專利名稱：一種新穎的化學發(fā)光酶免疫分析方法
技術領域：
本發(fā)明屬于臨床及實驗室化學發(fā)光免疫分析方法技術領域，更具體地說，本發(fā)明所揭示的化學發(fā)光免疫分析方法與通常的免疫分析方法相比減少了或無需分離步驟。
背景技術：
近年來隨著新型自動化儀器和新型試劑的開發(fā)，臨床及實驗室免疫分析方法的研究取得了極大進展，基于其優(yōu)異的特異性以及抗體-抗原結合反應的無限多樣性，免疫分析方法被廣泛應用于生物醫(yī)學及臨床診斷領域。
在特異性結合分析中，通常是一種物質(一般為目的分析物)充當橋聯(lián)中介，將兩個受體(例如，抗體、抗原、或DNA探針)聯(lián)結起來形成“夾心”復合物，該復合物中的兩個受體至少有一個被標記。在非均相免疫分析中，沒有形成免疫復合物的被標記受體被分離除去，通過測定分析體系中所剩余被標記物的含量即可測定目的分析物。而在均相免疫分析中，無需將沒有形成免疫復合物的被標記受體被分離除去。相比而言，在此意義上均相免疫分析是一種更優(yōu)越的方法。但是由于設計上的困難，均相免疫分析在實際應用上還多只限于小分子目的分析物的測定。
化學發(fā)光免疫分析是新近十來年發(fā)展起來的，基于放射免疫分析的基本原理將化學發(fā)光與免疫反應結合起來建立的一種分析方法。根據(jù)標記方法的不同，化學發(fā)光免疫分析方法可分為化學發(fā)光標記免疫分析方法和酶標記的、以化學發(fā)光酶底物作信號試劑的化學發(fā)光酶免疫分析方法?；瘜W發(fā)光標記免疫分析方法用化學發(fā)光試劑直接標記抗體、抗原或DNA探針，丫錠酯類化合物(acridinium ester)是目前應用最廣泛的化學發(fā)光標記物。此類化合物在NaOH-H2O2作用下產生強烈的閃爍發(fā)光?；瘜W發(fā)光酶免疫分析方法則屬于酶免疫分析范疇，該方法用酶標記的生物活性物質(如抗體或抗原)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶作用于化學發(fā)光底物而產生光信號。最常用的酶標記為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosphotase，AP)。其中，使用辣根過氧化物酶作標記的化學發(fā)光酶免疫分析方法常用的底物有魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼，luminol)、異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰肼，isoluminol)以及新近報道的二氫丫啶酯類化合物(acridan ester)。
已有的研究表明，在辣根過氧化物酶催化的過氧化物氧化反應中，過氧化物(通常為過氧化氫)首先將辣根過氧化物酶活性中心的FeIII氧化成FeIV＝O，含有該高氧化態(tài)活性中心的酶作用于底物，使得其被氧化，同時自身轉化回初始態(tài)辣根過氧化物酶。
現(xiàn)有的化學發(fā)光酶免疫分析方法絕大多數(shù)為非均相系統(tǒng)，例如美國公司DPC的Immulite全自動免疫分析儀以堿性磷酸酶為標記物，1，2-環(huán)二氧乙烷為發(fā)光底物，采用聚苯乙烯珠為載體。美國公司Beckman Coulter的Access系統(tǒng)采用磁性微粒子(magnetic microparticles)作載體，其特點是磁性微粒子表面積大，結合快，達到最大發(fā)光信號時間短。所有這些非均相系統(tǒng)都不可避免地需要有多次分離洗滌步驟，故此不但耗時而且增加了自動化儀器的設計難度。
德國公司Dade Behring新近開發(fā)的一項技術采用兩種微粒子，其中一種微粒子附載有目的分析物之特異性結合物及光敏化劑(photosensitizer)，另一種微粒子附載有目的分析物之特異性結合物及一種能夠與單線態(tài)氧反應而產生化學發(fā)光的化合物。當被分析介質中含有目的分析物時，由于免疫復合物的形成，使得光敏化劑與上述化合物空間上接近，在外來光的激發(fā)和氧存在下，光敏化劑產生單線態(tài)氧，由于其壽命極短，只能擴散至極為鄰近的區(qū)域，只有存在于免疫復合物中的上述化合物能捕獲到單線態(tài)氧而產生化學發(fā)光。根據(jù)此技術設計的分析系統(tǒng)可以避免分離洗滌步驟。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種新的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其原理基于如下現(xiàn)象一體系中同時含有辣根過氧化物酶標記的抗體及辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的相同或相似抗體，實驗表明，當體系中含有上述抗體之抗原時，加入過氧化物后所產生的化學發(fā)光強度高出體系中不含相應抗原時的發(fā)光強度。此處，當體系中存在相應抗原時，即可形成“夾心”免疫復合物，在該免疫復合物中辣根過氧化物酶與其化學發(fā)光底物在空間上彼此鄰近；反之，若當體系中不含相應抗原時，即無法形成免疫復合物，辣根過氧化物酶與其化學發(fā)光底物游離存在于體系中。很顯然，在前一情形中，辣根過氧化物酶與其化學發(fā)光底物在空間上的彼此鄰近促進了化學發(fā)光反應。雖然化學發(fā)光反應被促進的具體機制尚不清楚，但這并不防礙根據(jù)該實驗現(xiàn)象來設計新的化學發(fā)光酶免疫分析方法。
根據(jù)本發(fā)明所提供的分析方法，在非競爭性免疫分析中，將被分析樣品與辣根過氧化物酶標記的目的分析物之特異性結合物質及辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的目的分析物之特異性結合物質相混合，當被分析樣品中含有目的分析物時，上述被標記的特異性結合物質與目的分析物結合形成免疫復合物，在其中，辣根過氧化物酶與其辣化學發(fā)光底物在空間上彼此鄰近，在過氧化物作用下產生增強的化學發(fā)光，通過測定該發(fā)光強度即可定性或定量地檢測目的分析物，該過程無需分離步驟，從而可以實現(xiàn)均相免疫分析。
此處，特異性結合物質是指一種能選擇性地與某一物質(大分子或小分子)特異性結合的化合物。通常該兩種物質被稱為特異性結合配對物，在本發(fā)明中，它們包括免疫學意義上的抗體-抗原，也包括其它特異性結合配對物，例如，生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)、荷爾蒙-荷爾蒙受體、IgG-蛋白A以及DNA-DNA、DNA-RNA等等。
辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物是指一種在辣根過氧化物酶和過氧化物存在下，于適合的化學反應條件下能夠產生化學發(fā)光的化合物。這里，適合的化學反應條件是指諸如介質、溫度、pH值以及其它反應物的參與，等等因素，故此，在該反應體系中，除該化合物、辣根過氧化物酶及其化學發(fā)光底物之外，不排除其它化學組分的存在，例如發(fā)光增強劑、輔助增強劑等。雖然在本發(fā)明的實例中，只使用了魯米諾、異魯米諾以及二氫丫啶羰基磺酰胺作為辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物，但基于本發(fā)明的原理，任何一位熟知本技術領域的人士都可輕易將此推廣至其它辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物，因此需要特別指出，本發(fā)明之權利要求書中所述的辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物包含任何符合上述定義的化合物。
根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，在一種情形下，辣根過氧化物酶標記的特異性結合物質與其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，二者當中有一者附載于固相表面，該固相表面可以是檢測分析所用容器的內壁，也可以是任何一種固體微粒。此處，被固載化的辣根過氧化物酶或其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質可以是標記物與該特異性結合物質的直接偶聯(lián)物(conjugate)，也可以由標記物與該特異性結合物質分別附載于該固相表面而形成。例如，可以將異魯米諾標記的抗體通過物理吸附或化學鍵聯(lián)的方式附載于96孔微板的內壁，也可將該異魯米諾標記的抗體通過物理吸附或化學鍵聯(lián)的方式附載于某種固體微粒表面，同時還可以將異魯米諾和該抗體分別通過物理吸附或化學鍵聯(lián)的方式彼此鄰近地附載于同一固相表面，如上所述，該固相表面可以是檢測分析所用容器的內壁，也可以是任何一種固體微粒。在上述這些情形下，免疫復合物形成于固相表面，檢測靈敏度有顯著提高。
根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，在另一種情形下，辣根過氧化物酶標記的特異性結合物質與其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，二者分別附載于兩種固相表面。此處可以有以下兩種設計，第一種情形，辣根過氧化物酶標記的特異性結合物質與其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，二者當中有一者附載于檢測分析所用容器的內壁，另者附載于一種可自由懸浮(suspensible)的固體微粒上，此處，該可自由懸浮的固體微粒的大小須小至一定程度，使得該固體微粒與水的懸浮液在無外力存在下能穩(wěn)定存在相當長時間。第二種情形，辣根過氧化物酶標記的特異性結合物質與其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，二者分別附載于兩種可自由懸浮的固體微粒上，該兩種固體微粒的性狀如上所述。在此兩種情形下，與前文所述類似，被固載化的辣根過氧化物酶或其化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質可以是標記物與該特異性結合物質的直接偶聯(lián)物(conjugate)，也可以由標記物與該特異性結合物質分別附載于該固相表面而形成。這里，免疫復合物的形成將兩種固相表面橋聯(lián)起來，而沒有形成免疫復合物的辣根過氧化物酶以及其化學發(fā)光底物則分別存在于彼此分開的兩種固相表面，這將有助于提高信噪比。
根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，在非競爭性免疫分析的形式下，各組分混合的次序對分析結果影響并不顯著。值得指出的是，根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，將被標記的特異性結合物質固載化可以顯著提高檢測靈敏度。此處，雖然固載化過程本身可能需要分離洗滌步驟，但所有固載化過程可以預先完成，而在實際分析檢測過程中無需分離洗滌步驟，故此，極大地縮短了分析時間，而且有助于簡化儀器設計，縮小儀器體積，有利于便攜式設備的設計與生產。
本發(fā)明所提供的方法也可應用于競爭性免疫分析。在此情形下，辣根過氧化物酶標記的目的分析物與被分析樣品中可能存在的目的分析物相競爭，同辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的相應目的分析物之特異性結合物質結合形成免疫復合物；或者，辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的目的分析物與被分析樣品中可能存在的目的分析物相競爭，同辣根過氧化物酶標記的相應目的分析物之特異性結合物質結合形成免疫復合物。被標記的目的分析物所形成的免疫復合物，在過氧化物作用下產生增強的化學發(fā)光。因此當被標記的目的分析物和被標記的目的分析物之特異性結合物質使用量固定時，被分析樣品中存在的目的分析物含量越大，體系中被標記的目的分析物形成免疫復合物的幾率就越小，過氧化物作用下所產生的化學發(fā)光強度也就越弱，據(jù)此便可測定被分析樣品中目的分析物的含量。此處，被標記的目的分析物之特異性結合物質可以附載于一種固相表面，該固相表面可以是檢測分析所用容器的內壁，也可以是任何一種固體微粒。如前所述，固載化了的被標記的目的分析物之特異性結合物質可以是標記物與該特異性結合物質的直接偶聯(lián)物(conjugate)，也可以由標記物與該特異性結合物質分別附載于該固相表面而形成。
具體實施例方式
下面通過具體的實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述。
實施例1異魯米諾標記的兔抗鼠IgG的制備根據(jù)文獻方法由N-4-氨基丁基-N-乙基異魯米諾(ABEI)與硫光氣反應制得N-4-氨基丁基-N-乙基異魯米諾異硫氰酸酯(ABEI-ITC)。ABEI-ITC標記兔抗鼠IgG的反應在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.5)中進行，反應中ABEI-ITC與抗體的摩爾比為10∶1，反應后抗體經Sephedex G-25凝膠層析純化，所得抗體溶液濃度為0.25mg/mL。
鼠IgG的檢測分析配制六種不同濃度的鼠IgG溶液(Tris緩沖液，0.1M，pH 8.5)(100μL)，向上述每種溶液加入10μL上述異魯米諾標記的兔抗鼠IgG溶液，混合放置2分鐘后加入10μL辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG F(ab)2(0.25mg/mL)，混合放置2分鐘后加入50μL H2O2-四苯硼鈉溶液(Tris緩沖液，0.1M，pH 8.5，H2O2濃度7.5mM，四苯硼鈉濃度0.8mM)，2秒鐘后紀錄發(fā)光強度，結果如下

實施例2二氫丫啶-9-羰基磺酰胺標記的兔抗鼠IgG的制備10-(3-磺酸基丙基)二氫丫啶-9-羰基[N-對甲苯磺酰-N-(3-羧基丙基)]酰胺由相應的丫錠化合物(acridinium 9-carboxamide)經鋅/氯化銨還原反應制得，用HPLC提純。標記反應在酸性緩沖液(0.1M MES，pH 4.7)中使用EDC偶聯(lián)方法完成，反應期間標記化合物與抗體的摩爾比為10∶1，反應后抗體經Sephedex G-25凝膠層析純化，所得抗體溶液濃度為0.25mg/mL。
鼠IgG的檢測分析按照實施例1所述方法進行，結果如下

實施例3將實施例1中制得的異魯米諾標記的兔抗鼠IgG溶液稀釋10倍。取一可分離式96孔微板，向其中一縱列條(strip)各孔中加入100μL上述稀釋了的抗體溶液，4℃下放置過夜，充分洗滌(10×200μL)，加入100μL1％BSA溶液，37℃恒溫1小時，充分洗滌(10×200μL)，向該縱列條各孔中依次加入100μL不同濃度的鼠IgG溶液(Tris pH 8.5)，稍后加入10μL辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG F(ab)2(0.25mg/mL)，混合放置2分鐘后加入50μL H2O2-四苯硼鈉溶液(Tris緩沖液，0.1M，pH 8.5，H2O2濃度7.5mM，四苯硼鈉濃度0.8mM)，2秒鐘后紀錄發(fā)光強度，結果如下


實施例4用二氫丫啶-9-羰基磺酰胺標記的兔抗鼠IgG取代實施例3中的異魯米諾標記的兔抗鼠IgG，進行同樣實驗，結果如下

實施例5將1mL 10％聚苯乙烯乳膠顆粒(latex particle，1.0μm)水溶液離心分離，所得聚苯乙烯乳膠顆粒以去離子水洗滌(4×1mL)，然后懸浮于1mL去離子水中制成乳液。將2mL按實施例2制得的二氫丫啶-9-羰基磺酰胺標記的兔抗鼠IgG溶液與0.5mL上述聚苯乙烯乳膠顆粒懸浮液混合，置于4℃搖床上過夜，離心分離，將所得乳膠顆粒充分洗滌(6×1mL)后懸浮于10mL緩沖液(0.1M Tris，pH 7.4)中制成乳液。取一可分離式96孔微板，向其中一縱列條(strip)各孔中加入100μL不同濃度的鼠IgG溶液(Tris pH 8.5)，然后加入10μL上述附載有二氫丫啶-9-羰基磺酰胺-兔抗鼠IgG的聚苯乙烯乳膠顆粒懸浮液，混合放置2分鐘，加入10μL辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG F(ab)2(0.25mg/mL)，混合放置2分鐘后加入50μLH2O2-四苯硼鈉溶液(Tris緩沖液，0.1M，pH 8.5，H2O2濃度7.5mM，四苯硼鈉濃度0.8mM)，2秒鐘后紀錄發(fā)光強度，結果如下

實施例6將4mL 2.5％附載有魯米諾的聚苯乙烯乳膠顆粒(1.0μm，Polysciences)水溶液離心分離，所得聚苯乙烯乳膠顆粒以去離子水洗滌(4×1mL)，然后懸浮于1mL去離子水中制成乳液。將2mL兔抗鼠IgG溶液(0.4mg/mL)與0.5mL上述聚苯乙烯乳膠顆粒懸浮液混合，置于4℃搖床上過夜，離心分離，將所得乳膠顆粒充分洗滌(6×1mL)后懸浮于10mL緩沖液(0.1M Tris，pH 7.4)中制成乳液。采用此同時附載有魯米諾及兔抗鼠IgG的聚苯乙烯乳膠顆粒乳液，按照實施例5所述方法進行鼠IgG檢測分析，結果如下


實施例7將1mL 10％羧基乳膠顆粒(carboxylated latex particle，0.7μm)水溶液離心分離，所得羧基乳膠顆粒以去離子水洗滌(4×1mL)，然后懸浮于1mL去離子水中制成乳液。將2mg ABEI與0.5mL上述羧基乳膠顆粒懸浮液于1.5mL緩沖液(MES，pH 4.7)中，在EDC存在下反應3小時，離心分離，所得微顆粒以去離子水洗滌(6×2mL)，再與0.1mg兔抗鼠IgG于同樣條件下反應3小時，離心分離，以去離子水洗滌(6×2mL)后懸浮于10mL緩沖液(0.1M Tris，pH 7.4)中制成乳液A。另將0.1mg辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG F(ab)2與0.5mL上述羧基乳膠顆粒懸浮液于1.5mL緩沖液(MES，pH 4.7)中，在EDC存在下反應3小時，離心分離，所得微顆粒以去離子水洗滌(6×2mL)，懸浮于10mL緩沖液(0.1M Tris，pH 7.4)中制成乳液B。
取一可分離式96孔微板，向其中一縱列條(strip)各孔中加入100μL不同濃度的鼠IgG溶液(Tris pH 8.5)，然后加入10μL乳液A，混合放置2分鐘，加入10μL乳液B，混合放置2分鐘后加入50μLH2O2-四苯硼鈉溶液(Tris緩沖液，0.1M，pH 8.5，H2O2濃度7.5mM，四苯硼鈉濃度0.8mM)，2秒鐘后紀錄發(fā)光強度，結果如下


權利要求
1.一種用于臨床及實驗室檢測的化學發(fā)光酶免疫分析方法，該方法包含以下特征環(huán)節(jié)1)將下列組分A.辣根過氧化物酶標記的特異性結合物質，B.辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，C.被分析樣品，按某一次序混合。當樣品中含有目的分析物時，A和B因與該目的分析物特異性結合形成免疫反應復合物而空間上彼此接近；2)加入一種或多種過氧化物。在上述免疫反應復合物中，辣根過氧化物酶與其化學發(fā)光底物空間上比鄰，在過氧化物存在下產生化學發(fā)光，其強度高于樣品中不含目的分析物時的情形。通過測定該發(fā)光強度，便可定性或定量地檢測目的分析物。
2.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述組分A與B中有一組分附載于固相表面，該固相表面是下列情形中的一種1)檢測分析所用容器的內壁，2)固體微粒。
3.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述組分A與B分別附載于兩種固相表面，并為下列情形中的一種1)組分A與B中有一組分附載于檢測分析所用容器的內壁，另一組分附載于固體微粒；2)組分A與B所附載于的固相表面為固體微粒。
4.根據(jù)權利要求2～3任意一項所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述組分A與B中至少有一組分，其中所述標記物與所述特異性結合物質并非直接聯(lián)結，而是彼此鄰近地附載于所述固相表面。
5.一種用于臨床及實驗室檢測的化學發(fā)光酶免疫分析方法，該方法包含以下特征環(huán)節(jié)1)將被分析樣品與A.辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的目的分析物、B.辣根過氧化物酶標記的相應目的分析物之特異性結合物質相混合，或者將被分析樣品與A.辣根過氧化物酶標記的目的分析物、B.辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的相應目的分析物之特異性結合物質相混合。被標記的目的分析物同被分析樣品中存在的目的分析物相競爭，與被標記的相應目的分析物之特異性結合物質結合形成免疫復合物；2)加入一種或多種過氧化物。被標記的目的分析物與被標記的相應目的分析物之特異性結合物質形成的免疫復合物中，辣根過氧化物酶與其化學發(fā)光底物空間上比鄰，在過氧化物存在下產生化學發(fā)光，通過測定該發(fā)光強度，便可定性或定量地檢測目的分析物。
6.根據(jù)權利要求5所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述被標記的目的分析物之特異性結合物質附載于固相表面，該固相表面是下列情形中的一種1)檢測分析所用容器的內壁，2)固體微粒。
7.根據(jù)權利要求6所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述標記物(辣根過氧化物酶或辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物)與所述特異性結合物質并非直接聯(lián)結，而是彼此鄰近地附載于所述固相表面。
8.根據(jù)權利要求1～7任意一項所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，所述特異性結合物質是下列情形之一1)抗體，2)抗原，3)DNA探針。
9.根據(jù)權利要求1～9任意一項所述的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，該方法無需分離步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于臨床及實驗室檢測的化學發(fā)光酶免疫分析方法，其特征在于，使用辣根過氧化物酶標記的以及辣根過氧化物酶化學發(fā)光底物標記的特異性結合物質，檢測分析過程中可以避免分離步驟。
文檔編號G01N33/543GK101051047SQ20061003485
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月4日 優(yōu)先權日2006年4月4日
發(fā)明者楊宵臨, 紀鑫 申請人:張薇