專利名稱：一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，尤其是一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒， 通過檢測(cè)乙酵脫氫酶2基因(aldehyde dehydrogenase 2 family, ALDH2)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn) 來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)酒精中毒和酒精成癮的易感性。
背景技術(shù)：
飲酒是人類重要的生活方式之一。當(dāng)一次飲入過量的酒精或酒類飲料，引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)由興奮轉(zhuǎn) 為抑制的狀態(tài)，稱為酒精中毒或乙醇中毒。
酒精中毒會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，引起昏睡和昏迷，極高濃度乙醇抑制延腦中樞會(huì)引起呼吸、 循環(huán)功能衰竭。另外乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)代謝生成大量還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),使之與氧化型的 比值(NADH/NAD)增高，甚至可髙達(dá)正常的2 3倍。相繼可發(fā)生如乳酸增高、酮體蓄積導(dǎo)致的代謝性酸中 毒；糖異生受阻后可出現(xiàn)低血糖。
酒精成癮會(huì)造成飲酒后產(chǎn)生輕松、興奮的欣快感。繼續(xù)飲酒后，產(chǎn)生耐受性，需要增加飲酒量才能達(dá) 到原有的效果。同時(shí)會(huì)造成對(duì)酒精的心理依賴和軀體依賴為了獲得飲酒后的特殊快感，渴望飲酒，這是 心理依賴，軀體依賴是指反復(fù)飲酒使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生了某種生理、生化變化，以致需要乙醇持續(xù)地存在 于體內(nèi)，以避免發(fā)生特殊的稱之為戒斷綜合征的病征。長(zhǎng)期大量飲酒時(shí)進(jìn)食減少，可造成明顯的營(yíng)養(yǎng)缺乏。 同時(shí)乙醇對(duì)粘膜和腺體分泌有刺激作用，可引起食管炎、胃炎、胰腺炎。乙醇在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生自由 基，可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成肝細(xì)胞壞死，肝功能異常。
ALDH2為aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial)(乙醛脫氫酶2，線粒體乙醛脫氨酶) 編碼基因，主要功能是在肝臟內(nèi)將乙醇代謝產(chǎn)物乙醛進(jìn)一步脫氫成為乙酸，進(jìn)入外周組織的三羧酸循環(huán)， 分解產(chǎn)生C02和水。該基因的缺陷或活性下降會(huì)導(dǎo)致大量飲酒后體內(nèi)的乙醛無法被及時(shí)代謝，從而導(dǎo)致一 系列對(duì)肝臟、血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。該基因的缺陷型在東亞人群包括中國(guó)、韓國(guó)、日本具有廣泛 的分布，帶有這類基因型的個(gè)體通常更容易發(fā)生酒精中毒，而較少發(fā)生酒精成癮和因此而引起的酒精性疾 病。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性、和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。
關(guān)于中國(guó)人群關(guān)聯(lián)分析均一致表明，ALDH2缺陷基因型與飲酒不適，酒后臉紅相關(guān)。國(guó)內(nèi)外大樣本研 究均表明ALDH2基因上的rs671號(hào)SNP位點(diǎn)(SEQ ID NO: 1所示序列中第161位)基因型與ALDH2基因發(fā) 生缺陷有顯著關(guān)系，rs671號(hào)SNP位點(diǎn)是位于第十二號(hào)染色體上ALDH2基因上的一個(gè)G/A多態(tài)，引起ALDH2 基因編碼的蛋白第504個(gè)氨基酸由Arg(R)變?yōu)長(zhǎng)ys(K)。低頻等位基因型A編碼的蛋白活性較低，對(duì)乙醛 代謝的能力下降，引起飲酒的不適感，臉紅綜合癥等，容易導(dǎo)致酒精中毒。另外一方面，低頻等位基因型 A攜帶者由于飲酒的不適感使得該種人不易酒精成癮，酒精性疾病反而減少。
因此ALDH2基因上的rs671號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)酒精中毒和酒精成癮的易感性，目 前已通過中國(guó)科學(xué)院國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心的認(rèn)證。

發(fā)明內(nèi)容
基于ALDH2基因上的rs671號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)酒精中毒和酒精成癮的易感性的基 礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒。
該試劑盒包括檢測(cè)ALDH2基因SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)基因型的特異性引tl對(duì)及特異性
熒光探針、TaQ醸、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增 出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這一對(duì)引物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這個(gè)SNP位點(diǎn)酒精中毒易感基因型的探針。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探針。特異性熒光探針可用 常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這一條探針，所 有可用于熒光定量PCR檢測(cè)SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)基因型的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 ljxl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0.1^1 25mM dNTP混合液， 0.5nl 25mM MgCl2溶液， 0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(duì)各0. 225^1, l(HiM特異性熒光探針O. 25nl, 去離子水5. 68fd。
本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用可檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探
針
有義引物5' - TTTGGTGGCTACMGATGT -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值為 54*C
反義引物5， - CTCCGAGCCACCAGCA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為54°C
熒光操針5， - GCTGCAGGCATACACTAMGT -3， (SEQ ID NO: 4) Tm值為62'C
熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積10nl，包含濃度為20ng/nl的DM模板2^1、 1 pi 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. lul 25mM dNTP混合液、0.5^1 25raM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有義引物0.225^1、 20nM的反義引物0.225nl、 10jxM的熒光探針0. 25^x1,去離子水5.68pl。
在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 95'C、 30秒，60'C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: SNP基因型分析
將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針最終的熒光信號(hào)明顯高于正 常對(duì)照，說明被檢測(cè)DNA的ALDH2基因上的rs671號(hào)SNP位點(diǎn)基因攜帶有A型，為酒精中毐易感型，同時(shí)
也是酒精成癮不易感型。
實(shí)施例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防酒精中毒和酒精成癮的服務(wù) 目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項(xiàng)服務(wù)。 步驟l: DNA提取
對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書，填寫飲酒習(xí)慣問巻調(diào)査表。依照取樣盒中 的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者DNA的ALDH2基因上的rs671號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢 測(cè)，確定該SNP位點(diǎn)的基因型。
步驟3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防酒精中毒和酒精成癮
通過對(duì)被檢測(cè)者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和被檢測(cè)者個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告?；驒z 測(cè)報(bào)告詳細(xì)說明了被檢測(cè)者酒精中毒和酒精成癮易感程度的高低。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢測(cè)者的基因 分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其飲酒習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)者酒精中毒和酒精成癮遺傳易感的相對(duì) 風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)制定出針對(duì)于被檢測(cè)者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲酒習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議 等，并為被檢測(cè)者普及預(yù)防酒精中毒和酒精成癮的健康知識(shí)。
序列表
<110〉上海主健生物工程有限公司
<120〉 一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒
<160> 4
<210> 1 <211> 240 <212〉 DNA
<213〉人屬,人種(Homo sapiens, human) 〈400〉 1
gggagtgtaa cccataaccc ccaagagtga tttctgcaat ctcgtttcaa attacagggt 60 caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag 120 tggccgggsg ttgggcgagt acgggctgcs ggcatacact gaagtg3aaa ctgtgagtgt 180 gggscctgct gggggctcag ggcctgttgg ggcttg鄉(xiāng)g tctgctggtg gctcggeigcc 240
<210〉 2 <211> 19 <212> ■ <213>人工序列
<220>
<223〉引物 <400〉 2
tttggtggct acaag8tgt 19
〈210〉 3 <211> 16 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉引物 ■〉 3
ctccgagcca ccagca 16
<210〉 4 <211> 21 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>探針 <400> 4
gctgcaggca tacactaaag t 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒，包括檢測(cè)ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQIDNO: 1中第161 位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ ID NO: l中第 161位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這個(gè)SNP位點(diǎn)酒精中毒易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括lul 10 X熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液，0. lpl 25mM dNTP揮合液，0. 5^1 25raM MgCL溶液，0. 02^1 (5units/jil) Taq DNA聚合酶， 20jiM特異性引物對(duì)各0.225nl， 10nM特異性熒光探針0.25jxl，去離子水5.68fil。本試劑盒供一人份檢測(cè) 應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)酒精中毒和酒精成癮易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測(cè)分析個(gè)體的ALDH2基因上SNP位點(diǎn)基因攜帶型來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)酒精中毒和酒精成癮的易感性。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101109705SQ20061002920
公開日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者馮哲民, 屹 樓, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司