專利名稱：一種檢測胃炎相關(guān)標(biāo)志物的芯片及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于檢測胃炎相關(guān)的標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片及相應(yīng)的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
慢性胃炎是常見病和多發(fā)病，一般有兩個類型炎癥病變比較表淺，局限在胃粘膜表面一層(不超過三分之一)者，稱作慢性淺表性胃炎；而炎癥病變波及胃粘膜的全層，并伴有胃腺體萎縮者，則為慢性萎縮性胃炎。胃鏡普查證實，我國人群中慢性胃炎的發(fā)病率高達60％以上，萎縮性胃炎約占其中的20％。萎縮性胃炎常由慢性淺表性胃炎發(fā)展而來，是一種慢性進行性病變。萎縮性胃炎如果不經(jīng)診斷和治療，會引起癡呆、神經(jīng)性疾病、心臟疾病等，增加胃癌和胃潰瘍的發(fā)病幾率。國內(nèi)資料報道，萎縮性胃炎的胃癌發(fā)生率為2％-7％左右。
早期對萎縮性胃炎確診的手段是胃鏡檢查及病理確診。通過胃鏡及病理檢查，可以明確萎縮性胃炎的程度和是否處于胃癌前病變。目前也有通過傳統(tǒng)ELISA方法分析胃泌素17(Gastrin-17)、胃蛋白酶原I(Pepsinogen I)和胃蛋白酶原II(Pepsinogen II)這三種血清標(biāo)志物診斷萎縮性胃炎的方法，檢測結(jié)果有助于診斷病人是否是胃炎、萎縮性胃炎以及胃炎發(fā)生的部位(胃竇、胃體)。這種血清學(xué)的檢測是一種可替代胃鏡檢查及病理診斷的用于對胃痛和消化不良的病人進行初始診斷的非侵入性的方法。然而由于目前對這三個因子的檢測是由3個ELISA試劑盒完成的，而且三種ELISA試劑盒對樣品收集和處理的要求(是否禁食或因血清中Gastrin-17含量太低而給以高蛋白劑刺激)、測試樣品的預(yù)處理(56℃水浴或否)、樣品稀釋程度(從稀釋2倍到200倍)、ELISA反應(yīng)時間(從2個小時到4.5小時)等等均不相同，并且在檢測時背景干擾十分嚴重，給臨床診斷帶來不便。
綜上，目前國內(nèi)外尚無快速、靈敏的能解決上述問題以及能同時檢測多個與胃病相關(guān)的標(biāo)志物的檢測用品。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)快速、靈敏的能同時檢測多個與胃病相關(guān)的標(biāo)志物的產(chǎn)品，以便于臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本產(chǎn)品的目的就是提供一種可快速靈敏地同時檢測多個胃炎標(biāo)志物的液相蛋白質(zhì)芯片。
本發(fā)明的另一目的就是提供含有所述液相蛋白質(zhì)芯片的試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種蛋白質(zhì)芯片，所述的蛋白質(zhì)芯片包括2種以上(如2-100種)不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗體，其中，所述的第一抗體為抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體，并且所述的第一抗體選自下組抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、或抗胃泌素-17抗體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述芯片中，抗胃蛋白酶原I抗體∶抗胃蛋白酶原II抗體∶抗胃泌素-17抗體的摩爾比為(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，當(dāng)存在所述抗體時。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的不同的微球是具有不同微球識別信號的微球。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的微球識別信號為熒光信號。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述芯片中，每一種微球的數(shù)量為103-107個；較佳的為103-106個，更佳的103-105個。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的微球的平均直徑為1-100微米。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述芯片含有三種不同的微球，并且在三種微球上分別固定有抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、和抗胃泌素-17抗體，其中，每種微球的數(shù)量為103-107個，并且各第一抗體的數(shù)量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原I抗體，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原II抗體，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的第一抗體還包括抗CEA抗體、抗CA19-9抗體、抗CA242抗體、抗CA724抗體、或抗CA50抗體。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種多胃炎標(biāo)志物并行檢測的方法，所述方法包括以下步驟(a)將待測樣品與權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片混合，從而使待測樣品中的胃炎標(biāo)志物與第一抗體及微球形成“胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物；(b)將步驟(a)形成的三元復(fù)合物與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有不同種的帶有可檢測信號的第二抗體，每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于蛋白質(zhì)芯片中相應(yīng)的第一抗體，而且對應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于該胃炎標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2，從而形成“第二抗體-胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；(c)檢測四元復(fù)合物中不同微球的微球識別信號，從而確定待檢測樣品中各胃炎標(biāo)志物的存在與否以及存在的量；附加條件是待測樣品與蛋白質(zhì)芯片和第二抗體溶液的混合，可依次進行，也可同時進行。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的可檢測信號為藻紅蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，還包括步驟(d)將測定的可檢測信號與對照或標(biāo)準曲線進行比較，從而確定待檢測樣品中各胃炎標(biāo)志物的存在與否，和/或數(shù)量。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用于檢測多胃炎標(biāo)志物的試劑盒，它包括以下組分(1)第一容器，以及裝于該容器中的第一抗體溶液，所述的第一抗體溶液中含有權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括(2)第二容器，以及裝于該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有不同種的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于該胃炎標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括(3)標(biāo)準品、或?qū)φ掌贰?br> 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括(1’)容器a，以及裝于所述容器中的權(quán)利要求1所述的液相蛋白質(zhì)芯片；(2’)容器b，以及裝于所述容器中的帶有可檢測信號的不同種第二抗體，每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于液相蛋白質(zhì)芯片中相應(yīng)的第一抗體；(3’)容器c，以及裝于容器內(nèi)的雜交液(如10.1mM Na2HPO4，138mM NaCl，1.76mM KH2PO4，2.7mM KCl，0.05％(V/V)Tween-20，pH7.4)；(4’)容器d，以及裝于容器內(nèi)的雜交后洗液(如10.1mM Na2HPO4，138mMNaCl，1.76mM KH2PO4，2.7mM KCl，0.02％(m/V)Timerosal，1％(m/V)BSA，pH7.4)；(5’)容器e，以及裝于容器內(nèi)的對應(yīng)于可檢測信號的檢測物質(zhì)(如熒光染料)；(6’)陰性對照和陽性對照。
在本發(fā)明的第四方面，提供所述的蛋白質(zhì)芯片的用途，用于制備診斷或輔助診斷胃炎的試劑盒；或用于制備體外檢測樣品中是否存在胃炎標(biāo)志物的試劑盒。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的檢測是定量檢測。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了固定有第一抗體的微球的示意圖，其中，25為第一微球，45為與微球25連接并固定的第一種第一抗體分子，27為第二微球，47為與微球27連接并固定的第二種第一抗體分子，第一微球25與第二微球27自身具有可區(qū)別的不同熒光信號。
圖2顯示了采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片進行檢測的示意圖。其中，1代表帶有第一抗體的微球，2代表胃炎標(biāo)志物，3代表第二抗體，4代表可檢測信號。
圖3是G-17的標(biāo)準曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，將針對多種抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體分別固定在不同微球(Beads)上，制得蛋白質(zhì)芯片，并且本發(fā)明人根據(jù)各種胃炎標(biāo)志物在血清中的濃度不同來設(shè)計抗胃炎標(biāo)志物抗體在蛋白質(zhì)芯片中的量，從而大大提高了胃炎相關(guān)標(biāo)志物的檢出量和準確率，最大限度降低了背景信號的產(chǎn)生?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“胃炎標(biāo)志物”是指在胃炎的發(fā)生和進展過程中，由機體產(chǎn)生的，存在于體液(如血清)中，反映胃炎存在和進展的一類物質(zhì)。代表性的胃炎標(biāo)志物包括(但并不限于)胃泌素17(G-17)、胃蛋白酶原I(PG I)、胃蛋白酶原II(PG II)。
如本文所用，“捕獲抗體”、“包被抗體”、“第一抗體”、與“一抗”可互換使用，都是指用于固定于微球上的、特異性抗一種相應(yīng)的胃炎標(biāo)志物的抗體，如抗胃泌素17抗體、抗胃蛋白酶I抗體、和抗胃蛋白酶原II抗體。
如本文所用，“檢測抗體”、“第二抗體”、與“二抗”可互換使用，都是指特異性抗一種相應(yīng)的胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于液相蛋白質(zhì)芯片中相應(yīng)的第一抗體的抗體。對于同一種胃炎標(biāo)志物而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時結(jié)合于所述的胃炎標(biāo)志物的不同表位。
如本文所用，所述的“微球識別信號”是指位于微球上的，用于區(qū)別不同的第一抗體的識別信號。為了方便起見，對于固定有同一種第一抗體的微球，微球識別信號優(yōu)選是相同的。優(yōu)選的，所述的微球識別信號是熒光信號，并且，對于固定有不同種第一抗體的微球，熒光的色彩是不同的，對于固定有同種第一抗體的微球，熒光的色彩優(yōu)選是相同的。
如本文所用，所述的“可檢測信號”是指與第二抗體上生物素結(jié)合用于顯示第二抗體與相應(yīng)的胃炎標(biāo)志物發(fā)生結(jié)合的信號。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的可檢測信號為鏈親和素-藻紅蛋白，其與抗體上標(biāo)記的生物素結(jié)合，通過激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號。
基本原理本發(fā)明的基本原理是雙抗夾心法。常規(guī)的做法是將一抗固定于載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，洗滌，最后進行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。
對上述雙抗夾心法進行改進的是將所述的一抗固定于攜帶特定可檢測信號的微球上，制備液相蛋白質(zhì)芯片，通過采用液相蛋白質(zhì)芯片進行檢測的原理是使單個微球通過檢測通道，并使用兩種激光同時對微球上的微球識別信號和可檢測信號進行檢測。一種激光激發(fā)的是微球上的微球識別信號，根據(jù)微球上的不同種識別信號，可以將微球分類，從而將各個不同的結(jié)合反應(yīng)區(qū)分開來。另一種激光激發(fā)的是可檢測信號，目的是確定微球上結(jié)合的可檢測信號的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量。因此，通過兩種激光的同時檢測，可以確定被結(jié)合的檢測物的種類和數(shù)量。
蛋白質(zhì)芯片所述的蛋白質(zhì)芯片包括2種以上(如2-50種)不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗體，其中，所述的第一抗體為抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體，并且所述的第一抗體選自下組抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、或抗胃泌素-17抗體。
本發(fā)明中，將第一抗體固定在微球上的詳細操作程序可用常規(guī)方法，例如按照Luminex公司的產(chǎn)品說明書或網(wǎng)站www.luminexcorp.com中所述的方法進行偶連，從而得到不同微球與相應(yīng)一抗形成的偶連物。
所述的不同的微球是具有不同微球識別信號的微球，由于帶有不同的微球識別信號，使不同微球之間可被區(qū)分。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的微球識別信號為熒光信號，并且，微球上的熒光信號因固定于微球上的相應(yīng)的第一抗體的不同而不同。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片中，所述的微球為采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。并且，所述的微球的平均直徑為1-100μm；更優(yōu)選的，所述的微球的平均直徑為2-80μm，最優(yōu)選的，所述的微球的平均直徑為2-50μm。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片中，對采用的微球的數(shù)量沒有特別的限制，在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，在一個反應(yīng)體系中(如約100μl體系)，每一種固定有不同的第一抗體的微球的數(shù)量為103-107個；更優(yōu)選的為103-106個，最優(yōu)選的為104-105個。
為了更好地檢測所述的胃炎標(biāo)志物，本發(fā)明人根據(jù)胃炎標(biāo)志物(如蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、胃泌素-17)在樣品(如血清)中含量的不同，對采用的不同抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體的量進行獨特設(shè)計，以保證能夠從樣品中精確地檢出胃炎標(biāo)志物，提高檢出率。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述芯片中，抗胃蛋白酶原I抗體∶抗胃蛋白酶原II抗體∶抗胃泌素-17抗體的摩爾比為(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，當(dāng)存在所述抗體時。也即當(dāng)所述的抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體為抗胃蛋白酶原I抗體、和抗胃蛋白酶原II抗體時，它們在蛋白質(zhì)芯片中的摩爾比例為(4-10)∶(4-12)。比如，在進行檢測時，在96孔板的每個孔中(約100μl體系)，它們的含量分別為0.04-0.1μg/0.5-2.5×104個微球、和0.04-0.12μg/0.5-2.5×104個微球。
當(dāng)所述的抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體為抗胃蛋白酶原I抗體、和抗胃泌素-17抗體時，它們在液相蛋白質(zhì)芯片中的摩爾比例為(4-10)∶(6-15)。比如，在進行檢測時，在96孔板的每個孔中，它們的含量分別為0.04-0.1μg/0.5-2.5×104個微球、和0.06-0.15μg/0.5-2.5×104個微球。
當(dāng)所述的抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體為抗胃蛋白酶原II抗體、和抗胃泌素-17抗體時，它們在液相蛋白質(zhì)芯片中的摩爾比例為(4-12)∶(6-15)。比如，在進行檢測時，在96孔板的每個孔中，它們的含量分別為0.04-0.12μg/1-2.5×104個微球、和0.06-0.15μg/0.5-2.5×104個微球。
當(dāng)所述的抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體為抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、和抗胃泌素-17抗體時，它們在液相蛋白質(zhì)芯片中的含量比例為(4-10)∶(4-12)∶(6-15)。比如，在進行檢測時，在96孔板的每個孔中，它們的含量分另別為0.04-0.1μg/100μl、0.04-0.12μg/100μl、和0.06-0.15μg/100μl。
當(dāng)然，本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片中，所述的微球上還可固定各種抗胃病標(biāo)志物的抗體，包括但不限于抗CEA抗體、抗CA19-9抗體、抗CA242抗體、抗CA724抗體、抗CA50抗體(所述抗體均可購自Sigma、Biodesign、Medix、或Abcam)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片中，微球-第一抗體的結(jié)構(gòu)可參見圖1。其中25為第一微球，45為與微球25連接并固定的第一種第一抗體分子，27為第二微球，47為與微球27連接并固定的第二種第一抗體分子，第一微球25與第二微球27自身具有可區(qū)別的不同熒光信號。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的芯片所用的微球是一種直徑5.5微米，以不同熒光標(biāo)記的微球。在每種微球(固相載體)均偶聯(lián)了具有不同結(jié)合特異性的抗體分子。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，提供了一種蛋白質(zhì)芯片，所述芯片含有三種不同的微球，并且在三種微球上分別固定有抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、和抗胃泌素-17抗體，其中，每種微球的數(shù)量為103-107個，并且各第一抗體的數(shù)量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原I抗體，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原II抗體，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗體。
二抗以及二抗的標(biāo)記本發(fā)明中，每一種第二抗體分別抗一種相應(yīng)的胃炎標(biāo)志物，且對應(yīng)于相應(yīng)的第一抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，由于每一種胃炎標(biāo)志物抗原含有多個表位，因此其第二抗體不是唯一的，但第二抗體結(jié)合的抗原表位與相應(yīng)的第一抗體結(jié)合的抗原表位是不同的。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在利用第二抗體進行檢測時，針對于96孔板的每一個孔(約100μl體系)，第二抗體(檢測抗體)的含量如下抗PGI抗體750-1500ng；抗PGII抗體750-1500ng；抗G-17抗體750-1500ng。
本發(fā)明中，可選用多種可檢測信號來標(biāo)記所述的第二抗體。比如，所述的可檢測信號選自FITC、CY3、CY5、藻藍蛋白、Alexa Fluor Dyes、BODIPY Dyes、俄勒岡綠染料(Oregon Green Dyes)、得克薩斯紅染料(Texas Red Dye)，或若丹明(Rhodamine)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，二抗的生物素標(biāo)記方法如下分別取針對不同胃炎標(biāo)志物抗原的二抗純化后加入生物素二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光反應(yīng)，去除未反應(yīng)的生物素，保存?zhèn)溆谩?br> 對應(yīng)于可檢測信號的檢測物質(zhì)為能夠與可檢測信號相結(jié)合并能夠報告所述結(jié)合的分子(報告分子)。當(dāng)采用生物素來標(biāo)記第二抗體時，可采用鏈親和素-藻紅蛋白作為報告分子。
樣品本發(fā)明中，可用所述的蛋白質(zhì)芯片進行檢測的樣品包括任何提取自哺乳動物體內(nèi)的體液樣品或血液樣品。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的樣品為血液樣品；更優(yōu)選的，所述的樣品為血清樣品。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，樣品為無菌靜脈穿刺取得的血液經(jīng)新鮮沉降和冷藏獲得的血清，與臨床常規(guī)采血操作一致。樣品經(jīng)過一次1∶5倍稀釋，不需要特殊處理就可以在使用本發(fā)明人經(jīng)過微球包被條件的優(yōu)化，分析過程的優(yōu)化以及檢測抗體的優(yōu)化的芯片檢測時，保證3個因子在一張芯片內(nèi)使用同樣的分析條件完成同時檢測和定量分析。
對照或標(biāo)準為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設(shè)置對照。此外，為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測過程中設(shè)置含已知濃度的多個胃炎標(biāo)志物的標(biāo)準品。對照或標(biāo)準品的設(shè)置方法采用常規(guī)的方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，標(biāo)準品的設(shè)置如下標(biāo)準品I(G-17/PG I/PG II8.5pmol/L，100ug/L，12ug/L)標(biāo)準品II(G-17/PG I/PG II6.375pmol/L，75ug/L，9ug/L)標(biāo)準品III(G-17/PG I/PG II4.25pmol/L，50ug/L，6ug/L)
標(biāo)準品IV(G-17/PG I/PG II2.125pmol/L，25ug/L，3ug/L)標(biāo)準品V(G-17/PG I/PG II0.708pmol/L，8.33ug/L，1ug/L)標(biāo)準品VI(G-17/PG I/PG II0pmol/L，0ug/L，0ug/L)結(jié)果中對應(yīng)標(biāo)準品檢測出的熒光值為Y軸，對應(yīng)標(biāo)準品的濃度為X軸，由儀器軟件求得標(biāo)準曲線。系統(tǒng)根據(jù)樣品檢測的熒光值由標(biāo)準曲線計算出樣品中檢測標(biāo)志物的濃度。
多胃炎標(biāo)志物并行檢測的方法本發(fā)明方法中，充分利用了一抗固定在不同流動微球的特點，將固定了一抗的微球溶液與樣品、標(biāo)準品或?qū)φ掌?，可檢測信號標(biāo)記的二抗溶液依次或同時一并加入反應(yīng)容器中，從而發(fā)生以下反應(yīng)①微球上的一抗與樣品、標(biāo)準品、或?qū)φ掌分邢鄳?yīng)的抗原(即胃炎標(biāo)志物抗原)結(jié)合，形成“胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物，②二抗與樣品、標(biāo)準品、或?qū)φ掌分邢鄳?yīng)的抗原(即胃炎標(biāo)志物抗原)結(jié)合，最終形成“第二抗體-胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物(包括微球交聯(lián)的一抗-胃炎標(biāo)志物抗原-可檢測信號標(biāo)記的二抗復(fù)合物或微球交聯(lián)的一抗-標(biāo)準品或?qū)φ掌返目乖?可檢測信號標(biāo)記的二抗復(fù)合物)，反應(yīng)過程中不須多余的步驟，在液相中即可通過液相芯片檢測儀檢測復(fù)合物的熒光，達到從反應(yīng)到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在液相芯片檢測儀上，這些微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的微球識別信號從而決定被測胃炎標(biāo)志物的種類；另一束測定微球上結(jié)合的可檢測信號，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測胃炎標(biāo)志物的含量。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片的檢測示意圖見圖2。其中，1代表帶有第一抗體的微球，2代表胃炎標(biāo)志物，3代表帶有可與熒光檢測信號相結(jié)合標(biāo)記的第二抗體，4代表可與帶有標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合的熒光檢測物質(zhì)。
待測樣品與第一抗體溶液和第二抗體溶液的混合，可依次進行，也可同時進行。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的多胃炎標(biāo)志物并行檢測的方法包括如下步驟
1.取待檢人員外周血，分離血清；2.使用集成了不同結(jié)合特異性的液相蛋白質(zhì)芯片對待檢血清進行鑒定，具體如下(a)將制備好的液相蛋白質(zhì)芯片加入96孔抽濾板中，將待檢血清加入液相微球蛋白質(zhì)芯片中，并加入適量的緩沖液，室溫孵育30-60分鐘；(b)抽濾棄上清，加入雜交后洗液洗去未結(jié)合的檢測物；(c)向液相芯片中加入帶標(biāo)記的特異性抗不同胃炎標(biāo)志物的第二抗體混合物，室溫孵育15-30分鐘；(d)向液相芯片中加入相應(yīng)熒光染料，反應(yīng)后以液相芯片檢測儀進行檢測。
3.試劑盒本發(fā)明的檢測胃炎標(biāo)志物的液相蛋白質(zhì)芯片檢測試劑盒的主要技術(shù)特征在于將液相蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與免疫學(xué)方法相結(jié)合，對與胃炎相關(guān)的多種標(biāo)志物(如胃泌素17、胃蛋白酶I和胃蛋白酶原II)進行聯(lián)合標(biāo)志物的定量分析。
本發(fā)明的用于檢測多胃炎物的試劑盒包括以下組分第一容器，以及裝于該容器中的權(quán)利要求1所述的液相蛋白質(zhì)芯片。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的試劑盒還包括第二容器，以及裝于該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有不同種的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于該胃炎標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括標(biāo)準品、或?qū)φ掌贰?br> 在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，所述的試劑盒包括一個容器a，以及裝于所述容器中的上述的用于檢測胃炎相關(guān)血清標(biāo)志物的液相蛋白質(zhì)芯片；更優(yōu)選的，所述的試劑盒還至少包括一管雜交液，該雜交液用于液相蛋白質(zhì)芯片與分析物的雜交；更優(yōu)選的，所述的試劑盒還至少包括一管雜交后洗液，該雜交后洗液用于液相蛋白質(zhì)芯片與分析物雜交后的洗滌；更優(yōu)選的，所述的試劑盒還至少包括一管能與特定標(biāo)記的抗體結(jié)合的熒光染料；更優(yōu)選的，所述的試劑盒還至少包括一管陽性對照，該陽性對照用于在檢測3個目的分析物時，對檢測過程進行控制；更優(yōu)選的，所述的試劑盒還至少包括一管陰性對照，該陰性對照用于在檢測3個目的分析物時，對檢測過程進行控制。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于第一，可以同時對某一個體樣品中與胃炎相關(guān)的多個血清標(biāo)志物進行定量分析；并且，也可以同時對多個樣品中與胃炎相關(guān)的多個血清標(biāo)志物進行定量分析。
第二，由于對微球帶有的第一抗體的量進行配比設(shè)計，從而使得不容易檢出的胃炎標(biāo)志物(如G-17)也可靈敏地被檢測。并且，最大限度降低了不同分析物在雜交時存在的非特異性的結(jié)合，從而大大降低了背景信號的產(chǎn)生。同時也節(jié)省了大量時間與資金。
第三，本發(fā)明不僅對病人是否是胃炎、萎縮性胃炎以及胃炎發(fā)生的部位(胃竇、胃體)進行診斷，而且為更好防治萎縮性胃炎，以及降低胃癌和胃潰瘍的發(fā)病幾率創(chuàng)造了條件。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
抗體來源以下實施例中用到的抗體來源見表1。
表1

試劑配制以下實施例中用到的試劑見表2。
表2

實施例1芯片制備的方法(微球包被方法)(1)取約1.25×106個微球(購自Bio-rad公司，如171-506027，直徑5.5微米)，震蕩、超聲30秒→14000×g離心4min，棄上清，100μl的微球洗滌液重懸→1400rpm震蕩、超聲30s→14000×g離心4min，80μl的活化液重懸→加入各10μl的50mg/ml的EDC和S-NHS，避光室溫1400rpm震蕩20min→加入150μl PBS緩沖液，1800rpm震蕩15s，14000×g離心4min→加入250μlPBS緩沖液，1800rpm震蕩15s，14000×g離心4min→100μl PBS緩沖液重懸→加入4μg對應(yīng)的捕獲抗體(抗PGI第一抗體)分別用PBS緩沖液將之補足至500μl；避光、4℃、1400rpm震蕩過夜→14000×g離心4min，500μl的PBS緩沖液洗滌微球→14000×g離心4min，250μl封閉液；避光室溫1400rpm封閉30min→14000×g離心4min，500μl的儲存液洗滌微球→16000×g離心6min，用125μl的儲存液重懸微球；避光并4℃保存。
同上述步驟，分別制備含抗PGII第一抗體、抗G-17第一抗體的微球，但是兩種抗體的加入量分別是4.5ug和9ug。
(2)微球包被抗體效率檢測在每管50μl的生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG(濃度為2ug/ml)中加入1μl震蕩過的微球→避光室溫1400rpm，振蕩孵育30min→14000g離心4min，用50μl1∶25稀釋后的鏈親和素-藻紅蛋白重懸微球，避光室溫孵育10min→14000g離心4min，用100μl/管的洗滌液重懸微球→轉(zhuǎn)吸入96孔板，送入儀器檢測→最后檢測熒光值應(yīng)超過10000。
實施例2檢測抗體的生物素化(1)用30μl DMSO溶解BCA-SulfoNHS(Sigma)，并用0.1mol/l磷酸鈉緩沖液定容為0.5ml，終濃度為10mg/ml→在1ml的10mg/ml的抗體(針對不同胃炎標(biāo)志物，分別是PGI、PGII、G-17的第二抗體)溶液中加入38μl的BCA-SulfoNHS溶液→避光室溫震蕩30分鐘→過Sephadex G25柱分離純化生物素化的抗體→用BAC法測定回收后的抗體蛋白量。
(2)抗體生物素化效率檢測取50μl標(biāo)記好生物素的樣品(標(biāo)記好的PGI、PGII、G-17第二抗體)，加入5ul鏈酶蛋白酶，37℃水浴90分鐘→將3.2ml抗生物素蛋白(Avidin)與100ul 10mM的HABA[2-(4-羥基苯偶氮基)苯甲酸，2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid]混合，得到Avidin-HABA儲液→將90ul的Avidin-HABA儲液與10ul的酶處理后的樣品或者濃度分別為30nmol/L、25nmol/L、20nmol/L、15nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、2.5nmol/L、0nmol/L的d-生物素溶液混合→A500下(光程10mm)用PBS基線調(diào)零，測樣品和各個濃度的d-生物素和Avidin-HABA儲液的OD值，做標(biāo)準曲線，從而求得樣品中的生物素的濃度→將生物素濃度/蛋白樣品濃度＝生物素標(biāo)記效率→生物素標(biāo)記效率應(yīng)大于5。
實施例3檢測試劑盒的制備在本實施例中，制備一種用于檢測胃炎標(biāo)志物的試劑盒，所述的試劑盒包含以下組件(a)一個容器a，以及裝于所述容器中分別偶聯(lián)了PGI、PGII、G-17捕獲抗體的微球混合液(實施例1中制備)。
(b)一個容器b，以及裝于所述容器中生物素標(biāo)記的PGI、PGII、G-17檢測抗體的混合液(實施例2中制備)。
(c)一個容器c，以及裝于容器c中的2×緩沖液A(10.1mM Na2HPO4，138mMNaCl，1.76mMKH2PO4，2.7mMKCl，0.05％(V/V)Tween-20，pH7.4)。
(d)一個容器d，以及裝于容器d中的緩沖液B(10.1mM Na2HPO4，138mMNaCl，1.76mMKH2PO4，2.7mMKCl，1％(m/V)BSA，0.02％(m/V)Thimerosal，pH7.4)。
(e)一個容器e，以及裝于容器e中的能與標(biāo)記生物素的檢測抗體結(jié)合的鏈親和素-藻紅蛋白。
(f)一套6個容器，以及裝于容器中的一系列不同濃度的PGI、PGII、G-17標(biāo)準品(濃度在7.5-15ug/ml)混合液。
(g)一塊96孔抽濾板以及4塊用于孵育時封板用的封板膜。
實施例4血清的檢測(1)檢測方法1、將抗體偶聯(lián)微球在振蕩器上1400rpm震蕩30秒；2、將微球按1∶100稀釋；3、將抗體偶聯(lián)微球按50μl/孔的量加入96孔板中，真空抽干；4、加入100μl/孔的緩沖液A洗滌微球，重復(fù)該步驟；5、分別加入100μl/孔樣品(已用1×緩沖液A 1∶5稀釋)、標(biāo)準品(不用稀釋)，貼上封板膜；6、將板放置在平板搖床上，1100rpm避光振蕩1min，然后600rpm避光室溫孵育60min；7、真空抽濾，加入100μl/孔的1×緩沖液A，洗滌3次；8、加入100μl/孔的生物素標(biāo)記二抗，將板放在平板搖床上，1100rpm避光振蕩1min，600rpm避光室溫孵育30min。
9、真空抽濾，加入100μl/孔的1×緩沖液A，洗滌3次；10、加入50μl/孔鏈親和素-藻紅蛋白(已用緩沖液B 1∶12.5稀釋)，將板放在平板搖床上，1100rpm振蕩1min，400rpm避光室溫孵育10min；11、真空抽濾，加入100μl/孔的1×緩沖液A，洗滌3次；12、加入125μl/孔的緩沖液B重懸微球，將板放在平板搖床上，1100rpm避光振蕩1min。
13、將板送入儀器檢測。
(2)檢測結(jié)果采用本方法對70余人份血清進行檢測，結(jié)果如表1、表2所示。
表3為檢測儀讀取的檢測數(shù)據(jù)。
表4為根據(jù)檢測儀讀取的檢測數(shù)據(jù)換算獲得的各標(biāo)志物的相對濃度。
表3和表4的結(jié)果顯示三種胃炎標(biāo)志物的測定濃度精確。
并且，本發(fā)明人將采用本發(fā)明的方法測得的全部樣品的檢測結(jié)果與受試者的胃鏡檢驗報告比較，結(jié)果完全一致。
表3

*Well列各代號表示各種樣品在96孔板上對應(yīng)的孔號；Description列中，N1-N5表示陰性對照，P1-P5表示陽性對照，1-50表示受試者樣品；檢測結(jié)果中，比如，731.0(113)，表示檢測儀讀取了113個微球，讀到的熒光值為731.0。
表4

*Type列中eS1-eS6表示六個標(biāo)準品，X1-59代表未知樣品；Well列各代號表示各種樣品在96孔板上對應(yīng)的孔號；Description列中，N1-N5表示陰性對照，P1-P5表示陽性對照，1-49表示受試者樣品；后面3個Obs conc表示該胃炎標(biāo)志物通過標(biāo)準曲線求得的濃度(G-17濃度單位pmol/L，PG-I濃度單位ug/L，PG-II濃度單位μg/L)。OOR＜表示檢測后換算出的濃度遠遠超出標(biāo)準曲線范圍。表4是將熒光值在標(biāo)準曲線中進行換算求得的濃度，做Excel表輸出整合而成。
圖3為G-17的標(biāo)準曲線，G-17標(biāo)準品的濃度為0，0.126，0.252，0.503，1.062，2.125，4.25，8.5pmol/L，結(jié)果中對應(yīng)標(biāo)準品檢測出的熒光值為Y軸，對應(yīng)標(biāo)準品的濃度為X軸，由儀器軟件求得標(biāo)準曲線。系統(tǒng)根據(jù)樣品檢測的熒光值由標(biāo)準曲線計算出樣品中檢測標(biāo)志物的濃度。
實施例5采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片與醫(yī)院檢測的結(jié)果比較根據(jù)實施例1和實施例2的方法制備蛋白質(zhì)芯片和生物素標(biāo)記的第二抗體等，并且根據(jù)實施例4所述的方法，本發(fā)明人又檢測了多個樣品。這些樣品由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床基礎(chǔ)研究室提供，由胃鏡檢測確認是胃炎陽性樣本。
胃泌素17、胃蛋白酶I和胃蛋白酶原II的部分檢測結(jié)果如表5、表6、表7所示。
當(dāng)胃蛋白酶原I低于5μg/L時，表明有中度或者嚴重的胃體黏膜處胃炎或者胃體萎縮，是需要做進一步胃竇胃鏡的標(biāo)志，因為其低含量表明這些病人得胃癌的風(fēng)險更大。
當(dāng)結(jié)果中胃蛋白酶原I/II的比值低于2.5時，該病患罹患胃體萎縮癥的可能性大大提升。
在幽門螺桿菌抗體陽性的病人血清中，胃泌素-17的值小于5pmol/L說明其在胃竇處有中度或者重度的胃炎以及胃萎縮。
測得的胃泌素-17的濃度見表5；測得的胃蛋白酶原I的濃度見表6；測得的胃蛋白酶原II的濃度見表7。
表5 表6


表7

*表5、表6、表7中，Type列中eS1-eS6表示六個標(biāo)準品，X1-29代表未知樣品；Well列各代號表示各種樣品在96孔板上對應(yīng)的孔號；Obs conc表示該胃炎標(biāo)志物通過標(biāo)準曲線求得的濃度(G-17濃度單位pmol/L，PG-I濃度單位ug/L，PG-II濃度單位μg/L)。OOR＜表示檢測后換算出的濃度遠遠超出標(biāo)準曲線范圍。
本發(fā)明人將采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片測定的這些結(jié)果與醫(yī)院的臨床檢測結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)獲得的結(jié)果完全相符。
在時間上，采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片在測定這些結(jié)果時僅需要1.5小時時間，并且一次檢測就獲得了準確的結(jié)果；而醫(yī)院采用ELISA方法進行檢測時，由于三個因子分別檢測，累計消耗時間為10.5個小時，并且醫(yī)院在檢測時，有的樣品因有背景干擾，需要反復(fù)驗證。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)芯片，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)芯片包括2種以上不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗體，其中，所述的第一抗體為抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體，并且所述的第一抗體選自下組抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、或抗胃泌素-17抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片中，抗胃蛋白酶原I抗體∶抗胃蛋白酶原II抗體∶抗胃泌素-17抗體的摩爾比為(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，當(dāng)存在所述抗體時。
3.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的不同的微球是具有不同微球識別信號的微球。
4.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片中，每一種微球的數(shù)量為103-107個。
5.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片含有三種不同的微球，并且在三種微球上分別固定有抗胃蛋白酶原I抗體、抗胃蛋白酶原II抗體、和抗胃泌素-17抗體，其中，每種微球的數(shù)量為103-107個，并且各第一抗體的數(shù)量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原I抗體，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原II抗體，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的第一抗體還包括抗CEA抗體、抗CA19-9抗體、抗CA242抗體、抗CA724抗體、或抗CA50抗體。
7.一種多胃炎標(biāo)志物并行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將待測樣品與權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片混合，從而使待測樣品中的胃炎標(biāo)志物與第一抗體及微球形成“胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物；(b)將步驟(a)形成的三元復(fù)合物與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有不同種的帶有可檢測信號的第二抗體，每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于蛋白質(zhì)芯片中相應(yīng)的第一抗體，而且對應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于該胃炎標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2，從而形成“第二抗體-胃炎標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；(c)檢測四元復(fù)合物中不同微球的微球識別信號，從而確定待檢測樣品中各胃炎標(biāo)志物的存在與否以及存在的量；附加條件是待測樣品與蛋白質(zhì)芯片和第二抗體溶液的混合，可依次進行，也可同時進行。
8.一種用于檢測多胃炎標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，它包括以下組分(1)第一容器，以及裝于該容器中的第一抗體溶液，所述的第一抗體溶液中含有權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括(2)第二容器，以及裝于該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有不同種的帶有可檢測信號的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種胃炎標(biāo)志物且對應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于該胃炎標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片的用途，其特征在于，用于制備診斷或輔助診斷胃炎的試劑盒；或用于制備體外檢測樣品中是否存在胃炎標(biāo)志物的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)芯片，所述的蛋白質(zhì)芯片包括2種以上不同的微球，所述的微球上固定有不同的抗胃炎標(biāo)志物的第一抗體。本發(fā)明還公開了一種多胃炎標(biāo)志物并行檢測的方法。本發(fā)明還公開了一種含有所述蛋白質(zhì)芯片的試劑盒。本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片對微球上帶有的第一抗體的量進行配比設(shè)計，從而使得不容易檢出的胃炎標(biāo)志物也可靈敏地被檢測，并且最大限度降低了不同分析物在雜交時存在的非特異性的結(jié)合，從而大大降低了背景信號的產(chǎn)生。
文檔編號G01N33/544GK101063684SQ20061002597
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者趙芹, 何笑恬, 洪巍, 黃承 申請人:上海華冠生物芯片有限公司