專利名稱：控制靈芝孢子、靈芝孢子油及其制劑質(zhì)量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥品或保健品質(zhì)量分析方法，具體是涉及一種測定靈芝孢子油、靈芝孢子及其制劑中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯含量的方法。
背景技術：
靈芝是擔子菌綱多孔菌科(Polyproraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝[Ganoderma lucidium(Leyss.ex Fr.)Karst.]和紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd.]的總稱，具有扶正固本等功效，被《本經(jīng)》稱為上品。靈芝孢子(Ganoderma lucidiumspore)是赤芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子，為靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，其藥用價值也正日益受到重視。靈芝孢子的藥理作用主要有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂以及對神經(jīng)、心血管和呼吸系統(tǒng)有調(diào)節(jié)改善作用。關于靈芝孢子的產(chǎn)品也越來越多，如靈芝孢子油、靈芝孢子及其它們的制劑有靈芝孢子油軟膠囊、靈芝孢子油脂肪乳注射劑、靈芝孢子油脂肪乳口服劑、靈芝孢子膠囊、靈芝孢子片、靈芝孢子散劑等，但真假難分，質(zhì)量優(yōu)劣難分，沒有一種好的控制質(zhì)量的方法。
靈芝孢子的化學成分復雜，文獻報道有以下幾類甾醇類、三萜類、生物堿類、脂肪酸類、內(nèi)酯、蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、維生素類、胡蘿卜素、和無機離子類等?，F(xiàn)有報道控制靈芝孢子質(zhì)量的文獻主要集中在水溶性成分靈芝多糖的含量測定，而對脂溶性成分的含量測定主要是用紫外光譜法測定靈芝孢子油中的總?cè)坪?，但在靈芝孢子中三萜的含量很少，測定時專屬性不強，在其它植物油用同樣的方法中也能測到該類成分。
靈芝孢子中含有較高含量的脂肪油，約20％～30％，可通過提取方法得到靈芝孢子油。靈芝孢子油主含脂肪酸酯，也含甾醇類物質(zhì)，具有與靈芝孢子相同的功效。1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯是在靈芝孢子油中含量最高的二種成分。所以建立靈芝孢子、靈芝孢子油及其制劑中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量測定方法是控制其質(zhì)量的一種有效方法。到目前為止，還沒有文獻報道用1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量來評價靈芝孢子、孢子油及其制劑的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效控制靈芝孢子又能控制靈芝孢子油及其制劑的質(zhì)量的方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種靈芝孢子油或靈芝孢子或其制劑的質(zhì)量控制方法是用高效液相色譜法測定其產(chǎn)品中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯和/或甘油三油酸酯的含量，每1g靈芝孢子、靈芝孢子油或相當于1g靈芝孢子、1g靈芝孢子油的制劑中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯的量分別為12.0mg～60.0mg、100.0mg～250.0mg和/或含甘油三油酸酯的量分別為8.0mg～45.0mg、80.0mg～200.0mg，所說的高效液相色譜法是按下述步驟進行一、供試品溶液的制備(1)靈芝孢子油及制劑供試品的制備取5～100mg靈芝孢子油或含靈芝孢子油5～100mg的制劑，以每1mg加0.3～1ml的流動相，溶解并定溶，搖勻，即得，所用流動相與色譜條件中的流動相相同；(2)靈芝孢子及其制劑供試品的制備取靈芝孢子0.1～10g或含靈芝孢子0.1～10g的制劑，采用有機溶劑提取，回收溶劑得靈芝孢子提取物，以每1mg提取物加0.3～1ml的流動相，溶解并定溶，搖勻，即得，所用流動相與色譜條件中的流動相相同。
二、對照品溶液的制備取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯對照品，加同供試品溶液的流動相溶解并定溶，搖勻，配成每1ml含0.08～0.15mg的1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或每1ml含0.05～0.15mg的甘油三油酸酯的溶液為對照品溶液；三、色譜條件用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈、異丙醇、二氯甲烷以任意比例的二元或三元組成混合液為流動相，流動相的流速0.5～2.0ml/min；用蒸發(fā)光散射檢測器或差示折光率檢測器檢測；理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰計算，均應不低于2000；色譜柱溫為10～50℃；四、測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10～20μl，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。
高效液相色譜法的具體操作方法可按中國藥典附錄規(guī)定的常規(guī)技術進行。
為了有效而正確的取得測定數(shù)據(jù)，高效液相色譜測定法步驟三的色譜條件中采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測為佳；所述的步驟三的色譜條件中是采用乙腈∶異丙醇的體積比為40～60∶60～40或乙腈∶二氯甲烷的體積比為40～60∶60～40作流動相為較佳流動相；以乙腈∶異丙醇的體積比為53∶47或乙腈∶二氯甲烷的體積比為59∶41作流動相為最佳流動相；所說的步驟三的色譜條件中色譜柱最佳柱溫30℃；最佳流動相的流速0.8ml/min。
本發(fā)明的有益效果該含量測定方法能準確的測定原料及制劑中的1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯和甘油三油酸酯的含量或二者之一的含量，可作為該產(chǎn)品質(zhì)量控制的方法和依據(jù)，方法簡便，可操作性強，重現(xiàn)性高，是控制靈芝孢子油和靈芝孢子及其制劑質(zhì)量的有效方法。
下面通過實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案實施例1 高效液相色譜法測定靈芝孢子油中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯含量的方法的研究(1)儀器與試藥儀器Waters2695高效液相色譜議，色譜柱KromasilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，Sedex75蒸發(fā)光散射檢測器。
試藥對照品1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯(縮寫為OOP，以下同)、甘油三油酸酯(縮寫為OOO，以下同)由sigma公司提供；靈芝孢子油由廣州某公司提供，乙腈和異丙醇為色譜純，其它試劑均為分析純。
(2)供試品溶液的制備精密稱取62.520mg靈芝孢子油，置25ml的量瓶中，加流動相溶解并定溶至刻度，即得供試品溶液，采用乙腈∶異丙醇的體積比為53∶47的溶液作流動相；對照品溶液的制備a、精密稱取對照品1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯3.198mg、置25ml的量瓶中，加同供試品溶液的流動相，溶解并定溶至刻度，即得對照品溶液a；b、精密稱取對照品甘油三油酸酯2.865mg，置25ml的量瓶中，加同供試品溶液的流動相，溶解并定溶至刻度，即得對照品溶液b；。
(3)色譜條件色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫30℃；流動相用乙腈-異丙醇的體積比為53∶47的溶液；流速為0.8ml/min；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測；(4)線性關系考察精密量取對照品溶液(mg/ml)，5、10、15、20、25μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果見表1。
表1 線性關系實驗數(shù)據(jù)(n＝5)

AY＝1.786835X+5.581751，R＝0.9996BY＝1.807921X+5.60036，R＝0.9997以上結(jié)果表明1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯在1.279μg～6.395μg范圍內(nèi)、甘油三油酸酯在1.146μg～5.730μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關系。(5)精密度試驗取對照品溶液10μl，重復進樣6次，1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯峰面積值的RSD＜2％，結(jié)果見表2。
表2 精密度試驗數(shù)據(jù)(n＝6)

試驗證明，精密度良好。
(6)穩(wěn)定性試驗取樣品供試液分別于0小時，1小時，4小時，8小時，12小時，24小時，分別進樣20μl，測得樣品中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯峰面積的RSD＜2％，結(jié)果見表3。
表3 穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)(n＝6)

試驗結(jié)果表明，樣品供試液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。
(7)重現(xiàn)性試驗照含量測定方法項下操作，對同一批樣品6份進行測定，求得1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的RSD值分別為1.01％、1.20％。見表4表4 重現(xiàn)性試驗數(shù)據(jù)

試驗結(jié)果表明，該測定方法的重現(xiàn)性良好。
(8)回收率試驗用加樣回收，精密稱取已知含量的樣品25mg，分別精密加入1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯對照品，照含量測定項下操作，結(jié)果見表5、6。
表5 OOP回收率試驗結(jié)果


表6 OOO回收率試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明OOP回收率在95.99-99.81％之間、OOO回收率在96.55-99.76％之間，加樣回收良好。
(9)靈芝孢子油中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯含量測定照上述含量測定的方法操作，測定了3個樣品靈芝孢子油中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量，結(jié)果見表7。
表7 樣品中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量測定結(jié)果(n＝2)

測得三批靈芝孢子油中每1g含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量分別在125.88～191.26mg、109.76～175.57mg之間。
實施例2.靈芝孢子油乳劑中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量測定用高效液相色譜法測定色譜條件用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫30℃；流動相乙腈∶異丙醇的體積比為40∶60的溶液；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0.5ml/min。理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰計算，均大于2000；對照品溶液的制備取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯對照品2.98mg、2.67mg，置25ml的量瓶中，加流動相溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1ml分別含0.119mg、0.107mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取含靈芝孢子油乳劑(廣州某公司提供)1.025g，加入0.2g無水硫酸鈉，于水浴上加熱使乳劑破裂，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以乙醚萃取3次，每次2.0ml，合并乙醚液，蒸干，加流動相乙腈∶異丙醇的體積比為40∶60的溶液溶解，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，并定溶至刻度，即得供試品溶液；測定結(jié)果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。每1g乳劑中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯分別為15.21mg、11.43mg。
實施例3 靈芝孢子油中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯含量測定用高效液相色譜法測定色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫30℃；流動相乙腈∶異丙醇的體積比為60∶40的溶液；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0.8ml/min。理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯峰計算，大于2000；對照品溶液的制備取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯對照品3.04mg，置25ml的量瓶中，加流動相溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1ml分別含0.122mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取含靈芝孢子油52.52mg，置25ml量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；測定結(jié)果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μ1，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。每1g靈芝孢子油中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯187.93mg。
實施例4 靈芝孢子油中甘油三油酸酯含量測定色譜條件用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫30℃；流動相乙腈∶二氯甲烷的體積比為50∶50的溶液；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0.8ml/min。理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計算，大于2000；對照品溶液的制備精密稱取甘油三油酸酯對照品2.49mg，置25ml的量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含0.100mg、的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取含靈芝孢子油52.72mg，置25ml量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；測定結(jié)果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。每1g靈芝孢子油中含甘油三油酸酯147.57mg。
實施例5、靈芝孢子中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯的含量測定用高效液相色譜法測定色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫室溫；流動相乙腈∶二氯甲烷的體積比為59∶41的溶液，蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速1.0ml/min。理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰計算，均大于2000；對照品溶液的制備取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯對照品2.98mg、2.67mg，置25ml的量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1ml分別含0.119mg、0.107mg的溶液，即得對照品溶液；供試品溶液的制備精密稱取靈芝孢子302.45mg，置索氏提取器中，加入乙醚30ml，冷浸過夜，再加入乙醚50ml，于水浴加熱提取8小時，提取液回收乙醚至盡，殘渣以流動相溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，并定溶至刻度，即得供試品溶液；測定結(jié)果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。每1g靈芝孢子中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯、甘油三油酸酯分別為46.28mg、34.52mg。
實施例6 靈芝孢子片中1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯的含量測定色譜條件用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫20℃；流動相乙腈∶異丙醇∶二氯甲烷的體積比為45∶35∶20的溶液，差示折光率檢測器檢測；流速1.0ml/min。理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯大于2000。
對照品溶液的制備精密稱取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯對照品2.98mg置25ml的量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1ml分別含0.119mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取靈芝孢子片20片研細，精密稱取501.32mg、置索氏提取器中，加入乙醚50ml，于水浴加熱提取8小時，提取液回收乙醚至盡，殘渣以流動相溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，并定溶至刻度，搖勻，即得；測定結(jié)果分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。每片靈芝孢子片中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯16.43mg。
實施例7 靈芝孢子膠囊中甘油三油酸酯的含量測定色譜條件 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Kromasil C18，4.6mm×250mm，5um柱；柱溫25℃；流動相乙腈∶異丙醇的體積比為51∶49的溶液，差示折光率檢測器檢測；流速1.0ml/min。理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計算大于2000。
對照品溶液的制備精密稱取甘油三油酸酯對照品2.67mg，置25ml的量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含0.107mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取靈芝孢子膠囊15粒，研細，精密稱取503.16mg，置索氏提取器中，加入乙醚50ml，于水浴加熱提取8小時，提取液回收乙醚至盡，殘渣以流動相溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，并定溶至刻度，搖勻，即得；測定結(jié)果精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。每粒靈芝孢子膠囊中含甘油三油酸酯為15.87mg。
權利要求
1.一種控制靈芝孢子油或靈芝孢子及其制劑質(zhì)量的方法，其特征在于，用高效液相色譜法測定其產(chǎn)品中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯和/或甘油三油酸酯的含量，每1g靈芝孢子、靈芝孢子油或相當于1g靈芝孢子、1g靈芝孢子油的制劑中含1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯的量分別為12.0mg～60.0mg、100.0mg～250.0mg和/或含甘油三油酸酯的量分別為8.0mg～45.0mg、80.0mg～200.0mg，所說的高效液相色譜法是按下述步驟進行一、供試品溶液的制備(1)靈芝孢子油及其制劑供試品的制備取5～100mg靈芝孢子油及其含靈芝孢子油5～100mg的制劑，以每1mg加0.3～1ml的流動相，溶解并定溶，搖勻，即得，所用流動相與色譜條件中的流動相相同；(2)靈芝孢子及其制劑供試品的制備取靈芝孢子0.1～10g或含靈芝孢子0.1～10g的制劑，采用有機溶劑提取，回收溶劑得靈芝孢子提取物，以每1mg提取物加0.3～1ml的流動相，溶解并定溶，搖勻，即得，所用流動相與色譜條件中的流動相相同；二、對照品溶液的制備取1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯對照品，加同供試品溶液的流動相溶解并定溶，搖勻，配成每1ml含0.08～0.15mg的1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯，或每1ml含0.05～0.15mg的甘油三油酸酯的溶液；三、色譜條件用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈、異丙醇、二氯甲烷三種溶劑以任意比例的二元或三元組成的混合液為流動相，流動相的流速為0.5～2.0ml/min；用蒸發(fā)光散射檢測器或差示折光率檢測器檢測；理論板數(shù)按1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油三酯或甘油三油酸酯峰計算，均應不低于2000；色譜柱溫為10～50℃；四、測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10～20μl，注入高效液相色譜儀，測定，取對數(shù)計算，即得。
2.根據(jù)權利要求1所述的控制質(zhì)量的方法，其特征在于，所說的高效液相色譜測定法步驟三的色譜條件中采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。
3.根據(jù)權利要求1所述的控制質(zhì)量的方法，其特征在于，所述的步驟三的色譜條件中是采用乙腈∶異丙醇的體積比為40～60∶60～40或乙腈∶二氯甲烷的體積比為40～60∶60～40作流動相，流動相的流速為0.8ml/min。
4.根據(jù)權利要求3所述的控制質(zhì)量的方法，其特征在于，所述的步驟三的色譜條件中是采用以乙腈∶異丙醇的體積比為53∶47或乙腈∶二氯甲烷的體積比為59∶41作流動相。
5.根據(jù)權利要求1所述的控制質(zhì)量的方法，其特征在于，所說的步驟三的色譜條件中色譜柱溫為30℃。
全文摘要
控制靈芝孢子油、靈芝孢子及其制劑質(zhì)量的方法，涉及一種藥品或保健品控制質(zhì)量的方法。具體是用高效液相色譜法測定其產(chǎn)品中含1，2－油酸－3－棕櫚酸甘油三酯和/或甘油三油酸酯的含量，每1g靈芝孢子、靈芝孢子油或相當于1g靈芝孢子、1g靈芝孢子油的制劑中含1，2－油酸－3－棕櫚酸甘油三酯的量分別為12.0mg～60.0mg、100.0mg～250.0mg和/或含甘油三油酸酯的量分別為8.0mg～45.0mg、80.0mg～200.0mg，該方法可準確控制產(chǎn)品的質(zhì)量，可操作性強，重現(xiàn)性高，特異性強。
文檔編號G01N30/00GK1850125SQ200610033699
公開日2006年10月25日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權日2006年2月21日
發(fā)明者李吉來, 寧德山, 黃海, 陳路林 申請人:廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司