專利名稱：固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
較完整介紹熒光免疫分析(以下簡(jiǎn)稱FIA)技術(shù)始見(jiàn)于1979年Soini的報(bào)告[1]。由于熒光素標(biāo)記物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不受效期限制，不使用放射核素，使人們期望FIA能替代放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。但實(shí)際測(cè)量FIA靈敏度比理論數(shù)值低100-1000倍[1]；其主要原因是常規(guī)使用的熒光素、若丹明等的發(fā)光波長(zhǎng)和熒光壽命與熒光本底的波長(zhǎng)及壽命接近或重疊，導(dǎo)致信號(hào)/噪聲比降低[1，2]。
為解決這些問(wèn)題，1974年Sundberg首次報(bào)告了用稀土Eu3+-螯合劑(氨基-苯基-EDTA)標(biāo)記抗體進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫分析(以下簡(jiǎn)稱TRFIA)的方法[3]。稀土離子作為熒光探針，它量子產(chǎn)率高，Stokes位移(＞200nm)大，熒光壽命(μs-ms)長(zhǎng)，發(fā)射光譜窄(＜10nm)[4].
TRFIA的基本原理是用紫外光激發(fā)作為配體的螯合劑，螯合劑吸收能量后，躍遷到激發(fā)態(tài)后將部分能量傳遞給稀土離子，使稀土離子發(fā)射出較強(qiáng)的特征熒光，采用時(shí)間分辨技術(shù)，經(jīng)過(guò)50-100μs的延遲測(cè)量，即可排除短壽命熒光本底干擾[5]，在適當(dāng)條件下，Eu3+離子在水溶液中測(cè)量下限可達(dá)5×10-14mol/L。
Eu3+等稀土離子具有9配位的特性[1]，使其在水溶液中極易被共價(jià)結(jié)合的H2O分子包圍，導(dǎo)致熒光熄滅[1，6]；這是TRFIA必須解決的問(wèn)題。
1983年Soini，Skola等采用TRFIA解離增強(qiáng)體系(以下簡(jiǎn)稱DELFIA)可排除水分子的干擾[7，8]，使TRFIA分析靈敏度提高100-1000倍[9]，對(duì)IgG分析靈敏度達(dá)0.025ng/ml。該方法是將Eu3+從免疫反應(yīng)物上解離下來(lái)在熒光增強(qiáng)液(含表面活性劑TritonX-100，TOPO)中與β-二酮形成新的螯合物進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)在，DELFIA體系已經(jīng)被Wallac公司實(shí)現(xiàn)了商品化，在臨床檢測(cè)中得到應(yīng)用[10]。
DELFIA屬于間接檢測(cè)方法。因?yàn)樗枰獙⑾⊥岭x子從免疫反應(yīng)物上解離下來(lái)，才能進(jìn)行增強(qiáng)熒光的測(cè)量；由此失去了反應(yīng)配基的空間結(jié)合信息，故不適用于原位雜交、免疫組化、均相免疫分析等[11]；從上世紀(jì)80年代后期，有關(guān)的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向直接TRFIA測(cè)量方法的研究。
1983年，Pettersson采用無(wú)須解離Eu3+離子的固相結(jié)合免疫配基，在固相上采用DELFIA相似的熒光增強(qiáng)液及多氨多羧基螯合劑(EDTA、DTPA等)，分析靈敏度比DELFIA低約10倍[12]。由此推論要提高直接測(cè)量的TRFIA靈敏度，關(guān)鍵要制備發(fā)光效能更強(qiáng)的稀土離子雙功能螯合劑。
稀土離子雙功能螯合劑應(yīng)滿足下述基本要求具有高的量子產(chǎn)率，在水溶液中的充分溶解性及動(dòng)力穩(wěn)定性，其蛋白質(zhì)基團(tuán)易于進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，并經(jīng)偶聯(lián)蛋白質(zhì)后不影響免疫反應(yīng)性及特異性，稀土離子螯合基團(tuán)在接近中性水溶液中與稀土離子形成牢固穩(wěn)定的結(jié)合。螯合劑應(yīng)盡可能避免含有高振動(dòng)基團(tuán)，如O-H，N-H和C-H鍵，以減少因鍵振動(dòng)對(duì)熒光的熄滅[6]。
近卅年來(lái)，對(duì)發(fā)光體(parent)研究和應(yīng)用以2，2′-二吡啶為最多，最初由Cook(1989)合成[13]。以2，2′-二吡啶為核心的螯合劑研究目前已見(jiàn)到有數(shù)百種[4，6，11]，按其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為二類，一類是二吡啶聯(lián)結(jié)4位芳香基，6，6′-多氨多羧基的螯合劑，這類螯合劑以Wallac實(shí)驗(yàn)室為代表的研究多集中于結(jié)構(gòu)與光譜學(xué)關(guān)系的理論探討，實(shí)際應(yīng)用于TRFIA的報(bào)告不多；另一類為Alpha B(1987)首批以二吡啶為核心的穴狀螯合劑(cryptates)。1993年，Mathis用穴狀螯合劑作均相TRFIA檢測(cè)泌乳素，靈敏度達(dá)到0.3μg/L[14].
除2，2′-二吡啶外，其他類型的螯合劑如1，7-雙(氯磺二苯基)-1，10-菲洛啉-2，9-二羧酸(BCPDA)和2，6-二(3′-氨甲基-1′-吡唑)-(4-苯基吡啶)-羧酸(BPTA)用于TRFIA尚未達(dá)到DELFIA那樣實(shí)用程度[15]。
由于螯合劑分子結(jié)構(gòu)的改變會(huì)對(duì)整個(gè)螯合劑的效能產(chǎn)生影響[4，6，11，16]。迄今，有關(guān)螯合劑研究與實(shí)際要求仍有一定差距，分子生物學(xué)、基團(tuán)組學(xué)、蛋白組學(xué)分析仍然采用光學(xué)性能較差的有機(jī)染料[5]。因此，研究更高效能，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的稀土螯合劑，對(duì)TRFIA現(xiàn)代分子生物學(xué)、基團(tuán)組學(xué)、蛋白組學(xué)的發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑技術(shù)上的不足，例如2，6-二吡啶非直接結(jié)合導(dǎo)致發(fā)光效率降低；4，4′-二吡啶聯(lián)結(jié)非“硬鍵”方式偶聯(lián)蛋白致使發(fā)光體(二吡啶)的發(fā)光能量被偶聯(lián)的蛋白質(zhì)淬滅；苯非異硫氰基(以下簡(jiǎn)稱NCS)基團(tuán)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)易使蛋白生物活性降低。本發(fā)明的目的是提供了一種新的固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑及其制備方法。
本發(fā)明的螯合劑名稱為2，2′，2″，2-{[4，4′-二異硫氰基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸；其結(jié)構(gòu)式如下所示。

(1)、螯合劑發(fā)光體為處于中心部位的2，2′-二吡啶。
為比較各種發(fā)光體的發(fā)光效率，文獻(xiàn)[6]中研究了它們發(fā)光產(chǎn)額(logR)，最大激發(fā)波長(zhǎng)(λexc)和代表共價(jià)結(jié)合于稀土離子的H2O分子數(shù)的發(fā)射衰減常數(shù)(Kchel)，摘要列于表1。
表1.發(fā)光體螯合Eu3+后的logR、λexc和Kchel參數(shù)比較

由表1可見(jiàn)，2，2′-二吡啶發(fā)光率5.50，共價(jià)結(jié)合H2O分子為1.70個(gè)，其性能是最好的，它的λexc＞300nm，可減少本底熒光的影響[16]，2，2′-二吡啶較高的三重點(diǎn)能量與稀土離子發(fā)射能量有足夠的間隔，可防止受激發(fā)離子的能量向配體的反向傳遞[11]。
(2)、2，2′-二吡啶聯(lián)結(jié)蛋白的位置對(duì)螯合劑發(fā)光效能有重要作用。文獻(xiàn)[4]報(bào)告二吡啶4，4′位聯(lián)結(jié)二甲基、甲氧苯基的logR分別為5.61和5.57而3，3′聯(lián)結(jié)相應(yīng)的基團(tuán)則logR分別為4.90和3.91。本發(fā)明采用4，4′位聯(lián)接本乙炔應(yīng)該是合理的。
(3)、在二吡啶4，4′位上結(jié)合吸電子基團(tuán)的苯基有利于提高發(fā)光效率及螯合劑內(nèi)部能量向Eu3+離子的轉(zhuǎn)移[4，6]。
(4)、螯合劑偶聯(lián)蛋白大分子后，其發(fā)光率(ε·Φ)及發(fā)光壽命明顯降低。有關(guān)的研究以吡唑-2，5-二吡啶為發(fā)光體的螯合劑-Tb為對(duì)象，比較其發(fā)光性質(zhì)，結(jié)果如表2[11]。
表2.偶聯(lián)蛋白前后螯合劑-Tb激發(fā)波長(zhǎng)λexc、發(fā)光壽命τ及發(fā)光產(chǎn)率ε·Φ的比較

由表2可見(jiàn)，偶聯(lián)蛋白后發(fā)光產(chǎn)率降低一倍多，發(fā)光壽命從2811μs降至1350μs，由此可見(jiàn)，螯合劑偶聯(lián)蛋白基團(tuán)及偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)螯合劑發(fā)光效能具有重要影響。為此，本發(fā)明的的偶聯(lián)蛋白基團(tuán)用NCS-4-苯乙炔聯(lián)結(jié)在吡啶4位。這種可有效降低蛋白大分子對(duì)螯合劑能量的消耗[17，18]；而NCS基團(tuán)不需加任何偶聯(lián)試劑，即可在較溫和的條件下與蛋白質(zhì)游離氨基結(jié)合，有利于保持蛋白質(zhì)的生物活性不受偶聯(lián)反應(yīng)的影響。
(5)稀土離子螯合基團(tuán)為二吡啶6，6′位分別結(jié)合二組次氮基二羧酸；四羧酸能牢固結(jié)合稀上離子，增加螯合劑的水溶解性及水相中動(dòng)力穩(wěn)定性[4，6，11，16]。四羧基和四個(gè)氮原子形成八配位結(jié)構(gòu)，有效地排除水分子的熄滅作用。
本發(fā)明的螯合劑從上述五方面全面考慮發(fā)光效率、熒光壽命和最大吸收波長(zhǎng)，對(duì)核心配體、蛋白質(zhì)偶聯(lián)基團(tuán)和稀土離子螯合基團(tuán)進(jìn)行優(yōu)化組合，體現(xiàn)了本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的螯合劑合成路線如下
本發(fā)明的制備方法的步驟和條件，結(jié)合具體實(shí)施方式
說(shuō)明如下(1).用2-氨基-6-甲基吡啶制備2-溴-6-甲基吡啶。
把2-氨基-6-甲基吡啶72g(0.67mol)溶于330ml質(zhì)量濃度為40％HBr溶液中，保持在-15～0℃，緩慢滴加100ml含量為2mol的Br2，再滴加含有亞硝酸鈉116g的水溶液，該亞硝酸鈉的水溶液是把1.68mol溶于175ml H2O中得到的，攪拌30min，繼續(xù)滴加含有NaOH 253g的水溶液，該NaOH水溶液是把6.33mol溶于265mlH2O中得到的，再攪拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，減壓濃縮，減壓蒸餾在4mmHg下收集62-65℃油狀物，得到結(jié)晶產(chǎn)物2-溴-6-甲基吡啶。
(2).向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入2-溴-6-甲基吡啶90g(0.53mol)，二水合甲酸鈉82.6g(0.79mol)，含鈀5％的碳3.2g，芐基三乙基氯化銨21.2g(0.08mol)，質(zhì)量濃度為32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，攪拌，加熱至回流，反應(yīng)48h，每隔4-8h加入3.8～11.5g二水合甲酸鈉、0.8～1.5g含鈀5％的碳、0.6～3.8g芐基三乙基氯化銨和6.7～13.5ml質(zhì)量濃度為32％的NaOH溶液，用步驟①的方法提取、濃縮、干燥、減壓蒸餾在2mmHg下收集105-106℃的餾分，得產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(3)產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶10g(54.35mmol)加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml質(zhì)量濃度為30％的H2O2溶液，于80℃攪拌條件下，持續(xù)加溫7h，冷卻至室溫，用質(zhì)量濃度為25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、濃縮，所得固體用大量乙醚洗，干燥，得產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(4).將濃硫酸7.7ml與濃硝酸5.8ml混合后用冰水冷卻，保持溫度在-10～0℃，加入產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.92g(8.89mmol)，在100℃反應(yīng)6h，濾出生成的沉淀，干燥，得黃色結(jié)晶4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(5).產(chǎn)物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.5g(4.9mmol)溶于20ml冰醋酸中，在60℃，滴加乙酰溴11.5ml，開(kāi)口，控制反應(yīng)溫度在80℃，反應(yīng)2.5h，冷卻至室溫，倒入100g碎冰中，用質(zhì)量濃度為25％的NaHCO3溶液中和，用二氯甲烷萃取、干燥、濃縮，倒入適量乙醚，所得固體干燥，得產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。
(6).產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物0.64g(1.71mmol)溶于16ml二氯甲烷，加入3.2ml三溴化磷，攪拌加熱，回流反應(yīng)2h，冷卻后倒入少量碎冰中，分離二氯甲烷層，用質(zhì)量濃度為25％的NaOH溶液堿化，得白色沉淀，得產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(7).在氮?dú)鈿夥障?，產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶403.1mg(1.179mmol)溶于13ml甲苯，加入362.3mg(2.46mmol)的對(duì)硝基苯乙炔，68.62mg(0.059mmol)的Pd(PPh3)4和24.52mg(0.13mmcl)的CuI，回流反應(yīng)4h，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)成分，濾液傾入過(guò)量甲醇中，收集沉淀，溶于20ml四氫呋喃(以下簡(jiǎn)稱THF)中，甲醇重結(jié)晶，再溶于THF經(jīng)硅膠G柱層析純化，洗脫液為正己烷和THF，正己烷和THF的體積比＝3∶1，得產(chǎn)物4，4′-對(duì)硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。
(8)產(chǎn)物4，4′-對(duì)硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶48.92mg(0.103mmol)溶于150ml的CCl4，加入N-溴代琥珀酰亞胺45.94mg(0.26mmol)，回流反應(yīng)30分鐘，加入過(guò)氧化苯甲酰2.85mg，反應(yīng)6h，先濾出固體成分，再冷卻至0℃，所生成的沉淀用甲醇沖洗，濾液過(guò)硅膠柱，洗脫液為MeOH和CCl4，MeOH和CCl4體積比為1∶9，得(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-雙(溴亞甲基)。
(9).產(chǎn)物(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-雙(溴亞甲基)252.8mg(0.4mmol)，166.3mg(0.88mmol)的亞氨基二乙酸乙酯，0.21g(2.0mmol)的Na2CO3溶于10ml甲腈，回流反應(yīng)過(guò)夜，沉淀濾出，濾液濃縮，硅膠純化，洗脫液為MeOH和CHCl3，MeOH和CHCl3體積比為1∶9，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(10).將蒸餾水16.4ml，濃氨水30ml，產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯13.91g(0.0164mol)先后加到250ml三頸瓶?jī)?nèi)，攪拌，冷卻到0℃.鋅粉16g(0.246mol)分次加入到反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，密封反應(yīng)瓶，攪拌反應(yīng)2.5h.隨后室溫繼續(xù)攪拌20h.反應(yīng)混合物用50ml水稀釋，再用二氯甲烷萃取、洗滌、干燥，揮盡溶劑，剩余物在氬氣保護(hù)下用石油醚-苯混合溶劑重結(jié)晶，得產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯。
(11).產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯236.4mg(0.3mmol)溶于三氟乙酸5ml，室溫?cái)嚢?h，減壓蒸發(fā)除去三氟乙酸，再經(jīng)乙酸酐處理，濾出沉淀，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)得產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸。
(12)產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸223.1mg(0.33mmol)溶于10ml的H2O中，用固體NaHCO3調(diào)pH至8.5，取二氯硫化碳42mg(0.305mmol)溶于10ml的CHCl3中，緩慢滴加，室溫?cái)嚢?，?dāng)游離氨檢測(cè)為陰性時(shí)，中止反應(yīng)。分離出水相，蒸發(fā)濃縮，F(xiàn)lorisil柱層析純化，乙腈/水洗脫，得最終產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二異硫氰基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸。
本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新特點(diǎn)及有益效果如下本發(fā)明的螯合劑技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)在2，2′-二吡啶兩個(gè)4位中聯(lián)結(jié)4-NCS-苯乙炔作為偶聯(lián)蛋白基團(tuán)。
常用的蛋白偶聯(lián)基團(tuán)有-NH2，-COOH，-HS，-SCl等，前三者需加偶聯(lián)劑(戊二醛，碳二亞胺等)，反應(yīng)過(guò)程較復(fù)雜，容易引起蛋白質(zhì)自身偶聯(lián)，甚至變性，第四種方法需在酸性條件偶聯(lián)，而且該基團(tuán)極不穩(wěn)定，也不利于保持蛋白質(zhì)的活性。本發(fā)明采用的偶聯(lián)基團(tuán)具有如下優(yōu)點(diǎn)·不需要任何偶聯(lián)劑，在非常溫和的條件下-NCS基即可與蛋白質(zhì)自行偶聯(lián)，充分保證蛋白質(zhì)的生物活性。
·-NCS和苯乙炔皆采用4位結(jié)合，可減少激發(fā)光能的損失。
·吡啶4位聯(lián)結(jié)苯基可提高螯合劑發(fā)光效率及分子內(nèi)能量的傳遞。
·苯基上的乙炔屬“硬”性鍵(rigid backbone)[18]，可阻斷蛋白大分子對(duì)螯合劑發(fā)光能量的消耗。
技術(shù)難點(diǎn)是在聯(lián)結(jié)上述基團(tuán)的反應(yīng)過(guò)程如何保護(hù)相關(guān)基團(tuán)不被破壞。其中-NCS在酸處理及氧化、溴化反應(yīng)易分解，乙炔鍵在氧化、溴化中容易丟失。為此，采取如下措施·將聯(lián)結(jié)苯乙炔基團(tuán)安排在第6步反應(yīng)后進(jìn)行，可避免濃H2SO4、HNO3、乙酰溴、及三溴化磷的作用。
·聯(lián)結(jié)苯乙炔后的反應(yīng)9為保護(hù)炔鍵，6，6′-二甲基的溴化采用較溫和的溴化劑-溴代琥珀酰亞胺。
·為保護(hù)-NCS，將該反應(yīng)安排在最后一步，氨基在二氯硫化碳作用下轉(zhuǎn)化成-NCS，使其不受前面一系列反應(yīng)的影響。
本發(fā)明的螯合劑的技術(shù)指標(biāo)及優(yōu)點(diǎn)·具有高發(fā)光效率及優(yōu)越的光學(xué)性能。2，2′-二吡啶的發(fā)光效率logR為5.50，λexc為307nm，λem為660nm，發(fā)光衰減常數(shù)為1.70。
·四羧基和四氨基螯合基團(tuán)以8配位牢固結(jié)合稀土離子，減少水分子的熄滅作用。
·吡啶4位上的苯基既可提高發(fā)光體發(fā)光效率，又提供了蛋白結(jié)合基團(tuán)。
·吡啶4位的乙炔鍵保證了螯合劑發(fā)光能量高效率地傳遞給稀土離子。
·-NCS偶聯(lián)蛋白后，保證蛋白生物活性不受影響。
·本螯合劑的高發(fā)光效率，在水溶液中的高溶解性及穩(wěn)定性，高度離子結(jié)合能力和結(jié)合蛋白大分子的高生物活性，使其能用于固相TRFIA直接測(cè)量。
技術(shù)參考文獻(xiàn)如下1.Hemmila.I.，斯堪地那維亞臨床實(shí)驗(yàn)研究雜志，1988，48，389-400Hemmila.I.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，1988，48，389-4002.orin M.，分析化學(xué)學(xué)報(bào)，1989，219，67-77Morin M.，Anal.Chim.Acta.，1989，219，67-773.Sundberg M.W.，et al.醫(yī)用化學(xué)雜志，1974，17，1304-1307Sundberg M.W.，et al.J.Med.Chem.，1974，17，1304-13074.Veli-Matti M.，哈維化學(xué)學(xué)報(bào)，1992，75，1578-1592Veli-Matti M.，Helv.Chim.Acta.，1992，75，1578-15925.Hovinen J.，有機(jī)通訊雜志，2001，3(16)，2473-2476Hovinen J.，Organic Letters，2001，3(16)，2473-24766.Mukkala V.M.，et al.哈維化學(xué)學(xué)報(bào)，1992，75，1621-1632Mukkala V.M.，et al.Helv.Chim.Acta.，1992，75，1621-16327.oini E.，et al.臨床化學(xué)，1983，21(1)，60-64Soini E.，et al.Clin.Chem.，1983，21(1)，60-648.skola J.V.，et al.臨床化學(xué)，1983，21(10)，1777-1780Eskola J.V.，et al.Clin.Chem.，1983，21(10)，1777-17809.Hemmila I.，et al.分析生物化學(xué)，1984，137，335-343Hemmila I.，et al.Anal.Biochem.，1984，137，335-34310.Michael P.，et al.分析實(shí)踐，1984，109，1449-1450Michael P.，et al.Analyst，1984，109，1449-145011.Takalo H.，et al.哈維化學(xué)學(xué)報(bào)，1997，80，372-387Takalo H.，et al.Helv.Chim.Acta.，1997，80，372-38712.Siitari H.，et al.自然，1983，301，258-260Siitari H.，et al.Nature，1983，301，258-26013.Cook M.J.，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)，1989，111，7221-7227Cook M.J.，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，7221-722714.Mathis G.，臨床化學(xué)，1993，39(9)，1953-1959Mathis G.，Clin.Chem.，1993，39(9)，1953-195915.Yuan J.，et al.分析化學(xué)，2001，73，1869-1876Yuan J.，et al.Anal.Chem.，2001，73，1869-187616.Takalo H.，et al.哈維化學(xué)學(xué)報(bào)，1993，76，877-883Takalo H.，et al.Helv.Chim.Acta.，1993，76，877-88317.Takalo H.，et al.斯堪地那維亞化學(xué)研究學(xué)報(bào)B，1988，42，662-665Takalo H.，et al.Acta.Chem.Scand.Ser.B，1988，42，662-66518.Egbe D.K.M.，et al.大分子化學(xué)物理，1998，199，2683-2688Egbe D.K.M.，et al.Macromol Chem.Phys.，1998，199，2683-2688
權(quán)利要求
1.固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑，其特征在于，該螯合劑名稱為2，2′，2″，2-{[4，4′-二異硫氰基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸；其結(jié)構(gòu)式如下所示。
2.如權(quán)利要求1所述的固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑的制備方法，其特征在于，步驟和條件如下(1).用2-氨基-6-甲基吡啶制備2-溴-6-甲基吡啶。把2-氨基-6-甲基吡啶72g(0.67mol)溶于330ml質(zhì)量濃度為40％HBr溶液中，保持在-15～0℃，緩慢滴加100ml含量為2mol的Br2，再滴加含有亞硝酸鈉116g的水溶液，該亞硝酸鈉的水溶液是把1.68mol溶于175ml H2O中得到的，攪拌30min，繼續(xù)滴加含有NaOH 253g的水溶液，該NaOH水溶液是把6.33mol溶于265mlH2O中得到的，再攪拌30min，用二氯甲烷提取，用MgSO4吸水干燥，減壓濃縮，減壓蒸餾在4mmHg下收集62-65℃油狀物，得到結(jié)晶產(chǎn)物2-溴-6-甲基吡啶。(2).向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入2-溴-6-甲基吡啶90g(0.53mol)，二水合甲酸鈉82.6g(0.79mol)，含鈀5％的碳3.2g，芐基三乙基氯化銨21.2g(0.08mol)，質(zhì)量濃度為32％的NaOH溶液53ml，H2O 130ml，攪拌，加熱至回流，反應(yīng)48h，每隔4-8h加入3.8～11.5g二水合甲酸鈉、0.8～1.5g含鈀5％的碳、0.6～3.8g芐基三乙基氯化銨和6.7～13.5ml質(zhì)量濃度為32％的NaOH溶液，用步驟①的方法提取、濃縮、干燥、減壓蒸餾在2mmHg下收集105-106℃的餾分，得產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。(3)產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶10g(54.35mmol)加冰醋酸63.7ml，滴加22.3ml質(zhì)量濃度為30％的H2O2溶液，于80℃攪拌條件下，持續(xù)加溫7h，冷卻至室溫，用質(zhì)量濃度為25％的NaOH溶液中和至中性，用氯仿萃取、干燥、濃縮，所得固體用大量乙醚洗，干燥，得產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。(4).將濃硫酸7.7ml與濃硝酸5.8ml混合后用冰水冷卻，保持溫度在-10～0℃，加入產(chǎn)物6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.92g(8.89mmol)，在100℃反應(yīng)6h，濾出生成的沉淀，干燥，得黃色結(jié)晶4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。(5).產(chǎn)物4，4′-二硝基-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物1.5g(4.9mmol)溶于20ml冰醋酸中，在60℃，滴加乙酰溴11.5ml，開(kāi)口，控制反應(yīng)溫度在80℃，反應(yīng)2.5h，冷卻至室溫，倒入100g碎冰中，用質(zhì)量濃度為25％的NaHCO3溶液中和，用二氯甲烷萃取、干燥、濃縮，倒入適量乙醚，所得固體干燥，得產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物。(6).產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶-1，1′-二氧化物0.64g(1.71mmol)溶于16ml二氯甲烷，加入3.2ml三溴化磷，攪拌加熱，回流反應(yīng)2h，冷卻后倒入少量碎冰中，分離二氯甲烷層，用質(zhì)量濃度為25％的NaOH溶液堿化，得白色沉淀，得產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。(7).在氮?dú)鈿夥障?，產(chǎn)物4，4′-二溴-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶403.1mg(1.179mmol)溶于13ml甲苯，加入362.3mg(2.46mmol)的對(duì)硝基苯乙炔，68.62mg(0.059mmol)的Pd(PPh3)4和24.52mg(0.13mmol)的CuI，回流反應(yīng)4h，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)成分，濾液傾入過(guò)量甲醇中，收集沉淀，溶于20ml THF中，甲醇重結(jié)晶，再溶于THF經(jīng)硅膠G柱層析純化，洗脫液為正己烷和THF，正己烷和THF的體積比＝3∶1，得產(chǎn)物4，4′-對(duì)硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶。(8).產(chǎn)物4，4′-對(duì)硝基苯乙炔-6，6′-二甲基-2，2′-二吡啶48.92mg(0.103mmol)溶于150ml的CCl4，加入N-溴代琥珀酰亞胺45.94mg(0.26mmol)，回流反應(yīng)30分鐘，加入過(guò)氧化苯甲酰2.85mg，反應(yīng)6h，先濾出固體成分，再冷卻至0℃，所生成的沉淀用甲醇沖洗，濾液過(guò)硅膠柱，洗脫液為MeOH和CCl4，MeOH和CCl4體積比為1∶9，得(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-雙(溴亞甲基)。(9).產(chǎn)物(4，4′-二硝基苯乙炔)-2，2′-二吡啶-6，6′-雙(溴亞甲基)252.8mg(0.4mmol)，166.3mg(0.88mmol)的亞氨基二乙酸乙酯，0.21g(2.0mmol)的Na2CO3溶于10ml甲腈，回流反應(yīng)過(guò)夜，沉淀濾出，濾液濃縮，硅膠純化，洗脫液為MeOH和CHCl3，MeOH和CHCl3體積比為1∶9，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯。(10).將蒸餾水16.4ml，濃氨水30ml，產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二硝基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯13.91g(0.0164mol)先后加到250ml三頸瓶?jī)?nèi)，攪拌，冷卻到0℃.鋅粉16g(0.246mol)分次加入到反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，密封反應(yīng)瓶，攪拌反應(yīng)2.5h.隨后室溫繼續(xù)攪拌20h.反應(yīng)混合物用50ml水稀釋，再用二氯甲烷萃取、洗滌、干燥，揮盡溶劑，剩余物在氬氣保護(hù)下用石油醚-苯混合溶劑重結(jié)晶，得產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯。(11).產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸酯236.4mg(0.3mmol)溶于三氟乙酸5ml，室溫?cái)嚢?h，減壓蒸發(fā)除去三氟乙酸，再經(jīng)乙酸酐處理，濾出沉淀，得2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)得產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸。(12).產(chǎn)物2，2′，2″，2-{[4，4′-二氨基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸223.1mg(0.33mmol)溶于10ml的H2O中，用固體NaHCO3調(diào)pH至8.5，取二氯硫化碳42mg(0.305mmol)溶于10ml的CHCl3中，緩慢滴加，室溫?cái)嚢?，?dāng)游離氨檢測(cè)為陰性時(shí)，中止反應(yīng)。分離出水相，蒸發(fā)濃縮，F(xiàn)lorisil柱層析純化，乙腈/水洗脫，得最終產(chǎn)物2，2′，2″，2-{4，4′-二異硫氰基-雙(苯基-1-乙炔基)-4，4′-(2，2′-二吡啶)]-6，6′-(亞甲基次氮基)}-四乙酸。
全文摘要
本發(fā)明的螯合劑為2，2′，2″，2″′－{[4，4′－二異硫氰基－雙(苯基－1－乙炔基)－4，4′－(2，2′－二吡啶)]－6，6′－(亞甲基次氮基)}－四乙酸。將兩個(gè)4－異硫氰基－1－乙炔基－苯結(jié)合于2，2′－二吡啶的4，4′位上，可增強(qiáng)二吡啶發(fā)光效率并有利于螯合劑激發(fā)能向稀土離子轉(zhuǎn)移，苯4位的異硫氰基無(wú)需聯(lián)結(jié)劑在溫和條件下與蛋白質(zhì)游離氨基結(jié)合，確保蛋白質(zhì)生物活性。吡啶4位與4－異硫氰基—苯之間是“硬性”鍵苯乙炔聯(lián)結(jié)，可阻止螯合劑激發(fā)光能向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，減少蛋白分子對(duì)激發(fā)能的熄滅作用。二吡啶6，6′位上N，N′－四羧基八配位結(jié)構(gòu)可牢固結(jié)合稀上離子，有效排除水分子的熄滅作用，提高螯合劑的水溶解性及在水溶液中的動(dòng)力穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1876632SQ20061001699
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日
發(fā)明者潘利華, 馬世鹽, 謝文兵, 常江, 孫令艷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所