，而且包被全抗原的結合位點略微過量，保證在抗體的有限結合位點可以發(fā)生競爭反應。
在優(yōu)化的包被和抗體工作濃度下，若樣品中含有罌粟堿，則會與包被全抗原競爭有限的抗體結合位點，造成最終結合到包被全抗原上的抗體量減少，引起吸光度值的變化。本發(fā)明方法中，最合適的罌粟堿濃度范圍是0.1ng/mL-1000ng/mL。
上述步驟(5)通常使用辣根過氧化物酶標記的二抗；步驟(6)經酶底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作用顯藍色，加終止液硫酸，變成黃色；步驟(7)在450nm處測吸光度值A450nm。試樣中罌粟堿的濃度與A450nm值成反比，通過繪制吸光度值-濃度對數(shù)的標準曲線求出樣品中罌粟堿濃度。
本發(fā)明的方法適合于水溶液中罌粟堿的測定，該溶液可以是水、含有其他基質的血樣、注射液或與水混溶的有機溶劑的水溶液。本發(fā)明的方法也適用于植物、食品類樣品中罌粟堿的測定，在檢測該類樣品時，需要先將樣品中的罌粟堿提取到一種合適的溶劑中，如水溶液，或甲醇、乙醇等有機溶劑中，一般要求過濾取清液。對于溶液的pH值，較佳的是7～8，保證抗原抗體之間的結合反應。
選用合適的溶劑和方法能夠從植物及食品樣中提取罌粟堿。用水或含水的甲醇、鹽酸等溶液，采用超聲、煮沸等方法均可從這些固體樣品中提出罌粟堿。較佳的提取方法是選用80％甲醇，在室溫下超聲30分鐘即可完成提取。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種結構簡單、操作便利、靈敏度高的測定罌粟堿含量的試劑盒，包括包被有抗原的酶標板抗原為罌粟堿的甲氧基苯環(huán)與載體蛋白偶聯(lián)的全抗原；第一抗體溶液含有針對罌粟堿的特異性抗體，為罌粟堿的甲氧基苯環(huán)與另一載體蛋白偶聯(lián)的全抗原免疫動物得到的多克隆抗體，4℃存儲；酶標二抗溶液含有酶標記的二抗，4℃存儲，可選用的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶(AP)和β-D-半乳糖苷酶；罌粟堿標準溶液作參比，用于繪制吸光度值-濃度對數(shù)的標準曲線；洗滌緩沖液含有吐溫20的生理緩沖溶液，用于洗去酶標板上未結合的物質以及非特異性吸附的物質；樣品稀釋液生理緩沖溶液，用于稀釋待測樣品或罌粟堿標準溶液；底物溶液所含底物可被標記二抗的酶催化成有色產物；終止液用于終止酶催化反應。
上述載體蛋白選自牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)和鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)，但用于包被的全抗原和免疫的全抗原所選的載體蛋白不同。
上述第一抗體溶液通常配制成1mg/mL，使用時稀釋1000倍作為第一抗體工作液。
酶標二抗溶液使用時應稀釋后作為酶標抗體工作液，使最終的吸光度值落入0.2～1.0，稀釋倍數(shù)通常為500倍。
樣品稀釋液及洗滌緩沖液通常配制成10×溶液，使用時均作10倍稀釋。
試劑盒(包括第一抗體工作液和酶標抗體工作液)在4℃存儲，1×樣品稀釋液、1×洗滌緩沖液配制后可于常溫保存。
應用試劑盒檢測水溶液及植物成分(如果實，殼等)、食品中罌粟堿含量的方法，首先要求對樣品進行適當?shù)奶幚砣魳悠窞槿芤?，則可直接進行檢測或簡單過濾后進行檢測；若樣品為固體(果實、殼、食品等)，則以水或有機溶劑配合煮沸、超聲等方法提取后，過濾取清液進行檢測。
本發(fā)明的有益效果，一是用罌粟堿的甲氧基苯環(huán)連接牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或鑰孔嘁血藍蛋白的全抗原免疫動物所獲得的多克隆抗體效價較高，并且以該抗體為基礎所建立的分析方法的重現(xiàn)性好，靈敏度高，罌粟堿的最低檢出限可達0.06ng/mL(對火鍋底料中添加罌粟殼的實際檢出下限可達到0.025g罌粟殼/L湯)，比Yeremenko等創(chuàng)立的方法靈敏近10000倍，比目前最佳的色譜結果靈敏10倍。二是樣品處理簡單，生物體液樣品、醫(yī)用制劑可以直接測量或稍加稀釋即可，而固體類樣品則用甲醇或水經過超聲提取，簡單過濾就可用于檢測。一般含有其它基質的樣品，如血清，稀釋40倍就可消除基體效應；而鹽酸罌粟堿注射液等基體簡單的溶液和罌粟殼、火鍋底料等樣品的提取液，只要濃度合適，直接檢測即可。三是方法所涉及的儀器和試劑簡單，通用性好，除全抗原和抗體之外，其它所有試劑、96孔酶標板、酶標儀及溫箱等均極易獲得，這使得本方法可以被許多檢測機構及相應部門直接使用，作為檢測罌粟堿的手段。
綜上所述，由于本發(fā)明采用了全新的全抗原合成方法，獲得高效價抗體，使檢測的靈敏度達到了0.06ng/mL。本發(fā)明的方法和試劑盒特異性強，靈敏度高，能快速簡單的檢測生物體液樣品(血液、尿樣、分泌液)、藥用制劑(注射液)和植物、食品中罌粟堿含量。而常見的色譜法，由于靈敏度所限，還需要進行濃縮等操作，所以本方法適于實現(xiàn)快速、靈敏的檢測。這一方法不僅適于廣大生產、醫(yī)療及檢測部門對罌粟堿及罌粟殼的使用進行監(jiān)測、控制，而且可以進一步制成試劑盒實現(xiàn)現(xiàn)場、及時的檢測，這對于及時監(jiān)控生產過程，觀察個體給藥以及現(xiàn)場食品監(jiān)督都具有極其重要的意義。
具體實施方法實施例實施例1罌粟堿全抗原的制備及相應多克隆抗體的獲取1)單脫甲基罌粟堿(MDMPAP)的合成取0.5g罌栗堿加入6mL 40％的HBr水溶液，攪拌加熱回流反應15min；冷卻后以10mL水稀釋，并調pH為8.0；接著于室溫避光放置1hr，過濾，以水洗滌沉淀3次，再向沉淀中加入4mL甲醇，加熱回流1hr；隨后旋蒸除去甲醇，加入0.5mL氯仿/甲醇(v/v＝95∶5)混合液溶解固體，并以該溶液作為洗脫液，用硅膠柱色譜分離反應物，最終獲得單脫甲基罌粟堿固體約0.25g。
2)單脫甲基罌粟堿-O-羧甲基醚(PAP-O-CME)的合成取45mg步驟1產物溶于1.2mL干燥DMSO溶劑，加入0.088g KOH，攪拌反應5min；隨后加入28.9mg溴乙酸，避光攪拌反應2hr，加入4mL冰水終止反應，并調pH為8.0；以氯仿萃取3次，回收未參加反應的單脫甲基罌粟堿；再以1mol/L的HCl調整水相pH至2.0，然后以氯仿萃取3次，萃取液經無水硫酸鈉干燥，清液旋蒸至干，加入少量甲醇，析出黃白色沉淀，過濾并紅外烤干，最終獲得產品約20mg。
3)PAP-BSA全抗原的合成在1mL干燥的DMSO溶液中加入7mg步驟2產物，3.2mgNHS和5.5mg EDC，室溫攪拌反應2hr；然后逐滴加入4mL 0.1mol/L pH7.0的NaHCO3水溶液(含45mg BSA)中，持續(xù)攪拌反應2hr；最后將所得溶液除鹽凍干，得約40mg產物，-20℃保存。
4)免疫動物用步驟3所獲得的全抗原按表1過程對家兔進行免疫；然后采血，4000rpm離心20min，取血清，-20℃凍存。
5)多克隆抗體的純化取1mL血清，用0.06mol/L，pH 4.8的HAc-NaAc緩沖液稀釋4倍，逐滴加入120μL辛酸，攪拌30min；于室溫12,000rpm離心20min，取上清；接著加入體積為上清1/10的0.1mol/L，pH 7.4的PBS溶液，并用1.0mol/L NaOH調pH為7.4；攪拌下，滴加等體積pH 7.4的飽和硫酸銨溶液，靜置2hr；于4℃12,000rpm離心30min，棄上清，并將沉淀溶于1mL 0.01mol/L，pH 7.4的PBS中，透析除鹽，最后測定該抗體溶液的濃度，置于-20℃凍存待用。
表1.罌粟堿全抗原免疫家兔的完整流程

實施例2本發(fā)明檢測方法的最低檢出限及線性范圍在96孔酶標板中，每孔用100μL 5μg/mL的PAP-OVA包被，于4℃過夜或37℃溫育2小時；以5％脫脂奶粉溶液在37℃封閉2小時后，每孔中加入50μL 8μg/mL的純化抗體溶液和50μL梯度稀釋罌粟堿標準品溶液(濃度分別為0，0.2，2，20，200，2000μg/mL)，37℃溫育1小時，然后每孔加入100μL的合適濃度的酶標二抗，使最終的吸光度值在0.2～1.0(通常商購的酶標二抗需1∶500稀釋)，經過同樣的溫育過程后加入底物顯色，10-15分鐘后以2mol/L硫酸終止。每個試樣同時做5份平行。
采用logit-log法對測定結果進行線性回歸。本發(fā)明方法的工作曲線的線性范圍為0.1-1000ng/mL；回歸方程為ln(A/(A0-A))＝1.489-1.340logcPAP(R＝0.991，n＝5)。以競爭罌栗堿含量為0的測定結果做為空白參比，計算其5份平行樣品的吸光度值的標準偏差σ，得出該方法的最低檢測限為0.06ng/mL(定義為三倍信噪比)。
實施例3本發(fā)明與標準的高效液相色譜(HPLC)方法的比較以市售鹽酸罌粟堿注射液(標稱參考值為30mg/mL)為測量物，用本發(fā)明的方法和HPLC分別測量該注射液的濃度。
1)HPLC測量用色譜進行測量的操作條件如下色譜柱C18反相柱(Dikma Techonologies Diamonsil，5μ，150×4.6mm)；流動相甲醇-乙腈-H2O-冰醋酸(34∶47∶19∶0.05v/v)，流速1.0mL/min；柱溫25℃檢測器紫外檢測器(UVD)，檢測波長為254nm；進樣器20μL樣品環(huán)。
以0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10、12、15、20、30μg/mLPAP標準溶液作為工作曲線，采用峰面積積分，線性回歸，確定HPLC對于罌粟堿的工作曲線為A(mAu)＝23.35+162.5 cPAP(R＝0.9999，n＝3)，線性范圍為0.1-30μg/mL，檢測限為0.05μg/mL(定義為三倍信噪比)。
在測量鹽酸罌粟堿注射液的過程中，分別測量了1.5×104，6.0×103，3.75×103，3.0×103，2.0×103倍稀釋的注射液，最終測得鹽酸罌粟堿注射液的濃度為28.7mg/mL。
2)本發(fā)明方法(ELISA法)的測量ELISA操作過程及試劑量同實施例2中工作曲線的測定部分，具體測量了3×105，1.5×106和1.5×107倍稀釋的鹽酸罌粟堿注射液的濃度，最終測得鹽酸罌粟堿注射液的濃度為30.3mg/mL。
兩種方法的測量結果顯示，HPLC和本發(fā)明方法的測量結果基本一致，但本發(fā)明的方法具有更低檢測限及檢測范圍。
實施例4本發(fā)明方法的回收率測定以20倍稀釋的正常人血清樣品為基體，加入標準罌粟堿，使樣品中罌粟堿的最終濃度分別為100ng/mL，20ng/mL，2ng/mL，0.8ng/mL，然后按實施例2中的過程與抗體混合進行測定。每個點作6份平行，結果見表2。
表2.人血清模擬樣品的回收率測定(n＝6)

相對標準偏差表示測量的精密度，用多次測量后的標準差與測量平均值的比值百分數(shù)表示。結果表明該方法的回收率很好，且樣品溶液中基體的干擾對方法影響小。
實施例4火鍋底料中添加罌粟殼的試劑盒檢測一個檢測實際樣品的罌粟堿檢測試劑盒，盒內包括一塊96孔酶標板，第一抗體溶液(含1mg/mL抗體)，酶標二抗溶液(100μL，1∶500稀釋為工作液)，罌粟堿標準溶液(1mL，2mg/mL)，10×洗滌緩沖液(20mL，0.1mol/L PBST)，10×樣品稀釋液(20mL，0.1mol/LPBS)，顯色液A(15mL)，顯色液B(1mL 30％H2O2)，終止液(15mL，2mol/LH2SO4)以及操作流程一份。其中酶標板包被有抗原，抗原為罌粟堿通過其甲氧基苯環(huán)與載體蛋白偶聯(lián)的全抗原；第一抗體溶液含有針對罌粟堿的特異性抗體(1mg/mL)，為通過上述全抗原免疫動物得到的多克隆抗體，4℃存儲；酶標二抗溶液辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃存儲；罌粟堿標準溶液作參比，用于繪制吸光度值-濃度對數(shù)的標準曲線；10×洗滌緩沖液0.1mol/L的含吐溫20的磷酸緩沖液，具體每升含有2.89gNa2HPO4·12H2O，80g NaCl，2g KCl，2g KH2PO4和0.05％(v/v)吐溫20(Tween 20)，用于洗去酶標板上未結合的物質以及非特異性吸附的物質；10×樣品稀釋液0.1mol/L的磷酸緩沖液，具體每升含有2.89g Na2HPO4·12H2O，80gNaCl，2g KCl，2g KH2PO4，用于稀釋待測樣品或罌栗堿標準溶液；顯色液A含0.6mg 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)，44mgNa2HPO4·12H2O，137mg NaH2PO4·2H2O，100μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和10mL的去離子水，與顯色液B配合使用，并由辣根過氧化物酶作為催化劑，加速反應顯色；
顯色液B30％的H2O2水溶液，與顯色液A配合，并由辣根過氧化物酶作為催化劑，加速反應顯色；終止液2mol/L的H2SO4溶液，用于終止酶催化反應。
試劑盒的檢測過程通過以下步驟得以實現(xiàn)1.加樣將標準溶液、空白及待測樣50μl與50μl第一抗體工作液混合，加入酶標板的各孔內，置于37℃溫育1小時。
2.洗板用1×洗滌液將酶標板洗滌3次，每次3分鐘，在濾紙上拍干。
3.每孔加入酶標二抗工作液100μl，37℃溫育1小時。
4.洗板，同前。
5.顯色底物A與底物B按1000∶1.5比例混合，每孔加入上述底物混合液100μL，暗處反應10-15分鐘。
6.終止每孔加入終止液60μl，在450nm處測吸光值。通過與標準工作曲線的比較，得出樣品中罌粟堿的含量。
將市售的固體海鮮底料加水超聲提取后的溶液上清作為空白火鍋湯料，取0.5g罌粟殼粉碎樣加入8mL該湯料中，超聲處理30分鐘后，離心過濾，并用空白湯料清液定容至10mL，再分別稀釋20、200、2000倍。然后將上述湯料50μL與50μL 8μg/mL的第一抗體溶液混合，加入96孔酶標板內，置于37℃溫育1小時；以1×洗滌緩沖液洗滌3次，再于每個孔內加入100μL酶標抗體溶液(1∶500稀釋)，37℃溫育1小時；接著以1×洗滌緩沖液洗滌3次，每孔加入100μL顯色液A與顯色液B按1000∶1.5比例混合的顯色液，，置于暗處反應15分鐘；最后于每孔內加入60μL終止液結束反應，測量450nm處的吸光值。其中每個試樣同時做6份平行，并以0，0.1，1，10，100，1000μg/mL罌粟堿標準溶液為工作曲線，樣品的測量結果見表3。
表3.添加罌粟殼的火鍋湯料系列稀釋測定結果

表3中不同稀釋倍數(shù)的測定結果基本一致，表明本試劑盒適合于檢測實際火鍋湯料中源于罌粟殼的罌粟堿含量。另外，由于2000倍稀釋后的測量值已經接近本方法工作曲線的下限，若以此計算該方法的實際靈敏度，即相當于每升火鍋湯料中加入0.025克罌粟殼就可被本試劑盒檢出，可見該試劑盒的靈敏度完全可以滿足食品中非法添加罌粟殼的實際檢測的需求。
權利要求
1.一種測定罌粟堿含量的酶聯(lián)免疫分析方法，包括如下步驟(1)活化罌粟堿的芐基甲氧基，分別與不同的載體蛋白偶聯(lián)制成免疫全抗原和包被全抗原；(2)用免疫全抗原免疫動物，獲得多克隆抗體；(3)用包被全抗原包被酶標板；(4)封閉后，加入上述多克隆抗體與待測樣品的混合液進行競爭性結合反應，同時以多克隆抗體與標準罌粟堿溶液的混合液作為參比；(5)加入酶標二抗；(6)加底物顯色，終止反應后目測即可得到罌粟堿的大致含量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)制備全抗原包括以下步驟1-1.罌粟堿在HBr水溶液中加熱回流生成苯環(huán)3位或4位的單脫甲基罌粟堿；1-2.苯環(huán)3位或4位的單脫甲基罌粟堿在強堿條件下經鹵代羧酸活化生成單脫甲基罌粟堿-O-羧烷基醚；1-3.單脫甲基罌粟堿-O-羧烷基醚經N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺作用與載體蛋白偶聯(lián)成全抗原。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟1-2中的鹵代羧酸為α-溴乙酸、3-溴丙酸或3-氯丙酸。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白和鑰孔嘁血藍蛋白。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還可以包括步驟(7)定量檢測吸光度值，確定罌粟堿的含量。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)使用的是辣根過氧化物酶標記的二抗；步驟(6)經酶底物四甲基聯(lián)苯胺作用顯藍色，加終止液硫酸，變成黃色。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟(7)在450nm處測吸光度值A450nm以確定罌粟堿的含量。
8.一種測定罌粟堿含量的試劑盒，包括包被有抗原的酶標板抗原為罌粟堿的甲氧基苯環(huán)與載體蛋白偶聯(lián)的全抗原；第一抗體溶液含有針對罌粟堿的特異性抗體，為罌粟堿的甲氧基苯環(huán)與另一載體蛋白偶聯(lián)的全抗原免疫動物得到的多克隆抗體，4℃存儲；酶標二抗溶液含有酶標記的二抗，4℃存儲；罌粟堿標準溶液用作參比，用于繪制吸光度值-濃度對數(shù)的標準曲線；洗滌緩沖液含有吐溫20的生理緩沖溶液，用于洗去酶標板上未結合的物質以及非特異性吸附的物質；樣品稀釋液生理緩沖溶液，用于稀釋待測樣品或罌粟堿標準溶液；底物溶液所含底物可被標記二抗的酶催化成有色產物；終止液用于終止酶催化反應。
9.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白和鑰孔嘁血藍蛋白。
10.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述標記二抗的酶為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量檢測罌粟堿的酶聯(lián)免疫分析方法，以罌粟堿的甲氧基苯環(huán)連接載體蛋白制成免疫全抗原并獲得其高效價抗體為基礎，用罌粟堿的甲氧基苯環(huán)連接另一載體蛋白制成的包被全抗原包被酶標板，封閉后，加入所述高效價抗體與試驗樣品液進行競爭性結合反應，然后加入酶標二抗，顯色，檢測罌粟堿的存在。通過定量檢測吸光度值還可以進一步確定罌粟堿的含量。本發(fā)明還提供了一種依據(jù)該方法制備的簡便易行的試劑盒。由于本發(fā)明采用了全新的全抗原合成方法，獲得高效價抗體，使檢測的靈敏度達到了0.06ng/mL。本發(fā)明的方法和試劑盒特異性強，靈敏度高，能快速簡單的檢測生物體液樣品、藥用制劑和植物、食品中罌粟堿含量。
文檔編號G01N33/531GK1821782SQ200610011570
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月28日 優(yōu)先權日2006年3月28日
發(fā)明者宓捷波, 閆瑾, 徐菁, 趙美萍 申請人:北京大學