專利名稱：一種sars冠狀病毒多肽抗原及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
非典型肺炎(SARS)是由一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒(severe acuterespiratory syndrome associated coronavirus，Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species)所引起。病毒的基因組由一條單鏈RNA組成，其中包含有14個開放式閱讀框(ORF)。目前已知病毒編碼的蛋白質(zhì)包括脂雙層膜及其上的棒狀膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜內(nèi)部衣殼蛋白N，以及一些蛋白酶和復(fù)制酶，然而大多數(shù)的ORF是否編碼蛋白質(zhì)，以及他們的功能都不清楚(Rota PA，Oberste MS，The genome sequence ofthe ARS-associated coronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404)。
ORF3a最近研究比較集中的SARS病毒基因之一。ORF3a(例如序列為SEQ ID NO4)編碼了一個全長274個氨基酸的全新病毒蛋白(例如序列為SEQ ID NO5)，已有研究人員通過免疫印跡和蛋白質(zhì)質(zhì)譜的方法證明了這一病毒蛋白的存在，并推測其很可能是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。通過生物信息學(xué)分析，該蛋白具有3個跨膜區(qū)，與其他已知蛋白的同源性很低(吳家睿，曾嶸等，申請?zhí)?00310108604.X)。雖然通過很多不同的實驗方法都證明了3a蛋白的存在，但是關(guān)于這一蛋白功能的研究還很少，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)都沒有能夠闡明該蛋白在病毒周期中的作用。(Naoto lto，Eric C.Mossel，KrishnaNarayanan，Vsevolod L Popov，et al.，Severe acute respiratory syndromecoronavirus 3a protein is a viral structural protein，2005，J.Virol.79，3182-3186)。同時，也未見有利用其全蛋白或者部分多肽序列作為抗原免疫動物的報道。
目前通常使用的SARS臨床檢測手段如PCR檢測病毒DNA等方法可靠性低、操作性差，操作不夠方便。且目前的SARS免疫檢測的檢測成本較高。(Poon，Leo L.M.，Chan，Kwok Hung，et al.Early diagnosis of SARScoronavirus infection by real time RT-PCR.J.Clin.Virol.2003，28，233-238)。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題為了克服上述缺陷，提供一系列強免疫原性的多肽抗原及其多克隆、單克隆抗體，同時指明其檢測SARS冠狀病毒抗體或者抗原的方法。
技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一提供是一種SARS冠狀病毒多肽抗原，其特征在于，該多肽抗原具有適合于制備抗體的免疫原性，并具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO1經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。特別地，所述的抗體為具有病毒和抗原特異性的多克隆抗體或單克隆抗體。
上述的SARS冠狀病毒多肽抗原的一種優(yōu)選方案為，與序列表中SEQ IDNO4所述序列中的10-72位的堿基所編碼蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO5同源。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二為提供一種抗體，該抗體特異性地與技術(shù)方案之一所述的SARS冠狀病毒多肽抗原結(jié)合。
上述的抗體的一種優(yōu)選方案為，該抗體是技術(shù)方案之一的SARS冠狀病毒多肽抗原的多克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供技術(shù)方案之一所述的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫動物；(3)取動物的抗血清過抗原偶連的親和層析柱純化，即得到所述的抗體。
上述的抗體的另一種優(yōu)選方案為，該抗體是技術(shù)方案之一的SARS冠狀病毒多肽抗原的單克隆抗體，是由下列制備方法所制備的，步驟包括(1)提供技術(shù)方案之一所述的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫小鼠；(3)分離小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株融合；(4)加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株；(5)克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細(xì)胞株；(6)將單克隆抗體細(xì)胞株植入小鼠體內(nèi)，分泌所需要的單克隆抗體。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三為提供一種SARS冠狀病毒抗體的檢測方法，其特征在于，利用技術(shù)方案一所述的SARS冠狀病毒多肽抗原包被檢測基質(zhì)，以ELISA法檢測抗SARS冠狀病毒抗體。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需特別的實驗即可理解，所述的ELISA法檢測是指酶聯(lián)免疫分析。即利用多肽抗原特異性地結(jié)合待測溶液中的SARS冠狀病毒抗體，然后加入標(biāo)記的二抗檢測，最后讀取波長為450nm的OD值。按照該方法，只要對照濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出待測樣品中的SARS冠狀病毒抗原含量。其檢測SARS冠狀病毒抗體的步驟包括(1)以5ng/mL的濃度抗原多肽包被；(2)一系列濃度梯度的SARS冠狀病毒抗體、待測樣品，37攝氏度共溫育一個小時；(3)在包被板上加入待測的共溫育過的樣品，37攝氏度孵育兩個小時；(4)加入HRP標(biāo)記的抗人抗體作為二抗，37攝氏度孵育一個小時；(5)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD；(6)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照后即可獲得抗原濃度。
這些步驟并不是一成不變的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況進(jìn)行合理的修改使之符合應(yīng)用要求。比如在合適的過程中增加洗滌的步驟以降低檢測結(jié)果的本底等等。
本發(fā)明的技術(shù)方案之四為提供一種SARS冠狀病毒抗原的檢測方法，其特征在于，利用技術(shù)方案之三所述的抗體包被檢測基質(zhì)，以免疫印記法檢測SARS冠狀病毒抗原。一種優(yōu)選方式為，使用上述的多克隆抗體，更優(yōu)選使用上述的單克隆抗體。
上述兩種技術(shù)方案所述的免疫印記法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的，借助抗體對抗原進(jìn)行檢測的方法，可以是定性的檢測，也可以是定量的檢測，達(dá)到檢測目的的具體試驗方案可以參考分子生物學(xué)的各實驗手冊、或者是購買市售的檢測試劑盒，按照其說明書的指示進(jìn)行檢測操作。
有益效果本發(fā)明制備了針對3a的特異性抗體，在3a蛋白的N段發(fā)現(xiàn)了三段人工設(shè)計多肽序列中的一段(LH21)是具有高抗原性的蛋白表位，其所在氨基酸序列為SEQ ID NO1。
應(yīng)用該氨基酸序列設(shè)計合成的多肽可以應(yīng)用于SARS的臨床診斷。與目前通常使用的SARS臨床檢測手段相比，酶聯(lián)免疫方法具有安全可靠，可操作性高，使用方便的特點，而利用抗原多肽作為抗原檢測樣品中的特異性抗體，則使得設(shè)計和生產(chǎn)檢測試劑盒更加快速簡便。利用LH-21設(shè)計制造的SARS檢測試劑盒具有極高的特異性和親和力，為降低檢測成本，節(jié)省檢測時間，提高準(zhǔn)確率提供了可能。
應(yīng)用合成的LH-21多肽免疫動物后獲得了具有極高效價和特異性的單抗與多抗。這些抗體對病毒裂解液中的SARS病毒3a蛋白能夠特異性的識別，可以在臨床檢測和病毒基礎(chǔ)研究中發(fā)揮重要的作用。


圖1是使用anti-LH21抗體對SARS-CoV感染FRhK-4細(xì)胞提取物的聚丙稀酰胺凝膠電泳免疫印跡檢測結(jié)果。
圖2是使用LH-21多肽作為抗原包被，分別檢測正常人和SARS病人血清中抗3a蛋白的抗體。
圖3是LH21、LH22和LH23的抗原效價比較，顯示LH21在三條多肽中的抗原性最強。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學(xué)試劑和有機溶劑購自上?；瘜W(xué)試劑廠和Sigma公司。
實施例1針對3a蛋白特異性抗體的制備利用生物軟件，分析了3a蛋白的抗原性(病毒株為SARS coronavirusGZ50；Viruses；ssRNA positive-strand viruses，no DNA stage；Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species。GeneBank號為AAS00004。來源為香港大學(xué)鄭伯建教授)，在蛋白中選擇了三條(抗原性較高的氨基酸序列，并命名為LH21(4-24位Amino acids SEQ ID NO1FMRFFTLGSITAQPVKIDNAS)、LH22(211-231位Amino acids SEQ IDNO2YYQLESTQITTDTGIENATFF)和LH23(251-271位Amino acids SEQID NO3SSGVANPAMDPIYDEPTTTTS)。采用化學(xué)方法合成這三條多肽(吉爾生化(上海)有限公司)。將多肽分別溶解在PBS緩沖液中，通過戊二醛與載體蛋白BSA偶連。化學(xué)偶連2個小時后，加入glysin終止反應(yīng)，并對反應(yīng)體系透析過夜。使用偶連有載體蛋白的三種多肽抗原分別免疫兔子。先抗原稀釋到1mg/mL，取1mL抗原與1mL完全弗氏佐劑乳化，對動物皮下，皮內(nèi)，足掌三點注射，3周后，取同樣劑量的抗原和不完全弗氏佐劑乳化，對動物進(jìn)行加強免疫，第二次加強免疫后第七天，處死動物，取出抗血清。將抗原偶連到層析柱上，利用親和層析的方法對抗血清進(jìn)一步的純化。洗脫下來的即為高親和力和特異性的抗3a蛋白的多克隆抗體。
將三種抗體分別用于ELISA，以病毒裂解液為底物，檢測所制備的抗體效價，結(jié)果顯示針對LH-21的抗體能特異性的識別3a蛋白，并且效價很高。因此，LH21在三條多肽中的抗原性最強，免疫后效果最好。
采用相同的抗原免疫小鼠，對小鼠皮下，皮內(nèi)，足掌三點注射，3周后，取同樣劑量的抗原和不完全弗氏佐劑乳化，對動物進(jìn)行加強免疫，第二次加強免疫后第七天，處死動物，分離小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株融合；加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株；克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細(xì)胞株；將單克隆抗體細(xì)胞株植入小鼠體內(nèi)，分泌所需要的單克隆抗體。(圖3)實施例2使用anti-LH21抗體檢測病毒感染的細(xì)胞中3a蛋白的表達(dá)取上述SARS-CoV感染的FRhK-4細(xì)胞，先用PBS緩沖液洗細(xì)胞幾遍。直接使用1×SDS細(xì)胞裂解緩沖液，冰上裂解細(xì)胞15分鐘。對細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲粉碎，沸水煮5分鐘后用于SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，并分別與anti-LH21多克隆抗體和單克隆抗體37攝氏度溫育2小時，染色觀察免疫印跡結(jié)果。(圖1)
實施例3表位多肽LH-21的應(yīng)用，即ELISA法檢測樣品中抗SARS冠狀病毒抗體表位多肽以5ng/mL的濃度包被；與一系列濃度梯度的SARS冠狀病毒抗體對照、及待測樣品，37攝氏度共溫育一個小時；在包被板上加入待測的共溫育過的樣品，37攝氏度孵育兩個小時；加入HRP標(biāo)記的抗人抗體作為二抗，37攝氏度孵育一個小時；洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD；與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照后即可獲得抗原濃度。(圖2)實施例4anti-LH21多克隆抗體應(yīng)用，即免疫印記法檢測SARS冠狀病毒抗原將待測樣品與SARS病毒3a蛋白標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照和陰性對照在SDS/PAGE上做蛋白凝膠電泳，并將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸素纖維膜上，經(jīng)過5％BSA的封閉后，將anti-LH21多克隆抗體稀釋成150ng/mL的濃度室溫孵育2個小時，PBS洗3邊，每次5分鐘后。再用HRP標(biāo)記的抗兔的第二抗溫育一個小時；PBS洗滌；最后加入HRP底物；采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色。這樣就可以檢測樣品中是否含有SARS病毒3a蛋白。將病毒抗原對照的條帶亮度相對于其抗原濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照待測樣品還可獲得抗原濃度。
實施例5anti-LH21單克隆抗體應(yīng)用，即免疫印記法檢測SARS冠狀病毒抗原以anti-LH21單克隆抗體替代實施例4中的多克隆抗體，按照實施例4的方法檢測樣品中有無抗原以及抗原濃度。
核苷酸/氨基酸序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一種SARS冠狀病毒多肽抗原及其應(yīng)用<130>2006052901<160>5<170>Patentln version 3.3<210>1<211>21<212>PRT<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>抗原多肽<222>(1)..(21)<400>1Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln Pro Val Lys1 5 10 15
Ile Asp Asn Ala Ser20<210>2<211>21<212>PRT<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>抗原多肽<222>(1)..(21)<400>2Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly Ile Glu1 5 10 15Asn Ala Thr Phe Phe20<210>3<211>21<212>PRT
<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>抗原多肽<222>(1)..(21)<400>3Ser Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro15 10 15Thr Thr Thr Thr Ser20<210>4<211>825<212>DNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>結(jié)構(gòu)蛋白基因<222>(1)..(825)
<400>4atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt 60gacaatgctt ctcctgcaag tactgctcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca 120ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc 180aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt 240tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt 300atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca 360tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt 420tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat 480aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc 540aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat 600gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact 660acaaacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca 720ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat 780ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaa 825<210>5<211>274<212>PRT<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus
<220>
<221>病毒結(jié)構(gòu)蛋白<222>(1)..(274)<400>5Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln1 5 10 15Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 4045Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu85 90 95Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100 105110Tyr Phe Leu Gln Cys Ile Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn
130135 140Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185 190Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195200 205Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220Ile Glu Asn Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230235 240Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn245250 255Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270Pro Leu
權(quán)利要求
1.一種SARS冠狀病毒多肽抗原，其特征在于，該多肽抗原具有適合于制備抗體的免疫原性，并具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者具有SEQID NO1經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒多肽抗原，其特征在于，所述的抗體為具有病毒抗原特異性的多克隆抗體或單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒多肽抗原，其特征在于，與序列表中SEQ ID NO4所述序列中的10-72位的堿基所編碼蛋白質(zhì)序列SEQ IDNO5同源。
4.一種SARS冠狀病毒抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地與權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒多肽抗原結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，是權(quán)利要求1所述多肽抗原的多克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供權(quán)利要求1所述的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫動物；(3)取動物的抗血清過抗原偶連的親和層析柱純化，即得到所述的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，是權(quán)利要求1所述多肽抗原的單克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供權(quán)利要求1所述的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫小鼠；(3)分離小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株融合；(4)加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株；(5)克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細(xì)胞株；(6)將單克隆抗體細(xì)胞株植入小鼠體內(nèi)，分泌所需要的單克隆抗體。
7.一種SARS冠狀病毒抗體的檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒多肽抗原包被檢測基質(zhì)，以ELISA法檢測抗SARS冠狀病毒抗體。
8.一種SARS冠狀病毒抗原的檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求4所述的抗體包被檢測基質(zhì)，以免疫印記法檢測SARS冠狀病毒抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的SARS冠狀病毒抗原的檢測方法，其特征在于，所述的抗體是權(quán)利要求4所述的多克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的SARS冠狀病毒抗原的檢測方法，其特征在于，所述的抗體是權(quán)利要求5所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SARS冠狀病毒多肽抗原及其應(yīng)用，其氨基酸序列為SEQ ID NO1或者其衍生序列。本發(fā)明篩選的抗原表位LH21是由ORF3a基因所編碼蛋白的N段，具有強免疫原性，該抗原表位具有臨床診斷的應(yīng)用價值，利用該表位制備的抗體可以應(yīng)用于病毒抗原的檢測。
文檔編號G01N33/543GK101085812SQ200610027480
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者孫兵, 鄭伯健, 呂偉, 徐可 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院