專利名稱：檢測蘇丹紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測辣椒醬、辣椒油、辣椒粉食品中蘇丹紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
背景資料
蘇丹紅(SudanI)是一種人工合成地紅色染料，常作為一種工業(yè)染料，被廣泛用于如溶劑、油、蠟、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。蘇丹一號染色劑含有“偶氮苯”，當(dāng)“偶氮苯”被降解后，就會產(chǎn)生“苯胺”，這是一種中等毒性的致癌物。過量的“苯胺”被吸入人體，可能會造成組織缺氧，呼吸不暢，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和其他臟器受損，甚至導(dǎo)致不孕癥，因其嚴(yán)重的致癌性、致敏性和遺傳毒性我國及歐盟等國已明文規(guī)定禁止其作為色素在食品中進(jìn)行添加，2005年2月18日，英國食品標(biāo)準(zhǔn)局(TheFoodStandardAgency，F(xiàn)SA)就含有添加蘇丹紅色素的食品向消費者發(fā)出警告，并在其網(wǎng)站上公布了可能含有蘇丹紅I的產(chǎn)品清單。
檢測蘇丹紅殘留量的化學(xué)方法目前有高效液相色譜法，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的方法用于檢測辣椒醬、辣椒油、辣椒粉食品中蘇丹紅染料的殘留量。
(二)技術(shù)方案
本發(fā)明的檢測原理為
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入蘇丹紅特異性抗體溶液，樣本中殘留的蘇丹紅或蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的蘇丹紅偶聯(lián)抗原競爭蘇丹紅特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中蘇丹紅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅特異性抗體時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原溶液，樣本中殘留的蘇丹紅或蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗原競爭包被在酶標(biāo)板上的蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與蘇丹紅藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅特異性抗體溶液，樣本中殘留的蘇丹紅或蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的蘇丹紅抗原競爭蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中蘇丹紅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時，加入蘇丹紅抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原溶液，樣本中殘留的蘇丹紅或蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原競爭蘇丹紅特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中蘇丹紅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。同時也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，與系列濃度蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中蘇丹紅殘留量的濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種用于檢測蘇丹紅物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；
(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；
(3)蘇丹紅特異性抗體濃縮液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)；
(4)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)底物顯色液；
(6)終止液；
(7)濃縮洗滌液；
(8)濃縮抗體稀釋液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)。
(9)濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所提供的檢測蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被有包被原的酶標(biāo)板、可能含有蘇丹紅特異性抗體濃縮液(酶標(biāo)板上包被抗原，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體時或酶標(biāo)板上包被的抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原)和酶標(biāo)記物工作液；所述包被原可為蘇丹紅偶聯(lián)抗原、蘇丹紅特異性抗體或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體、蘇丹紅半抗原或蘇丹紅特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
所述蘇丹紅半抗原是將蘇丹紅和琥珀酸酐通過酰化反應(yīng)得到的。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。
所述蘇丹紅特異性抗體可為蘇丹紅單克隆抗體或蘇丹紅多克隆抗體；它們均是用蘇丹紅半抗原與載體蛋白采用混合酸酐法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述蘇丹紅多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述蘇丹紅單克隆抗體優(yōu)選為蘇丹紅鼠單克隆抗體，所述蘇丹紅多克隆抗體優(yōu)選為蘇丹紅兔多克隆抗體。
所述蘇丹紅單克隆抗體優(yōu)選為抗蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-1CGMCC No.1706分泌的單克隆抗體。
所述抗蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-1 CGMCC No.1706已于2006年4月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
以上抗體均可以用蘇丹紅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按混合酸酐法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述蘇丹紅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將蘇丹紅半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮抗體稀釋液(酶標(biāo)板上包被抗原，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體時或酶標(biāo)板上包被的抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原)，濃縮復(fù)溶液為2×的0.04mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮洗滌液為0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫20和0.5％疊氮鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液為2×的0.04mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，顯色液為對硝基苯磷酸酯緩沖液，終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。
當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體時或酶標(biāo)板上包被的抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時所述濃縮抗體稀釋液為pH8.6，0.05mol/L含有2％小牛血清、10％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH 6.6 0.01～0.03mol/L的檸檬酸鈉緩沖液；所用的封閉液含有0.5％馬血清，1‰疊氮化鈉，3％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，再4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明中抗原的合成過程為
1.半抗原的合成
將蘇丹紅用琥珀酸酐法合成蘇丹紅半抗原。
2.蘇丹紅抗體的制備
將蘇丹紅半抗原與載體蛋白采用混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
蘇丹紅是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將蘇丹紅和琥珀酸酐合成蘇丹紅半抗原，給蘇丹紅接出了一個含4個碳的間隔臂，這樣突出了蘇丹紅分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的蘇丹紅抗體對蘇丹紅的特異性很高。
蘇丹紅鼠單克隆抗體的制備
動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以蘇丹紅半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多克隆抗體，取出肝臟進(jìn)行細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
蘇丹紅兔多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以蘇丹紅與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價得到多克隆抗體。
本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0μg/L，0.1μg/L，0.4μg/L，1.6μg/L，6.4μg/L，25.6μg/L，3ml/瓶。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測蘇丹紅藥物的方法，它包括步驟
(1)樣品前處理；
(2)用試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明提供以蘇丹紅為食品添加劑食品的樣本(水基質(zhì)、油基質(zhì)及粉末狀)處理，稱取樣本于離心管中，加入乙腈震蕩離心進(jìn)行提取，移取上清液氮氣吹干，加入正己烷進(jìn)行萃取，強堿去雜質(zhì)，取上層氮氣吹干，用于檢測。
本發(fā)明中用試劑盒檢測是當(dāng)包被原為蘇丹紅偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為蘇丹紅偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為蘇丹紅特異性抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入蘇丹紅抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)蘇丹紅半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計算公式為
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中蘇丹紅的殘留量。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成，樣本最低檢測限為8μg/L(kg)。
(三)有益效果
本發(fā)明中檢測食品中蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測辣椒醬、辣椒油、辣椒粉等食品中蘇丹紅染料的殘留量，樣品前處理過程簡單，能同時檢測大批樣品。
本發(fā)明采用高特異性的蘇丹紅單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，檢驗方法簡便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，將在食品中蘇丹紅的殘留檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1蘇丹紅的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 試劑盒組分的制備
1.抗原的合成
a.半抗原的合成
將蘇丹紅用琥珀酸酐法合成蘇丹紅半抗原。具體步驟取蘇丹紅5g溶于20mlDMF中加入琥珀酸酐3g及50ml吡啶80℃回流反應(yīng)70～80小時，抽干除去溶劑用純水洗滌5次(30ml/次)烘干即可。
b.免疫原合成
將蘇丹紅半抗原和卵清蛋白，采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的制備過程取蘇丹紅半抗原2g溶于30ml，50％的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中，加到半抗原溶液中室溫攪拌反應(yīng)4小時，取載體蛋白32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將入人血清白蛋白滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的人工抗原用透析袋裝好放入0.2M的磷酸鹽緩沖液中透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原凍干保存。
c.包被原蘇丹紅偶聯(lián)抗原的制備
將蘇丹紅半抗原和甲狀腺蛋白，采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。
包被原的制備過程取蘇丹紅半抗原2g溶于30ml，50％的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中，加到半抗原溶液中室溫攪拌反應(yīng)4小時，取載體蛋白32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將卵清蛋白滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的人工抗原用透析袋裝好放入0.2M的磷酸鹽緩沖液中透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原凍干保存。
2.單克隆抗體的制備
a.動物免疫
將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為80μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。
b.細(xì)胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株-蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-1 CGMCC No.1706。
c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
將蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的制備與純化
將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4ml/只，7天后腹腔注射蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5×105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)境保存。
3.多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以蘇丹紅半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
4.羊抗鼠抗抗體的制備過程以山羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以山羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
5.酶標(biāo)板的制備
用包被緩沖液將蘇丹紅偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.05-0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實施例2 檢測蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
組建檢測蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1)包被蘇丹紅偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；
(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；
(3)蘇丹紅單抗體濃縮液；
(4)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L，0.1μg/L，0.4μg/L，1.6μg/L，6.4μg/L，25.6μg/L；
(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；
(6)終止液為2mol/L鹽酸；
(7)濃縮洗滌液為0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；
(8)抗體稀釋液為pH8.6，0.05mol/L含有2％小牛血清、10％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
(9)濃縮復(fù)溶液為2×的0.04mol/L的磷酸鹽緩沖液。
實施例3 樣品中蘇丹紅殘留的檢測
1.樣品前處理
以蘇丹紅為食品添加劑食品的樣本(水基質(zhì)、油基質(zhì)及粉末狀)處理步驟
稱取2g樣本于離心管中，加入10ml乙腈，劇烈震蕩10min，室溫3000rpm以上離心10min。移取5ml上清液于50℃環(huán)境下氮氣吹干。加入4ml正己烷渦動30s溶解干燥的殘留物，加入1ml 1M NaOH渦動15s室溫3000rpm離心10min，移取1ml上清液于50℃環(huán)境下氮氣吹干，加入0.5ml DMF充分溶解干燥的殘留物，取50μl加入950μl稀釋好的復(fù)溶液充分混勻，得到待測樣品溶液。
2.用試劑盒檢測
向蘇丹紅偶聯(lián)抗原包被的酶標(biāo)板微孔中加入蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液50μl，再加入蘇丹紅單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。
3.檢測結(jié)果分析
用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中蘇丹紅的殘留量。
實驗例1
標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗
分別從三個不同的時間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定4.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。
表1 標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(CV％)
通過上述試驗結(jié)果可以得出，每批試劑盒各測定10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在3.8％～11.7％之間，符合精密度小于或等于20％的規(guī)定。
實驗例2
樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗
a.樣品精密度試驗
取蘇丹紅標(biāo)樣，添加15μg/L到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表。
表2 水基質(zhì)添加染料樣品可重復(fù)性試驗
表3 油基質(zhì)添加染料樣品可重復(fù)性試驗
表4 粉末狀添加染料樣品可重復(fù)性試驗
結(jié)果表明，水基質(zhì)添加染料樣品變異系數(shù)均低于25％，油基質(zhì)添加染料樣品的變異系數(shù)均低于25％，粉末狀添加染料樣品的變異系數(shù)均低于25％。
b.樣本準(zhǔn)確度試驗
取三個濃度的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為10μg/kg(L)、50μg/kg(L)和100μg/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，具體方法如實施例1中樣品前處理步驟，分別計算準(zhǔn)確度。
表5 試劑盒的準(zhǔn)確度
結(jié)果表明水基質(zhì)添加染料樣品添加準(zhǔn)確度在60.8％-102.3％之間，油基質(zhì)添加染料樣品添加準(zhǔn)確度在63.5％-94.8％之間，粉末狀添加染料樣品添加準(zhǔn)確度在62.8％-92.6％之間。
實驗例3
交叉反應(yīng)率試驗
選擇與蘇丹紅有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的2種藥物測定交叉反應(yīng)率。通各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)越大，那么此試劑盒對蘇丹紅的檢測的特異性就越好。交叉反應(yīng)率(％)＝(引起50％抑制蘇丹紅的濃度/引起50％抑制的類似物濃度)×100％
表6 試劑盒的特異性
實驗例4
試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、蘇丹紅添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1、一種檢測蘇丹紅藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；
(2)酶標(biāo)記物；
(3)蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(4)底物顯色液；
(5)終止液；
(6)濃縮洗滌液；
(7)濃縮復(fù)溶液。
2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被原為抗原、抗體或抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體，所用包被緩沖液為pH值為6.60.01～0.03mol/L的檸檬酸緩沖液，所用的封閉液為含有0.5％馬血清、1‰疊氮化鈉和3％酪蛋白的溶液。
3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時還含有
(8)蘇丹紅特異性抗體濃縮液；
(9)濃縮抗體稀釋液。
4、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板中包被的包被原為蘇丹紅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、蘇丹紅特異性抗體或抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白；蘇丹紅特異性抗體為蘇丹紅單克隆抗體或多克隆抗體；所述蘇丹紅單克隆抗體為抗蘇丹紅的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-1CGMCC No.1706分泌的單克隆抗體；抗抗體為山羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
5、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體、酶標(biāo)記蘇丹紅半抗原或酶標(biāo)記特異性抗體；其中抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶。
6、如任一權(quán)利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。
7、如任一權(quán)利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于，標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
8、如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，濃縮洗滌液為0.01M，pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為2×的0.04mol/L的磷酸鹽緩沖液；封閉液含有3-10％的牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
9、如權(quán)利要求1或8所述的試劑盒，其特征在于蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度制為0μg/L，0.1μg/L，0.4μg/L，1.6μg/L，6.4μg/，25.6μg/L。
10、一種檢測樣品蘇丹紅藥物殘留的方法，包括步驟
(1)樣品前處理；
(2)用任一權(quán)利要求1-9所述的試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測蘇丹紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，蘇丹紅特異性抗體濃縮液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)，蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮抗體稀釋液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測蘇丹紅的方法，包括步驟首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒用于檢測辣椒醬、辣椒油、辣椒粉食品中蘇丹紅染料的殘留量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高，能夠進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
文檔編號G01N21/78GK1844926SQ20061001187
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 馮才偉, 萬宇平, 吳小平, 馮才茂, 趙正苗, 王善良, 羅貴昆 申請人:北京望爾生物技術(shù)有限公司