專利名稱：海水魚卵子石蠟切片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種海水魚卵子石蠟切片技術(shù)，是在已有石蠟切片技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)固定劑、脫水程序、透明程序、透蠟方法以及染色方法進(jìn)行全面改進(jìn)的方法。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明做出之前，石蠟切片由于操作簡單、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，一直是傳統(tǒng)的生物學(xué)研究技術(shù)，石蠟切片包括固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、染色、透明以及封片等步驟，在生物學(xué)的許多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。但是由于海水魚卵子有著特殊的卵膜構(gòu)造，其石蠟切片的效果一直不盡人意，對(duì)于淡水魚卵，國內(nèi)外采用了剝除卵膜后按傳統(tǒng)方法進(jìn)行石蠟切片的方法，效果明顯提高。但是由于海水魚類卵子的卵周隙較小，剝除卵膜操作困難且很容易造成卵子破裂；沒有剝除卵膜的卵子在進(jìn)行切片時(shí)，由于卵膜的阻擋作用，往往存在卵子變形、切片破碎等問題；在固定劑方面，采用常用的光鏡樣品固定劑，對(duì)于海水魚卵子樣品的固定效果不理想，導(dǎo)致切片不完整；在脫水程序中，由于魚卵帶有卵膜，影響卵膜內(nèi)外的物質(zhì)交流，常規(guī)的脫水方法會(huì)由于脫水過快導(dǎo)致卵子變形；在透明程序中，脫水后的魚卵進(jìn)入二甲苯后迅速變形，且不可恢復(fù)；在透蠟程序中，由于石蠟分子量較大，卵膜對(duì)其的阻擋作用更強(qiáng)，導(dǎo)致透蠟不完全；目前一直沒有效果較好的海水魚卵子石蠟切片方法，有些研究者只能采用費(fèi)用、設(shè)備都要求較高的電鏡觀察方法，限制了對(duì)海水魚類早期發(fā)育生物學(xué)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠改善和提高海水魚卵子石蠟切片質(zhì)量的方法，通過該方法的實(shí)施，可以省略費(fèi)時(shí)的剝除卵膜步驟，簡化和改善海水魚卵子石蠟切片的效果，解決海水魚卵子石蠟切片過程中的卵子變形、蠟片不連續(xù)、有空洞的問題。
本發(fā)明是按以下操作技術(shù)完成的石蠟切片包括固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、染色、透明以及封片，本發(fā)明在海水魚卵子石蠟切片過程中，對(duì)固定劑、脫水程序、透明程序、透蠟方法、包埋程序和染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，即進(jìn)行了固定劑的選擇、脫水程序的確定、透明程序的確定、透蠟程序的確定、染色方法的改進(jìn)。
固定劑的選擇采用電鏡樣品固定常用的戊二醛，戊二醛的濃度為1.5％，采用脫脂棉過濾的海水作為溶劑。固定過程中更換固定液3～4次。
脫水程序的確定樣品采用乙醇脫水，采用85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min。85％到95％乙醇采取10％的濃度梯度，95％到100％乙醇采取5％的濃度梯度，每梯度2次脫水程序，樣品脫水前用100％瓊脂將樣品包埋定位。
透明程序的確定采取1∶1的二甲苯∶乙醇過渡方法。具體透明過程如下1∶1二甲苯100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s。
透蠟程序的確定和包埋透蠟采用熔點(diǎn)為42～47℃的軟蠟，透蠟程序如下透蠟時(shí)間3小時(shí)，期間換蠟一次，即石蠟1h30min，石蠟1h30min，透蠟后用紙盒包埋。采用普通生物切片機(jī)切片，切片厚度5μm；用恒溫水浴展片，動(dòng)物膠貼片。
染色方法的改進(jìn)染色采用了曙紅蘇木素復(fù)染，蘇木素染液配方如下熱蒸餾水2000ml，蘇木素2g，碘酸納0.4g，鉀明礬150g，檸檬酸2g，水和氯醛100g；伊紅染液配方1％曙紅Y水溶液100m1，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。
本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)是1、本發(fā)明省略了魚卵石蠟切片過程中難以操作的卵膜剝離程序，簡化了程序、提高了工作效率。
2、本發(fā)明克服了海水魚卵子石蠟切片中存在的卵子變形、切片不連續(xù)、存在空洞等問題，切片厚度可達(dá)5μm。
3、本發(fā)明方法操作簡單，不需要專門設(shè)備，藥品易得，便于推廣使用。


圖1、大菱鲆卵子切片，示減數(shù)分裂中卵子皮層中的紡錘體。
1-卵子皮層、2-紡錘體圖2、大菱鲆卵子切片，示卵裂中卵子中的紡錘體。
2-紡錘體
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方法
石蠟切片包括固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、透明以及封片。本發(fā)明在海水魚卵子石蠟切片過程中，對(duì)固定劑、脫水程序、透明程序、透蠟方法、包埋程序和染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，即進(jìn)行了固定劑的選擇、脫水程序的確定、透明程序的確定、透蠟程序的確定、染色方法的改進(jìn)。
固定劑的選擇常用的光鏡樣品固定劑，對(duì)于海水魚卵子樣品的固定效果并不理想，在切片過程中常出現(xiàn)切片破裂等情況。我們采用電鏡樣品固定常用的戊二醛，取得了良好的固定效果，切片連續(xù)，破裂情況大大減少。戊二醛的濃度為1.5％，為了保證固定液與魚卵滲透壓的一致性，采用脫脂棉過濾的海水作為溶劑。為了保證戊二醛固定液的濃度，固定過程中更換固定液3～4次。
脫水程序由于魚卵帶有卵膜，影響卵膜內(nèi)外的物質(zhì)交流，常規(guī)的脫水方法會(huì)由于脫水過快導(dǎo)致卵子變形，經(jīng)過不斷修改脫水程序，我們采用的脫水程序如下85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min；85％到95％乙醇采取10％的濃度梯度，95％到100％乙醇采取5％的濃度梯度，每梯度2次的脫水程序，獲得了較好的脫水效果，卵子脫水完全，基本無收縮、變形情況。另外樣品脫水前用100％瓊脂將樣品包埋定位，這樣可以方便以后的操作。
透明程序在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，脫水后的魚卵進(jìn)入二甲苯后迅速變形，且不可恢復(fù)，為此，我們采取了1∶1的二甲苯∶乙醇過渡的方法，很好地解決了這一問題。具體透明過程如下1∶1二甲苯∶100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s。
透蠟、包埋和切片程序由于石蠟分子量較大，卵膜對(duì)其的阻擋作用很強(qiáng)，因此，我們采用了較長的透蠟時(shí)間，為了防止透蠟時(shí)間過長而導(dǎo)致樣品發(fā)脆，我們又采用熔點(diǎn)較低的石蠟，這樣，取得了很好的效果，透蠟完全，切片完整。透蠟采用熔點(diǎn)為42～47℃的軟蠟，透蠟程序如下透蠟時(shí)間3小時(shí)，期間換蠟一次，即石蠟1h30min，石蠟1h30min，透蠟后用紙盒包埋。采用普通生物切片機(jī)切片，切片厚度5μm；用恒溫水浴展片，動(dòng)物膠貼片。
脫蠟、染色和封片方法脫蠟采取二甲苯脫蠟，具體程序如下二甲苯5min，二甲苯5min，然后進(jìn)行復(fù)水，具體程序如下100％乙醇2min，100％乙醇2min，95％乙醇2min，95％乙醇2min，80％乙醇2min，80％乙醇2min，50％乙醇2min，蒸餾水2min；復(fù)水后的切片用曙紅蘇木素復(fù)合染色。有文獻(xiàn)表明，戊二醛固定液會(huì)影響切片的染色情況，造成染色淺，分色不明顯，為此我們對(duì)1.5％戊二醛海水固定液固定樣品的切片進(jìn)行了染色觀察，染色采用了曙紅蘇木素復(fù)染，蘇木素染液配方如下熱蒸餾水2000m1，蘇木素2g，碘酸納0.4g，鉀明礬150g，檸檬酸2g，水和氯醛100g；曙紅染液配方1％曙紅Y水溶液100m1，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。具體程序如下蘇木素3min50s，自來水沖洗4min，曙紅2min30s；結(jié)果表明，戊二醛固定液對(duì)染色沒有明顯的影響，切片染色效果良好，染色深度合適，分色明顯。染色后的切片用酒精脫水，二甲苯透明，具體程序如下95％乙醇2min，95％乙醇2min，100％乙醇2min，100％乙醇2min，二甲苯2min30s，二甲苯2min30s，二甲苯2min30s，然后用加拿大樹膠封片。
采用上述方法，我們在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，共對(duì)大菱鲆、牙鲆等海水魚的十幾批卵子進(jìn)行了石蠟切片，結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法可以獲得良好的切片和染色質(zhì)量，切片連續(xù)、完整，切片中紡錘體等細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰可見，具體效果見(圖1、2)。
權(quán)利要求
1.一種海水魚卵子石蠟切片方法，它的操作程序是固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、脫蠟以及染色，其特征在于在海水魚卵子石蠟切片過程中，對(duì)固定劑、脫水程序、透明程序、透蠟方法和染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，即進(jìn)行了固定劑的選擇、脫水程序的確定、透明程序的確定、透蠟程序的確定、染色方法的改進(jìn)固定劑的選擇采用電鏡樣品固定常用的戊二醛，戊二醛的濃度為1.5％，采用脫脂棉過濾的海水作為溶劑；固定過程中更換固定液3～4次；脫水程序的確定樣品采用乙醇脫水，采用85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min；85％到95％乙醇采取10％的濃度梯度，95％到100％乙醇采取5％的濃度梯度，每梯度2次脫水程序，樣品脫水前用100％瓊脂將樣品包埋定位；透明程序的確定采取1∶1的二甲苯∶乙醇過渡方法；具體透明過程如下1∶1二甲苯∶100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s；透蠟程序的確定和包埋透蠟采用熔點(diǎn)為42～47℃的軟蠟，透蠟程序如下透蠟時(shí)間3小時(shí)，期間換蠟一次，即石蠟1h30min，石蠟1h30min，透蠟后用紙盒包埋；采用普通生物切片機(jī)切片，切片厚度5μm；用恒溫水浴展片，動(dòng)物膠貼片；染色方法的改進(jìn)染色采用了曙紅蘇木素復(fù)染，蘇木素染液配方如下熱蒸餾水2000ml，蘇木素2g，碘酸納0.4g，鉀明礬150g，檸檬酸2g，水和氯醛100g；伊紅染液配方1％曙紅Y水溶液100ml，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。
全文摘要
一種海水魚卵子石蠟切片方法，包括固定劑的選擇、脫水程序的確定、透明程序的確定、透蠟程序的確定、染色方法的改進(jìn)，省略了魚卵石蠟切片過程中難以操作的卵膜剝離程序，簡化了程序、提高了工作效率?？朔撕Ｋ~卵子石蠟切片中存在的卵子變形、切片不連續(xù)、存在空洞等問題，獲得良好的切片和染色質(zhì)量，該方法簡單易操作，不需專門設(shè)備，藥品易得，可用于海水魚類早期發(fā)育生物學(xué)研究。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1912567SQ200610045429
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者張巖, 張立敬, 黃倢, 陳四清, 肖永雙 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所