專利名稱：檢測氟甲喹藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測動物組織中氟甲喹藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
氟甲喹是第二代氟喹酮類抗菌藥，對大腸桿菌、支原體、嗜水氣單胞菌引起的畜、禽及水生動物疾病有較好療效，由于其具有高安全性、耐受性、在組織中高生物活性和獨具的高滲透性因此被廣泛使用，被大量用于治療、預(yù)防和促生長。其耐藥性和潛在的致癌性，使得其在應(yīng)用同時受到了殘留監(jiān)控的重視。
檢測氟甲喹殘留量的化學(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC/MS)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等，由于復(fù)雜地儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明提高了藥物殘留檢測的靈敏度，節(jié)省操作時間，價格便宜、便于攜帶，并適合現(xiàn)場大量樣本的篩選，改變了傳統(tǒng)的藥物殘留檢測方法，具有高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測的優(yōu)點。
(二)技術(shù)方案
本發(fā)明的檢測原理為
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被氟甲喹偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入氟甲喹特異性抗體溶液，樣本中殘留的氟甲喹藥物與酶標(biāo)板上包被的氟甲喹偶聯(lián)抗原競爭氟甲喹特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行發(fā)大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與氟甲喹藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氟甲喹的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可判斷樣品中氟甲喹殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被氟甲喹特異性抗體時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記氟甲喹半抗原溶液，樣本中殘留的氟甲喹藥物與酶標(biāo)記抗原競爭包被在酶標(biāo)板上的氟甲喹特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與氟甲喹藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氟甲喹的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可判斷樣品中氟甲喹殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被氟甲喹偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記氟甲喹特異性抗體溶液，樣本中殘留的氟甲喹藥物與酶標(biāo)板上包被的氟甲喹抗原競爭氟甲喹特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與氟甲喹藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氟甲喹的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可判斷樣品中氟甲喹殘留量的濃度范圍。
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時，加入氟甲喹抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)記氟甲喹偶聯(lián)抗原溶液，樣本中殘留的氟甲喹藥物與酶標(biāo)記氟甲喹偶聯(lián)抗原競爭氟甲喹特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與氟甲喹藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氟甲喹的殘留含量。同時根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色的深淺，與系列濃度的氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可判斷樣品中氟甲喹殘留量的濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種用于檢測氟甲喹物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；
(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；
(3)氟甲喹特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)；
(4)氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)底物顯色液；
(6)終止液；
(7)濃縮洗滌液；
(8)濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所提供的檢測氟甲喹的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氟甲喹特異性抗體工作液及預(yù)包被包被原的酶聯(lián)板和酶標(biāo)記物工作液；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記氟甲喹半抗原或酶標(biāo)記氟甲喹特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
所述氟甲喹半抗原是將氟甲喹和6-氨基己酸通過酰化方法得到的。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。
所述氟甲喹特異性抗體可為氟甲喹單克隆抗體或氟甲喹多克隆抗體；它們均是用氟甲喹半抗原與載體蛋白采用混合酸酐法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述氟甲喹多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述氟甲喹單克隆抗體優(yōu)選為氟甲喹鼠單克隆抗體，所述氟甲喹多克隆抗體優(yōu)選為氟甲喹兔多克隆抗體。
所述氟甲喹單克隆抗體優(yōu)選為氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-2CGMCC No.1707分泌的單克隆抗體。
所述氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-2 CGMCC No.1707已于2006年4月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
以上抗體均可以用氟甲喹半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按碳化二亞氨法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述氟甲喹半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將氟甲喹半抗原和載體蛋白用碳化二亞氨法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為0.02M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，顯示液為對硝基苯磷酸酯緩沖液，終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。
所述濃縮復(fù)溶液為含0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×濃縮磷酸鹽緩沖液。
其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH6.8，0.05mol/L的檸檬酸緩沖液；所用的封閉液含有3～10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.05-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，再4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明中抗原的合成過程為
1.半抗原的合成
將氟甲喹和6-氨基己酸通過?；椒ǖ玫降摹?br> 2.氟甲喹抗體的制備
將氟甲喹半抗原與載體蛋白采用碳化二亞氨法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的具體制備方法氟甲喹是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將氟甲喹和6-氨基己酸合成氟甲喹半抗原，給氟甲喹接出了一個含6個碳的間隔臂，這樣突出了氟甲喹分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的氟甲喹抗體對氟甲喹的特異性很高。
氟甲喹鼠單克隆抗體的制備
動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氟甲喹半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多克隆抗體，取出肝臟進(jìn)行細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
氟甲喹兔多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氟甲喹與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價得到多克隆抗體。
本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L，3ml/瓶。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測氟甲喹藥物的方法，它包括步驟
(1)樣品前處理；
(2)用試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明提供氟甲喹在雞肉、蝦肉樣本中的處理，用勻質(zhì)器勻質(zhì)樣本后，稱取樣本于離心管中，加入PB緩沖液上下混合后，加入而二氯甲烷，混勻離心，氮氣吹干，復(fù)溶，取樣分析。
本發(fā)明中用試劑盒檢測是當(dāng)包被原為氟甲喹偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為氟甲喹偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為氟甲喹特異性抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記氟甲喹半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入氟甲喹抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)氟甲喹半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計算公式為
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中氟甲喹的殘留量。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。
本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成，最低檢測限為1.2μg/L。
(三)有益效果
本發(fā)明檢測氟甲喹的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中氟甲喹的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；采用高特異性的氟甲喹單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利，檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在氟甲喹的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。


圖1氟甲喹的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 試劑盒組分的制備
1.抗原的合成
a.半抗原的合成
將氟甲喹和6-氨基己酸通過酰化方法得到的。
半抗原的具體步驟取200mg氟甲喹和100mg 6-氨基己酸和50mgNHS(活化酯)用水?dāng)嚢璺磻?yīng)過夜。
b.免疫原合成
將氟甲喹半抗原與兔血清白蛋白采用碳化二亞氨法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
c.包被原氟甲喹偶聯(lián)抗原的制備
將氟甲喹半抗原與人血清白蛋白采用碳化二亞氨法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的制備過程取EDC100mg，用pH8.0的10mmol/LPBS液2.5ml使之充分融解(I液)；取氟甲喹半抗原15g，用0.2oml/LnaOH溶液2ml溶解(II液)；取兔血清白蛋白30mg，溶于10mmol/LPBS(pH8.0)溶液中，(III液)；將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)；室溫下避光攪拌1小時，逐滴加入余下的I液；4℃攪拌12小時。靜置10小時(4℃)；用蒸餾水使之充分透吸(約48小時)，得到免疫原。
2.單克隆抗體的制備
a.動物免疫
將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。
b.細(xì)胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株-氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-2 CGMCC No.1707。
c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
將氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d.單克隆抗體的制備與純化
將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4ml/只，7天后腹腔注射氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5×105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20℃保存。
3.多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氟甲喹與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
4.羊抗鼠抗抗體的制備過程以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
5.酶標(biāo)板的制備
用包被緩沖液將氟甲喹偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.05-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
6.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的置備
將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4∶1；由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決這個問題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，即
1)省去了氨基的封閉過程，因為能產(chǎn)生自身氨基連接的氨基實際很少。
2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2∶1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。
實施例2 檢測氟甲喹的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
組建檢測氟甲喹的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1)包被氟甲喹偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；
(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；
(3)氟甲喹單抗體工作液；
(4)氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；
(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；
(6)終止液為2mol/L鹽酸；
(7)濃縮洗滌液為0.02M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；
(8)濃縮復(fù)溶液為0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×濃縮磷酸鹽緩沖液。
實施例3 樣品中氟甲喹殘留的檢測
1.樣品前處理
動物組織(雞肉、蝦肉)稱2.0g均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中，加入8ml PB緩沖液。充分上下混合30min，加入10ml的二氯甲烷，充分混勻10min，3000g以上，15℃離心10min，取5ml上層有機(jī)相到干燥瓶中(清亮無雜質(zhì))，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮氣吹干，用1ml稀釋了的復(fù)溶液渦動30s，溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，3000g以上，15℃離心10min(若下層有明顯混濁，請重復(fù)此步)，輕吸掉上層有機(jī)相和中間部份液體，取下層100μl+100μl PB緩沖液混勻即可分析。(該樣品被稀釋了2倍)
2.用試劑盒檢測
向包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板微孔中加入氟甲喹抗體工作液100μl，37℃反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，同時加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的氟甲喹半抗原工作液50μl，37℃反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液對硝基苯磷酸酯100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在405nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。
3.檢測結(jié)果分析
用所獲得的每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出氟甲喹的殘留量。
實驗例1
標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗
分別從三個不同的時間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定9.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計算變異系數(shù)。
表1 標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(CV％)
通過上述試驗結(jié)果可以得出，每批試劑盒各10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在2.9％-11.7％之間，符合精密度小于或等于25％的規(guī)定。
實驗例2
樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗
a.樣品精密度試驗
取氟甲喹標(biāo)樣，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表。
表2 雞肉樣品可重復(fù)性試驗
表3 蝦樣品可重復(fù)性試驗
結(jié)果表明，雞肉樣本變異系數(shù)均低于25％，蝦樣本的變異系數(shù)均低于25％。
b.樣本準(zhǔn)確度試驗
取兩個濃度的氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為20μg/kg(L)和50μg/kg(L)，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，具體方法如實施例1中樣品前處理步驟，分別計算準(zhǔn)確度。
表4 試劑盒的準(zhǔn)確度
結(jié)果表明雞肉樣品添加準(zhǔn)確度在63.4％-112.7％之間，蝦樣品添加準(zhǔn)確度在62.8％-102.7％之間。
實驗例3
交叉反應(yīng)率試驗
選擇與氟甲喹有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的3種藥物測定交叉反應(yīng)率。通各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)越大，那么此試劑盒對氟甲喹的檢測的特異性就越好。
交叉反應(yīng)率(％)＝(引起50％抑制氟甲喹的濃度/引起50％抑制的類似物濃度)×100％
表5 試劑盒的特異性
實驗例4
試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、氟甲喹添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1、一種檢測氟甲喹藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；
(2)酶標(biāo)記物；
(3)氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(4)底物顯色液；
(5)終止液；
(6)濃縮洗滌液；
(7)濃縮復(fù)溶液。
2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被原為抗原、抗體或抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體，所用包被緩沖液為pH6.8，0.05mol/L的檸檬酸緩沖液，所用的封閉液為3～10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸鹽緩沖液。
3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時還含有
(8)氟甲喹特異性抗體工作液。
4、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板中包被的包被原為氟甲喹半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、氟甲喹特異性抗體或抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白；氟甲喹特異性抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；所述氟甲喹單克隆抗體為氟甲喹的單克隆雜交瘤細(xì)胞株B-1-2CGMCC No.1707分泌的單克隆抗體；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
5、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體、酶標(biāo)記氟甲喹半抗原或酶標(biāo)記特異性抗原；抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶氟甲喹半抗原是將氟甲喹和6-氨基己酸通過?；椒ǖ玫降陌肟乖?。
6、如任一權(quán)利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。
7、如任一權(quán)利要求1-5所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
8、如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，濃縮洗滌液為0.02M，pH7.4，含有0.8％～1.2％吐溫80和0.5％硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液；復(fù)溶液為0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×濃縮磷酸鹽緩沖液。
9、如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于制備抗體所需要的免疫原采用混合酸酐法或碳化二亞氨法將氟甲喹半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。
10、如權(quán)利要求1或9所述的試劑盒，其特征在于氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L。
11、一種檢測樣品氟甲喹藥物殘留的方法，包括步驟
(1)樣品前處理；
(2)用任一權(quán)利要求1-10所述的試劑盒進(jìn)行檢測；
(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測氟甲喹藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，氟甲喹特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時含有)，氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測氟甲喹的方法，它包括步驟首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測動物組織如雞肉、蝦肉等樣品中氟甲喹的殘留量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
文檔編號G01N21/77GK1844927SQ20061001187
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 吳小平, 羅曉琴 申請人:北京望爾生物技術(shù)有限公司