專利名稱：應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性死亡率較高的一種惡性腫瘤，雄激素及其受體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。前列腺癌與前列腺特異性抗原(prostatespecific antigen，PSA)關(guān)系密切，多數(shù)前列腺癌患者無論早期或晚期均有PSA持續(xù)表達(dá)，高度表達(dá)者占90％以上，因此PSA已作為前列腺癌臨床診斷和治療監(jiān)測的敏感指標(biāo)之一。PSA的表達(dá)受雄激素調(diào)節(jié)，雄激素進(jìn)入前列腺上皮細(xì)胞后首先與細(xì)胞核內(nèi)雄激素受體蛋白(androgen receptor，AR)結(jié)合，引起AR構(gòu)象改變，隨后AR與熱休克蛋白解離，受體磷酸化形成二聚體，二聚體與PSA啟動子中雄激素應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合，誘導(dǎo)PSA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。有些物質(zhì)可調(diào)節(jié)AR的表達(dá)，例如生長因子使AR增加五倍等。有研究發(fā)現(xiàn)雄激素非依賴的前列腺癌中AR同樣是非常重要的分子，其作用有待進(jìn)一步研究。
通過以上分析可知，利用誘導(dǎo)PSA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的AR作為特異性靶蛋白來檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用將具有突出的實(shí)際意義，申請人目前還沒有發(fā)現(xiàn)通過特異性靶蛋白定向檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的具體方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法，該方法具有精確度高、適用性廣、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法由以下步驟組成(1)由姜黃素處理LNCap細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行圖像采集；MTT法檢測LNCap細(xì)胞生長情況；流式細(xì)胞技術(shù)FCM檢測細(xì)胞凋亡率；(2)用免疫印跡Western-blotting技術(shù)檢測雄激素受體AR的表達(dá)①由姜黃素處理的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞至少24h后收集，用PBS洗滌三次后加入細(xì)胞裂解液，細(xì)胞裂解后離心取上清液，沸水浴蛋白變性后Bradford蛋白定量測定蛋白濃度，其合適濃度范圍為0.5-2μg/μL；②裂解后所得細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電泳后的凝膠于60mA恒流轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，選用可復(fù)性麗春紅染液振蕩染色，并根據(jù)蛋白質(zhì)Marker比較條帶分子量大小去除非特異性條帶，先后加入一抗和二抗后，用ECL熒光western-blotting試劑盒顯色，顯影、定影。
所述的特異性裂解液的組分及其濃度為甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化鈉137mmol/L，氟化鈉10mmol/L，乙二醇雙(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸鈉1mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)20mmol/L，原礬酸鈉1mmol/L，SDS 3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫蘇糖醇(DTT)2.8mmol/L，溴酚藍(lán)1.5mmol/L。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是1.本發(fā)明所公開的一種應(yīng)用特異性靶蛋白定向檢測姜黃素對前列腺癌雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞是否有抑制作用的方法，其結(jié)果證明該方法利用特異性靶蛋白AR、通過癌細(xì)胞生長情況和凋亡率檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用是準(zhǔn)確的。同時，也能證明免疫印跡技術(shù)在本方法中的具體應(yīng)用也是可靠的。
2.本發(fā)明的方法具有簡單和易于推廣應(yīng)用的突出優(yōu)點(diǎn)。


附圖1LNCap細(xì)胞原形態(tài)特征照片。
附圖2經(jīng)姜黃素處理后的LNCap細(xì)胞形態(tài)特征照片。
附圖3MTT法測定細(xì)胞存活率統(tǒng)計圖。
附圖4western blotting法測定LNCap細(xì)胞AR的表達(dá)結(jié)果照片。
附圖5western blotting法測定LNCap細(xì)胞常規(guī)蛋白(β-actin)結(jié)果照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一、細(xì)胞培養(yǎng)LNCap細(xì)胞在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI-1640，含10％新生牛血清及青霉素、鏈霉素各100U/ml，其形態(tài)特征如圖1照片所示。
二、姜黃素對LNCap細(xì)胞形態(tài)的影響以五種濃度的姜黃素分組進(jìn)行以下操作在生長對數(shù)期的LNCap細(xì)胞中分別加入濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黃素，并分別于0h、12h、24h、48h倒置顯微鏡下觀察LNCap細(xì)胞形態(tài)，激光掃描共聚焦顯微鏡攝像系統(tǒng)對各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行圖像采集，其中姜黃素濃度40μmol/L組24h后細(xì)胞形態(tài)照片如圖2所示。
圖2所示照片與圖1對照組比較，在顯微鏡下清楚顯示LNCap細(xì)胞形態(tài)有明顯的變化，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡征象，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮變圓，胞體變小，與周圍失去聯(lián)系，胞膜形成泡狀突起，胞質(zhì)收縮，有典型凋亡小體存在。
三、MTT法測細(xì)胞生長曲線LNCap細(xì)胞以3.0×104個孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L不同濃度的姜黃素分別處理12h、24h、36h、48h終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4h加入5mg/mLMTT10μl，終濃度為0.5mg/mL，4h后棄上清液，DMSO溶解MTT結(jié)晶，用BiotekMicroplate EJ309酶標(biāo)測定儀測OD值，檢測波長570nm，參考波長為630nm，各組每次測12孔，重復(fù)三次取均值，以下式計算細(xì)胞相對存活率細(xì)胞相對存活率％＝(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100％(以空白組OD值調(diào)零)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
MTT法測的LNCap細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出10～40μmol/L的姜黃素都能夠抑制細(xì)胞的增殖和生長，并且在0h以上都有抑制作用，其中40μmol/L作用24h最強(qiáng)，細(xì)胞存活率為對照組的40％。說明40μmol/L的姜黃素最具臨床意義。
四、FCM測細(xì)胞生長周期分別以濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黃素處理LNCaP細(xì)胞24h后收集，1000r/m離心10min，PBS洗滌，70％乙醇4℃固定過夜，保存于4℃?zhèn)溆?；LNCaP細(xì)胞同法洗兩次，500目銅網(wǎng)過濾，離心，加PI(碘化丙啶propidium iodide)染色液，4℃避光過夜。流式細(xì)胞儀測定DNA熒光強(qiáng)度及散射光參數(shù)，激發(fā)光波長488nm，并用凋亡軟件測定細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。
姜黃素可誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞凋亡，濃度為0、10、20、30、40μmol/L姜黃素作用細(xì)胞的凋亡率分別為1.20％、1.22％、2.22％、3.69％和9.23％。其中40μmol/L姜黃素效果最顯著，10、20μmol/L姜黃素作用不明顯，30μmol/L姜黃素效果優(yōu)于10、20μmol/L的姜黃素。
五、免疫印跡western blotting檢測雄激素受體AR的表達(dá)
(1)以濃度為0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L的姜黃素分別處理LNCap細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，用以下組分和重量的裂解液裂解細(xì)胞，裂解液組成是甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化鈉(NaCl)137mmol/L，氟化鈉(NaF)10mmol/L，乙二醇雙(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸鈉1mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)20mmol/L，原礬酸鈉1mmol/L，SDS 3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫蘇糖醇DTT(DTT)2.8mmol/L，溴酚藍(lán)1.5mmol/L。
裂解細(xì)胞后離心取上清液，沸水浴蛋白變性后用Bradford蛋白定量測定試劑初步測定蛋白濃度，濃度為1.5μg/μL。
(2)上述所得細(xì)胞總蛋白作SDS-PAGE電泳分析配制8％的分離膠10ml，灌膠后，用0.1％SDS封膠，并靜置30min，使其完全聚合；傾出SDS溶液，用雙蒸水將未聚合的分離膠沖除，反復(fù)數(shù)次后，用濾紙吸凈；配制4％的濃縮膠5ml插號梳子后灌膠，靜置30min后，加入電泳緩沖液(runningbufferTris-base 15.1g，Glycine 94g，SDS 5.0g，溶解于雙蒸水中定容至1000ml)，并將加樣孔中未聚合的濃縮膠沖除；每加樣孔中加入蛋白質(zhì)樣品30μg，在100V電壓下進(jìn)行電泳；取膠做考馬斯亮藍(lán)染色45min，脫色液過夜脫色，掃描凝膠保存結(jié)果。
(3)經(jīng)SDS-PAGE電泳后的凝膠于60mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時間常規(guī)蛋白β-actin為45min，AR為1.5h，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，具體過程為將分離膠從電泳儀上剝離，放在事先用電泳緩沖液[三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)5.8g，甘氨酸(Glycine)2.9g，十二烷基硫酸鈉(SDS)0.37g，甲醇200ml溶解于雙蒸水中定容至1000ml]浸潤的濾紙上，并依次覆蓋硝酸纖維素膜和濾紙，然后用電泳緩沖液徹底浸潤并去除氣泡；將處理后的分離膠和硝酸纖維素膜放入電轉(zhuǎn)移槽中，以100V電壓轉(zhuǎn)移1h；電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，可用麗春紅染液振蕩染色4～5min，取出硝酸纖維素膜，用蒸餾水洗凈觀察，去除非特異條帶。
待蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，先用TBST(一種混合洗液T表示三羥甲基氨基甲烷，B表示鹽酸，S表示氯化鈉，T表示吐溫-20)將膜洗凈，再用TBST配制的含5％的脫脂牛奶封閉1h；取出膜，將膜放入工作液中振蕩雜交2～3h，工作液由TBST、脫脂牛奶、鼠抗人AR單抗和鼠抗人β-actin抗體混合組成，其重量比為1000∶5∶1∶0.5。吸去含一抗的工作液后，再用TBST洗滌硝酸纖維素膜三次，每次10min，以去除多余的一抗；之后將膜放入另一工作液中振蕩雜交1h，工作液由TBST、脫脂牛奶和含山羊抗小鼠IgG組成，其重量比為2000∶5∶1。吸去含二抗的工作液后，再用TBST洗滌硝酸纖維素膜三次，每次10min，以去除多余的二抗；用PBS洗滌液(Na2HPO41.15g/L，KH2PO40.2g/L，NaCl8g/L，KCl0.2g/L，PH7.4)浸泡、洗膜2～3min，去除TBST中吐溫-20(Tween-20)對熒光反應(yīng)的影響。
(4)化學(xué)發(fā)光加強(qiáng)ECL系統(tǒng)Western-blotting試劑盒顯色剪取一張保鮮膜，將TBST洗滌過的硝酸纖維素膜放在保鮮膜上。將試劑盒中放射性免疫熒光試劑魯米鈉溶液A(Luminol Reagent SolutionA)與放射性免疫熒光試劑魯米鈉溶液B(Luminol Reagent SolutionB)等比例混勻，按照0.125ml/cm2均勻鋪在膜的蛋白面，室溫下反應(yīng)1min后，將保鮮膜折疊，連同靶蛋白膜帶入暗室進(jìn)行包括感光、顯影、定影等操作。
分別以不同濃度的姜黃素處理LNCap細(xì)胞24h后，Western-blot檢測AR表達(dá)，結(jié)果見圖4。圖4中AR蛋白免疫印跡條帶從左到右依次是經(jīng)過濃度為40μmol/L、30μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、0μmol/L的姜黃素處理LNCap細(xì)胞的結(jié)果。圖4清楚顯示，姜黃素可抑制AR的表達(dá)，并且對AR表達(dá)的抑制程度依賴于姜黃素的濃度，其中姜黃素濃度為40μmol/L時抑制效果最好。
圖5是western blotting法測定LNCap細(xì)胞常規(guī)蛋白β-actin結(jié)果照片，說明不同濃度的姜黃素對LNCap細(xì)胞常規(guī)蛋白β-actin沒有影響。
上述實(shí)施例中姜黃素劑量范圍為0～50μmol/L，50μmol/L為最大非毒性劑量，以上劑量范圍對檢測結(jié)果沒有影響。
上述實(shí)施例中，姜黃素(Curcurmin)購自Sigma公司，前列腺癌細(xì)胞LNCap，由本申請人單位保存。ECL系統(tǒng)western-blotting試劑盒購于北京中山生物公司，硝酸纖維素膜購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，AR單克隆抗體(鼠抗人)辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體(羊抗鼠)購自北京中山公司。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法，其特征在于由以下步驟組成(1)由姜黃素處理LNCap細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；MTT法檢測LNCap細(xì)胞生長情況；流式細(xì)胞技術(shù)FCM檢測細(xì)胞凋亡率；(2)用免疫印跡Western-blotting技術(shù)檢測雄激素受體蛋白AR的表達(dá)①由姜黃素處理的前列腺癌雄激素依賴性細(xì)胞至少24h后收集，用PBS洗滌三次后加入細(xì)胞裂解液，細(xì)胞裂解后離心取上清液，沸水浴蛋白變性后Bradford蛋白定量測定蛋白濃度，其合適濃度范圍為0.5-2μg/μL；②裂解后所得細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電泳后的凝膠于60mA恒流轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，選用可復(fù)性麗春紅染液振蕩染色，并根據(jù)蛋白質(zhì)Marker比較條帶分子量大小去除非特異性條帶，先后加入一抗和二抗后，用ECL熒光western-blotting試劑盒顯色，顯影、定影。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于特異性裂解液的組分及其濃度為甘油108mmol/L，曲拉通(TritonX-100)150mmol/L，氯化鈉(NaCl)137mmol/L，氟化鈉(NaF)10mmol/L，乙二醇雙(a-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)1mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)5mmol/L，焦磷酸鈉1mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)20mmol/L，原礬酸鈉1mmol/L，SDS3.7mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)1mmol/L，β-磷酸甘油100mmol/L，抑肽酶3.6mmol/L，二硫蘇糖醇DTT(DTT)2.8mmol/L，溴酚藍(lán)1.5mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明是一種應(yīng)用特異性靶蛋白檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本方法利用特異性靶蛋白AR、通過癌細(xì)胞生長情況和凋亡率檢測姜黃素對前列腺癌細(xì)胞抑制作用，其檢測結(jié)果證明是準(zhǔn)確的，同時，也能證明免疫印跡技術(shù)在本方法中的具體應(yīng)用也是可靠的。該方法具有簡單和易于推廣應(yīng)用的突出優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/531GK1936583SQ20061001619
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月23日
發(fā)明者楊磊, 呼文亮, 陳立軍, 王洪敏, 牟心紅, 靳秋月, 姚麗, 鎖江蕊, 謝紅, 王瑞岷, 王瑋, 程世翔, 樊嶸 申請人:中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院