專利名稱：對白細胞進行分類的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞分類所用的試劑及分類方法，特別是涉及一種對血液中的白細胞進行四分類時所用的試劑及分類方法。
背景技術(shù)：
在臨床檢查領(lǐng)域中，用患者的全血對白細胞進行分類計數(shù)工作，在診斷各種疾病時是極其常見并且非常重要的。
迄今為止，用于白細胞分類的裝置及方法的專利發(fā)表了許多。其中，中國專利CN95115317.X公開了一種通過兩種試劑完成白細胞的五分類的方法。該兩種試劑除都含有非離子表面活性劑和緩沖劑外，第一試劑至少含一種離子表面活性劑和一種帶陰離子的有機化合物，將血細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞以及嗜堿細胞加中性粒細胞四類，第二試劑至少含一種離子表面活性劑，將血細胞分成嗜堿細胞和其他細胞類群。該方法通過綜合兩種結(jié)果將白細胞五分類。檢測系統(tǒng)為激光散射法。
美國專利5,618,733是一篇白細胞五分類試劑專利，通過兩種試劑完成白細胞的五分類，這兩種試劑除都含有非離子表面活性劑和緩沖劑外，第一試劑至少含一種帶陰離子的有機化合物，將血細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞和嗜堿細胞加中性粒細胞四類，第二試劑至少含一種離子表面活性劑，可以是陽離子或兩性表面活性劑中一種，將血細胞分成嗜堿細胞和其他細胞類群，綜合兩種結(jié)果將白細胞五分類。
美國專利5,389,549是一篇白細胞五分類和計數(shù)試劑專利，通過兩種試劑，第一試劑為稀釋血樣的高滲溶液，第二試劑為含陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的溶液，檢測系統(tǒng)是射頻和直流法。
美國專利5,538,893是一篇白細胞五分類試劑專利，試劑至少含一種陽離子表面活性劑和一種非離子表面活性劑，檢測系統(tǒng)是光散射和電阻法。
申請?zhí)枮?8101677、審定號為CN1018586B的中國專利是通過一種pH 2-4的酸性溶解劑對紅細胞快速溶解和白細胞保持完整后加入抑制劑對白細胞進行分類的方法，其檢測系統(tǒng)可以使用光散射也可以使用射頻/直流法。
美國專利5,155,044是一篇白細胞五分類試劑系統(tǒng)專利，由溶血劑和稀釋液組成，溶血劑由兩種試劑組成，第一試劑含各種酸及皂苷，可以溶解紅細胞，同時白細胞不變；第二試劑為堿性抑制劑，反應(yīng)終點PH為6-7.5。
美國專利5,731,206是一篇白細胞五分類方法和試劑系統(tǒng)專利，溶血劑由兩種試劑組成，第一試劑含羧酸和磺酸的衍生物及皂苷，PH為2.6-4.0，第二試劑為堿性抑制劑。反應(yīng)終點PH為6-7.5。
美國專利5,817,518是一篇白細胞五分類方法和試劑系統(tǒng)專利，溶血劑由兩種試劑組成，第一試劑含烷基磺酸的堿金屬鹽類、有機酸、無機酸或其混合物及非離子表面活性劑。PH1.4-3.6。第二試劑含聚氧乙烯或聚氧丙烯的共聚物類表面活性劑、十二烷基磺酸鈉的高滲堿性溶液。檢測方法為直流阻抗和射頻法。
美國專利5,510,267是一篇白細胞五分類方法和試劑專利，溶血劑含2-苯氧基乙醇、非離子表面活性劑及緩沖液。檢測系統(tǒng)為四角度激光散射法。
以上現(xiàn)有技術(shù)中的分類試劑及方法中，大部分對pH值有特定的要求，而且pH值適用范圍都只包含一較窄的范圍。而在中國專利CN95115317.X、美國專利5,618,733、美國專利5,389,549、美國專利5,538,893中，分類試劑都必須包含非離子表面活性劑，材料的選用范圍較窄，同時pH值也有一定的限制，比如，中國專利CN95115317.X中pH值要求在5-11之間。這些都限制了上述技術(shù)的應(yīng)用范圍。
另外，申請?zhí)?8101677、審定號為CN1018586B的中國專利中提到的分類技術(shù)，其最適反應(yīng)條件為常溫，但隨著環(huán)境溫度發(fā)生變化，很難保證處于25度恒溫狀態(tài)，所以測量結(jié)果隨著溫度變化會產(chǎn)生波動，降低了結(jié)果的準確性。在此方法基礎(chǔ)上，如果為了消除溫度對反應(yīng)的影響，需要增加恒溫裝置，但為了控制在25度則不僅需要加熱裝置，同時需要配備制冷裝置，這樣大大提高了儀器成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能在酸性到弱堿性的pH范圍及較寬溫度范圍內(nèi)應(yīng)用，且主要成分具有較寬選擇范圍的白細胞分類用的試劑及方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種用于對白細胞進行分類的試劑，所述分類是將白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應(yīng)的3個集團，以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共計4個集團，所述試劑包括a.能夠溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑是指選自非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑及兩性表面活性劑中的一種或幾種的組合，但不包括陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合，b.能夠與白細胞內(nèi)陽離子結(jié)合，使白細胞之間產(chǎn)生形態(tài)差異的至少一種帶陰離子基團的有機化合物，c.能夠?qū)H值調(diào)整在2～8范圍內(nèi)的緩沖劑；并且當(dāng)所述至少一種表面活性劑為陽離子表面活性劑與非離子表面活性劑的組合，或者為陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的組合時，所述緩沖劑的pH范圍為2～4.5。
優(yōu)選的，所述試劑進一步包括作為助溶劑的醇類。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述非離子表面活性劑為具有式I所示結(jié)構(gòu)的非離子表面活性劑，R1-R2-(CH2CH2O)n-HI其中，R1為C原子數(shù)8到23的烷基或鏈烯基，R2為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)。
所述陽離子表面活性劑為具有式II所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽型陽離子表面活性劑， 其中R3為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R4及R5為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基；R6為C原子數(shù)為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。
所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉，或者是具有式III所示結(jié)構(gòu)的陰離子表面活性劑，R7-R8-(CH2CH2O)n-Y III其中，R7為C原子數(shù)8到22的烷基、鏈烯基或炔基，R8為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)，Y為-SO3Na，-COONa，-OSO3Na，或-ONa。
所述兩性表面活性劑為具有式IV所示結(jié)構(gòu)的兩性表面活性劑， 其中，R9為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R10及R11為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基。
所述帶陰離子基團的有機化合物為酸性有機色素。
本發(fā)明還公開了一種對白細胞進行分類的方法，所述方法包括步驟，將上述的試劑加入到全血樣本中，使白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應(yīng)的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共計4個集團，然后通過測定細胞大小和形態(tài)信息對所分成的四個集團進行分類計數(shù)。
所述分類過程中的反應(yīng)溫度為10～40℃，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為35℃。
所述測定細胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，測定角度為2-6度；所述測定細胞形態(tài)信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，測定角度為8-20度。
由于采用了以上的方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于利用本發(fā)明的試劑和方法進行白細胞的四分類，相比較現(xiàn)有技術(shù)，能夠在酸性到弱堿性的pH條件下進行，而且該pH值范圍不會對結(jié)果造成不良影響，從而擴充了本發(fā)明的試劑及方法的使用條件。另外，本發(fā)明的試劑中所用的主要成份表面活性劑，具有非常寬的選擇范圍，陽離子、陰離子、非離子、兩性的表面活性劑以及它們的組合(除了陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合)都可用于本發(fā)明，并且選用以上各種表面活性劑，都能實現(xiàn)白細胞的四分類，并保證結(jié)果的準確性。此外，利用本發(fā)明的試劑及方法進行白細胞分類時，反應(yīng)溫度也具有較大的選擇范圍，反應(yīng)溫度只要固定在10～40℃范圍的任一溫度，就都能保證分類結(jié)果的穩(wěn)定；而反應(yīng)能夠在高于室溫但不超過40℃范圍的溫度下進行，能夠保證在實際應(yīng)用中，只需加熱裝置就可以提供恒溫，而不需要制冷裝置，從而大大節(jié)約了儀器成本。
以上各方面優(yōu)點使得本發(fā)明的應(yīng)用范圍得到極大的拓寬，在原料的選擇及反應(yīng)條件的適用方面，與現(xiàn)有技術(shù)相比有了很大的進步。


圖1是利用本發(fā)明實施例1的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖2是利用本發(fā)明實施例2的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖3是利用本發(fā)明實施例3的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖4是利用本發(fā)明實施例4的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖5是利用本發(fā)明實施例5的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖6是利用本發(fā)明實施例6的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖7是利用本發(fā)明實施例7的試劑進行白細胞四分類計數(shù)時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的試劑與方法可用于對全血中的白細胞進行四分類。將本發(fā)明的試劑加入全血中后，試劑中的成分能夠迅速溶解紅細胞，并使不同類型的白細胞發(fā)生形態(tài)與大小方面的差異，分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞相對應(yīng)的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共4個集團。再使用激光散射法，采用低角度散射光測定細胞的大小信息以及采用高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息，并通過對散射光進行檢測，從而對四個集團的白細胞分別進行分類計數(shù)。
本發(fā)明試劑的主要成分包括能夠溶解紅細胞、且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少一種表面活性劑，能夠與白細胞內(nèi)陽離子結(jié)合、使白細胞之間產(chǎn)生形態(tài)差異的至少一種帶陰離子基團的有機化合物以及能夠?qū)H值調(diào)整在2～8范圍內(nèi)的緩沖劑。
本發(fā)明所用的表面活性劑，具有很寬的選擇范圍，可以選用非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑以及兩性表面活性劑中的一種，也可選用它們的任意組合，但陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合除外(陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑組合時可能會產(chǎn)生沉淀，因此不能用于本發(fā)明)。
利用本發(fā)明的試劑進行白細胞的分類時，pH值范圍對分類結(jié)果沒有絕對的影響，一般在2-8范圍內(nèi)都可以滿足要求，但對于陰離子或陽離子表面活性劑與非離子表面活性劑的組合，pH值范圍應(yīng)當(dāng)限定在2-4.5范圍內(nèi)。緩沖劑的選擇沒有特定的要求，常用的緩沖系統(tǒng)如甲酸、鄰苯二甲酸、乙酸、磷酸、TRIS等，都可以用于本發(fā)明。緩沖劑的使用量通常在10-500mM。
其中，對于非離子表面活性劑，本發(fā)明優(yōu)選具有如式I所示結(jié)構(gòu)的非離子表面活性劑R1-R2-(CH2CH2O)n-HI其中，R1為C原子數(shù)8到23的烷基或鏈烯基，R2為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)。作為R1的原子數(shù)8-23的烷基或鏈烯基，可以是辛基、癸基、月桂基、十四烷基、鯨蠟基、硬脂酰等，特別優(yōu)選月桂基、十四烷基、鯨蠟基等的直鏈烷基。
上述非離子表面活性劑，其用量應(yīng)足以溶解紅細胞，并造成白細胞的細胞膜部分損傷。具體用量為非離子表面活性劑在本發(fā)明試劑中的重量體積百分含量(W/V)為0.1-1％，優(yōu)選0.1-0.7％，最優(yōu)選0.2-0.5％，也可以根據(jù)使用種類作適當(dāng)調(diào)整。
對于陽離子表面活性劑，本發(fā)明優(yōu)選具有如式II所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽型陽離子表面活性劑， 其中R3為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R4及R5為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基；R6為C原子數(shù)為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。作為R3的原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特別優(yōu)選辛基、癸基、月桂基等的直鏈烷基。作為R4及R5的C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基，可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特別優(yōu)選甲基、乙基、丙基。
對于陰離子表面活性劑，本發(fā)明優(yōu)選十二烷基磺酸鈉(SDS)以及具有如式III所示結(jié)構(gòu)的陰離子表面活性劑，R7-R8-(CH2CH2O)n-YIII其中，R7為C原子數(shù)8到22的烷基、鏈烯基或炔基，R8為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)，Y為-SO3Na，-COONa，-OSO3Na或-ONa。作為R7的C原子數(shù)8-22的烷基、鏈烯基或炔基，可以是辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特別優(yōu)選癸基、月桂基等的直鏈烷基。
對于兩性表面活性劑，本發(fā)明優(yōu)選具有如式IV所示結(jié)構(gòu)的兩性表面活性劑， 其中，R9為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R10及R11為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基。作為R9的原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特別優(yōu)選辛基、癸基、月桂基等的直鏈烷基.作為R10及R11的C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基，可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特別優(yōu)選甲基、乙基、丙基。
可用于本發(fā)明的上述離子表面活性劑，其用量應(yīng)足以溶解紅細胞，并造成白細胞的細胞膜部分損傷。在本發(fā)明試劑系統(tǒng)中的用量通常為50-6000mg/L，優(yōu)選200-5000mg/L，最優(yōu)選500-4000mg/L。具體用量也可以根據(jù)使用的表面活性劑的種類作適當(dāng)調(diào)整。
表1列舉了能夠用于本發(fā)明的一些表面活性劑的種類及其最適用量。這些表面活性劑可以只使用其中的一種，也可以一種以上任意組合使用(陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合除外)。
表1表面活性劑的最適用量

無論使用哪一種表面活性劑，其對白細胞的溶解力，只要能使白細胞膜開孔到胞質(zhì)可以部分溢出，與陽離子結(jié)合的有機化合物能夠進入的程度即可，最好使用遠遠少于使細胞完全裸核時的用量。表面活性劑的溶血效果和所帶側(cè)鏈(非離子表面活性劑中的R1、陽離子表面活性劑中的R3、陰離子表面活性劑中的R7以及兩性表面活性劑中的R9)的鏈長是成正比的，側(cè)鏈的C原子數(shù)越多，溶血能力越強，所需要的濃度就越低。
本發(fā)明的主要成分除表面活性劑外，還包括一種有機化合物，該有機化合物可以和細胞內(nèi)陽離子結(jié)合導(dǎo)致細胞類群間形態(tài)差異。這種有機化合物，帶有疏水基團(如由芳香族組成的基團、由C原子數(shù)6個以上的烴基形成的基團以及C原子數(shù)大于6的雜環(huán)等)及陰離子基團(如羧基、磺酸基等)，在水中帶負電荷，能與白細胞結(jié)合使白細胞形態(tài)發(fā)生改變。幾乎所有酸性有機色素如酸性藍系列、直接藍、酸性綠、酸性黃、酸性橙、甲基紅、甲基橙、苯胺藍、茜素黃等都可以滿足要求。使用量通常為50-1000mg/L，優(yōu)選100-500mg/L。
此外，本發(fā)明中還可以含有一定量的醇類作為助溶劑。醇類作為助溶劑對種類沒有特別要求，甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、2-苯氧乙醇等均可用于本發(fā)明。作為助溶劑的醇類，其用量占本發(fā)明的試劑的體積百分比濃度通常為0.1-10％左右。
在本發(fā)明的試劑系統(tǒng)中，還可以加入一定量的NaCl以調(diào)整溶液的滲透壓至合適范圍。
本發(fā)明的試劑系統(tǒng)可以配制為一種試劑，也可以配制為兩種試劑組合使用。作為兩種試劑組合使用時，兩種試劑的pH值可以相同，也可以不同。當(dāng)使用兩種試劑組合使用時，可以通過在第二試劑中加入帶有疏水基團及陰離子基團的有機色素將嗜酸粒細胞從其他粒細胞中分離出來。
利用本發(fā)明的方法對白細胞進行分類的具體過程包括，將本發(fā)明的上述試劑加入全血中混合一定時間后，檢測細胞的形態(tài)和大小信息，根據(jù)細胞形態(tài)與大小的不同將細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞相對應(yīng)的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共4個集團，檢測系統(tǒng)同時對四類細胞進行分類計數(shù)。
血樣與本發(fā)明試劑的混合比例沒有特別的限制，但通常按照血樣與本發(fā)明試劑的體積比為1∶10～100的比例混合。通常在兩者混合12～30秒后就可以進行檢測。
利用本發(fā)明的試劑及方法進行白細胞分類時，在10～40℃溫度范圍內(nèi)均可以進行。對每一個具體的反應(yīng)，只要將反應(yīng)溫度固定在10～40℃范圍的任一溫度下，就都能夠保證分類結(jié)果的穩(wěn)定。本發(fā)明優(yōu)選的溫度為35℃。選用該溫度的原因是由于該溫度高于室溫，因此在實際應(yīng)用中只需加熱裝置就可以實現(xiàn)恒溫，而不必增加制冷裝置，大大節(jié)約了儀器成本。
本發(fā)明檢測細胞的形態(tài)和大小信息的方法優(yōu)選使用激光檢測法。該方法可以利用公知的裝置，采用測定角度為2-6度的低角度散射光來測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。該裝置可以選用如中國專利95115317.X中所描述的裝置，也可以選用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他裝置。而散射光的檢測可以通過常用的光電二極管傳感器完成。
下面列舉具體的實施例實施例1一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成鄰苯二甲酸 1gNaCl 0.2g2-苯氧乙醇 10gBrij 35 3.4g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 2.5按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到2.5，滲透壓100mOsm。
在溫度保持25度的條件下，在30μl血中加入0.5ml上述試劑。混合12秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖1所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例2一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.2g甲醇 2gSDS 1.5g磷酸二氫鈉 3.08g磷酸氫二鈉 4.87g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 6.5
按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到6.5，滲透壓100mOsm。
在溫度保持35度的條件下，在30μl血中加入1ml上述試劑?；旌?0秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖2所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例3一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.3g甲醇 3g十二烷基甘氨酸 1.2g三羥甲基氨基甲烷 3.05gHCl 0.82g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 7.2按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到7.2，滲透壓140mOsm。
在溫度保持35度的條件下，在30μl血中加入1.5ml上述試劑?；旌?0秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖3所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例4一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.3g2-苯氧乙醇 10g癸基三甲基溴化銨 6.1g
乙酸 1.95g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 4.8按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到4.8，滲透壓140mOsm。
在溫度保持25度的條件下，在30μl血中加入2ml上述試劑?；旌?0秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖4所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例5一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.2g甲醇 2gBrij 35 1.4gSDS 1.2g甲酸 1.3g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 3.8按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到3.8，滲透壓100mOsm。
在溫度保持35度的條件下，在30μl血中加入2ml上述試劑?；旌?5秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖4所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例6
一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.2g甲醇 2g十二烷基甘氨酸 1.2gSDS 0.75g磷酸二氫鈉 3.08g磷酸氫二鈉 4.87g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 7.5按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到7.5，滲透壓100mOsm。在溫度保持25度的條件下，在30μl血中加入1ml上述試劑。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖4所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實施例7一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成鄰苯二甲酸 1gNaCl 0.2g2-苯氧乙醇 10g癸基三甲基溴化銨 5.4g十二烷基甘氨酸 1.2g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 2.8按上述配方配制的試劑將PH調(diào)整到2.8，滲透壓130mOsm。在溫度保持35度的條件下，在30μl血中加入1.2ml上述試劑?；旌?4秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結(jié)果如圖4所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
權(quán)利要求
1.一種用于對白細胞進行分類的試劑，所述分類是將白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應(yīng)的3個集團，以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共計4個集團，其特征在于，所述試劑包括a.能夠溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑是指選自非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑及兩性表面活性劑中的一種或幾種的組合，但不包括陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑的組合，b.能夠與白細胞內(nèi)陽離子結(jié)合，使白細胞之間產(chǎn)生形態(tài)差異的至少一種帶陰離子基團的有機化合物，c.能夠?qū)H值調(diào)整在2～8范圍內(nèi)的緩沖劑；并且當(dāng)所述至少一種表面活性劑為陽離子表面活性劑與非離子表面活性劑的組合，或者為陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的組合時，所述緩沖劑的pH范圍為2～4.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑進一步包括作為助溶劑的醇類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述非離子表面活性劑為具有式I所示結(jié)構(gòu)的非離子表面活性劑，R1-R2-(CH2CH2O)n-H I其中，R1為C原子數(shù)8到23的烷基或鏈烯基，R2為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述陽離子表面活性劑為具有式II所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽型陽離子表面活性劑， 其中R3為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R4及R5為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基；R6為C原子數(shù)為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉，或者是具有式III所示結(jié)構(gòu)的陰離子表面活性劑，R7-R8-(CH2CH2O)n-Y III其中，R7為C原子數(shù)8到22的烷基、鏈烯基或炔基，R8為-O-或-COO-，n為8-30的整數(shù)，Y為-SO3Na，-COONa，-OSO3Na，或-ONa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述兩性表面活性劑為具有式IV所示結(jié)構(gòu)的兩性表面活性劑， 其中，R9為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基；R10及R11為原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述帶陰離子基團的有機化合物為酸性有機色素。
8.一種采用權(quán)利要求1～7中任意一項所述的試劑對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述方法包括步驟，將所述的試劑加入到全血樣本中，使白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應(yīng)的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應(yīng)的1個集團共計4個集團，然后通過測定細胞大小和形態(tài)信息對所分成的四個集團進行分類計數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述分類過程中的反應(yīng)溫度為10～40℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述分類過程中的反應(yīng)溫度為35℃。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述測定細胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，測定角度為2-6度；所述測定細胞形態(tài)信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，測定角度為8-20度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于對白細胞進行四分類的試劑，所述試劑包括a.能夠溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少一種表面活性劑；b.能夠與白細胞內(nèi)陽離子結(jié)合，使白細胞之間產(chǎn)生形態(tài)差異的至少一種帶陰離子基團的有機化合物；c.能夠?qū)H值調(diào)整在2～8范圍內(nèi)的緩沖劑。本發(fā)明還公開了用上述試劑進行細胞四分類的方法。利用本發(fā)明的試劑和方法進行白細胞的四分類時，反應(yīng)可以在酸性到弱堿性pH條件下進行，溫度以及主要成分表面活性劑的種類都具有很寬的選擇范圍，從而使本發(fā)明的應(yīng)用范圍得到極大的拓寬，與現(xiàn)有技術(shù)相比有了很大的進步。
文檔編號G01N33/49GK101078721SQ20061002103
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月23日
發(fā)明者許文娟, 張利娜, 劉兵 申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司