專(zhuān)利名稱(chēng)：磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)微量磺胺藥的器具，特別是涉及一種磺胺藥多殘留分析的金標(biāo)層析檢測(cè)試紙盒。
二、技術(shù)背景磺胺藥是一類(lèi)用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)藥物。具有抗菌譜廣、價(jià)廉、使用方便的特點(diǎn)，除廣泛用于獸醫(yī)臨床治療外，常常作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用，以便控制某些疾病。由于磺胺藥在動(dòng)物生產(chǎn)中的不規(guī)范使用，使其在動(dòng)物體內(nèi)殘留，并通過(guò)肉、蛋、奶等食物鏈進(jìn)入人體，在人體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，造成過(guò)敏性反應(yīng)，發(fā)生中毒，還可引起造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血等，有些還有致畸、致癌作用，嚴(yán)重危害人類(lèi)的身體健康。
磺胺藥是近15～20年來(lái)在動(dòng)物性食品中殘留超標(biāo)現(xiàn)象非常嚴(yán)重的一類(lèi)獸藥，因此，世界各國(guó)對(duì)磺胺藥的殘留極為關(guān)注，我國(guó)已把動(dòng)物性食品中磺胺藥殘留列為重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象之一。
檢測(cè)磺胺藥殘留的方法很多，如微生物學(xué)法、薄層層析法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用分析法和毛細(xì)管電泳法等。但這些方法有的需要昂貴的儀器設(shè)備，需要熟練的專(zhuān)業(yè)人員操作，操作過(guò)程復(fù)雜，需要的時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其應(yīng)用范圍，難以在生產(chǎn)實(shí)際中推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制出特異，敏感、快速、簡(jiǎn)便的磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成。反應(yīng)膜用印制有隱形檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應(yīng)膜上的檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，反應(yīng)膜上的對(duì)照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或?yàn)檠蚩雇肐gG、或?yàn)橥每馆d體蛋白IgG抗體印制，對(duì)照線和檢測(cè)線平行排列組合為“|||”，或?yàn)椤皘|||”，或?yàn)椤皘||||”，或?yàn)椤皘|||||”。
所述的金標(biāo)抗體和相應(yīng)的結(jié)合抗原形成下述的任意2～5種組合，金標(biāo)抗磺胺甲基嘧啶(SM1)抗體，檢測(cè)線為SM1-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺二甲基嘧啶(SM2)抗體，檢測(cè)線為SM2-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMD)抗體，檢測(cè)線為SMD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺嘧啶(SD)抗體，檢測(cè)線為SD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)抗體，檢測(cè)線為SDM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺間甲氧嘧啶(SMM)抗體，檢測(cè)線為SMM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺甲噁唑(SMZ)抗體，檢測(cè)線為SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺異噁唑(SIZ)抗體，檢測(cè)線為SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺甲氧吡嗪(SMP)抗體，檢測(cè)線為SMP-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺喹噁啉(SQ)抗體，檢測(cè)線為SQ-載體蛋白結(jié)合抗原。
一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成。反應(yīng)膜用印制有隱形檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種金標(biāo)磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應(yīng)膜檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應(yīng)膜上的對(duì)照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或?yàn)檠蚩雇肐gG、或?yàn)橥每馆d體蛋白IgG抗體印制，對(duì)照線和檢測(cè)線平行排列組合為“|||”，或?yàn)椤皘|||”，或?yàn)椤皘||||”，或?yàn)椤皘|||||”。
所述的金標(biāo)磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原和相應(yīng)的磺胺藥抗體為下述的任意2～5種組合，金標(biāo)SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SM1抗體；金標(biāo)SM2-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SM2抗體；金標(biāo)SMD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMD抗體；金標(biāo)SD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SD抗體；金標(biāo)SDM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SDM抗體；金標(biāo)SMM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMM抗體；金標(biāo)SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMZ抗體；金標(biāo)SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SIZ抗體；金標(biāo)SMP-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMP抗體；金標(biāo)SQ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SQ抗體。
所述的襯板用硬質(zhì)塑膠條，樣品墊為玻璃纖維棉；吸水墊為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙。
所述的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA，或人血清白蛋白HSA，或血藍(lán)蛋白KLH。
所述的顯示窗旁邊分別印有字母T1、T2…Tn和C，T表示檢測(cè)線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對(duì)照線，在遠(yuǎn)離加樣孔側(cè)，其中n為1、2、3、4、5。
本發(fā)明的積極有益效果本發(fā)明的磺胺藥多聯(lián)金標(biāo)層析檢測(cè)試紙盒具有以下突出優(yōu)點(diǎn)，①試紙盒特異性強(qiáng)，敏感性高。最低檢出限可達(dá)到10ppb，低于我國(guó)目前限量標(biāo)準(zhǔn)。
②試紙盒實(shí)現(xiàn)了磺胺藥多殘留金標(biāo)層析快速檢測(cè)，用同一試紙盒可一次加樣同時(shí)檢測(cè)多種磺胺藥物，克服以前的常規(guī)單項(xiàng)檢測(cè)試紙盒一次只能檢測(cè)一種藥物的不足；大大節(jié)省了檢測(cè)多種磺胺藥物的檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率。
③使用該試紙盒，無(wú)需其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，在10分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果，簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)。
④使用該試紙盒以棕紅色線條“|”顯示數(shù)量或有無(wú)，作為檢測(cè)結(jié)果判定依據(jù)，形象、直觀，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)人為誤判。
⑤節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用該試紙盒，比用儀器分析和常規(guī)單項(xiàng)檢測(cè)試紙條費(fèi)用大幅下降。同時(shí)，試紙盒適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專(zhuān)業(yè)檢驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、加工企業(yè)和養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)等，便于推廣應(yīng)用。
四

圖1、試紙芯側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2、試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3、二項(xiàng)聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖4、試紙盒底座構(gòu)造示意圖。
圖5、三項(xiàng)聯(lián)檢試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6、三項(xiàng)聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖7、五項(xiàng)聯(lián)檢試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖8、五項(xiàng)聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖中，1襯板；2樣品墊；3金標(biāo)物結(jié)合墊；4反應(yīng)膜；5吸水墊；6對(duì)照線；7檢測(cè)線；8加樣孔；9顯示窗；10面板；11底座；12固定槽。
五具體實(shí)施例方式要制成磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，首先需要制備某種磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，同時(shí)需要制備磺胺藥金標(biāo)物，而且需要制備羊抗或兔抗小鼠IgG抗體或羊抗兔IgG抗體，或兔抗載體蛋白IgG抗體，進(jìn)而制備試紙芯，并安裝在塑料殼底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起。
1、磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原制備采用重氮化法或戊二醛法可制備任何一種磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原。
采用的載體蛋白分別為牛血清白蛋白(BSA)，雞卵清白蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，血藍(lán)蛋白(KLH)。
重氮化法以SMM為例，在冰浴條件下進(jìn)行，稱(chēng)取SMM40mg溶于5ml0.1mol/L稀鹽酸中，攪拌下滴加0.3～0.5ml10％的NaNO2，反應(yīng)4～6h；稱(chēng)取BSA20mg溶于3ml PBS液，并在攪拌下緩慢加入上液中，用1mol/L的NaOH調(diào)pH≈8.5，反應(yīng)過(guò)夜。收集反應(yīng)液裝入透析袋，在4℃下用0.1mol/L(pH7.4)的PBS透析3～5天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的人工結(jié)合抗原SMM-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA或KLH替代BSA制得人工結(jié)合抗原SMM-OVA或SMM-HSA或SMM-KLH。
戊二醛法以SMM為例，將10mg BSA溶于2ml pH＝9.6的0.05mol/L碳酸緩沖液中，再緩緩滴加25％戊二醛溶液0.2mL，攪拌反應(yīng)4～6h；稱(chēng)取SMM20mg溶于2ml 0.1mol/L的NaOH溶液，并在攪拌下緩慢加入上液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜。收集反應(yīng)液裝入透析袋，在4℃下用0.1mol/L(pH7.4)的PBS透析3～5天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的人工結(jié)合抗原SMM-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA或KLH替代BSA制得人工結(jié)合抗原SMM-OVA或SMM-HSA或SMM-KLH。
采用上述兩種方法可制備的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原分別為SM1-BSA、SM2-BSA、SMD-BSA、SD-BSA、SDM-BSA、SMM-BSA、SMZ-BSA、SIZ-BSA、SMP-BSA、SQ-BSA；SM1-OVA、SM2-OVA、SMD-OVA、SD-OVA、SDM-OVA、SMM-OVA、SMZ-OVA、SIZ-OVA、SMP-OVA、SQ-OVA；SM1-HSA、SM2-HSA、SMD-HSA、SD-HSA、SDM-HSA、SMM-HSA、SMZ-HSA、SIZ-HSA、SMP-HSA、SQ-HSA；SM1-KLH、SM2-KLH、SMD-KLH、SD-KLH、SDM-KLH、SMM-KLH、SMZ-KLH、SIZ-KLH、SMP-KLH、SQ-KLH。
2、抗某種磺胺藥單克隆抗體或多克隆抗體的制備單抗制備以SM1為例，用SM1-載體蛋白結(jié)合抗原按50～100μg/只的劑量免疫8周齡BALB/c小鼠3～4次，每次免疫間隔時(shí)間3～5周，最后一次超強(qiáng)免疫后3～4天，無(wú)菌取其脾細(xì)胞并與NS0骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14天，用間接ELISA方法選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體可特異地與SM1反應(yīng)。以體內(nèi)誘生法進(jìn)行單抗制備，以辛酸-硫酸銨法提純單抗，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 多抗制備以SM1為例，用SM1-載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200～500μg/次，背部皮下分4～6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，與等量弗氏完全佐劑(FCA)混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，與等量弗氏不完全佐劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2～3周進(jìn)行，連續(xù)免疫4～5次，每次間隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法測(cè)定其效價(jià)達(dá)到105以上時(shí)，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 上述方法可用于任何一種磺胺藥單克隆抗體或多克隆抗體的制備。
3、金標(biāo)物結(jié)合墊的制備①金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，即在沸騰的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鮮配制的1％檸檬酸鈉8ml，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3調(diào)pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存?zhèn)溆?。?∶2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的單克隆抗體或多克隆抗體加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標(biāo)記10min后，加入20％的PEG10000至終濃度為0.05％，4℃、1500～2000rpm離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化的金標(biāo)抗體蛋白，再用丙烯葡聚糖S一400柱層析進(jìn)行分離純化，獲得膠體金標(biāo)記抗體。將1∶100～500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附于精制玻璃纖維棉中，4℃低溫真空干燥，制備金標(biāo)抗體結(jié)合墊。
上述方法可用于任何一種磺胺藥金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備。
②金標(biāo)抗原結(jié)合墊的制備參照金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備方法進(jìn)行，以磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗磺胺藥抗體，將膠體金pH值調(diào)為6.0～7.0即可。
4、羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體的制備以飽和硫酸銨鹽析法提取磺胺藥陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)，用小鼠血清(或兔血清)IgG以50～100μg/kg體重的劑量經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，測(cè)定其血清瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1∶40以上時(shí)，心臟或動(dòng)脈采血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨鹽析法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 5、兔抗載體蛋白IgG抗體的制備用載體蛋白BSA免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200～500μg/次，背部皮下分4～6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌PBS溶解BSA，與等量FCA混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解BSA，與等量FIA混合，充分乳化，首免后2～3周進(jìn)行，連續(xù)免疫3～4次，每次間隔2～3周，末次免疫后10～15天，測(cè)定其血清瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到105以上時(shí)，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取抗BSA抗體，置一20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 同法制備抗OVA抗體、抗HSA抗體、抗KLH抗體。
6、試紙盒檢測(cè)反應(yīng)原理由于膠體金標(biāo)記對(duì)象不同，其檢測(cè)反應(yīng)原理稍有差異。
當(dāng)膠體金標(biāo)記物是抗體時(shí)，加入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)物及金標(biāo)物結(jié)合墊中的金標(biāo)抗體一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散，在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)藥物可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，從而封閉了金標(biāo)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體被反應(yīng)膜上的結(jié)合抗原檢測(cè)線攔截，檢測(cè)線不顯示，而羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可攔截金標(biāo)抗體，顯示一條棕紅色對(duì)照線“|”，為陽(yáng)性表示；否則，樣品溶液中無(wú)待測(cè)藥物時(shí)，不能阻止金標(biāo)抗體被反應(yīng)膜上的結(jié)合抗原檢測(cè)線攔截，顯示棕紅色檢測(cè)線“|”，但羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也攔截金標(biāo)抗體，顯示棕紅色對(duì)照線“|”，為陰性表示；如果反應(yīng)膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
當(dāng)膠體金標(biāo)記物是結(jié)合抗原時(shí)，加入待測(cè)樣品溶液后，樣品溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)藥物及金標(biāo)物結(jié)合墊中的金標(biāo)結(jié)合抗原一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散，樣品中的游離待測(cè)藥物分子量小移動(dòng)速度快，先到達(dá)反應(yīng)膜檢測(cè)線，先與檢測(cè)線上的抗體相結(jié)合，封閉了檢測(cè)線上抗體的結(jié)合位點(diǎn)，阻止金標(biāo)結(jié)合抗原與反應(yīng)膜上的抗體檢測(cè)線結(jié)合，檢測(cè)線不顯示，而抗載體蛋白抗體則可攔截金標(biāo)結(jié)合抗原，顯示一條棕紅色對(duì)照線“|”，為陽(yáng)性表示；否則，樣品溶液中無(wú)待測(cè)藥物時(shí)，金標(biāo)結(jié)合抗原到達(dá)反應(yīng)膜上的檢測(cè)線時(shí)即被相應(yīng)的檢測(cè)線抗體攔截，顯示棕紅色檢測(cè)線“|”，同時(shí)抗載體蛋白抗體也可攔截金標(biāo)結(jié)合抗原，顯示棕紅色對(duì)照線“|”，為陰性表示；如果反應(yīng)膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實(shí)施例一磺胺藥二項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座(11)和面板(10)，底座設(shè)有安裝試紙芯的固定槽(12)，面板設(shè)有加樣孔(8)和顯示窗(9)，顯示窗旁邊設(shè)有T1、T2和C標(biāo)示。試紙芯的構(gòu)造是襯板(1)用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊(2)用玻璃纖維棉制成；金標(biāo)物結(jié)合墊(3)，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標(biāo)記的抗SDM和抗SM2單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應(yīng)膜(4)用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測(cè)線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2相對(duì)應(yīng)，用羊抗小鼠IgG抗體制備隱形對(duì)照線“|”，3條線平行排列組合成“|||”；吸水墊(5)用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM和SM2聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座(11)上的固定槽(12)內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應(yīng)膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對(duì)應(yīng)，反應(yīng)膜上的2條檢測(cè)線和1條對(duì)照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2和C相對(duì)應(yīng)，嵌合面板后制成試紙盒。
檢測(cè)樣品檢測(cè)樣品可為組織樣、血樣、奶樣、蛋樣、尿樣和蜂蜜樣品。
檢測(cè)樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，取樣與乙腈水溶液按1∶3的比例混合，3000rpm離心10min，取上清液分別按1∶0.5～1和1∶1～2的比例加入水和乙酸乙酯混合，3000rpm離心5min，取上層液用氮?dú)獯蹈?，用PBS溶解干燥物，1∶1加入異辛烷混勻，3000rpm離心5min，棄上層液，取下層液作為待測(cè)樣品。
②血樣、奶樣和尿樣檢測(cè)血樣，提取血清并用生理鹽水將其稀釋制成1∶1～10待測(cè)樣品；檢測(cè)奶樣，直接用生理鹽水將奶樣稀釋制成1∶2～10待測(cè)樣品懸液；檢測(cè)尿樣，直接取尿液作為待測(cè)樣品。
③蜂蜜樣取蜂蜜加入1～2倍生理鹽水溶解稀釋后，再按1∶1～5的比例加入乙酸乙酯，震蕩10min，3000rpm離心10min，取上層液氮?dú)獯蹈桑稍镂镉蒙睇}水復(fù)溶作為待測(cè)樣品。
操作方法檢測(cè)時(shí)，將試紙盒平放，從加樣孔滴加待測(cè)樣品液，5～10分鐘從顯示窗判定檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果判定如只有C位置顯示一條棕紅色線“|”時(shí)，表示SDM和SM2檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含這2種待測(cè)藥物；如在T1和C位置顯示2條棕紅色線“||”時(shí)，表示SM2檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，SDM檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含SM2而不含SDM；如在T2和C位置顯示2條棕紅色線“||”時(shí)，表示SDM檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，SM2檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含SDM而不含SM2；如在T1、T2和C位置顯示3條棕紅色線“|||”時(shí)，表示SDM和SM2檢測(cè)結(jié)果均為陰性；如在反應(yīng)膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實(shí)施例二磺胺藥二項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于用抗SDM和抗SM2的多克隆抗體替代抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例一，不再重述。
實(shí)施例三磺胺藥二項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于用SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例一，不再重述。
實(shí)施例四磺胺藥三項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座和面板，底座設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板設(shè)有加樣孔和顯示窗，顯示窗旁邊設(shè)有T1、T2、T3和C標(biāo)示。試紙芯的構(gòu)造是襯板用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊用玻璃纖維棉制成；金標(biāo)物結(jié)合墊，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標(biāo)記的抗SDM、抗SM2和抗SD單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應(yīng)膜用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白、SM2-載體蛋白和SD-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測(cè)線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2、T3相對(duì)應(yīng)，用兔抗小鼠IgG抗體制備隱形對(duì)照線“|”，4條線平行排列組合成“||||”；吸水墊用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM、SM2和SD聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座的固定槽內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應(yīng)膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對(duì)應(yīng)，反應(yīng)膜上的3條檢測(cè)線和1條對(duì)照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2、T3和C相對(duì)應(yīng)，嵌合面板后制成試紙盒。
其它包括檢測(cè)樣品制備和操作方法均同實(shí)施例一，不再重述。
結(jié)果判定如只有C位置顯示1條棕紅色線“|”時(shí)，表示SDM、SM2和SD檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含這3種待測(cè)藥物；如顯示1條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||”時(shí)，表示2種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外1種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含2種藥物而不含另外1種藥物；如顯示2條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||”時(shí)，表示1種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外2種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含12種藥物而不含另外2種藥物；如顯示3條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||”時(shí)，表示3種藥物檢測(cè)結(jié)果均為陰性；如在反應(yīng)膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實(shí)施例五磺胺藥三項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例四基本相同，不同之處在于用抗SD、抗SDM和抗SM2的多克隆抗體替代抗SD、抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例四，不再重述。
實(shí)施例六磺胺藥三項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例四基本相同，不同之處在于用SD-載體蛋白、SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SD、抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例四，不再重述。
實(shí)施例七磺胺藥五項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座和面板，底座設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板設(shè)有加樣孔和顯示窗，顯示窗旁邊設(shè)有T1、T2、T3、T4、T5和C標(biāo)示。試紙芯的構(gòu)造是襯板用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊用玻璃纖維棉制成；金標(biāo)物結(jié)合墊，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標(biāo)記的抗SDM、抗SM2、抗SD、抗SM1和抗SMD單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應(yīng)膜用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白、SM2-載體蛋白、SD-載體蛋白、SM1-載體蛋白和SMD-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測(cè)線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2、T3、T4、T5相對(duì)應(yīng)，用羊抗兔IgG抗體制備隱形對(duì)照線“|”，6條線平行排列組合成“||||||”；吸水墊用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM、SM2、SD、SM1和SMD聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座的固定槽內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應(yīng)膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對(duì)應(yīng)，反應(yīng)膜上的5條檢測(cè)線和1條對(duì)照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2、T3、T4、T5和C相對(duì)應(yīng)，嵌合面板后制成試紙盒。
其它包括檢測(cè)樣品制備和操作方法均同實(shí)施例一，不再重述。
結(jié)果判定如只有C位置顯示1條棕紅色線“|”時(shí)，表示SDM、SM2、SD、SM1和SMD檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含這5種待測(cè)藥物；如顯示1條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||”時(shí)，表示4種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外1種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含4種藥物而不含另外1種藥物；如顯示2條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||”時(shí)，表示3種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外2種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含3種藥物而不含另外2種藥物；如顯示3條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||”時(shí)，表示2種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外3種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含2種藥物而不含另外3種藥物；如顯示4條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||||”時(shí)，表示1種藥物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，另外4種藥物檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含1種藥物而不含另外4種藥物；如顯示5條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||||”時(shí)，表示5種藥物檢測(cè)結(jié)果均為陰性；如在反應(yīng)膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實(shí)施例八磺胺藥五項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例七基本相同，不同之處在于用抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的多克隆抗體替代抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例七，不再重述。
實(shí)施例九磺胺藥五項(xiàng)聯(lián)檢金標(biāo)層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實(shí)施例七基本相同，不同之處在于用SDM-載體蛋白、SM1-載體蛋白、SM2-載體蛋白、SD-載體蛋白和SMD-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的單克隆抗體，制備金標(biāo)結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應(yīng)膜上制備隱形對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例七，不再重述。
權(quán)利要求
1.一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成，反應(yīng)膜用印制有隱形檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應(yīng)膜上的檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，反應(yīng)膜上的對(duì)照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或?yàn)檠蚩雇肐gG、或?yàn)橥每馆d體蛋白IgG抗體印制，對(duì)照線和檢測(cè)線平行排列組合為“|||”，或?yàn)椤皘|||”，或?yàn)椤皘||||”，或?yàn)椤皘|||||”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙盒，其特征是所述的金標(biāo)抗體和相應(yīng)的結(jié)合抗原形成下述的任意2～5種組合，金標(biāo)抗磺胺甲基嘧啶SM1抗體，檢測(cè)線為SM1-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺二甲基嘧啶SM2抗體，檢測(cè)線為SM2-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺對(duì)甲氧嘧啶SMD抗體，檢測(cè)線為SMD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺嘧啶SD抗體，檢測(cè)線為SD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺二甲氧嘧啶SDM抗體，檢測(cè)線為SDM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺間甲氧嘧啶SMM抗體，檢測(cè)線為SMM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺甲噁唑SMZ抗體，檢測(cè)線為SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺異噁唑SIZ抗體，檢測(cè)線為SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺甲氧吡嗪SMP抗體，檢測(cè)線為SMP-載體蛋白結(jié)合抗原；金標(biāo)抗磺胺喹噁啉SQ抗體，檢測(cè)線為SQ-載體蛋白結(jié)合抗原。
3.一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設(shè)有安裝試紙芯的固定槽，面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成，反應(yīng)膜用印制有隱形檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種金標(biāo)磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應(yīng)膜檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應(yīng)膜上的對(duì)照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或?yàn)檠蚩雇肐gG、或?yàn)橥每馆d體蛋白IgG抗體印制，對(duì)照線和檢測(cè)線平行排列組合為“|||”，或?yàn)椤皘|||”，或?yàn)椤皘||||”，或?yàn)椤皘|||||”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試紙盒，其特征是所述的金標(biāo)磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原和相應(yīng)的磺胺藥抗體為下述的任意2～5種組合，金標(biāo)SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SM1抗體；金標(biāo)SM2-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SM2抗體；金標(biāo)SMD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMD抗體；金標(biāo)SD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SD抗體；金標(biāo)SDM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SDM抗體；金標(biāo)SMM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMM抗體；金標(biāo)SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMZ抗體；金標(biāo)SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SIZ抗體；金標(biāo)SMP-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SMP抗體；金標(biāo)SQ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測(cè)線為抗SQ抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試紙盒，其特征為襯板用硬質(zhì)塑膠條，樣品墊為玻璃纖維棉；吸水墊為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試紙盒，其特征是所述的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA，或人血清白蛋白HSA，或血藍(lán)蛋白KLH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試紙盒，其特征是所述的顯示窗旁邊分別印有字母T1、T2…Tn和C，T表示檢測(cè)線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對(duì)照線，在遠(yuǎn)離加樣孔側(cè)，其中n為1、2、3、4、5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種磺胺藥多殘留分析的金標(biāo)層析檢測(cè)試紙盒。該試紙盒由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗，反應(yīng)膜用印制有隱形檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜，金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，反應(yīng)膜上的檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的磺胺藥－載體蛋白結(jié)合抗原，或者金標(biāo)物結(jié)合墊用吸附2～5種金標(biāo)磺胺藥－載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應(yīng)膜檢測(cè)線為2～5條相應(yīng)的抗某種磺胺藥的抗體，反應(yīng)膜上的對(duì)照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或?yàn)檠蚩雇肐gG、或?yàn)橥每馆d體蛋白IgG抗體印制。本發(fā)明的試紙盒一次加樣同時(shí)檢測(cè)多種磺胺藥物，大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便，直觀，準(zhǔn)確，適用范圍廣，成本低，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1888905SQ200610017998
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者鄧瑞廣, 張改平, 李學(xué)伍, 肖治軍, 刑廣旭, 楊繼飛, 柴書(shū)軍, 李青梅, 盧曉翠 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所