專利名稱：一種網(wǎng)絡(luò)狀大孔結(jié)構(gòu)纖維素吸附與轉(zhuǎn)印膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印以及免疫測試的纖維素微孔膜的制備方法，具體地說，是涉及一種網(wǎng)絡(luò)狀大孔結(jié)構(gòu)纖維素吸附與轉(zhuǎn)印膜的制備方法。
背景技術(shù)：
纖維素主鏈?zhǔn)怯搔?1，4-糖苷鍵連接起來的脫水葡萄糖組成，如圖1所示。由于纖維素的線性結(jié)構(gòu)，使其本身雖然親水但不溶于水，可溶于比較便宜的有機(jī)溶劑，如丙酮、醋酸酯，微溶于醇類。同時(shí)纖維素上的羥基的存在使其帶有一定的電荷。纖維素作為分離用膜材料具有來源廣泛、成膜性能良好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，但耐熱性差，易于發(fā)生化學(xué)及生物降解，為避免降解，在室溫下使用時(shí)pH應(yīng)在4至6.5之間，另外，對生物降解也很敏感。
纖維素膜的最早研究始于1855年Fick以陶瓷管浸入纖維素乙醚溶液中制成袋型半透膜，1907年Bechhold發(fā)表了的一篇系統(tǒng)研究濾膜性質(zhì)的報(bào)告，他指出用改變纖維素溶液的方法控制和改變膜的孔徑的大小，從而制出不同孔徑系列的平板膜，用以透析生物流體溶液。1918年Zsigmondy等人首先提出以商品化規(guī)模生產(chǎn)硝化纖維濾膜的方法，并于1921年獲得專利。1925年在德國哥丁根成立了世界上第一家膜公司專門生產(chǎn)和經(jīng)銷濾膜。第二次世界大戰(zhàn)，美英等國得到德國濾膜公司的資料，于1947年相繼成立了工業(yè)生產(chǎn)機(jī)構(gòu)，開始生產(chǎn)纖維素膜，用于水質(zhì)和化學(xué)武器的檢驗(yàn)。隨著技術(shù)的發(fā)展和纖維素本身的缺點(diǎn)，促使人們進(jìn)一步尋找新性質(zhì)優(yōu)良的膜。從60年代開始逐漸出現(xiàn)了聚乙烯和醋酸纖維素等其它材質(zhì)的濾膜，接著又出現(xiàn)了硝酸纖維素和醋酸纖維素混合酯濾膜，由于它容易制備，性能優(yōu)良，已成為應(yīng)用最廣的濾膜類型。60年代后隨著制膜技術(shù)的成熟，人們開始研究將纖維素進(jìn)一步改進(jìn)得到微濾膜和超濾膜。
80年代Masahiro等將纖維素溶解于甲酰胺與甲醇混合溶劑中，配制成一定濃度的纖維素制膜液，靜置后，將制膜液涂覆于聚對苯二甲酸乙二醇酯布上，在空氣中蒸發(fā)一定時(shí)間后，置于水溶液中，固化成膜，并徹底交換出溶劑和添加劑，獲得了較好強(qiáng)度與水通量的纖維素膜，用于人工腎的研究。并考察了制膜條件對膜滲透性、水通量、吸附性的影響。由于纖維素膜的強(qiáng)度較低，90年代德國的Beer等人將纖維素溶解于醋酸甲酯、乙醇和異丁醇的溶劑和非溶劑的混合液中，并添加一定量的非溶劑水，配制成一定濃度的制膜液，然后將制膜液涂于聚酯膜上，于室溫下自然蒸發(fā)，使制膜液發(fā)生相分離，制得了孔徑為0.45～10.00μm的纖維素-聚酯復(fù)合微孔膜，從而增強(qiáng)了膜的強(qiáng)度，用于化學(xué)分析和醫(yī)藥診斷實(shí)驗(yàn)，但其強(qiáng)度仍不理想。
纖維素膜上負(fù)電荷的存在使其對蛋白質(zhì)和核酸分子具有極強(qiáng)的非特異性吸附能力，目前已經(jīng)在分子雜交、免疫印跡、細(xì)胞培養(yǎng)和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。1965年，Nygaard第一次報(bào)道了硝酸纖維素(NC)膜對單鏈DNA的吸附性能；1975年，Southern采用電泳的方法將DNA轉(zhuǎn)印到NC膜上，稱為“Southern blotting”；1977年，Alwine同樣采用電泳的方法將RNA轉(zhuǎn)印到NC膜上，稱為“Northern blotting”；1979年，Towbin等將蛋白質(zhì)分子從SDS-PAGE上轉(zhuǎn)印到NC膜上，稱之為“Westernblotting”，至此，維素膜在生物領(lǐng)域的應(yīng)用得到了飛速發(fā)展。
對抗原物質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳，再利用纖維素和抗原物質(zhì)之間的靜電作用和疏水相互作用，將抗原轉(zhuǎn)印到纖維素膜表面，然后利用抗原和抗體之間的免疫作用，可對多克隆抗體進(jìn)行分離純化。目前此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。如Kurien等用NC膜分離純化抗體，將SDS-PAGE上的12條抗原轉(zhuǎn)印到NC膜上，放入不同的免疫血清中，就能分離純化不同的抗體。國內(nèi)駱愛玲等將抗原結(jié)合到NC膜上，用其對甜菜堿醛脫氫酶抗體進(jìn)行分離純化，取得了很好的效果。丁鏟等用纖維素膜免疫吸附法純化雞IgM，重復(fù)再生使用5次，從10ml IgM陽性血清中，分別獲得1.37，1.32，1.26，1.20和1.17mg IgM純品。
在生物學(xué)檢測上的應(yīng)用主要是酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，其原理是利用纖維素膜對蛋白質(zhì)的強(qiáng)吸附能力，使抗原抗體結(jié)合在膜上，結(jié)合在纖維素膜上的酶標(biāo)抗體通過將底物降解成不溶性的產(chǎn)物沉淀，在纖維素膜上形成斑點(diǎn)。而待檢測抗原或抗體含量可以通過膜上斑點(diǎn)顏色的深淺來判斷。這項(xiàng)技術(shù)80年代開始興起。該方法精度高，不需要特殊的儀器，且做好的膜可以在一定的條件下保存而不失效，已被應(yīng)用多種臨床醫(yī)學(xué)中。如Sironi等研究發(fā)現(xiàn)微管蛋白羧肽酶可以與吸附在纖維素膜上的微管蛋白反應(yīng)，釋放出酪氨酸。隨著酶與底物的反應(yīng)，溶液中的酪氨酸含量與反應(yīng)時(shí)間且呈線性關(guān)系，可以用來測量酶的含量，這種方法比直接在水溶液中的靈敏度高2.65倍。Mary等以帶有IgM捕獲酶的纖維素膜來作為登革熱病毒傳染的病因檢測儀，其準(zhǔn)確率達(dá)到99％。國內(nèi)王秀華用纖維素膜印跡法測定日本對蝦血淋巴堿性磷酸酶(ALP)的相對活性，此方法比原來的試劑盒精確100倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種不需要經(jīng)過復(fù)雜后處理工藝，直接通過干法制取高透過通量、可控孔徑的纖維素平板膜的制膜方法，制備出性能穩(wěn)定、孔徑較大、高蛋白質(zhì)吸附量的纖維素平板多孔膜。
一種網(wǎng)絡(luò)狀大孔結(jié)構(gòu)纖維素吸附與轉(zhuǎn)印膜的制備方法，其步驟為1)將纖維素溶于有機(jī)溶劑中，加入添加劑和非溶劑水，室溫下攪拌均勻，靜置脫泡后，得纖維素制膜液，靜置待用；2)將制膜液用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度為400～600μm；3)在制膜室密閉環(huán)境條件下自然揮發(fā)溶劑，直至固化成膜；4)將上述膜浸入去離子水中浸泡；交換出溶劑和添加劑后取出，自然晾干。
所述的制膜室的操作條件為溫度15～40℃，相對濕度為40～90％。膜在去離子水中浸泡時(shí)間至少20小時(shí)。
所述的制備方法中，加入原料的量以重量百分比計(jì)，為纖維素5～10％，溶劑40～70％，添加劑20～50％，非溶劑水4～10％。
其中纖維素為二醋酸纖維素、三醋酸纖維素或二硝酸纖維素，有機(jī)溶劑為醋酸酯、丙酮、二甲基酰胺、二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種或其混合物，添加劑為醇類溶劑，優(yōu)選為乙醇、丙醇、甘油、正丁醇、異丁醇的一種或其混合物，非溶劑水為去離子水。
本發(fā)明方法通過適當(dāng)?shù)暮勘壤?，充分利用添加劑進(jìn)行溶脹分散、增稠作用，使制膜液有適當(dāng)?shù)姆稚⑿院头€(wěn)定性，有效控制制膜液的成膜速度，從而可不經(jīng)后處理直接制備出性能穩(wěn)定、孔徑較大、高蛋白質(zhì)吸附量的纖維素平板多孔膜，此膜可廣泛用于生化、食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、生物免疫檢測多種工業(yè)領(lǐng)域中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)制備工藝過程簡單、容易產(chǎn)業(yè)化。
2)溶劑為常見的醋酸酯、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和二甲基亞砜，溶脹劑為乙醇、丙醇、甘油、正丁醇和異丁醇等，非溶劑為純水，環(huán)境溫度為10～40℃，這就節(jié)省了高溫環(huán)境所需要的能耗，這些都大大降低了生產(chǎn)成本。
3)該法制備的纖維素沒有支撐層，且膜的強(qiáng)度較高，孔徑大，分布窄，這些都大大降低了纖維素膜在應(yīng)用過程中的阻力。


圖1為纖維素的分子結(jié)構(gòu)式；圖2、圖3分別為孔徑為0.7μm的纖維素膜表面和截面的電鏡照片；圖4、圖5分別為孔徑為6.5μm的纖維素膜表面和截面的電鏡照片；圖6、圖7分別為孔徑為8.5μm的纖維素膜表面和截面的電鏡照片；圖8、圖9分別為孔徑為13.7μm的纖維素膜表面和截面的電鏡照片；圖10、圖11分別為孔徑為18.7μm的纖維素膜表面和截面的電鏡照片；圖12為蛋白質(zhì)在孔徑為0.7μm的纖維素膜的轉(zhuǎn)印條帶。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將一定比例的纖維素、溶劑、添加劑及去離子水在室溫下于三角瓶中充分?jǐn)嚢枞芙?，至纖維素完全溶解，溶液保持澄清。將脫泡完畢的制膜液用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度為400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度和相對濕度，在此條件下自然揮發(fā)溶劑，直至固化成膜。然后將初生態(tài)的膜在室溫下用蒸餾水漂洗一段時(shí)間，徹底交換出溶劑和添加劑。將漂洗后的膜在室溫下晾干，得到一定孔徑分布的微孔膜。
實(shí)施例1將10克纖維素溶解在丙酮∶乙醇∶正丁醇＝5∶3∶2的100克溶劑和添加劑的混合液中，往溶液中添加5克去離子水，在室溫下攪拌溶解，靜置脫泡后用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度大約400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度在35℃，相對濕度為50％，在此條件下自然揮發(fā)溶劑，直至固化成膜。然后將初生態(tài)的膜在室溫下用蒸餾水漂洗20小時(shí)以上，徹底交換出溶劑。將漂洗后的膜在室溫下晾干，得到一定孔徑分布的微孔膜，膜的結(jié)構(gòu)如圖2、3所示。
剪取直徑為7cm的圓形膜片，放入超濾杯中，該膜首先在0.15MPa下預(yù)壓30分鐘直到水通量基本穩(wěn)定，然后在0.1MPa下測量。膜的表面形態(tài)由干膜鍍金后用掃描電鏡觀察，膜的表面形態(tài)見附圖2。將干燥后的微孔膜放入一定濃度的蛋白質(zhì)溶液中，靜態(tài)吸附1h，檢測吸附前后溶液中蛋白質(zhì)的變化量，算出單位面積膜的蛋白質(zhì)吸附量。所得結(jié)果見表1。
表1實(shí)例1所制備膜的各項(xiàng)性能

實(shí)施例2保持溶劑和非溶劑的種類不變，改變非溶劑添加量。將10克纖維素溶解在丙酮∶乙醇∶正丁醇＝5∶3∶2的100克溶劑和添加劑的混合液中，往溶液中添加7克水，在室溫下攪拌溶解，靜置脫泡后用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度大約400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度在20℃，相對濕度為80％。以下步驟同實(shí)例1。所得結(jié)果見表2和附圖4、5。
表2實(shí)例2所制備膜的各項(xiàng)性能

實(shí)施例3將7克纖維素溶解在二甲基甲酰胺∶甘油∶異丁醇＝3∶4∶3的100克溶劑和添加劑的混合液中，往溶液中添加8克水，在室溫下攪拌溶解，靜置脫泡后用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度大約400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度在35℃，相對濕度為80％。以下步驟同實(shí)例1。所得結(jié)果見表3和附圖6、7。
表3實(shí)例3所制備膜的各項(xiàng)性能

實(shí)施例4將5克纖維素溶解在醋酸酯∶丙醇∶正丁醇＝4∶4∶2的100克溶劑和添加劑的混合液中，往溶液中添加7克水，在室溫下攪拌溶解，靜置脫泡后用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度大約400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度在20℃，相對濕度為70％。以下步驟同實(shí)例1。所得結(jié)果見表4和附圖8、9。
表4實(shí)例4所制備膜的各項(xiàng)性能

實(shí)施例5將7克纖維素溶解在二甲基亞砜∶乙醇∶正丁醇＝4∶3∶3的100克溶劑和添加劑的混合液中，往溶液中添加6克水，在室溫下攪拌溶解，靜置脫泡后用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度大約400～600μm。調(diào)節(jié)制膜室的溫度在30℃，相對濕度為70％。以下步驟同實(shí)例1。所得結(jié)果見表5和附圖10、11。
表5實(shí)例5所制備膜的各項(xiàng)性能

將重組別藻藍(lán)蛋白(rAPC)做電泳分析，然后轉(zhuǎn)印到實(shí)施例1制備的孔徑為0.7μm的纖維素膜上，附圖12為rAPC在膜上的轉(zhuǎn)印條帶。
權(quán)利要求
1.一種網(wǎng)絡(luò)狀大孔結(jié)構(gòu)纖維素吸附與轉(zhuǎn)印膜的制備方法，其步驟為1)將纖維素溶于有機(jī)溶劑中，加入添加劑和非溶劑水，室溫下攪拌均勻，靜置脫泡后，得纖維素制膜液，靜置待用；2)將制膜液用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度為400～600μm；3)在制膜室密閉環(huán)境條件下自然揮發(fā)溶劑，直至固化成膜；4)將上述膜浸入去離子水中浸泡，交換出溶劑和添加劑后取出，自然晾干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的制膜室的操作條件為溫度15～40℃，相對濕度為40～90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的膜在去離子水中浸泡時(shí)間至少20小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于加入原料的量以重量百分比計(jì)，為纖維素5～10％，有機(jī)溶劑40～70％，添加劑20～50％，非溶劑水4～10％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的纖維素為二醋酸纖維素、三醋酸纖維素或二硝酸纖維素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為醋酸酯、丙酮、二甲基酰胺、二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種或其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的添加劑為醇類溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的醇類溶劑為乙醇、丙醇、甘油、正丁醇、異丁醇的一種或其混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的制備方法，其特征在于所述的非溶劑水為去離子水。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9任一權(quán)利要求所述的制備方法制備的纖維素微孔膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種網(wǎng)絡(luò)狀大孔結(jié)構(gòu)纖維素吸附與轉(zhuǎn)印膜的制備方法，其步驟為1)將纖維素溶于有機(jī)溶劑中，加入添加劑和非溶劑水，室溫下攪拌均勻，靜置脫泡后，得纖維素制膜液，靜置待用；2)將制膜液用刮刀刮在潔凈平整的玻璃板上，膜液厚度為400～600μm；3)在制膜室密閉環(huán)境條件下自然揮發(fā)溶劑，直至固化成膜；4)將上述膜浸入去離子水中浸泡；徹底交換出溶劑和添加劑后取出，自然晾干。本發(fā)明工藝可不經(jīng)后處理直接制備出性能穩(wěn)定、孔徑較大、高蛋白質(zhì)吸附量的纖維素平板多孔膜，此膜可廣泛用于生化、食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、生物免疫檢測多種工業(yè)領(lǐng)域中。
文檔編號G01N33/531GK1851462SQ20061005083
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日
發(fā)明者陳歡林, 孫海翔, 劉圣南, 張 林 申請人:浙江大學(xué)